Αφηρημένο

Τα γλοιοβλαστώματα (GBM) μπορεί να περιέχει ένα μεταβλητό ποσοστό του ενεργού καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) σε θέση να αυτο-ανανέωσης, της συγκέντρωσης σε

+ νευρόσφαιρες CD133, και να αναπτύξουν ενδοκρανιακών όγκων που phenocopy οι αρχικές. Υποθέσαμε ότι nucleostemin μπορεί να συνεισφέρει στη βιολογία του καρκίνου αρχέγονων κυττάρων όπως τα κύτταρα αυτά έχουν κοινά χαρακτηριστικά με φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα. Εδώ αναφέρουμε ότι nucleostemin εκφράζεται σε GBM-ΚΕΠ που απομονώθηκαν από δείγματα ασθενών, και ότι η έκφρασή της, αντίθετα με ό, τι έχει περιγραφεί για τους απλούς βλαστικά κύτταρα, δεν εξαφανίζεται όταν τα κύτταρα διαφοροποιούνται. Η σημασία της nucleostemin έκφρασης στο ΚΕΠ αντιμετωπίστηκε με τη στόχευση των αντίστοιχων mRNA χρησιμοποιώντας lentivirally μετάγονται RNA μικρή φουρκέτα (shRNA). Με τον τρόπο αυτό, βρήκαμε μια off-στόχο nucleostemin RNAi (shRNA22) που καταργεί τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση σε GBM-ΚΕΠ. Επιπλέον, με την παρουσία του shRNA22, GBM-ΚΕΠ απέτυχε να σχηματίσει νευρόσφαιρες

in vitro

ή αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ. Όταν αυτά τα κύτταρα ξενομεταμοσχευμένων στους εγκεφάλους γυμνών αρουραίων, η ανάπτυξη του όγκου καθυστέρησε σημαντικά. Έγιναν προσπάθειες για να εντοπίσει ο πρωταρχικός στόχος /s της shRNA22, προτείνοντας έναν παράγοντα μεταγραφής που εμπλέκονται σε μία από τις MAP κινάσες-σηματοδότησης-μονοπάτια ή πολλαπλούς στόχους. Η χρήση αυτής της shRNA μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για αυτή την ανίατη τύπος εγκεφαλικού όγκου

Παράθεση:. Gil-Ranedo J, Mendiburú-Eliçabe Μ, García-Villanueva Μ, Medina D, del Álamo Μ, Izquierdo Μ (2011) μια off-στόχος Nucleostemin RNAi αναστέλλει την ανάπτυξη στην γλοιοβλαστώματος ανθρώπου-Προέρχεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (12): e28753. doi: 10.1371 /journal.pone.0028753

Επιμέλεια: Keith L. Μαύρο, Cedars-Sinai Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Ιουνίου 2011? Αποδεκτές: 14 του Νοεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Δεκ 2011

Copyright: © 2011 Gil-Ranedo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από πόρους: Ministerio Επιστημών e Innovación (SAF 2009 έως 07259) Ισπανία, και Fundación Eugenio Rodriguez Pascual (Μαδρίτη). Το Centro de Biologia Μοριακής δ.Ο. Είναι επίσης ο αποδέκτης ενός θεσμικού επιχορήγηση από το Ίδρυμα Ramón Areces. JG-R ήταν ο αποδέκτης ενός predoctoral υποτροφία από το Gobierno Vasco, Ισπανία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πολύμορφο γλοιοβλάστωμα είναι ένα από τα πιο κοινά κακοήθη και όλων των αστροκυττάρων όγκων [1]. Το πρότυπο ανάπτυξης της GBM είναι πολύ διηθητική, καθιστώντας μια χειρουργική θεραπεία είναι πολύ δύσκολη και οδηγεί σε πολύ κακή έκβαση επιβίωσης που έχουν βελτιωθεί μόνο οριακά τις τελευταίες δεκαετίες [2]. Η υπόθεση του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων υποδηλώνει ότι οι όγκοι οργανώνονται σε μια ιεραρχία με έναν υποπληθυσμό των ΚΕΠ υπεύθυνο για την εξέλιξη του όγκου, τη συντήρηση, και την επανάληψη [3]. Τα κύτταρα με ιδιότητες στέλεχος που μοιάζει αρχικά αναγνωρίστηκαν στην οξεία μυελογενή λευχαιμία [4], και επί του παρόντος η ύπαρξή τους έχει επιβεβαιωθεί στον καρκίνο του μαστού [5], μυελοβλάστωμα και γλοιοβλάστωμα [6], του καρκίνου του προστάτη [7], το μελάνωμα [8], καρκίνο των ωοθηκών [9], κεφαλής και λαιμού πλακωδών καρκινωμάτων [10], καρκίνος του παχέος εντέρου [11], του καρκίνου του παγκρέατος [12] και τον καρκίνο του πνεύμονα [13], μεταξύ άλλων. Σε γλοιοβλάστωμα, υποτροπές συνήθως ακολουθούν θεραπεία, πιθανώς επειδή ΚΕΠ είναι ιδιαίτερα διηθητικής, επιλεκτικά ανθεκτικά σε radiotherapies, χημειοθεραπείες [14], [15], [16], ανοσοθεραπείες [17], και την προώθηση της αγγειογενετική δραστηριότητα. Επιπλέον, χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία θεραπείες μπορεί προνομιακή ΚΕΠ όγκου στον εγκέφαλο για να ενισχύσει βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με τα χαρακτηριστικά τους [18]. Αυτός ο πληθυσμός του ΚΕΠ είναι εξαιρετικά ογκογόνα και phenocopy του αρχικού όγκου σε μοντέλα τρωκτικών ξενομοσχεύματος [19], [20]. Προσεγγίσεις για να αναγκάσει ΚΕΠ να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα με περιορισμένη ή καθόλου ιδιότητες κυτταρικής διαίρεσης, με έκθεσή τους σε μορφογενετικών πρωτεϊνών των οστών, για παράδειγμα, χρησιμοποιήθηκαν για να καθιστούν πιο ευάλωτες σε συμβατικές θεραπείες, και έδειξε σημαντική αποτελεσματικότητα σε μοντέλα ποντικού [21]. Η κατανόηση της βασικής βιολογίας του καρκίνου βλαστικών κυττάρων είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό πριν από τη μετάβαση σε υποθετικό θεραπείες για την εξάλειψή τους.

