Αφηρημένο

Η αντίσταση στη χημειοθεραπεία παραμένει ένα σημαντικό εμπόδιο στη θεραπεία του καρκίνου. Η μελέτη αυτή αποσκοπεί να αξιολογηθεί η μοριακός μηχανισμός και η αποτελεσματικότητα του Honokiol στην επαγωγή της απόπτωσης και την ενίσχυση χημειοθεραπεία με πακλιταξέλη σε προ-κλινικές πολλαπλά φάρμακα ανθεκτικά μοντέλα (MDR) καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου γράμμωση προερχόμενο ανθρώπινο MDR (ΚΒ-8-5, ΚΒ-C1, KB-V1) και της γονικής ναρκωτικών ευαίσθητα καρκινικές κυτταρικές σειρές τους ΚΒ-3-1.

In vitro

αναλύσεις απέδειξαν ότι Honokiol αποτελεσματικά ανέστειλε πολλαπλασιασμό σε ΚΒ-3-1 κύτταρα και τα παράγωγα MDR (IC

50 κυμαίνονται 3,35 ± 0,13 μg /ml έως 2,77 ± 0,22 μg /ml), παρά τους σημαντικές διαφορές στην απόκριση στην πακλιταξέλη (IC

50 κυμαίνονται 1,66 ± 0,09 ng /ml έως 6560,9 ± 439,52 ng /ml). επαγόμενη Honokiol μιτοχόνδρια-εξαρτώμενη και θάνατο με τη μεσολάβηση υποδοχέων απόπτωση σε MDR κύτταρα ΚΒ, η οποία σχετίζεται με την αναστολή του EGFR-STAT3 σηματοδότησης και προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων στόχων STAT3. Συνδυασμένη θεραπεία με Honokiol και πακλιταξέλη επαυξημένης συνεργικά κυτταροτοξικότητα σε MDR κύτταρα ΚΒ, σε σύγκριση με τη θεραπεία με κάθε παράγοντα ξεχωριστά

in vitro

. Σημαντικά, η συνδυασμένη θεραπεία ανέστειλε σημαντικά

in vivo

ανάπτυξη του ΚΒ-8-5 όγκων σε ένα υποδόριο μοντέλο. ιστοί όγκου από την ομάδα συνδυασμού παρουσίασαν σημαντική αναστολή της έκφρασης Ki-67 και μια αύξηση στην TUNEL-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η στόχευση αντίσταση σε πολλά φάρμακα χρησιμοποιώντας Honokiol σε συνδυασμό με φάρμακα χημειοθεραπείας μπορούν να παρέχουν νέες θεραπευτικές δυνατότητες

Παράθεση:. Wang Χ, Beitler JJ, Wang Η, Lee MJ, Huang W, Koenig L, et al. (2014) Honokiol Βελτιώνει Paclitaxel Αποτελεσματικότητα σε Multi-Drug Resistant Human μοντέλο καρκίνου μέσω της επαγωγής της απόπτωσης. PLoS ONE 9 (2): e86369. doi: 10.1371 /journal.pone.0086369

Επιμέλεια: Devanand Sarkar, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 8 Δεκεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) μέσω μιας κεφαλής και τραχήλου βραβείο σπορίων (P50CA128613), Ρ30 CA138292 και AR47901. D.M.S., J.J.B. και Z.G.C. Θα ήθελα επίσης να αναγνωρίσω τη Γεωργία Συνασπισμό του Καρκίνου για την υποστήριξη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. A.R.M. Ruhul Amin σήμερα είναι μέλος PLoS ONE Συντακτική Επιτροπή. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Hyung Ju Γ Shin σήμερα απασχολείται από μια εμπορική εταιρεία Quest Diagnostics, Atlanta. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η χημειοθεραπεία παραμένει μία από τις βασικές επιλογές θεραπείας για πολλούς τύπους καρκίνου, ωστόσο, μια σημαντική ποσοστό των ασθενών αναπτύσσουν αντοχή φαρμάκου κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας, και αναπόφευκτα μεταβαίνει χωρίς θεραπεία [1], [2]. Παρά την αξιοσημείωτη πρόοδο στην ανάπτυξη φαρμάκων, πακλιταξέλη με ευρύ αντικαρκινικό φάσμα της έχει στερεοποιηθεί τη διακοπή της δυναμικής μικροσωληνίσκων ως μία από τις πιο αποτελεσματικές αντικαρκινικές στρατηγικές που χρησιμοποιούνται σήμερα. Εντούτοις, η εμφάνιση των καρκινικών κυττάρων ανθεκτικών σε φάρμακο έχει περιορίσει σε μεγάλο βαθμό την κλινική αποτελεσματικότητα της. Συνεπώς, είναι επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τη μείωση ή την αντιμετώπιση χημειοαντίσταση στον καρκίνο. Διάφορες προσεγγίσεις για την ενίσχυση της chemoresponse σε χημειοθεραπεία μοντέλα καρκίνο έχουν εξερευνηθεί, περιλαμβανομένων εκείνων που συνδυάζουν τα φυσικά προϊόντα ή ενώσεις με πακλιταξέλη ή άλλα τυποποιημένα αντιδραστήρια χημειοθεραπείας.

