Αφηρημένο

Το ογκογονίδιο FOXM1 έχει εμπλακεί σε όλους τους βασικούς τύπους καρκίνου στον άνθρωπο. Εμείς πρόσφατα έδειξαν ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση FOXM1 προκαλεί διαστολή των αρχέγονων κυττάρων με αποτέλεσμα την έναρξη της υπερπλασίας. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι FOXM1 ρυθμίζει

HELLS

, ένα SnF2 /ελικάση που εμπλέκονται στην μεθυλίωσης του DNA, εμπλέκοντας

FOXM1

στην επιγενετική ρύθμιση. Εδώ, έχουμε αποδείξει με τη χρήση πρωτογενών φυσιολογική ανθρώπινη στοματική κερατινοκύτταρα (NOK) ότι η ρύθμιση προς τα άνω του

FOXM1

κατέστειλε το ογκοκατασταλτικό γονίδιο

p16

ΙΝΚ4 &

(

CDKN2A

) μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού. Νοκ ντάουν του

HELLS

χρήση siRNA επανεργοποίησε την έκφραση του mRNA της

p16

ΙΝΚ4 &

και ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω των δύο μεθυλοτρανσφεράσες DNA

DNMT1

και

DNMT3B

. Η εξαρτώμενη από την δόση προς τα πάνω ρύθμιση της ενδογενούς

FOXM1

(ισόμορφο Β) έκφραση κατά την διάρκεια της προόδου του όγκου σε ένα πάνελ κανονικών στελεχών πρωτοβάθμιας ΝΟΚ (n = 8), δυσπλασίες (n = 5) και κεφαλής και λαιμού πλακώδους κυττάρου καρκινώματος ( HNSCC) κυτταρικές σειρές (n = 11) συσχετίζεται θετικά με ενδογενή εκφράσεις του

HELLS

,

BMI1

,

DNMT1

και

DNMT3B

και αρνητικά με

p16

ΙΝΚ4 &

και ινβολουκρίνη. Όξινο θειώδες τροποποίηση και ανάλυση υποστηρικτής μεθυλίωσης-ειδική χρήση απόλυτη ποσοτική PCR (MS-qPCR) έδειξε ότι η αυξητική ρύθμιση του

FOXM1

σημαντικά προκαλούμενη

p16

ΙΝΚ4 &

υπερμεθυλίωση προαγωγού (10-φορές, P & lt? 0.05) στην πρωτογενή κύτταρα ΝΟΚ. Χρησιμοποιώντας μια μεθυλίωση υποστηρικτής μέθοδο των μικροσυστοιχιών προφίλ γονιδίωμα-ευρεία μη προκατάληψη, έχουμε αποκάλυψε ότι παρεκκλίνουσα

FOXM1

έκφρασης στην πρωτοβάθμια NOK προκάλεσε παγκόσμιο πρότυπο υπομεθυλίωση παρόμοια με αυτή που βρέθηκε σε ένα HNSCC (SCC15) κυτταρική γραμμή. Μετά από πειράματα με επικύρωση απόλυτη qPCR, έχουμε εντοπίσει μια σειρά από διαφορετικά μεθυλιωμένων γονιδίων, βρέθηκε να συσχετίζεται αντίστροφα με την

in vivo

επίπεδα έκφρασης του mRNA των δειγμάτων της βιοψίας του όγκου κλινική HNSCC. Η μελέτη παρέχει την πρώτη απόδειξη, χρησιμοποιώντας πρωτογενή φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα και ιστούς όγκων, η παρεκκλίνουσα ρύθμιση προς τα άνω του

FOXM1

ενορχήστρωσε μια υπογραφή μεθυλίωσης του DNA που μιμείται το τοπίο καρκίνο methylome, από την οποία έχουμε εντοπίσει ένα μοναδικό

FOXM1

επαγόμενη από επιγενετικές υπογραφή που μπορεί να έχει κλινική δυνατότητες μεταγραφική ως βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου, διαγνωστικών ή /και θεραπευτικών παρεμβάσεων

Παράθεση:. Teh MT, Gemenetzidis Ε, Patel D, Tariq R, Nadir Α, Bahta AW, et al. (2012) FOXM1 Προκαλεί μια Υπογραφή Παγκόσμια μεθυλίωση που μιμείται την Καρκίνου επιγονιδίωμα στην Κεφαλής και Τραχήλου πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα. PLoS ONE 7 (3): e34329. doi: 10.1371 /journal.pone.0034329

Συντάκτης: Andrew Yeudall, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 του Νοεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 26 του Φλεβάρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 26 Μάρτη, 2012

Copyright: © 2012 Teh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο συγχρηματοδοτήθηκε από το Wellcome Trust (ΜΤΤ, EG), τη Χειρουργικής Προσώπου Ίδρυμα Ερευνών και Μελετών – Εξοικονόμηση Πρόσωπα (ΜΤΤ, AW) και το Ινστιτούτο Οδοντιατρικής (DP, RT, AN), Barts και το London School of Ιατρικής και Οδοντιατρικής, Queen Mary University του Λονδίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η κατανόηση του επιγενετικές μηχανισμός που ρυθμίζει τον προσδιορισμό των βλαστικών κυττάρων μοίρα παρέχει θεμελιώδεις γνώσεις σχετικά με τη φυσιολογία της αναγέννησης των ιστών και την παθογένεση του καρκίνου. Το καλύτερα μελετημένο επιγενετικό μηχανισμός διαταράσσεται κατά την έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου είναι η μεθυλίωση του DNA το οποίο προσθέτει χημικά ομάδες μεθυλίου σε κυτοσίνες στα 5 ‘θέσεις τους, κυρίως στο CpG δινουκλεοτίδια στο γονιδιακό DNA των θηλαστικών [1]. Μεθυλίωσης του DNA περιλαμβάνει τρία βασικά μεθυλοτρανσφεράσες DNA: DNMT1, Dnmt3a και DNMT3B. DNMT1 έχει κλασικά έχουν εμπλακεί στην διατήρηση των υφιστάμενων μετουσιωμένο DNA, ενώ, Dnmt3a και DNTM3B στο