Nucleostemin είναι GTP-δεσμευτική πρωτεΐνη, που ονομάζεται έτσι λόγω της πυρηνισκικό εντοπισμό και την προτιμησιακή έκφραση στα βλαστικά κύτταρα [22 ]. Παρά το γεγονός ότι η πρωτεΐνη είναι κυρίως παρούσα σε εμβρυϊκά και ενήλικα βλαστικά κύτταρα, εκφράζεται επίσης σε διάφορες μετασχηματισμένες κυτταρικές γραμμές και όγκους [23], [24]. Nucleostemin, από την άλλη πλευρά, είναι απότομα κάτω-ρυθμίζονται κατά την διάρκεια της διαφοροποίησης προ τερματικό κυτταρική διαίρεση. Αυτή η πρωτεΐνη εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε ενήλικα νευρικά βλαστικά κύτταρα αρουραίου, και έχει εμπλακεί στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου [22]. Αρκετές πρωτεΐνες nucleostemin πρόσδεσης έχουν ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένων ρ53, MDM2 και το δεσμευτικό παράγοντα 1 (TRF1) τελομερή επανάληψη [22], [25], [26]. Μεταβολές σε nucleostemin επίπεδα έκφρασης προκαλεί μία μείωση στον ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων, σε αμφότερες τις εξαρτώμενες και ανεξάρτητες ρ53 τρόπους, [22], [26] – [28]. Η πρωτεΐνη είναι απαραίτητη για την πρώιμη εμβρυογένεση [29], αλλά είναι επίσης σημαντική σε ενήλικα νευρικών βλαστικών κυττάρων [30]. Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι η εξάντληση των nucleostemin συνδέεται με μια περιορισμένη ογκογόνο ικανότητα τόσο HeLa και PC-3 κύτταρα [31], [24]. Εκτός επιπτώσεις της στην ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, έχουν αρκετές πρόσθετες ρόλους ανατεθεί σε nucleostemin όπως ρύθμιση του μήκους των τελομερών με την προώθηση της αποδόμησης του TRF1 [25], επεξεργασία του προ-rRNAs [32] και τη συντήρηση των πυρηνισκικός αρχιτεκτονική [33].

η πρόθεσή μας ήταν να διερευνήσει το ρόλο των nucleostemin σε ανθρώπινο GBM-ΚΕΠ χρησιμοποιώντας lentivirally μετάγονται σύντομο RNAs φουρκέτα (τα siRNAs) να μειώσει σημαντικά την παρουσία της στα κύτταρα. Τα ΚΕΠ απεμπλουτισμένο του nucleostemin έκφρασης (shRNA18) δεν είχε ως αποτέλεσμα την έντονη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και αυξημένη απόπτωση που περιμέναμε. Αντ ‘αυτού, ένα φακοϊό εκτός στόχου (shRNA22) κατάργησε τον πολλαπλασιασμό, αυτο-ανανέωση και την επιβίωση των ΚΕΠ. Επίσης, η παρουσία αυτού του shRNA καθυστερήσει σημαντικά ΚΕΠ ογκογόνο ικανότητα, όταν ξενο-μεταμόσχευσις στο γυμνό εγκεφάλους αρουραίων.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της nucleostemin σε δύο ανθρώπινα-γλοιοβλαστώματος που προέρχονται από κυτταρικές σειρές καρκίνου βλαστικών