Honokiol είναι ένα φυσικό συστατικό που απομονώνεται από το φλοιό του δέντρου magnolia [2], [3], η οποία έχει παραδοσιακά χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία των διαταραχών άγχους που σχετίζονται με το πεπτικό και καταγγελιών [2], [4]. Είναι ενδιαφέρον, Honokiol εμφάνισαν επίσης ισχυρή αντικαρκινική δραστηριότητα [5], [6], [7] και περαιτέρω βελτιωμένα συμβατικά χημειοθεραπείες σε μια ποικιλία προκλινικά μοντέλα καρκίνου στον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένης της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας [3], ο καρκίνος του προστάτη [8] και το πολλαπλό μυέλωμα [9]. Αυτά τα σχετικά ευρείες αντικαρκινικές ικανότητες και ευνοϊκό προφίλ ασφάλειας κάνουν Honokiol μια ελκυστική συμπληρωματική θεραπεία για την ενίσχυση της συμβατικής χημειοθεραπείας σε κλινικό περιβάλλον.

Η υπερέκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών είναι ένα υποκείμενο μηχανισμό που συμβάλλει στην απόκτηση θεραπευτικών αντίστασης, υποτροπής και μετάσταση. Ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι τρία αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, δηλαδή, survivin, Mcl-1, και Bcl-2, μπορεί να σχετίζεται άμεσα με την αντίσταση του φαρμάκου στον καρκίνο [10], [11]. Η αναστολή αυτών των κρίσιμων παραγόντων επιβίωσης έχει αποδειχθεί για να προκαλέσει απόπτωση και ευαισθητοποιούν τα καρκινικά κύτταρα σε θεραπεία ναρκωτικών [5] – [11]., Έτσι αυτή η προσέγγιση μπορεί να υπόσχεται στην υπερνίκηση χημειοαντίσταση και τη βελτίωση της χημειοθεραπείας στον καρκίνο του

Με τη χρήση μια σειρά από γράμμωσης που προέρχεται KB ανθρώπινο καρκίνο πλακωδών κυτταρικές σειρές που εμφανίζουν διακριτά ευαισθησίες σε αγωγή με πακλιταξέλη, αποδείξαμε ότι Honokiol θα μπορούσε να προκαλέσει αποτελεσματικά απόπτωση σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) των καρκινικών κυττάρων. Μηχανιστικές μελέτες έδειξαν ότι Honokiol αναστέλλει την EGFR-STAT3 μονοπατιού σηματοδότησης, και καταστέλλει την έκφραση survivin και άλλους παράγοντες επιβίωσης. Δείξαμε περαιτέρω το

in vivo

αποτελεσματικότητα της Honokiol στη θεραπεία του καρκίνου MDR και την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας πακλιταξέλη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Η KB- 3-1 και τα παράγωγα κυτταρικές σειρές της MDR ήταν γενναιόδωρα από τον Dr. Michael M. Gottesman (NCI, ΝΙΗ, Bethesda, MD) και έχουν χαρακτηριστεί στο παρελθόν [12]. ΚΒ-3-1 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. ΚΒ-8-5 και ΚΒ-C1 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 0.01 και 1 μg /ml κολχικίνη αντίστοιχα. κύτταρα ΚΒ-V1 διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδούς και 1 μg /ml βινμπλαστίνη. Για την εξάλειψη των επιπτώσεων της κολχικίνης ή βινμπλαστίνης σε αποτέλεσμα πείραμα, ανθεκτικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για μία εβδομάδα πριν από κάθε πείραμα.

ΟβΙΙ Growth Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων σε τετράδα. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα φάρμακα προστέθηκαν σε διάφορες κλίμακες συγκέντρωσης σαν απλούς παράγοντες ή σε δύο-φαρμάκου συνδυασμούς και στη συνέχεια επωάστηκαν για 72 ώρες. Η κλίμακα για Honokiol ήταν από το 0,625 έως 20 μg /ml και για τις τέσσερις κυτταρικές σειρές. Για την πακλιταξέλη, η περιοχή συγκεντρώσεων ήταν 0,19 έως 97,5 ng /ml, 3,02 ng /ml έως 3,12 μg /ml, 12,1 ng /ml έως 25,0 μg /ml, και 97.5 ng /ml έως 100 μg /ml για ΚΒ-3-1 , ΚΒ-8-5, ΚΒ-C1, και ΚΒ-V1 κύτταρα, αντίστοιχα. αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων μετρήθηκε με προσδιορισμό της κυτταρικής πυκνότητας με την δοκιμασία σουλφοροδαμίνης Β. Το ποσοστό της αναστολής προσδιορίστηκε με σύγκριση της κυτταρικής πυκνότητας σε κύτταρα αγωγή με φάρμακο με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Η απόπτωση Ανάλυση

Η απόπτωση αναλύθηκε σε τέσσερις κυτταρικές σειρές. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Honokiol, πακλιταξέλη, ή συνδυασμός τους, όπως υποδεικνύεται στις λεζάντες σχήμα, επεξεργασία με θρυψίνη, και πλύθηκαν σε ψυχρό 1 × PBS. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό σύνδεσης 1 × αννεξίνης (BD PharMingen), και στη συνέχεια βάφονται με Annexin V-φυκοερυθρίνη (αννεξίνης V-ΡΕ? BD PharMingen) και 7-AAD (BD PharMingen) επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα βαμμένα δείγματα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο ενεργοποιούμενη με φθορισμό (FACS) διαμέτρημα πάγκου κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). λογισμικού FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση απόπτωσης. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές ανεξάρτητα.

ανοσοαποτύπωσης

Τριάντα μικρογραμμάρια πρωτεΐνης από εκχυλίσματα ολικού κυττάρου ή κυτταροπλασματικές και τις μιτοχονδριακές κλάσματα ποσοτικοποιήθηκαν, διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Αφού αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Ποντικού αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (Trevigen, Gaithersburg, MD) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης δείγματος. Ανοσοχρωματίστηκε ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια kit (Amersham, Buckinghamshire, UK). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές.