de novo

μεθυλίωσης του DNA [1]. Η κληρονομική φύση της μεθυλίωσης του DNA επιτρέπει στα κύτταρα για να προσδιοριστεί κύτταρο δραστικότητα /μοίρα χωρίς να αλλάζει την πρωτοταγή αλληλουχία του γενωμικού DNA. Η αναστρεψιμότητα του προγραμματισμού της μεθυλίωσης του DNA καθιστά τις προδιαγραφές μοίρα των κυττάρων εξαιρετικά πλαστικό και αναστρέψιμη. Επιγενετικές επαναπρογραμματισμό που συνεπάγονται αλλαγές στο DNA μεθυλίωση έχει ενοχοποιηθεί σε όλα τα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου [2], [3]. Έχει επίσης δειχθεί ότι επιγενετικές επαναπρογραμματισμός προηγείται της έναρξης του καρκίνου, όπως βλαστικά /προγονικά κύτταρα [4]. Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι τα καρκινικά κύτταρα εκμεταλλεύονται τις αναστρέψιμες και κληρονομικές ιδιότητες της μεθυλίωσης του DNA να διαταράσσουν την ισορροπία μεταξύ ανανέωσης και διαφοροποίησης βλαστικών /προγονικών κυττάρων προωθώντας έτσι την έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου [2], [3], [4].

FOXM1 (ισόμορφο Β) πρώτα βρέθηκε να είναι ένας προς τα κάτω στόχος του μονοπατιού σηματοδότησης ογκογόνου Sonic Hedgehog μέσω μιας οικογένειας γλοιώματος παράγοντα μεταγραφής δακτύλου ψευδαργύρου 1 (Gli1) σε καρκινωμάτων των βασικών κυττάρων [5]. Μετέπειτα μελέτες αποκάλυψαν ότι FOXM1 ήταν πανταχού παρούσες ρυθμίζεται αυξητικά στην πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνων [6], [7], οι οποίες περιλαμβάνουν τον εγκέφαλο, το ήπαρ, του μαστού, του πνεύμονα, του στομάχου, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου, του νεφρού, της ουροδόχου κύστης, του προστάτη, των όρχεων, των ωοθηκών, της μήτρας, του τραχήλου , του αίματος (οξεία μυελοειδή λευχαιμία), δερματικό μελάνωμα, το κεφάλι και το λαιμό καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [8], [9].

Κατά την αναζήτηση για να κατανοήσουν την ογκογόνο μηχανισμό FOXM1, έχουμε δείξει πρόσφατα ότι FOXM1 προκαλεί καρκίνο έναρξη με την προώθηση των επιθηλιακών ανανέωση των κυττάρων ενήλικα ανθρώπινα βλαστικά /προγονικά και από τον ανταγωνισμό διαφοροποίηση [10]. Άλλοι έχουν δείξει ότι FOXM1 διαδραματίζει καίριο ρόλο στη διατήρηση κυτταρική ανανέωση βλαστικών /προγονικών μέσω των γονιδίων πλειοδυναμία συμπεριλαμβανομένων των

Oct4

,

Nanog

,

Sox2

και

Bmi1

[11], [12]. προηγούμενες εργασίες μας εντόπισε στόχο κατάντη FOXM1

HELLS

[8], ένας ανθρώπινος παράγοντας εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα /λεμφικών ειδικά SnF2 /ελικάση που συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και μεθυλίωσης του DNA [13], [14], που εμπλέκουν FOXM1 στην επιγενετική ρύθμιση κατά την ανανέωση αρχέγονων προγονικών κυττάρων /[8], [10]. Ωστόσο, δεν ήταν σαφές εάν FOXM1 έχει ένα ρόλο στην επιγενετική ρύθμιση. Σε αυτή τη μελέτη, με τη χρήση πρωτογενών κανονική ανθρώπινη στοματική κερατινοκύτταρα και (HNSCC) κυτταρικές σειρές όγκων κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων και ιστών βιοψίας όγκου, διερευνήσαμε το ρόλο της FOXM1 στη ρύθμιση της μεθυλίωσης υποκινητή του γονιδίου τόσο σε μόνο γονίδιο και τα επίπεδα του γονιδιώματος σε επίπεδο . Αυτό οδήγησε στην πρώτη απόδειξη σε φυσιολογικά πρωτογενή ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του στόματος που FOXM1 προκαλεί ένα τοπίο που μοιάζει με μεθυλίωση επιγονιδιώματος καρκίνου βρέθηκε σε ιστούς HNSCC όγκου.

Μέθοδοι

Κλινική ιστοί

η χρήση ανθρώπινων ιστών στην παρούσα μελέτη έχει εγκριθεί από ιδρύματα υποδοχής μας (Barts & amp? το London NHS Trust και την Ιατρική Σχολή του & amp? Οδοντιατρικής, Πανεπιστήμιο Queen Mary του Λονδίνου) και η Εθνική Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του Ηνωμένου Βασιλείου. Όλα τα κλινικά δείγματα, τα οποία ήταν πλεονασματική τη διάγνωση, συλλέχθηκαν σύμφωνα με τις τοπικές ηθικές πρωτόκολλα επιτροπή-εγκριθεί και γραπτή συγκατάθεση του ασθενούς ελήφθη από όλους τους συμμετέχοντες. Ζεύγη των κανονικών περιθωρίων και HNSCC όγκου πυρήνα βιοψίες ιστού ήταν ιστοπαθολογικές προ-επικυρωμένη με τη συνεργασία παθολόγων μας πριν από τη χρήση για την παρούσα μελέτη. Φρέσκα δείγματα ιστού βιοψίας διατηρήθηκαν σε RNA

Αργότερα

(Cat # AM7022, Ambion, Applied Biosystems, Warrington, UK) και αποθηκεύτηκε βραχυπρόθεσμη είτε στους 4 ° C (1-2 ημέρες) ή -20 ° C (έως 1 εβδομάδα) πριν από τη μεταφορά και την επακόλουθη μακροχρόνια αποθήκευση στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

Κυτταρική καλλιέργεια

Όλα τα πρωτεύοντα φυσιολογικό ανθρώπινο στόματος κερατινοκύτταρα (OK355, HOKG, OK113, ΝΟΚ, NOK1, NOK3, NOK16 και NOK376) έχουν εξαχθεί από την κανονική προφορική ιστούς βλεννογόνου δωρεά από υγιή ελεύθερη νόσου άτομα που υποβάλλονται σε εξαγωγή δοντιού σοφία και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8], [15]. Προφορική δυσπλαστικών προκαρκινικά στάδια κυτταρικές σειρές (OKF6 /T [16], POE9n [17], DOK [18], D19 [19], D20 [19]) και από του στόματος κυτταρικές σειρές SCC (SCC4 [20], SCC9 [20], SCC15 [20], SCC25 [20], δρΟΟ /Y1 [21], UK1 [22], VB6 [22], CaLH2 [22], CaDec12 [22], 5PT [22], H357 [22]), SVpgC2a [23 ] και SVFN1-8 [8] ήταν όλα καλά καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8], [10], [15].