Δύο καλλιέργειες εμπλουτισμένα για καρκινικά βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από τα δείγματα ανθρώπινου όγκου του εγκεφάλου (δείγματα ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7). Και οι δύο κυτταρικές σειρές αυξήθηκε εκθετικά και σχηματίζεται νευροσφαιρίδια ακόμα και όταν σπέρνονται σε χαμηλή πυκνότητα, υποδεικνύοντας μία ισχυρή ικανότητα αυτο-ανανέωσης. Οι σφαίρες νευρικών ήταν θετικά για CD133 (Σχήμα 1Α?. Πράσινο), νεστίνη (Σχήμα 1Α?. Κόκκινο), Sox2 (Σχήμα 1Β?. Πράσινο) vimentin (Εικ. 1Β? Κόκκινο), και nucleostemin (Σχήμα 1Β?. Ροζ) νευρωνικά βλαστικών κυττάρων δείκτες. Nucleostemin ήταν παρούσα στον πυρήνα του 88% των ΚΕΠ-5 και 7 ΚΕΠ-κύτταρα, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασίες ανοσοφθορισμού (Εικ. 1 C). Ένα μεγάλο ποσοστό των κυττάρων (76%) ήταν επίσης θετικά για CD133, και ακόμη υψηλότερα ποσοστά ελήφθησαν για νεστίνη, βιμεντίνη και Sox2 (πάνω από 95%), το τελευταίο που εμπλέκονται στην αυτο-ανανέωση και τον πολλαπλασιασμό των βλαστικών κυττάρων. CD15 ήταν ένας δείκτης για το 54% των ΚΕΠ-5 και 69% για τα ΚΕΠ-7. Η πολυδυναμικότητα αυτών των δύο καλλιεργειών καταδείχθηκε ως νευρόσφαιρες που αναπτύχθηκαν σε μέσο πρόκλησης διαφοροποίησης εμφανίζονται τυπικά μορφολογική διαφοροποίηση προς όλα τα τρία νευρωνικά καταγωγές – αστροκυτταρικές, νευρωνικά και oligodendrocytic, όπως αξιολογήθηκε με θετικότητα για β-ΙΙΙ-τουμπουλίνης [34] και ΜΑΡ2 ( νευρωνική) (Εικ. 1D κόκκινο, και S1 κόκκινο), GFAP (αστροκυττάρων) (Εικ. 1D πράσινο), και NG2 (oligodendrocytic πρόδρομος) (Εικ. S1 πράσινο) αντιγόνα αντίστοιχα. Παρ ‘όλα αυτά, τα διαφοροποιημένα κύτταρα δεν έχασαν την έκφραση του nucleostemin (Εικ. 1 Ε), αν και δεν εκφράζουν οποιαδήποτε από τις άλλες βλαστική ικανότητα συναφή γονίδια (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι αναλύσεις καρυοτυπική έδειξε αρκετές αλλαγές αντανακλούν μετασχηματισμού δραστηριότητα, και οι δοκιμασίες κλωνογονικότητας σε μαλακό άγαρ υποδεικνύεται ανάπτυξη πολλών αποικιών.

A. ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7 νευρόσφαιρες εκφράζουν CD133 (πράσινο) και νεστίνης (κόκκινο). Scalebar: 50 μm. Β ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7 κύτταρα που δείχνει την έκφραση και την κυτταρική εντόπιση του Sox2 (πράσινο), βιμεντίνη (κόκκινο) και nucleostemin (μοβ). Scalebar: 10 μm, και ποσοτική οικόπεδο (C) των δεικτών των βλαστικών κυττάρων CD133, νεστίνη, βιμεντίνη, Sox2, nucleostemin και CD15 στα ΚΕΠ-5 (γκρι) και ΚΕΠ-7 (πράσινο). Δ Neuron (β-ΙΙΙ-τουμπουλίνης, ροζ-κόκκινο) και αστροκυττάρων (GFAP, πράσινο) ικανότητα διαφοροποίησης των ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7. Scalebar: 50 μm. έκφρασης Ε Πυρηνικός nucleostemin σε βλαστικά ή differentiatiated ΚΕΠ-5 (γκρι) και τα κύτταρα ΚΕΠ-7 (πράσινο). ΣΤ Μαγνητική τομογραφία του

in vivo

όγκοι αναπτύσσονται από το ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7 (κίτρινο αιχμές βελών δείχνουν τον όγκο), και την ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier (G) του immunodeficent αρουραίους, μετά ΚΕΠ-5 (κόκκινο) ή CSC-7 (πράσινο) ορθοτοπική ξενομοσχεύματα.