In vivo

αντι-όγκου αποτελεσματικότητα Δοκιμασία

Το πείραμα ζώων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου Emory. ΚΒ-8-5 κύτταρα (5 × 10

5) ενέθηκαν υποδορίως σε 4-5 θηλυκά γυμνά ποντίκια εβδομάδων (αθυμικούς

ηυ /ηυ

, Taconic ΝΥ). Όταν οι όγκοι είχαν αναπτυχθεί σε περίπου 100 mm

3, οι ποντικοί χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες (η = 7 ή 8) με τρόπο που να ελαχιστοποιηθεί το βάρος και το μέγεθος του όγκου διαφορές μεταξύ των ομάδων: ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20% ενδολιπίδιο ( Baxter Healthcare), ομάδα Honokiol (1,0 mg /ποντικό ή 50 mg /kg), ομάδα πακλιταξέλη (20 mg /kg), και Honokiol (1,0 mg /ποντικό ή 50 mg /kg) συν πακλιταξέλη (20 mg /kg) ομάδα συνδυασμού . Honokiol διαλύθηκε σε 100% αιθανόλη και αναμιγνύεται με 20% Intralipid σε (ν /ν) αναλογία 1:14. Honokiol χορηγήθηκε στα ποντίκια 3 φορές την εβδομάδα σε δόσεις 1,0 mg /ποντίκι (ή 50 mg /kg) μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης. Η πακλιταξέλη χορηγήθηκε στους ποντικούς μία φορά την εβδομάδα σε 20 mg /kg μέσω ένεσης στην ουραία φλέβα. Η θεραπεία συνεχίστηκε για 4 εβδομάδες. Το σωματικό βάρος και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκαν τρεις φορές την εβδομάδα. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο:

V

=

//6 × μεγαλύτερη διάμετρο χ (μικρότερη διάμετρο) [13]. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 4 εβδομάδες μετά την έναρξη της θεραπείας. Tumor και οργάνων ιστούς (ήπαρ, καρδιά, πνεύμονα, σπλήνα, και νεφρό) συλλέχθηκαν για Η &?. Ε χρώση και ανοσοχρώση αναλύσεις

Ανοσοϊστοχημεία και TUNEL Δοκιμασία

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση για χρώση Κί-67 επί εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό ξενομοσχεύματος ποντικού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Κύτταρα θετικά για χρώση Κί-67 μετρήθηκαν και το ποσοστό των θετικών κυττάρων υπολογίστηκε. Ένας μέσος όρος των αναγνώσεων 8 χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση.

δοκιμασία TUNEL διεξήχθη με ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας τα ίδια δείγματα ως ανωτέρω, σύμφωνα με τη διαδικασία που προβλέπεται από τον κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων ανάλυσης, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων και τον αριθμό θετικών κυττάρων στην ίδια περιοχή μετρήθηκαν για πέντε τυχαίες περιοχές? το αποτέλεσμα παρουσιάστηκε ως μέση αναλογία του αριθμού των κυττάρων θετικών έναντι του συνολικού αριθμού των κυττάρων.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα της θεραπείας των κυττάρων στο

in vitro

δοκιμασία κυτταροτοξικότητα εκτιμήθηκε με τη χρήση του μαθητή

t-test

. Για

in vivo δοκιμασία

αποτελεσματικότητα κατά του όγκου, ένα λογαριθμικό-γραμμικό μεικτό μοντέλο με τυχαία τομής χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της σημασίας των όγκων μέσου όγκου μεταξύ κάθε ομάδας. Η στατιστική σημαντικότητα της επίδρασης της θεραπείας σε μικροσωληνίσκους, απόπτωση, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ιστούς όγκων ξενομοσχεύματος εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Kruskal-Wallis (μονόδρομη ΑΝΟνΑ).

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική σε όλες τις αναλύσεις

Αποτελέσματα

Honokiol Μειώνει Βιωσιμότητα και επάγει την απόπτωση στα ανθρώπινα MDR καρκινικά κύτταρα

Το MDR καρκινικές κυτταρικές σειρές ΚΒ-8-5, ΚΒ-C1 και ΚΒ-V1 προήλθαν από ευαίσθητα σε φάρμακο ομόλογό τους ΚΒ-3-1 κύτταρα και έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως ένα κλινικά σχετικό μοντέλο για τη μελέτη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα [14] , [15]. Αυτά τα κύτταρα εμφάνισαν διακριτή ευαισθησίες σε αγωγή με πακλιταξέλη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1α, 1β, το IC

50 τιμές σε κυτταρικές γραμμές MDR (ΚΒ-8-5:26.73 ± 1,01 ng /ml, ΚΒ-C1:195.0 ± 11,11 ng /ml, και ΚΒ-V1:6560.0 ± 439.52 ng /ml) αυξήθηκαν κατά 16-, 117- και 4000 φορές, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την γονική κυτταρική σειρά ΚΒ-3-1 (1,66 ± 0,09 ng /ml). Συνεπής με ανθεκτικές φαινότυπο τους, κυτταρικές γραμμές MDR εκφράζουν ουσιαστικά την κλασική δείκτη MDR P-glycoprotien (Σχ. 1β). Είναι ενδιαφέρον ότι, μια 72 h-θεραπεία με Honokiol μείωσε αποτελεσματικά την βιωσιμότητα των κυττάρων MDR (ΚΒ-8-5:3.22 ± 0.14 μg /ml, ΚΒ-C1:3.04 ± 0.30 μg /ml, ΚΒ-V1:2.77 ± 0.22 μg /ml), με IC