ανοσοαποτύπωσης

εκχύλιση πρωτεϊνών και διαχωρισμό σε SDS -PAGE πηκτές και ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως (5). Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού για ρ16

ΙΝΚ4 & (1:2000 αραίωση? Cat # 551154, BD Biosciences) και ένα πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού αντι-GAPDH (1:20,000 αραίωση? Cat # 9485, Abcam) χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοκηλίδωση

.

RNA παρεμβολής

Pre-επικυρωμένη ειδική γονιδιακή siHELLS (ON-TARGETplus SMARTpool HELLS, Cat # L-017444-09,10,11,12), τον έλεγχο siCTRL (ON-TARGETplus μη στοχεύουν στην πισίνα , Cat # D-001810-10-05) και αντιδραστήριο διαμόλυνσης siRNA (DharmaFECT 1, Cat # Τ-2001-02) αγοράστηκαν από την Dharmacon, Thermo Fisher Scientific. Ένα αρχικό πείραμα δόσης-απόκρισης διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για να προσδιοριστεί η βέλτιστη αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής. siRNA στα 10 ηΜ (48-ώρες επώασης) βρέθηκε να είναι η βέλτιστη τελική συγκέντρωση η οποία ως εκ τούτου χρησιμοποιείται σε όλα τα επόμενα πειράματα. Η επίδραση της γονιδιακής αποσιώπησης επικυρώθηκε από την ποσοτικοποίηση της έκφρασης mRNA του γονιδίου-στόχου (

HELLS

) με απόλυτη αντίστροφη μεταγραφή qPCR.

μεταγωγής ρετροϊού

Οι ρετροϊικοί υπερκείμενο και μεταγωγή διαδικασίες ήταν πραγματοποιείται με τη χρήση καθιερωμένων πρωτοκόλλων μας [8], [10], [15]. Ίσα επίπεδα

EGFP

και

FOXM1

(ισομορφή Β) έκφραση επιτεύχθηκαν με αύξοντα ρετροϊικό πείραμα υπερκείμενο τιτλοδότηση και στη συνέχεια

EGFP

αριθμό αντιγράφων του πλασμιδίου επιβεβαιώθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας γονιδιακό DNA εξάγεται από μεταχθέντα κύτταρα σύμφωνα με παλαιότερα καθιερωμένη μέθοδος μας [15]. Τα επίπεδα της έκτοπης

FOXM1

έκφραση στα πρωτογενή κερατινοκύτταρα τιτλοδοτήθηκαν να αντιγράφεται επίπεδα που βρίσκονται σε καρκινικά κύτταρα, όπως έχει ήδη αναφερθεί [8], [10], [15] (βλέπε Σχήμα 1C). Τα μετατραπέντα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 3-5 ημέρες για να επιτραπεί η έκφραση διαγονιδίου πριν το πείραμα.

(Α) FOXM1 καταστέλλει σημαντικά

ρ16

ΙΝΚ4 &

mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης (σχήμα ένθετο) σε πρωτογενείς φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. κύτταρα ελέγχου (mock-μεταγωγή με άδειο σωματίδια ρετροϊού ή EGFP μεταγωγή) δεν έδειξαν σημαντική καταστολή της p16

έκφραση ΙΝΚ4 &. (Β) Νοκ ντάουν ενός γονιδίου FOXM1-στόχος

HELLS

, η οποία ρυθμίζει το γονιδίωμα-ευρεία μεθυλίωση [14], που προκαλείται

p16

ΙΝΚ4 &

και ταυτόχρονα καταστέλλεται

DNMT1

και

DNMT3B

, αλλά όχι

Dnmt3a

έκφραση mRNA σε ένα FOXM1-μετασχηματισμένο κακοήθη κυτταρική γραμμή (SVFN5) που εκφράζουν συστατική επίπεδα ενδογενούς

HELLS

[8]. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μια μέση τιμή ± SEM των τριπλών διαμόλυνσης (48 ώρες) είτε με siCTRL ή siHELLS. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 και *** P & lt? 0,001 δείχνουν το επίπεδο της στατιστικής σημαντικότητας σε σύγκριση με τους μάρτυρες. (Γ) Η ενδογενής

FOXM1

(ισομορφή Β) τα επίπεδα έκφρασης του mRNA σε 8 στελέχη των πρωτογενών ανθρώπινων κανονικά από το στόμα κερατινοκύτταρα, 5 δυσπλαστικών και 11 HNSCC κυτταρικές σειρές. Σύνολο

FOXM1

επίπεδα έκφρασης του mRNA μετρήθηκαν στο EGFP και FOXM1 μεταγωγή ΝΟΚ (NOKG και NOKF), αντίστοιχα. (D-J) τρίτων προκειμένου πολυωνύμου αναλύσεις παλινδρόμησης πραγματοποιήθηκαν για την απόκτηση της R

2 συντελεστής αξιών αποφασιστικότητα που δείχνουν τη σημασία της συνεργασίας μεταξύ της έκφρασης κάθε γονιδίου με