η

στη συνέχεια, διερευνώνται οι δυνατότητες και των δύο ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7 για να σχηματίσουν όγκους μετά την ορθοτοπική xenogratf στο immunodeficent εγκεφάλους αρουραίων. Μετά την ένεση 5 × 10

5 κύτταρα ενδο-κρανιακά, και οι δύο κυτταρικές σειρές που σχηματίζονται μεγάλους όγκους στο 100% των περιπτώσεων (η = 12 για ΚΕΠ-5 και 11 για ΚΕΠ-7), που ακολουθείται από απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI) (Εικ. 1 F). Οι όγκοι ήταν υψηλώς διηθητική (Εικ. S2). Μοσχεύματα από αυτά τα γλοιώματα σειριακά μεταμοσχεύθηκαν σε εγκεφάλους άλλων γυμνών αρουραίων και δημιουργούνται θανατηφόρα όγκους που ήταν εξίσου εμπλουτισμένο σε ΚΕΠ, επιδεικνύοντας υψηλή ικανότητα για αυτο-ανανέωση. Οι μέσοι χρόνοι επιβίωσης των οικοδεσπότες ήταν 60 ± 4 ημέρες ΚΕΠ-5 και 81 ± 11 ημέρες για τα ΚΕΠ-7 κύτταρα (Εικ. 1G). Ιστοπαθολογική αναλύσεις των ξενομοσχευμάτων έδειξε τα γενικά χαρακτηριστικά γνωρίσματα της GBM, ως pseudopalisade και εστιακή νέκρωση, υψηλή κυτταροβρίθεια, υψηλή έκφραση του EGFR και υψηλή πολλαπλασιαστική δείκτη (ΜΙΒ-1). Οι ασθενείς και τα δείγματα ξενομοσχεύματα εμφανίζουν παρόμοια επίπεδα έκφρασης για όλους τους δείκτες, συμπεριλαμβανομένων των χαμηλών (ασθενής /ξενομόσχευμα 7) έκφρασης για ρ53 μέσου (ασθενής /ξενομόσχευμα 5) και, και πολύ χαμηλή, εάν υπάρχουν, για ρ16 (Εικ. S3). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα μεταμοσχευμένα όγκοι στους αρουραίους ήταν phenocopies των αρχικών όγκων του ασθενούς.