50 τιμές παρόμοιες με εκείνες του ΚΒ-3-1 κύτταρα (3,35 ± 0,13 μg /ml) (Σχ. 1γ, 1δ). ανάλυση απόπτωση έδειξε περαιτέρω ότι Honokiol επαγόμενη απόπτωση σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1ε). 24 ώρες μετά Honokiol θεραπεία, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ΚΒ-3-1 ήταν 11,9 ± 3,9% (5 μg /ml του Honokiol), 32,9 ± 0,9% (10 μg /ml), και 47,1 ± 2,7% (15 μg /ml)? το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σε 18,4 ± 2,1%, 51,5 ± 0,6%, και 65,3 ± 1,6%, αντίστοιχα, μετά από 48 h-θεραπεία, η οποία αυξήθηκε περαιτέρω σε 72 ώρες. Honokiol επάγεται επίσης ένα παρόμοιο βαθμό απόπτωσης σε άλλα κύτταρα MDR, συμπεριλαμβανομένων των ΚΒ-8-5, ΚΒ-C1 και ΚΒ-V1 (Εικ. 1ε). Για παράδειγμα, μια θεραπεία 48 ώρες με 10 μg /ml του Honokiol οδήγησε σε απόπτωση σε 51,5% του ΚΒ-3-1 κύτταρα, 52,7% του ΚΒ-8-5 κύτταρα, 52,9% των κυττάρων ΚΒ-C1 και 67,6% του κύτταρα ΚΒ-V1, αντίστοιχα. Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με τη δοκιμασία βιωσιμότητας (Σχ. 1γ, 1δ), και προτείνουν ότι Honokiol είναι ένας ισχυρός κυτταροτοξικός παράγοντας σε κύτταρα ΚΒ ανεξάρτητα από διαφορετικές ευαισθησίες paclitaxel τους.

(a, b) επίδραση αναστολής της ανάπτυξης του πακλιταξέλη και η έκφραση της p-gp στην ΚΒ-3-1, ΚΒ-8-5, ΚΒ-C1 και ΚΒ-V1 κύτταρα. Το IC

50 τιμές του paclitaxel σε ανθεκτικά στα φάρμακα ΚΒ-8-5, ΚΒ-C1 και ΚΒ-V1 κύτταρα αυξήθηκαν κατά 16-, 117- και 4000 φορές αντίστοιχα, σε σύγκριση με τη γονική ΚΒ-3-1 κύτταρα . (C, d) Growth αναστολή επίδραση του Honokiol σε ΚΒ-3-1, ΚΒ-8-5, ΚΒ-C1 και ΚΒ-V1 κύτταρα. Τα IC

50 τιμές Honokiol σε ανθεκτικά στα φάρμακα ΚΒ-8-5, ΚΒ-C1 και τα κύτταρα ΚΒ-V1 ήταν παρόμοια με εκείνη σε γονικά κύτταρα ΚΒ-3-1. (Ε) Honokiol επάγει απόπτωση σε κύτταρα ΚΒ. ΚΒ-3-1 και ΚΒ-8-5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5, 10, 15 μg /ml του Honokiol για 24, 48, και 72 ώρες. ΚΒ-C1 και ΚΒ-V1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Honokiol για 48 ώρες. Η απόπτωση μετρήθηκε με χρώση αννεξίνης V-φυκοερυθρίνη. * Υποδεικνύει στατιστικά σημαντικές τιμές ρ (*, έναντι του ελέγχου, σ & lt? 0,05? **, Έναντι 5 μg /ml, p & lt? 0,05).

Η

Honokiol Προκαλεί Mitochondria- και Θάνατος Receptor (DR) – εξαρτώμενη απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

Ερευνήσαμε το μηχανισμό της Honokiol επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα ΚΒ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2a-c, θεραπεία Honokiol επαγόμενη τη διάσπαση της PARP και κασπάσης-3 σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο σε όλες τις εξετασθείσες ΚΒ κύτταρα, υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση σημάτων απόπτωσης. Οι αναλύσεις στυπώματος Western βρήκαν ότι Honokiol όχι μόνο προκάλεσε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

στο κυτταρόπλασμα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2d), αλλά επίσης αύξησε την έκφραση του DR5 (εικ. 2d), μία επιφάνεια υποδοχέας για προ-αποπτωτική συνδέτες Apo2L /TRAIL. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι Honokiol θα μπορούσε ταυτόχρονα να ενεργοποιήσετε μιτοχόνδρια-εξαρτώμενη (εγγενής) απόπτωση και DR-εξαρτώμενη (εξωγενής) απόπτωση σε κύτταρα ΚΒ.

(α) ΚΒ-3-1 κύτταρα και (β) KB -8-5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5, 10, 15 μg /ml του Honokiol για 24, 48 ώρες. Πλήρους μήκους και διασπασμένη PARP, διασπασμένη κασπάση-3 και β-ακτίνης ως ένας έλεγχος φόρτωσης ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας λύματα ολόκληρων κυττάρων. (Γ) ΚΒ-C1 και τα κύτταρα ΚΒ-V1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5, 10, 15 μg /ml του Honokiol για 48 ώρες. Διασπασμένη PARP ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων. (Δ) Άνω πάνελ, ΚΒ-8-5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5, 10, 15 μg /ml του Honokiol για 48 ώρες. Κυτταροπλασματικά και μιτοχονδριακή κλάσματα διαχωρίστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με κυτόχρωμα c αντίσωμα (Cyto C). COX4 (α μιτοχονδριακή πρωτεΐνη) χρησιμοποιήθηκε για να δείξει την αποτελεσματικότητα του κυττάρου κλασματοποίησης. Κάτω πάνελ, ΚΒ-8-5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5, 10, 15 μg /ml του Honokiol για 24 και 48 ώρες. DR5 ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, και αντιπροσωπευτικά δεδομένα παρουσιάζονται.