FOXM1

σε όλα τα στελέχη 24 κυττάρων /γραμμές που αναφέρονται στον πίνακα Γ

η

νουκλεϊνικών οξέων προετοιμασίες από ιστούς και τα κύτταρα

Όλες οι βιοψίες ιστού πέψη με πρωτεϊνάση Κ (Cat # 03.115.887.001, Roche Diagnostics Ltd., Αγγλία, Ηνωμένο Βασίλειο) πριν από την ταυτόχρονη εκχύλιση mRNA (Dynabeads mRNA Direct κιτ, Cat # 610,12, Invitrogen) και γονιδιακό DNA (gDNA) η εκχύλιση (με πρότυπη μέθοδο phenol:chloroform στο mRNA-εξαντλημένο lystates). mRNA αμέσως αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA (Transcriptor cDNA Synthesis kit, Cat # 04897030001, Roche Diagnostics). gDNA ήταν διαμελισμένο από

ΜδθΙ

πέψη (37 ° C, 16 ώρες) πριν από την εμπλουτισμού για CpG-μεθυλιωμένου DNA χρησιμοποιώντας ένα MBD2b /MBD3L1-συζευγμένο σύστημα μαγνητικών σφαιριδίων που βασίζεται σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (MethylCollector Ultra kit, Cat # 55005, Active Motif Ευρώπη, Βέλγιο).

Γονιδίωμα-ευρύ υποστηρικτής μεθυλίωση Profiling

Σύμφωνα με το πρωτόκολλο και τις απαιτήσεις του κατασκευαστή, είσοδος

ΜδθΙ

που είχε υποστεί gDNA και μεθυλίωση εμπλουτισμένο DNA από κάθε δείγμα κυττάρων (NOKG, NOKF και SCC15) ενισχύθηκαν για να δημιουργήσει 6 μg DNA χρησιμοποιώντας WGA2 GenomePlex (Sigma) πριν από τα πειράματα μικροσυστοιχιών που εκτελούνται από την υπηρεσία μικροσυστοιχιών Roche NimbleGen χρησιμοποιώντας τα Ανθρώπινα DNA η μεθυλίωση 3x720K CpG νησί Plus REFSEQ υποστηρικτής Array (Cat # 05 924 600 001? NimbleGen συστήματος, Ρέικιαβικ, Ισλανδία) με βάση γονιδιώματος χτισμένο HG18, με υποκινητή ανάντη /κατάντη όργωμα του -2,44 /+ 0.61 kb, καλύπτοντας συνολικά 27.728 CpG νησίδων σε ολόκληρη την γονιδιώματος (GEO Πλατφόρμα: GPL14361). δεδομένων των μικροσυστοιχιών που δημιουργούνται σε αυτή τη μελέτη είναι MIAME συμβατό και έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME στην έκφραση γονιδίων Omnibus αποθετήριο (GEO Σειρά αριθμός ένταξης: GSE31767)

σε πραγματικό χρόνο απόλυτη ποσοτική PCR

. πρότυπη καμπύλη που βασίζεται σε πραγματικό χρόνο απόλυτη ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SYBR Green Ι Μάστερ (Cat # 04.887.352.001, Roche Diagnostics Ltd, Αγγλία, Ηνωμένο Βασίλειο) στο 384-καλά LightCycler 480 σύστημα qPCR (Roche) σύμφωνα με καθιερωμένα πρωτόκολλα μας [8] , [9], [15] οι οποίες είναι συμβατές MIQE [24]. Οι συνθήκες PCR ειδική της μεθυλίωσης πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], [26]. Όλες οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη που παρατίθεται στην Εικόνα S1. Προηγουμένως επικυρωμένη ισομορφή εκκινητές FOXM1 Β-ειδική χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση ειδικά FOXM1 (ισόμορφο Β) έκφραση mRNA σε αυτή τη μελέτη [8]. Όλα τα γονίδια στόχο ομαλοποιήθηκαν σε δύο σταθερές γονίδια αναφοράς (YAP1 και POLR2A) προηγουμένως επικυρωθεί να είναι μεταξύ των πιο σταθερή γονίδια αναφοράς σε μια ευρεία ποικιλία των πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων από το στόμα, δυσπλαστικών και κυτταρικές σειρές HNSCC [8].

αποτελέσματα και Συζήτηση

Δεδομένου προηγούμενο εύρημα μας ότι FOXM1 (ισομορφή Β) προώθησε την ανανέωση αρχέγονων προγονικών κυττάρων /μέσω διατάραξης της διαφοροποίησης της οδού [10], που αρχικά αμφισβητήθηκε η συμμετοχή ενός ογκοκατασταλτικό γονίδιο

p16

ΙΝΚ4 &

(

CDKN2A

) δεδομένου ότι έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει διαφοροποίησης επιθηλιακών βλαστικών /προγονικών κυττάρων [27] και είναι η πιο συχνά απενεργοποιημένο γονίδιο στον καρκίνο [28]. Εδώ, δείξαμε ότι η έκτοπη

FOXM1

έκφραση καταστέλλεται τόσο mRNA και πρωτεΐνης έκφραση του p16

ΙΝΚ4 & στην πρωτοβάθμια ανθρώπινη στοματική κερατινοκύτταρα (Εικόνα 1Α). Δυστυχώς, όπως έχει ήδη αναφερθεί φίμωση ενδογενούς

FOXM1

έκφραση προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου [29], η οποία αποκλείει περαιτέρω πειράματα χρησιμοποιώντας RNAi για τα εμφανώς ευαίσθητα πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα του στόματος [8], [10]. Παρ ‘όλα αυτά, μας

FOXM1

πειράματα υπερέκφρασης συμπερασματικά έδειξε ότι

FOXM1

ρύθμιση προς τα άνω καταστέλλεται

p16

ΙΝΚ4 &

γονιδιακής έκφρασης σε πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα του στόματος. Αυτό είναι σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα που

FOXM1

καταστέλλει την οδό γήρανση που προκαλείται από

p16

ΙΝΚ4 &

στα καρκινικά κύτταρα [30].