Χαρακτηρισμός των Τα siRNAs σχεδιαστεί για να καλύψουν το ανθρώπινο nucleostemin

Το γονίδιο nucleostemin έχει 15 εξόνια, και καθώς υποβάλλεται εναλλακτικό μάτισμα παράγει τρεις διαφορετικές μεταγραφές mRNA. Εκτός από το εξόνιο 1, αυτές οι παραλλαγές έχουν παρόμοιες αλληλουχίες. Ως εκ τούτου, για το σχεδιασμό ειδικών εκκινητών για knock-down και τις τρεις παραλλαγές, έχουμε επιλέξει εκκινητές σε κοινές θέσεις των εξωνίων 4, 10, 13 και 15 (Σχ. 2Α). Έχουμε στοχευμένες nucleostemin από μόλυνση με φακοϊό έκφραση shRNA έναντι πυρηνισκική πρωτεΐνης. Πέντε διαφορετικές Τα siRNAs με τέλεια συμπληρωματικές αλληλουχίες στο mRNA ανθρώπινου nucleostemin εισήχθησαν στο ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7 κύτταρα. Τρεις από τις πέντε Τα siRNAs επελέγησαν για περαιτέρω χαρακτηρισμό: shRNA18, shRNA20 και shRNA22. Η ανάλυση στυπώματος RT-PCR και τη δυτική αποκάλυψε ότι ενώ shRNA18 προκάλεσε μια σημαντική μείωση στην nucleostemin mRNA (78%) και τα επίπεδα πρωτεΐνης (51%), και τα δύο shRNA20 και shRNA22 δεν φαίνεται να επηρεάζει τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης, όταν εξομαλύνεται προς την αντίστοιχη αντίστοιχη GAPDH (mRNA) και ακτίνη (πρωτεΐνη) μάρτυρες (Εικ. 2Β). Τα αποτελέσματα δείχνουν off-δεσμευτικός στόχος και των δύο shRNA20 και shRNA22. Εναλλακτικά, σχετικά μικρές μειώσεις nucleostemin επίπεδα αγγελιαφόρου μέσω επίδραση στόχος θα μπορούσε να έχει συνέπειες στην κυρίαρχη έναν προσδιορισμό εάν η έξοδος είναι πολύ δόσης-ευαίσθητα σε επίπεδα αυτής της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Σχεδιάσαμε μία δοκιμασία, με βάση το σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ, να γίνει διάκριση μεταξύ των δύο δυνατοτήτων. Η έκφραση του shRNA18 σε ΚΕΠ-5 ή ΚΕΠ-7 δεν αναστέλλει το σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ, ενώ η έκφραση του shRNA22, και σε μικρότερο βαθμό shRNA20, μείωσε δραστικά τον αριθμό των αποικιών που αναπτύχθηκαν σε αυτό το είδος του μέσου (Σχ. 2C και 2D). Αν shRNA22 προκαλούσε μια μικρή μείωση στο μήνυμα nucleostemin, και αυτό προκάλεσε μια σημαντική αναστολή της ανάπτυξης, διότι το μονοπάτι που εμπλέκονται ήταν πολύ ευαίσθητος σε μικρές μειώσεις το επίπεδο του αγγελιοφόρου ή πρωτεΐνη, θα πρέπει να περιμένουμε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα, όταν τα κύτταρα είτε μολύνθηκαν με shRNA18 μόνο, ή όταν τα κύτταρα είναι ταυτόχρονα μολυσμένα με δύο shRNA18 και shRNA22. Δηλαδή, ένας μεγάλος αριθμός αποικιών αυξάνεται. Αντίθετα, αν ένα πραγματικό off-στόχο φαινόμενο λειτουργούσαν εδώ, το αποτέλεσμα αυτού του συνδυασμού θα είναι το αντίθετο, όπως ο πραγματικός στόχος θα είναι διαφορετική από nucleostemin, και θα τηρούν ως λίγες αποικίες που αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ όπως παρατηρείται αυτές όταν shRNA22 χρησιμοποιήθηκε μόνο. Η μόλυνση των κυττάρων με ένα φακοϊό δεν φέρει ένα shRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η μέτρηση του αριθμού των ΚΕΠ-5 αποικιών που σχηματίστηκαν σε μαλακό άγαρ μετά από διαφορετικούς συνδυασμένες θεραπείες έδωσε τα ακόλουθα αποτελέσματα (Σχήμα 2Ε).: Υψηλό αριθμό αποικιών για τον έλεγχο shRNA (shRNACo) και για τον συνδυασμό shRNACo + shRNA18, όπως αναμενόταν , και ένας μικρός αριθμός των αποικιών τόσο για shRNACo + shRNA22, και shRNA18 + shRNA22. Performing αυτό το πείραμα, ήμασταν σε θέση να διακρίνουν μεταξύ των δυνατοτήτων όλων των Τα siRNAs που στοχεύουν nucleostemin σε διαφορετικό βαθμό ή, το shRNA22 έχει ένα διαφορετικό στόχο. Εάν το αποτέλεσμα οφείλεται στο χαμηλό επίπεδο της αναστολής, ο συν-έκφραση της shRNA18 και shRNA22 να αποκρύψουν το αποτέλεσμα του τελευταίου, αφού shRNA18 θα αναστέλλει ισχυρότερη την έκφραση του γονιδίου nucleostemin. Από την άλλη πλευρά, αν το αποτέλεσμα ήταν εκτός στόχου, θα εκτιμήσουν τις συνέπειες της shRNA22 ανεξάρτητα από την έκφραση του shRNA18. Τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι shRNA22 επάγει επίδραση του ανεξάρτητα από την έκφραση του shRNA18, υποδεικνύοντας ότι οφείλεται σε επίδραση εκτός στόχου. Ως εκ τούτου, απέκλεισε την υπόθεση ενός πολύ μικρή μείωση των nucleostemin από shRNA22 έχει μια κυρίαρχη αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων. Πιστεύουμε ότι η επίδραση αναστολής της ανάπτυξης των shRNA22 σε μαλακό άγαρ οφείλεται σε

καλόπιστους

off επίδραση στόχων.

Α. Σχηματική αναπαράσταση των 3 nucleostemin παραλλαγές μεταγραφής και εξόνια. Αιχμές βελών δείχνουν το καθένα σχεδιασμένο shRNA. Β Nucleostemin mRNA (κόκκινο) και πρωτεΐνες (μπλε) ποσοτικοποίηση στο ΚΕΠ-5 αντιμετωπίζονται με shRNACo, shRNA18, shRNA20 και shRNA22. C. Τα siRNAs επίδραση επί ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ 7-μαλακό άγαρ ικανότητα σχηματισμού αποικιών, και ποσοτική ανάλυση της (D). Ε μαλακό άγαρ μετρήσεις αποικιών σε διπλά λοιμώξεων για τον προσδιορισμό της nucleostemin-ειδικότητα της shRNA22. ** P ≤ 0,05? *** P≤0.001.