Η

Honokiol Αναστέλλει EGFR-STAT3 Σηματοδοσίας σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του

Το μονοπάτι EGFR-STAT3 σηματοδότησης παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης και επιβίωσης στα καρκινικά κύτταρα. Εμείς ερεύνησε τις επιπτώσεις της Honokiol σε διάφορα βασικά στοιχεία του μονοπατιού σηματοδότησης EGFR-STAT3. ΚΒ-3-1 και ΚΒ-8-5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Honokiol (5 μg /ml) για 0,5, 1, και 2 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας ολικό κυτταρολύματα αποκάλυψε μια σημαντικά μειωμένη φωσφορυλίωση του EGFR σε Try1173, ένας δείκτης ενεργοποιημένων EGFR (Εικ. 3α). Εξετάσαμε περαιτέρω την κατάσταση φωσφορυλίωσης της STAT3 (Tyr705), Akt (Ser473), και ERK (Thr202 /Tyr204), τρεις γνωστούς EGFR κατάντη συνιστώσες σηματοδότησης. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία Honokiol ταχέως ανέστειλε phosphorlylation της STAT3 και ΑΚΤ, αλλά δεν είχε καμία επίδραση επί της φωσφορυλίωσης ERK (Εικ. 3αβ). Για να εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον το επίπεδο έκφρασης του EGFR και πρωτεϊνών προς τα κάτω στόχος του αναστέλλονται επίσης από Honokiol κατεργασία (5 μg /ml), υποβάλλαμε σε αγωγή κυττάρων για 24, 48, και 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3CD, θεραπεία Honokiol ανέστειλε πρωτεΐνη έκφραση του EGFR, STAT3, ERK, και ΑΚΤ σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο με ΚΒ-3-1 και ΚΒ-8-5 κύτταρα. Παρομοίως, η φωσφορυλίωση αυτών των πρωτεϊνών ήταν μειωμένη κατά Honokiol θεραπεία (Εικ. 3CD). Σταθερά, τα επίπεδα έκφρασης των τριών γνωστών γονιδίων στόχων STAT3, δηλαδή, survivin, Bcl-2 και Mcl-1, μειώθηκαν δραματικά μετά από αγωγή Honokiol (Σχ. 3e).

ΚΒ-3-1 και KB- 8-5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μg /ml του Honokiol για μικρό χρονικό διάστημα (0,5, 1, ή 2 ώρες) ή για μεγάλο χρονικό διάστημα (24, 48, ή 72 ώρες). Λύματα ολόκληρων κυττάρων ανοσοστυπώθηκαν για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. Η επίδραση της Honokiol σε πρώιμα χρονικά σημεία: (α) φωσφορυλίωση του EGFR και STAT3? (Β) Honokiol μειώνει τη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ και ERK. Η επίδραση της Honokiol σε όψιμους χρονικά σημεία: (γ) φωσφορυλίωση και έκφραση του EGFR και STAT3? (Δ) φωσφορυλίωση και την έκφραση των ΑΚΤ και ERK? (Ε) την έκφραση του survivin, Bcl-2, Mcl-1. (Στ) Honokiol αναστέλλει την EGFR μονοπάτι σηματοδότησης και ρυθμίζει προς τα κάτω γονιδίων-στόχων STAT3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. ΚΒ-3-1 και ΚΒ-8-5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5, 10, 15 μg /ml του Honokiol για 48 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων ανοσοστυπώθηκαν για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. (Ζ) Honokiol αναστέλλει την EGFR-STAT3 μονοπάτι στην ΚΒ-C1 και τα κύτταρα ΚΒ-V1. ΚΒ-C1 και ΚΒ-V1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5, 10, 15 μg /ml του Honokiol για 48 ώρες. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, και αντιπροσωπευτικά δεδομένα παρουσιάζονται.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε την δοσοεξαρτώμενη απόκριση του EGFR-STAT3 σηματοδότησης σε θεραπεία Honokiol στην ΚΒ-3-1 και ΚΒ-8 -5 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3f, η έκφραση και η φωσφορυλίωση του EGFR (Try1173) μειώθηκαν παρουσία 5 ή 10 μg /ml του Honokiol (48 ώρες), και περαιτέρω μείωση σε δόση 15 μg /ml του Honokiol (Σχ. 3f). Σταθερά, η έκφραση και /ή φωσφορυλίωση του EGFR συστατικών κατάντη σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του ΕΚΚ, Akt, STAT3, survivin, Bcl-2 και Mcl-1, επίσης ανέστειλε δραματικά με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 3στ). Μια παρόμοια επίδραση της Honokiol επί EGFR-STAT3 σηματοδότηση παρατηρήθηκε επίσης και στις δύο ΚΒ-C1 και τα κύτταρα ΚΒ-V1 (Σχ. 3G). Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, μια ανάλυση RT-PCR διαπιστώθηκε ότι Honokiol αναστολή της survivin έκφρασης μπορεί να περιλαμβάνει την καταστολή της μεταγραφής survivin σε επίπεδο mRNA (Σχήμα S1).