Η αδρανοποίηση του

p16

γονιδιακής έκφρασης ΙΝΚ4 &

θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα μιας σειράς μηχανισμών που περιλαμβάνουν τη διαγραφή των γονιδίων και υπερμεθυλίωση προαγωγού. Δεδομένου ότι FOXM1 στόχοι

HELLS

το οποίο ρυθμίζει μεθυλίωσης του DNA [13], [14], υποθέσαμε ότι FOXM1 μπορεί να καταστολή

p16

ΙΝΚ4 &

έκφραση μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού μέσω

HELLS

. Για να δοκιμάσετε αυτό, knockeddown

HELLS

από siRNA σε ένα HNSCC κυτταρική σειρά SVFN5, ένα FOXM1 που προκαλείται μεταμορφωθεί από του στόματος στοματική γραμμή κερατινοκυττάρων SVpgC2a [8], που εκφράζει υψηλά επίπεδα ενδογενούς

HELLS

και χαμηλά επίπεδα

p16

ΙΝΚ4 &

. Αυτό προκαλεί την εκ νέου ενεργοποίηση της έκφρασης του mRNA της

p16

ΙΝΚ4 &

(Εικόνα 1Β) και ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω των δύο μεθυλοτρανσφεράσες DNA

DNMT1

και

DNMT3B

αλλά χωρίς αποτέλεσμα στο

Dnmt3a

έκφρασης. Το γεγονός ότι

p16

ΙΝΚ4 &

αναστολή θα μπορούσε να επανενεργοποιηθεί υποστηρίζει κατά τη διαγραφή του γονιδίου ως μηχανισμός για

p16

ΙΝΚ4 &

αδρανοποίηση. Τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με προηγούμενα ευρήματα που

HELLS

αλληλεπιδρά με το

DNMT1

και

DNMT3B

[31] για να καταστείλει

p16

ΙΝΚ4 &

γονιδιακής έκφρασης [32] μέσω επιγενετικών τροποποιήσεων.

Για να επικυρώσετε περαιτέρω ότι η έκφραση του

FOXM1

,

HELLS

και

p16

ΙΝΚ4 &

γονίδια συσχετίζονται με εξέλιξης του καρκίνου και κατά πόσον υπάρχουν σύλλογοι με τα γονίδια που εμπλέκονται στην μεθυλίωσης του DNA, μετρήσαμε τα επίπεδα έκφρασης ενδογενούς mRNA της

FOXM1

,

p16

ΙΝΚ4 &

,

HELLS

,

BMI1

, ινβολουκρίνη (

IVL

, ένας δείκτης διαφοροποίησης έχει δειχθεί ότι ρυθμίζεται αρνητικά από

FOXM1

[10]) και 3 βασικά μεθυλοτρανσφεράσες DNA (

DNMT1

,

Dnmt3a

,

DNMT3B

) σε ένα πάνελ από 24 κυτταρικές στελεχών /σειρές που αποτελείται από 8 στελέχη του πρωτογενούς κανονική ανθρώπινη στοματική κερατινοκύτταρα (από κανονικούς ιστούς του στόματος βλεννογόνο), 5 δυσπλασία και 11 κυτταρικές σειρές HNSCC.

σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα [8], [10],

FOXM1

έδειξε δοσο-εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου από δυσπλασία σε HNSCC (Σχήμα 1C). Απέναντι από τον πίνακα των 24 κυτταρικών στελεχών /γραμμές, βρήκαμε ότι η έκφραση ενδογενούς mRNA της

FOXM1

συσχετίζεται αντίστροφα με

p16

ΙΝΚ4 &

αλλά η απόδοση συσχέτιση ήταν αδύναμη (R

2 = 0,23, σχήμα 1Δ). Η ρύθμιση προς τα κάτω του

p16

ΙΝΚ4 &

έκφραση βρέθηκε να είναι πιο έντονη σε δυσπλαστικών σε σχέση με κυτταρικές σειρές HNSCC. Όπως

p16 μοτίβο

ΙΝΚ4 &

έκφραση είναι σε πλήρη συμφωνία με το

in vivo p16

ΙΝΚ4 &

πρότυπο έκφρασης πρωτεΐνη που βρίσκεται στην στοματική δυσπλασία και τους ιστούς SCC [33]. Σταθερά,

BMI1

, μια ομάδα ογκογονίδιο Polycomb το οποίο είναι ένα ανάντη ρυθμιστή της

p16

ΙΝΚ4 &

γονίδιο [34], καθώς και ένας μεταγενέστερος στόχος των FOXM1 [12], [30], έδειξαν θετικά συν-έκφραση με

FOXM1

(R

2 = 0.64, Σχήμα 1Ε), αλλά αδύναμη αντίστροφη συσχέτιση με

p16

ΙΝΚ4 &

(R

2 = 0,42, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) υποστηρίζει την απόδειξη που

p16

ΙΝΚ4 &

έκφρασης ανεξάρτητα ρυθμίζεται από

BMI1

κατά τη διάρκεια της προφορικής καρκινογένεση [35]. Τα επίπεδα ασύμφωνα έκφρασης μεταξύ

FOXM1

και

p16

ΙΝΚ4 &

στα καρκινικά κύτταρα μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι

p16

ΙΝΚ4 &

μπορεί να απελευθερωθεί με ένα αριθμό διαφορετικών μηχανισμών, όπως απενεργοποιητική μετάλλαξη (μπορεί να οδηγήσει σε ρύθμιση προς τα άνω λόγω μηχανισμός ανάδρασης), διαγραφή του γονιδίου, ενίσχυση γονιδίου (του λειτουργικού γονιδίου αλλά ελαττωματικά κατάντη σηματοδότησης), υπερμεθυλίωση προαγωγέα, κ.λπ. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικό

ρ16

ΙΝΚ4 &

έκφραση ανεξάρτητη από

FOXM1

επίπεδα στα «καρκίνος» κυτταρικές σειρές. Ως εκ τούτου, ενώ η

FOXM1

μπορεί να προκαλέσει υπερμεθυλίωση προαγωγού του

p16

ΙΝΚ4 &

σε «φυσιολογικά» κύτταρα, όπως αποτέλεσμα μπορεί να διαταραχθεί σε κύτταρα «καρκίνος».