Η

Η εξάντληση των nucleostemin από shRNA18, δεν μειώνουν σημαντικά τον πληθυσμό των κυττάρων φάσης S όπως φαίνεται από το επίπεδο της πρόσληψης BrdU μετά από 15 λεπτά παλμού (Εικ. 3Α) ή ο συνολικός πληθυσμός των κυττάρων ποδηλασία συλλαμβάνεται από ένα BrdU αγωγή 20 ώρες (Σχ. 3Β). Τα άλλα δύο Τα siRNAs: shRNA20 και shRNA22, έχουν πολύ χαμηλή, εάν υπάρχει, αναστολή της έκφρασης, εμφανίζεται μια σταθερά χαμηλότερες ποσοστό των κυττάρων φάσης S και ποδηλασία. Όπως αποδεικνύεται από δοκιμασίες καμπύλη ανάπτυξης, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων που έχουν μολυνθεί με τον φακοϊό έλεγχο που στερείται shRNA εκφράζουν ένθετο (shRNACo) αυξήθηκε πολλές φορές πάνω από έξι ημέρες. Οι shRNA20 ή shRNA22 μολυσμένα κύτταρα δεν αυξήθηκαν σε αριθμό, ή ακόμη και να μειωθεί σημαντικά (Σχ. 3C και 3D), ενώ ΚΕΠ μολυνθεί με shRNA18 συμπεριφέρθηκε πολύ πιο κοντά για τον έλεγχο των κυττάρων από το να shRNA20 και shRNA22. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια επίπτωση του πρωταρχικού στόχου της shRNA22, και σε ελαφρώς μικρότερο βαθμό στην shRNA20 χτυπήσει, τη στήριξη της ανάπτυξης και της επιβίωσης του ανθρώπινου GBM-ΚΕΠ. Δεν είμαστε σίγουροι για shRNA20 και shRNA22 μοιράζονται ένα πρωταρχικό στόχο, παρά τη φυσική εγγύτητα των αρχικών ακολουθιών shRNA20 και shRNA22 στο γονίδιο nucleostemin. Παρά το γεγονός ότι μόνο 66 νουκλεοτίδια διαχωρίσει αυτές τις δύο σειρές, μια αναζήτηση του ανθρώπου ευθυγράμμιση ακολουθίας λαμβάνοντας υπόψη τα 66 νουκλεοτίδια μεταξύ τους δεν αποκάλυψε κανένα αγώνα εκτός nucleostemin.

Α. Αριθμός φάσης-S ή ολική-ποδήλατο (Β) ΚΕΠ-5 (γκρι) και τα κύτταρα ΚΕΠ-7 (πράσινο) αντιμετωπίζονται με τους διάφορους Τα siRNAs. Γ αριθμός των βιώσιμων κυττάρων σε DIV 0, 3 και 6 σε ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7 (D) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις διάφορες Τα siRNAs. ** P ≤ 0,05? *** P≤0.001.

Η

Η off-στόχο shRNA20 και shRNA22, επάγουν απόπτωση κατά προτίμηση στο CD133 + ΚΕΠ και μειώνει το σχηματισμό νευρόσφαιρα

Η παρουσία αυτών των Τα siRNAs επηρεάζουν όχι μόνο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αλλά και την κυτταρική επιβίωση. Εμείς ποσοτικά το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων και στις δύο ΚΕΠ, 5 και 7 του πληθυσμού μετά από shRNACo, shRNA18, shRNA20 και shRNA22 λεντοϊού μόλυνση. 7-AAD /αννεξίνη V-χρώση αποκάλυψε μια προνομιακή απόπτωση σε CD133

+ κύτταρα σε δύο CSC-5 και 7 πληθυσμούς (Σχήμα 4Α και 4Β).? Οι σχετικές τιμές σε σχέση με τους ελέγχους για ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7 παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Επίσης, το ποσοστό των

+ κύτταρα CD133 είναι μειωμένη τόσο σε ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7 πληθυσμοί εξής βραδέος μόλυνση shRNA20 και shRNA22 (Εικ. S4). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο πρωταρχικός στόχος της shRNA22 και shRNA20 είναι ένας παράγοντας επιβίωσης για GBM-ΚΕΠ κατά προτίμηση εκφράζεται σε CD133

+ κύτταρα.

Α. Απόπτωση που προκαλείται από Τα siRNAs στο ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7 (Β) CD133

+ (κόκκινο) ή CD133

– (μπλε) πληθυσμούς. Γ Νευροσφαιρών σχηματισμού-ικανότητα του ΚΕΠ-5 και 7-ΚΕΠ κύτταρα (D), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις διαφορετικές Τα siRNAs. ** P ≤ 0,05? *** P≤0.001.

Η

Sharing ορισμένα βασικά χαρακτηριστικά των φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων, ΚΕΠ είναι σε θέση να αυτο-ανανέωσης, η οποία επιτρέπει συνεχή συντήρηση αυτού του υποπληθυσμό και η επέκταση του αντίστοιχου όγκου. ικανότητα σχηματισμού Νευροσφαιρών μετά τη θεραπεία με το διαφορετικό Τα siRNAs μετρήθηκε (Σχ. 4C και 4D). Πρακτικά καμία σφαίρες σχηματίζονται από κύτταρα επεξεργασμένα με shRNA22 και πολύ λίγοι από ShRNA20 επεξεργασμένα κύτταρα σε αμφότερες τις ΚΕΠ-5 και 7 πληθυσμούς. Οι νευρόσφαιρες που αναπτύχθηκε σε 100% των ομάδων ελέγχου. Τα αποτελέσματα αυτά, μαζί με τις παρατηρήσεις μας, που ΚΕΠ απέτυχε να πολλαπλασιάζονται και υπέστησαν απόπτωση, υποδεικνύουν ότι ο πρωταρχικός στόχος της shRNA22 και shRNA20 απαιτείται για την αυτο-ανανέωση του καρκίνου του γλοιοβλαστώματος βλαστικών κυττάρων.