Honokiol Ενισχύει την in vitro κυτταροτοξικότητα της πακλιταξέλης σε καρκινικά κύτταρα MDR

Ερευνήσαμε κατά πόσο η αναστολή της survivin, Bcl-2 και Mcl-1 με Honokiol μπορούσε ευαισθητοποιούν MDR καρκινικά κύτταρα σε συμβατική χημειοθεραπεία όπως palictaxel. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, 24-h αγωγή είτε με Honokiol (5 μg /ml) ή paclitaxel (450 ng /ml) είχε ως αποτέλεσμα ≤20% απόπτωσης σε κύτταρα ΚΒ-C1, ενώ η συνδυασμένη θεραπεία χρησιμοποιώντας τόσο Honokiol και paclitaxel, οδήγησε σε περίπου 30% της απόπτωσης . Επιπλέον, στις 48 ώρες και 72 ώρες χρονικά σημεία, η συνδυασμένη θεραπεία πιο αποτελεσματικά επαγόμενη απόπτωση (76% και 86%, αντίστοιχα) σε κύτταρα ΚΒ-C1, είτε από μεμονωμένο παράγοντα (≤25%) ή τον έλεγχο του οχήματος. Σταθερά, η συνδυασμένη θεραπεία ήταν πιο αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης, είτε από μονοθεραπεία σε MDR ΚΒ-8-5 και ΚΒ-V1 κύτταρα (Εικ. 4). Χρησιμοποιώντας ΚΒ-8-5 κύτταρα ως ένα παράδειγμα, ένας δείκτης συνδυασμού (CI) δοκιμασία επιβεβαίωσε τη συνεργική επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας με Honokiol και πακλιταξέλη για τη μείωση της βιωσιμότητας των καρκινικών κυττάρων MDR (Πίνακας S1).

(α ) ΚΒ-8-5, (β) ΚΒ-C1, και (γ) κύτταρα ΚΒ-V1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μg /ml του Honokiol, πακλιταξέλη (15 ng /ml για ΚΒ-8-5, 450 ng /ml για ΚΒ-C1, και 6 μg /ml για ΚΒ-V1), ή ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24, 48 και 72 ώρες. Η απόπτωση μετρήθηκε. * Υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική τιμές ρ (*, συνδυασμός έναντι Honokiol, ρ & lt? 0,05? **, Συνδυασμός έναντι paclitaxel, ρ & lt? 0,05). Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Η

ανάλυση κηλίδος Western περαιτέρω βρεθεί ότι η συνδυασμένη θεραπεία με Honokiol και πακλιταξέλη ήταν πιο αποτελεσματικό από ό, τι είτε μόνες στην επαγωγή της διάσπασης της κασπάσης-3, PARP παράγοντα, και η απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

από μιτοχόνδρια στην ΚΒ-8-5 κύτταρα (Εικ. 5α, 5β). Μια θεραπεία 48 ώρες μόνο με Honokiol ή τον συνδυασμό Honokiol και πακλιταξέλης μείωσε την έκφραση και την φωσφορυλίωση του EGFR, όπως επίσης και άλλα βασικά εξαρτήματα EGFR-STAT3 σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου STAT3, ρ-STAT3 (Tyr705), ΕΚΚ, ρ-ΕΚΚ ( Thr202 /Tyr204), Akt και ρ-Ακί (Ser473). Η έκφραση της πρωτεΐνης του survivin, Bcl-2 και Mcl-1 επίσης μειώθηκε αισθητά μετά την επεξεργασία με Honokiol ή τον συνδυασμό Honokiol και πακλιταξέλη. Είναι ενδιαφέρον, όμως, η θεραπεία με paclitaxel μόνο δεν είχε σημαντική επίδραση επί αυτών των συστατικών σηματοδότησης ή γονίδια στόχους του EGFR-STAT3 οδού (Εικ. 5c).

(α) Honokiol ενισχύει προκαλούμενη paclitaxel PARP και caspase- 3 διάσπαση στην ΚΒ-8-5 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μg /ml του Honokiol, 15 ng /ml paclitaxel, ή ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων για 24, 48 και 72 ώρες. Πλήρους μήκους και διασπασμένη PARP, διασπασμένη κασπάση-3 και β-ακτίνης ως ένας έλεγχος φόρτωσης ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας λύματα ολόκληρων κυττάρων. (Β) Honokiol ενισχύει προκαλούμενη paclitaxel απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

στο κυτταρόπλασμα σε ΚΒ-8-5 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μg /ml του Honokiol, 15 ng /ml paclitaxel, ή του συνδυασμού για 48 ώρες. Κυτταροπλασματικά και μιτοχονδριακή κλάσματα διαχωρίστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με κυτόχρωμα c αντίσωμα (Cyto C). COX4 (α μιτοχονδριακή πρωτεΐνη) χρησιμοποιήθηκε για να δείξει την αποτελεσματικότητα του κυττάρου κλασματοποίησης. (Γ) Honokiol αναστέλλει την EGFR-STAT3 μονοπατιού σηματοδότησης και ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του γονιδίου-στόχου STAT3 στην ΚΒ-8-5 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μg /ml του Honokiol, 15 ng /ml paclitaxel, ή του συνδυασμού για 48 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων ανοσοστυπώθηκαν για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. (Δ) Η πακλιταξέλη προκαλεί μικροσωληνίσκων πολυμερισμού στην ΚΒ-8-5 κύτταρα. Η επαγόμενη από φάρμακα σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση της πολυμερούς μικροσωληνίσκων μάζα με αποτέλεσμα ομαδοποίηση παρατηρήθηκε κατά την αγωγή με το paclitaxel και το συνδυασμό? Ωστόσο, Honokiol από μόνη της δεν ήταν αποτελεσματική στην σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων (μεγέθυνση 400x). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μg /ml του Honokiol, 15 ng /ml paclitaxel, ή του συνδυασμού για 24 ώρες. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, και τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα παρουσιάζονται.