Έκφραση του

DNMT1

(R

2 = 0,84? Σχήμα 1) και

DNMT3B

(R

2 = 0,89? Σχήμα 1J), αλλά όχι

Dnmt3a

(R

2 = 0,13? Εικόνα 1Ι), έδειξε σημαντική θετική συν-έκφραση με

FOXM1

που βρίσκονται σε συμφωνία με τα ευρήματά μας παραπάνω (Εικόνα 1Β) ότι η φίμωση του

FOXM1

– κατάντη στόχος

HELLS

οδήγησε στην ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω του

DNMT1

και

DNMT3B

αλλά καμία επίδραση στο

Dnmt3a

έκφρασης. Δεν είναι σαφές γιατί

Dnmt3a

δεν επηρεάστηκε. Δημοσιευμένη βιβλιογραφία δείχνει ότι αν και οι δύο

Dnmt3a

και

Οι DNMT3B

εμπλέκονται σε

de novo

μεθυλοτρανσφεράσης, που εξυπηρετούν μη-επικαλυπτόμενα ρόλους [1]. Παρ ‘όλα αυτά, η συμμετοχή και των δύο

DNMT1

και

DNMT3B

εμπλέκει ένα ρόλο για

FOXM1

και

HELLS

στην ενεργοποίηση τόσο τη συντήρηση και

de novo

δραστηριότητες της μεθυλίωσης του DNA [1]. Όπως ήταν αναμενόμενο,

HELLS

ήταν θετικά (R

2 = 0.76, Σχήμα 1F) και

IVL

ήταν αρνητικά (R

2 = 0.52, Σχήμα 1G) συσχετίζεται με το

FOXM1

όπως φαίνεται προηγουμένως [8], [9], [10]. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν την πρώτη απόδειξη σε ανθρώπινα κύτταρα που

FOXM1

μπορεί να ενεργεί μέσω

HELLS

,

DNMT1

και

DNMT3B

να καταστείλει

p16

γονιδιακής έκφρασης ΙΝΚ4 &

. Δεδομένου ότι

HELLS

,

DNMT1

και

DNMT3B

έχουν προηγουμένως αποδειχθεί ότι διαμορφώνει

p16

ΙΝΚ4 &

υποστηρικτής μεθυλίωση [31], [32 ], υποθέσαμε ότι

FOXM1

μπορεί να ενεργοποιεί

p16

ΙΝΚ4 &

σίγηση γονιδίων μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού.

Για να διερευνήσουν υποστηρικτής CpG μεθυλίωσης του DNA, έχουμε ποσοτικά το επίπεδο της

ρ16

ΙΝΚ4 &

μεθυλίωση προαγωγού χρησιμοποιώντας τροποποίηση όξινου θειώδους και μεθυλίωσης-ειδική ποσοτική PCR (qPCR MS-? Σχήμα 2Α και Σχήμα S1). Η υπερέκφραση του

FOXM1

, αλλά όχι

EGFP

, βρέθηκε να επάγει

p16

ΙΝΚ4 &

υπερμεθυλίωση προαγωγού (Ρ & lt? 0.05), η οποία ήταν σημαντικά αντιστραφεί (P & lt? 0.001 ) μέσω μίας DNA παράγοντα απομεθυλίωσης 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5Aza) σε πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα του στόματος (Σχήμα 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν το ρόλο του

FOXM1

στην καταστολή

p16

ΙΝΚ4 &

έκφραση μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού. Υποστήριξη για

FOXM1

στην έναρξη ογκογένεση μέσω της αναστολής της

p16

ΙΝΚ4 &

, έχει αποδειχθεί ότι η επιγενετική αποσιώπηση του

p16

ΙΝΚ4 &

επάγει κυτταρική αθανασία σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού [36]. Επιπλέον, η προηγούμενη διαπίστωσή μας ότι

FOXM1

έκφραση συν-εκφράζεται με τα επιθηλιακά ΔNp63α δείκτη βλαστικών κυττάρων στον πολλαπλασιασμό αρχέγονων /προγονικών προφορική κερατινοκυττάρων υποπληθυσμό [10], και ότι ΔNp63α έχει αποδειχθεί να στοχεύσετε

HELLS

για να προκαλέσει το σχηματισμό πλακώδες καρκίνωμα σε ποντίκια [37], καθώς υποδηλώνουν μια πιθανή ρόλο για

FOXM1

(μέσω

HELLS

) στην ενεργοποίηση ογκογένεση μέσω φίμωση

p16

ΙΝΚ4 &

. Ο ακριβής μηχανισμός ογκογόνο είναι πέρα ​​από το πεδίο εφαρμογής της παρούσας μελέτης. Παρ ‘όλα αυτά, τα σημερινά δεδομένα μας παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι

FOXM1

είναι σε θέση να προκαλέσει υπερμεθυλίωση προαγωγού σε ένα ενιαίο επίπεδο γονιδίου προσφέρει μια γεύση από ενδεχόμενο ανώμαλης ρύθμιση προς τα άνω του

FOXM1

μπορεί να διαταράξει την επιγενετική ρύθμιση της μεθυλίωσης του DNA στο επίπεδο του γονιδιώματος-ευρεία.

(Α) Bisulfite τροποποίηση και μεθυλίωσης συγκεκριμένων απόλυτη qPCR για την ποσοτικοποίηση των

p16

ΙΝΚ4 &

κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή. Γενωμικό DNA πρώτα σε επεξεργασία με όξινο θειώδες νάτριο προ της PCR προ-ενίσχυσης της περιοχής του υποκινητή του

ρ16

ΙΝΚ4 &

(PCR

BS, 273 bp). Ειδικούς μεθυλίωσης (p16M-R /F) και μεθυλίωση ανεξάρτητες (p16U-F /R) εκκινητές στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση των σχετικών επιπέδων των μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων προϊόντων εντός της PCR