Η off-στόχος shRNA22 μειώνει σημαντικά το ογκογόνο δυναμικό των ΚΕΠ-5

Εξετάσαμε την επίδραση της μολύνοντας ΚΕΠ-5 κύτταρα με φακοϊούς έλεγχο ή φακοϊούς εκφράζουν shRNA22. Μετά την επιλογή πουρομυκίνης, 5 × 10

5 κύτταρα εγχύθηκαν στους εγκεφάλους γυμνών αρουραίων. Όλα τα ζώα που φέρουν κύτταρα ελέγχου, δηλαδή κύτταρα μολυσμένα με άδειο φακοϊό, (n = 3) ανέπτυξαν μεγάλους όγκους, που ακολουθείται από μαγνητικό συντονισμό, και πέθανε σε 63 ± 1 ημέρες, δεν διαφέρει πολύ από μη μολυσμένα ΚΕΠ-5 (61 ± 4 ημέρες, n = 12). Αντίθετα, τα ζώα που ενέθηκαν με κύτταρα που εκφράζουν shRNA22 (n = 6), αναπτύχθηκε σημαντικά μικρότερους όγκους, είναι το διάμεσο όγκο 148 mm

3, ενώ η μέση τιμή των όγκων που εκφράζουν shRNACo ήταν 358 mm

3 (Σχ . 5Α και 5Β). Το οικόπεδο επιβίωσης Kaplan-Meier υποδεικνύει μια σημαντική διαφορά μεταξύ του shRNACo και shRNA22 θεραπεία καρκινικών κυττάρων, με μέση επιβίωση των τελευταίων 71 ± 2 ημέρες (Εικ. 5C). Έτσι, η παρουσία και η έκφραση της shRNA22 σε ΚΕΠ φαίνεται να είναι σημαντική για την εξασθένηση της προόδου του όγκου.

A. Η ποσοτικοποίηση του όγκου των όγκων που προκαλούνται με ΚΕΠ-5 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με shRNACo (μαύρο) και shRNA22 (κόκκινο). B. Η μαγνητική τομογραφία αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των όγκων μετά από ορθοτοπική ξενομοσχεύματα σε γυμνό αρουραίο-εγκεφάλους των ΚΕΠ-5 κύτταρα που φέρουν shRNACo ή shRNA22, και την πλοκή επιβίωσης Kaplan-Meier (C) των αρουραίων immunodeficent εμβολιάζονται με ΚΕΠ-5 (μακέτα, γκρι ), κύτταρα που φέρουν shRNACo (μαύρο) και shRNA22 (κόκκινο). *** P≤0.001.

Η

Η επίδραση της shRNA22 δεν φαίνεται να είναι αποκλειστικά για ΚΕΠ

Προσπαθήσαμε να προσδιοριστεί η επίδραση των shRNA22 σε κύτταρα γλοιώματος χωρίς CD133

+ ιδιότητες βλαστικών όπως ανθρώπινες κυτταρικές σειρές γλοιώματος U87MG και U373MG. Εκτιμήσαμε κλωνογόνο δυναμικό τους με τη δοκιμασία μαλακό άγαρ μετά από shRNACo και shRNA22 λεντοϊού μόλυνση. Μια σημαντική μείωση του μέσου αριθμού των αποικιών παρατηρήθηκε όταν shRNA22 εκφράστηκε σε U373MG (μέχρι 1%), και σε μικρότερο βαθμό, όταν στην κυτταρική σειρά U87MG γλοιώματος (μέχρι 41%) (Σχ. 6Α). Μετρήσαμε επίσης την κυτταρική επιβίωση με αξιολόγηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές U373MG και U87MG εξής shRNACo, και shRNA22 λεντοϊού μόλυνση. 7-AAD /αννεξίνη V-χρώση αποκάλυψε προτιμησιακή απόπτωση σε κύτταρα U373 σε παρόμοια συμπεριφορά με ΚΕΠ. Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα U87MG φαίνεται μάλλον ανθεκτικά στην απόπτωση (Σχ. 6Β). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αν και shRNA22 μπορεί να μετριάσει την ογκική αύξηση σε κύτταρα γλοιώματος σε γενικές γραμμές, η επίδρασή της μπορεί να εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου. Το εύρημα ότι shRNA22 επίδραση δεν περιορίζεται στα ΚΕΠ είναι σημαντική κατά τον σχεδιασμό στρατηγικών για την εξάλειψη όλων των τύπων καρκινικών κυττάρων που συσσωρεύονται μια άκρως ετερογενή όγκου όπως γλοιοβλάστωμα.