Η

Η πακλιταξέλη εξασκεί αντικαρκινική δραστικότητα του με σύνδεση προς τουμπουλίνη μέσα στον αυλό του μικροσωληνίσκων, με αποτέλεσμα μικροσωληνίσκων πολυμερισμό, τη σταθεροποίηση και διαταραχή των μικροσωληνίσκων δυναμική, προκαλώντας μιτωτική σύλληψη και την απόπτωση στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Να διερευνήσει κατά πόσον Honokiol μπορεί να ενισχύσει την επαγόμενη από την πακλιταξέλη μικροσωληνίσκων πολυμερισμό και σταθεροποίηση, εξετάσαμε την επίδραση της κάθε θεραπείας σε μικροσωληνίσκους στην ΚΒ-8-5 και ΚΒ-C1 κύτταρα. Η επαγόμενη από φάρμακα σταθεροποίηση του μεσόφαση μικροσωληνίσκων των κυττάρων όγκου », όπως αποδεικνύεται από την αύξηση σε πολυμερές μικροσωληνίσκων μάζα με αποτέλεσμα ομαδοποίηση, παρατηρήθηκε κατά την αγωγή με το paclitaxel και το συνδυασμό? Ωστόσο, Honokiol από μόνη της δεν ήταν αποτελεσματικό στο σχηματισμό δεσμίδων μικροσωληνίσκων (Εικ. 5d). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Honokiol ενισχύει το

in vitro

κυτταροτοξικότητα της πακλιταξέλης σε καρκίνους MDR, μπορεί να είναι μέσω της αναστολής του EGFR-STAT3 σηματοδότηση επιβίωσης.

Honokiol Ενισχύει την in vivo αποτελεσματικότητα της πακλιταξέλης σε MDR ξενομοσχεύματος καρκίνου όγκοι

Αξιολογήσαμε την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της Honokiol, πακλιταξέλη, και ο συνδυασμός τους στη θεραπεία του καρκίνου MDR στο μοντέλο ξενομοσχεύματος ΚΒ-8-5. Η θεραπεία συνεχίστηκε για 4 εβδομάδες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6α, σε μία δόση των 20 mg /kg μία φορά την εβδομάδα, μία ένεση 4 εβδομάδων του paclitaxel μόνο δεν αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη του ΚΒ-8-5 υποδόριοι όγκοι, σε σύγκριση με το έκδοχο ελέγχου (ρ = 0.917). Η θεραπεία με Honokiol μόνο (50 mg /kg, 3 φορές την εβδομάδα, μέσω ί.ρ.) ελαφρώς κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου, αν και η διαφορά δεν ήταν σημαντική (ρ = 0,194) (Σχ. 6α). Αντιθέτως, η θεραπεία συνδυασμού ανέστειλε δραματικά την ανάπτυξη του ΚΒ-8-5 όγκους, σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες (vs. μάρτυρα: ρ & lt? 0,0001? Εναντίον Honokiol: ρ = 0.036? Εναντίον πακλιταξέλη: p = 0,004). Ο μέσος όγκος του όγκου σε κάθε ομάδα θεραπείας στο τελικό σημείο ήταν 2585,4 ± 510,0 χιλιοστά

3 (έλεγχος), 1810,2 ± 483,2 χιλιοστά

3 (Honokiol), 2591,3 ± 726,2 χιλιοστά

3 (πακλιταξέλη) και 573,9 ± 146.1mm3 (συνδυασμός). Αντιπροσωπευτικά ποντίκια από κάθε ομάδα φαίνεται στο (Σχ. 6c). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Honokiol μπορούσε να ενισχύσει σημαντικά την αντικαρκινική δράση της πακλιταξέλης σε καρκινικούς όγκους MDR ξενομοσχεύματος.

(α) Η αύξηση του όγκου του ΚΒ-8-5 ξενομοσχεύματα ανεστάλη σημαντικά στην ομάδα συνδυασμού αγωγή σε σύγκριση με την ελέγχου (ρ & lt? 0,0001), Honokiol (p = 0,0356) και paclitaxel (p = 0.004) αγωγή ομάδες. Οι όγκοι των όγκων στο Honokiol (p = 0,1942) ομάδα στην οποία χορηγήθηκε και paclitaxel (p = 0,9165) ομάδα που έλαβε αγωγή δεν έδειξε σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο. βάρη (β) του σώματος των ποντικών σε όλες τις ομάδες. Τα σωματικά βάρη των ποντικών και στις τέσσερις ομάδες ήταν παρόμοιες. (Γ) Αντιπροσωπευτικά ποντίκι από κάθε ομάδα. (Δ) Η ιστοπαθολογική αναλύσεις κύρια όργανα (ήπαρ, σπλήνα, νεφρό, καρδιά και τους πνεύμονες) από την ομάδα ελέγχου και θεραπείας συνδυασμού. (Ε) Αποτελέσματα της θεραπείας συνδυασμού της Honokiol και πακλιταξέλη σε κυτταρική διαίρεση, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση in vivo. τμήματα ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη από διαφορετικές ομάδες θεραπείας ανοσοχρωματίστηκαν με αντι-ΚΙ-67 για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και χρώση TUNEL για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων. Τα αποπτωτικά κύτταρα φαίνονται με πράσινο χρώμα? DNA αντίθετα με DAPI σε μπλε (μεγέθυνση 200x).

Η

Είμαστε αξιολόγησε την συστηματική τοξικότητα της Honokiol, πακλιταξέλη και τη θεραπεία συνδυασμού στο μοντέλο ξενομοσχεύματος ΚΒ-8-5. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, τα βάρη σώματος των ποντικών και στις τρεις ομάδες θεραπείας ήταν παρόμοιες, υποδεικνύοντας μία αμελητέα τοξικότητα υπό τις συνθήκες δοκιμάστηκαν (Σχ. 6β). Σταθερά, ιστοπαθολογικές αναλύσεις δεν βρήκε καμία σημαντική βλάβη των ιστών στα κύρια όργανα (συμπεριλαμβανομένων του ήπατος, σπλήνα, τα νεφρά, την καρδιά και τους πνεύμονες) που συλλέγονται από κάθε ομάδα θεραπείας, συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας συνδυασμού (εικ. 6δ).