δείγμα BS χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη απόλυτη μέθοδος qPCR βασίζεται για κάθε προϊόν, αντίστοιχα. ανάλυση τήξη διεξήχθη για να επικυρώσετε την ιδιαιτερότητα qPCR στην ανίχνευση των δύο Μ και U προϊόντων. (Β) μετατροπή διθειώδους και μεθυλίωσης ειδικές qPCR εκτελέσθηκαν για να μετρηθούν τα σχετικά επίπεδα των μη μεθυλιωμένη (U, θερμοκρασία που τήκεται στους 85,8 ° C) και μεθυλιωμένα (Μ, 91,2 ° C) είτε σε EGFP- ή FOXM1 μεταγωγή πρωτογενούς ΝΟΚ αγωγή είτε με όχημα (DMSO) ή 5Aza (1 μΜ, 3-ημερών επώαση με φρέσκο ​​αναπλήρωση φάρμακο καθημερινά). Διεξήχθησαν συνολικά n = 11 αντίγραφα από τουλάχιστον 4 ανεξάρτητα πειράματα. Στατιστική συμβολισμοί σημασία t-test * P & lt? 0,05 και *** P & lt?. 0.001

Η

Εμείς και άλλοι έχουν δημιουργήσει προηγουμένως έναν κεντρικό ρόλο για

FOXM1

για τη διατήρηση της σταθερότητας του γονιδιώματος σύμφωνα με την οποία παρεκκλίνουσα

FOXM1

έκφραση προκαλεί παγκόσμια γενωμική αστάθεια [8], [15], [38]. Επιπλέον, τα ευρήματα που

FOXM1

στοχεύει σε επιγενετικές /βλαστικών κυττάρων διαμορφωτή

HELLS

κατά την έναρξη του καρκίνου [8], [14] και

FOXM1

προκαλεί άμεσα

p16

ΙΝΚ4 &

προαγωγός υπερμεθυλίωση (Σχήμα 2), μας ώθησε να υποθέτουν ότι η παρεκκλίνουσα ρύθμιση προς τα άνω του

FOXM1

διαταράσσει την methylome. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, πραγματοποιήσαμε μια μη-προκατάληψη γονιδίωμα-ευρεία υποστηρικτής μεθυλίωσης μικροσυστοιχιών προφίλ για την πρωτοβάθμια κανονικά από το στόμα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (NOK) είτε υπερεκφράζουν το γονίδιο ελέγχου

EGFP

(NOKG) ή

FOXM1

(NOKF) (βλέπε Εικόνα 1C για

FOXM1

επίπεδα γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων NOKG και NOKF), καθώς επίσης και σε μια HNSCC κυτταρική σειρά (SCC15). SCC15 επιλέχθηκε σε αυτή τη μελέτη ως θετικός έλεγχος επειδή ο υποκινητής του

ρ16

ΙΝΚ4 &

γονίδιο (CDKN2A) έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι υπερμεθυλιωμένο και θα μπορούσε να επανενεργοποιηθεί από 5Aza [39], ως εκ τούτου, μας επιτρέπει να επικυρώσει τα στοιχεία array μεθυλίωσης.

FOXM1

βρέθηκε ότι επάγει μια παγκόσμια πρότυπο υπομεθυλίωση παρόμοια με αυτή που βρέθηκε στο HNSCC κυτταρική γραμμή, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που εκφράζουν ΝΟΚ

EGFP

(Σχήμα 3Α). Συγκρίνοντας τα μοτίβα μεθυλίωσης με συσχέτιση αναλύσεις παλινδρόμησης μεταξύ των τριών τύπων κυττάρων (NOKG, NOKF και SCC15), μόνο NOKF vs SCC15 έδωσε μια θετική συσχέτιση μοτίβο, ενώ NOKF ή SCC15 κάθε παρήγαγε μία αντίστροφη συσχέτιση με την NOKG ελέγχου (Σχήμα 3Β). Αυτό δείχνει ότι η υπερέκφραση του

FOXM1

, αλλά όχι

EGFP

, προκαλεί ένα τοπίο μεθυλίωση παρόμοια με αυτή που βρέθηκε στο SCC15. Τόσο σε παγκόσμιο όσο υπομεθυλίωση και εστιακή υπερμεθυλίωση (επηρεάζουν μεμονωμένα γονίδια) είναι τυπικά μοτίβα μεθυλίωσης που βρέθηκαν στον καρκίνο [2], [3]. Το γεγονός ότι η ρύθμιση προς τα πάνω του FOXM1 επάγει αυτά τα πρότυπα μεθυλίωσης σε «φυσιολογικά» κύτταρα δεικνύει ότι παρεκκλίνουσα έκφραση FOXM1 αλλάζει το τοπίο μεθυλίωση προς εκείνους του καρκίνου. Η συνέπεια της παγκόσμιας υπομεθυλίωσης έχει δειχθεί ότι προκαλεί γενωμική αστάθεια [2], [3], αυτό μπορεί να παρέχει ένα μηχανισμό για προηγούμενα ευρήματα μας ότι έκτροπη έκφραση προκαλεί FOXM1 γενωμική αστάθεια σε πρωτογενείς φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα [8], [15]. Αν και παγκόσμια υπομεθυλίωση φάνηκε να είναι το κυρίαρχο αποτέλεσμα, έχει δειχθεί ότι η εστιακή υπερμεθυλίωση φίμωση κλειδί ογκοκατασταλτικά γονίδια (π.χ..

ρ16

ΙΝΚ4 &

) παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση [2], [3] .

(Α) Γονιδίωμα-ευρύ ανάλυση μικροσυστοιχιών υποστηρικτής του πρωτογενούς κανονικά από το στόμα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα που εκφράζουν είτε

EGFP

(NOKG, μαύρες κουκκίδες) ή

FOXM1

(NOKF, κίτρινες κουκίδες ) και μια καθιερωμένη πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα γραμμή (SCC15, κόκκινες κουκκίδες). Κάθε τελεία αντιπροσωπεύει ένα μόνο γονίδιο. (Β) Ένα μη-γραμμική 2