περαιτέρω εκτελείται ανάλυση IHC να εξεταστεί η

in vivo

επίδραση της κάθε θεραπείας για την έκφραση του γενικού βιοδεικτών όγκου. Η συνδυασμένη θεραπεία μείωσε σημαντικά το επίπεδο των ιστών του Ki-67 σε ΚΒ-8-5 όγκους (ποσοστό Ki-67 θετικών κυττάρων: 3,84 ± 1,10), σε σύγκριση με εκείνη στην ομάδα ελέγχου (11,96 ± 2,86? Ρ & lt? 0.001) , η ομάδα Honokiol (7,18 ± 2,07? p = 0,027), ή ομάδα πακλιταξέλη (11,68 ± 1,82? p & lt? 0.001) (Σχήμα 6e.). Σταθερά, δοκιμασία TUNEL αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση σε αποπτωτικά κύτταρα όγκου στους ιστούς του όγκου από την ομάδα συνδυασμού (7.07 ± 2.11) σε σύγκριση με εκείνη στην ομάδα ελέγχου (1,64 ± 0,17? Ρ & lt? 0.001), ομάδα Honokiol (5,45 ± 1,19? Ρ & lt? 0,05) και της ομάδας paclitaxel (3,97 ± 3,58? Ρ = 0,08) (Εικ 6ε).. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Honokiol θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει τον καρκίνο MDR κύτταρα σε πακλιταξέλη μέσω της επαγωγής της απόπτωσης.

Συζήτηση

Παρά την κάποια επιτυχία στην παροδικά έλεγχο των κλινικών συμπτωμάτων του καρκίνου με χημειοθεραπεία, ένα σημαντικό ποσοστό των ασθενών αναπτύσσουν «ανθεκτικότητα σε πολλά φάρμακα», ή MDR, και αναπόφευκτα προχωρήσει χωρίς θεραπεία. Είναι επιτακτική ανάγκη να αναπτυχθούν νέες στρατηγικές για την αντιμετώπιση MDR και να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την πιθανή χρησιμότητα της φυσικής ένωσης Honokiol στη θεραπεία του καρκίνου με χρήση στη χημειοθεραπεία προκλινικά μοντέλα. Έχουμε αποδείξει ότι Honokiol θα μπορούσε να προκαλέσει αποτελεσματικά τον κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα, ανεξάρτητα από την αντίσταση τους στη χημειοθεραπεία με πακλιταξέλη φάρμακο. Σημαντικά, Honokiol αύξησε σημαντικά την

in vivo

αποτελεσματικότητα του paclitaxel στην αναστολή της ανάπτυξης του καρκίνου του MDR σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος. Εμείς παρείχε περαιτέρω μοριακή στοιχεία που να υποστηρίζουν ότι η επαγόμενη απόπτωση Honokiol και ενισχυμένη χημειοθεραπεία μέσω της αναστολής του EGFR-STAT3 σηματοδότησης και προς τα κάτω ρύθμιση πολλών παραγόντων επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένου survivin, Bcl-2 και Mcl-1. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι Honokiol θα μπορούσε να είναι πολλά υποσχόμενη στην ευαισθητοποίηση καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία και τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας πακλιταξέλη σε κλινικό περιβάλλον.

EGFR υπερέκφραση έχει στενό δεσμό με την εξέλιξη του όγκου, θεραπευτικές αντίσταση και την κακή κλινική έκβαση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου και άλλους τύπους καρκίνου [16], [17], [18], [19]. Το EGFR μονοπάτι σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων των πολλαπλών καθοδικών πορειών του, όπως ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, ERK1 /2, JAK /STAT3 και mTOR /ΝΡ-κΒ, παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού, της επιβίωσης, της μετανάστευσης και χημειοαντίσταση σε καρκινικά κύτταρα. σηματοδότηση EGFR, ως εκ τούτου, επιδιώκεται ενεργά ως υποσχόμενο στόχο για την ανάπτυξη θεραπευτικών για ανθεκτική και επαναλαμβανόμενες καρκίνο κεφαλής και τραχήλου και άλλου τύπου καρκίνου χρησιμοποιώντας αναστολείς μικρού μορίου και αντισωμάτων [20], [21]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι Honokiol μειωθεί τόσο τη φωσφορυλίωση και την έκφραση του EGFR, γεγονός που υποδηλώνει μια αναστολή της σηματοδότησης EGFR που είναι συνεπής με προηγούμενες μελέτες [5]. Όπως αναμενόταν, η έκφραση και η δραστικότητα αρκετών σημαντικά συστατικά της σηματοδότησης EGFR, συμπεριλαμβανομένων των ΑΚΤ, ERK και STAT3, επίσης ανέστειλε σε χημειοθεραπεία κύτταρα ΚΒ κατά την κατεργασία Honokiol. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι ρυθμίζει προς τα κάτω Honokiol πρωτεΐνη θερμικού σοκ (HSP) 90 σε καρκινικά κύτταρα του μαστού [22]. HSP90 και άλλες πρωτεΐνες chaperone όπως HSP70 και Hsp40 ρυθμίζουν αποικοδόμηση EGFR. Διακοπή της /του κύκλου HSP90-αναδίπλωση HSP70 οδηγεί σε ubiquitinylation και την υποβάθμιση του EGFR [23] [24]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι Honokiol προάγει αποικοδόμηση EGFR και αναστέλλει EGFR σηματοδότηση μέσω μιας HSP90-εξαρτώμενο μηχανισμό.

Πολλά γονίδια στόχους STAT3, όπως survivin, Bcl-2 και Mcl-1, έχει την κεντρική ρόλους στη ρύθμιση