ης τάξης πολυώνυμο αναλύσεις παλινδρόμησης πραγματοποιήθηκαν στις σχετικές μοτίβα μεθυλίωσης μεταξύ NOKG vs NOKF (αντίστροφη συσχέτιση), NOKG vs SCC15 (αντίστροφη συσχέτιση) και NOKF vs SCC15 (θετική συσχέτιση). (Γ) τα κριτήρια επιλογής γονιδίων για διαφορικά μεθυλιωμένο γονιδίων μεταξύ του ελέγχου (NOKG) και οι ομάδες δοκιμών (NOKF και SCC15). 100 πιο υπερμεθυλίωση και 100-πιο-μεθυλιωμένος γονίδια αντιστρόφως συνδυάζεται με διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια από NOKF και SCC15. Οι παρακείμενες λίστες γονίδιο δείχνουν την προκρίθηκαν FOXM1 που προκαλείται (βρίσκονται επίσης σε SCC15) διαφορικά υπερμεθυλίωση (κόκκινο) και υπο-μεθυλιωμένα γονίδια (πράσινο) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου NOKG. Οι CDKN2A (κωδικοποιεί

p16

ΙΝΚ4 &

) του γονιδίου, υποστηρικτής του είναι γνωστό ότι υπερμεθυλίωση στο HNSCC, περιλήφθηκε ως θετικός μάρτυρας για υπερμεθυλίωση προαγωγού. (D) Κλινική δείγμα συσχέτιση ιστού όγκου μεταξύ των σχετικών επιπέδων της μεθυλίωσης και γονιδιακή έκφραση κάθε γονιδίου προεπιλεγεί σε μία ομάδα από 10 ασθενείς με ζευγαρωμένα κανονικό περιθώριο και τα δείγματα ιστού όγκου HNSCC. Κάθε τελεία αντιπροσωπεύει μέση ± SEM του κάθε γονιδίου. Κάθετες μπάρες σφάλματος προήλθαν από σχετική γονιδιακή έκφραση ζεύγη ιστών 10 margin-όγκου και οριζόντιες γραμμές σφάλματος προήλθαν από σχετική μεθυλίωση υποστηρικτής των 3 ανεξάρτητων πρωτοβάθμιας NOK (NOKG /NOKF) πειράματα. συντελεστή συσχέτισης (R

2) από ένα μη-γραμμικό 2

ης τάξης πολυώνυμο αναλύσεις παλινδρόμησης πραγματοποιήθηκαν σε όλα τα 30 υποψήφια γονίδια (αριστερό πάνελ), 16 υπερμεθυλιωμένων γονίδια (μεσαίο πάνελ) ή 14 μεθυλιωμένος γονίδια (δεξιά πλευρά) , αντίστοιχα.

Η

Για να επικυρώσετε την υπόθεσή μας ότι

FOXM1

-orchestrated μια υπογραφή μεθυλίωσης που μιμείται ένα methylome καρκίνο, διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια (100 πιο μεθυλιωμένος και 100 πιο υπερμεθυλιωμένων) επελέγησαν αρχικά για την αντίστροφη συγκρίσεις μεταξύ NOKG και NOKF /SCC15, και ένα υποσύνολο των 30 συναίνεσης γονιδίων, μοιράζονται μεταξύ των κυττάρων NOKF και SCC15, με αντίθετες κατάσταση μεθυλίωσης σε NOKG κύτταρα ελέγχου, στη συνέχεια προκρίθηκαν για περαιτέρω αναλύσεις (Σχήμα 3C). Αν αυτά υποψήφιος

FOXM1

επαγόμενη διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια ήταν πράγματι μια επιγενετική υπογραφή του καρκίνου, υποθέσαμε ότι οι ιστοί HNSCC όγκου θα πρέπει να διατηρήσει μια αντίστροφη

in vivo

mRNA υπογραφή έκφραση αυτών των υποψηφίων γονιδίων. Για να το επιβεβαιώσετε αυτό, πραγματοποιήσαμε απόλυτη qPCR να ποσοτικοποιηθεί κάθε ένα από τα 30 υποψήφια γονίδια: i, τα σχετικά επίπεδα του προαγωγέα DNA μεθυλίωση του κάθε γονιδίου σε NOKG vs κύτταρα NOKF, και, ii, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA σε ζεύγη κανονικό περιθώριο vs HNSCC δείγματα ιστού όγκου. Συσχέτιση παλινδρόμησης αναλύσεις των 30 υποψηφίων γονιδίων έδειξε μια αντίστροφη σχέση (R

2 = 0,62? Σχήμα 3D, αριστερό πάνελ). Μεταξύ γονιδιακή έκφραση των ιστών HNSCC όγκου και μεθυλίωσης του DNA των κυττάρων NOKF

Είναι ενδιαφέρον, μεθυλιωμένος γονίδια έδειξε σημαντικά υψηλότερη μορφή αντίστροφης συσχέτισης (R

2 = 0,92? Σχήμα 3D, δεξί πάνελ) από τις υπερμεθυλιωμένων γονίδια (R

2 = 0,27? Σχήμα 3D, μεσαίο πλαίσιο). Αυτό υποδηλώνει ότι υπομεθυλίωση υποκινητής επέδειξαν ισχυρότερη επίδραση επί μεταγραφική ενεργοποίηση σε σύγκριση με υπερμεθυλίωση προαγωγού στην μεταγραφική καταστολή. Μια εξήγηση μπορεί να είναι ότι μπορεί να είναι ευκολότερο να ανιχνευθούν μεταγραφική ενεργοποίηση εξής υπομεθυλίωση υποκινητή, σε αντίθεση με την ανίχνευση μεταγραφικής καταστολής που εξαρτάται από το αν τα γονίδια ενεργοποιούνται πριν από την υπερμεθυλίωση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η υπογλυκαιμία /υπερμεθυλίωση μπορεί να μην είναι μια απλή συμμετρική διακόπτη on /off για γονιδιακή μεταγραφή. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για να οριοθετηθούν τα μεταγραφικούς μηχανισμούς που ρυθμίζονται από το DNA υποστηρικτής μεθυλίωσης /απομεθυλίωσης.

Από τη λίστα των 15 νέων

FOXM1

επαγόμενη υπερμεθυλίωση γονίδια (Σχήμα 3D, μεσαίο πάνελ), 4 γονίδια (

C6orf136

,

MGAT1

,

NDUFA10

και

PAFAH1B3

) είχαν σημαντικά μειωτικά επίπεδα έκφρασης του mRNA σε όγκους HNSCC, μαζί με το θετικό μάρτυρα

p16

ΙΝΚ4 &

(

CDKN2A

). Μικρή δημοσιευμένες πληροφορίες γονίδιο ήταν διαθέσιμη για

C6orf136

.