A. Τα siRNAs επίδραση επί U373MG (μαύρο) και U87MG (γκρι) μαλακό άγαρ ικανότητα σχηματισμού αποικίας. B. Τα siRNAs επαγόμενη απόπτωση σε U373MG (μαύρο) και U87MG (γκρι). ** P ≤ 0,05? *** P≤0.001.

Η

προσπάθεια να εντοπισθούν οι πρωταρχικός στόχος της shRNA22

Πραγματοποιήσαμε μία γονιδιωματική έρευνα για ακολουθίες, εκτός από nucleostemin, με διαφορετικούς βαθμούς ομολογίας με shRNA22 νουκλεοτίδια. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε το βασικό εργαλείο αναζήτησης τοπικής ευθυγράμμισης (BLAST) και επιλέγουμε τέσσερις υποψήφιοι: PCLO, που εμπλέκονται στην απελευθέρωση neurotransmisor? HSPA13, μέλος της οικογένειας HSP70 συνοδού? SEC22C, που εμπλέκονται στην φυσαλιδώδη κυκλοφορίας? και CNOT1 που σχετίζονται με τη μεταγραφή και την υποβάθμιση του mRNA. Από τις 21 νουκλεοτίδια, 14 ήταν μια τέλεια αντιστοιχία σε όλες τις περιπτώσεις εκτός CNOT, με έναν αγώνα 13 νουκλεοτίδια. Ωστόσο, δεν είναι μία από τις τέσσερις υποψηφίους ήταν ο πρωταρχικός στόχος για shRNA22 όπως μετράται με qRT-PCR (δεδομένα που δεν φαίνονται), όπως δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη συγκέντρωση του mRNA τους με την παρουσία ή απουσία shRNA22 σχετίζονται με shRNACo.

Για τον προσδιορισμό του γονιδιώματος σε επίπεδο διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε ΚΕΠ-5 μετά την μόλυνση shRNA22, χρησιμοποιήσαμε Affymetrix GeneChip Gene 1.0 Σύστημα Array ST που περιέχει περίπου 28.869 ανθρώπινα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) των mRNA που θα μπορούσε να είναι μια στόχο για τη σύνδεση σε ένα μικρο (mi) RNA μοιάζει με τρόπο. Ως αποτέλεσμα αναγνωρίσαμε 182 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ΚΕΠ-5 υποβάλλεται σε επεξεργασία με shRNA22 σε σχέση με shRNACo (Πίνακας S1). Όπως ήταν αναμενόμενο, nucleostemin δεν ήταν μεταξύ των γονιδίων κάτω-ρυθμίζονται. Προσπάθειες για να ομαδοποιήσετε τα γονίδια με shRNA22 χτυπά ανά λειτουργία (με βάση την οντολογία γονιδίων και δεδομένα σηματοδότησης μονοπατιού) αποκάλυψε την παρουσία των 26 γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεταγραφής μεταξύ των σιγήσει γονίδια, και 56 πρωτεΐνες που δεσμεύονται με DNA (Εικ. 7Α). Το μονοπάτι μεταγωγής σήματος με περισσότερα γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω ήταν η ΜΑΡΚ κινασών οδός (Σχ. 7Β). Αν και τα μέχρι τώρα αποτελέσματα δεν είναι πειστικά, αποτελεί ένδειξη ότι shRNA22 μπορούν να συμμετέχουν στην φίμωση ενός παράγοντα μεταγραφής εμπλέκεται σε ένα από τα ΜΑΡ-κινάσες σηματοδότησης-μονοπάτια μπορεί να προταθεί. Εναλλακτικά, πολλαπλές επιδράσεις στόχος είναι επίσης μια ισχυρή πιθανότητα για shRNA22, με παρόμοιο τρόπο με micro RNAs.

Α. Δηλωτικός κατάντη (πράσινο), ανάντη (κόκκινο) και όλα τα ρυθμιζόμενα γονίδια (μπλε) ομαδοποιούνται με βάση τη λειτουργία των βιολογικών διεργασιών, ή που ανήκουν σε μονοπάτια σηματοδότησης (Β) που προκαλείται από shRNA22 στο ΚΕΠ-5 κύτταρα.

Συζήτηση

Οι ομοιότητες και οι διαφορές μεταξύ των ΠΚ και ΚΕΠ ήταν η πηγή πολλών ισχυρισμό [35], [36], [37]. ΚΕΠ εγκέφαλος μοιάζει με νευρική ΠΚ από την άποψη του φαινοτύπου, σηματοδότησης και της συμπεριφοράς in vitro [38], αλλά δεν είναι επί του παρόντος σαφές εάν τα ΚΕΠ είναι, στην πραγματικότητα,

καλόπιστους

βλαστικά κύτταρα. Πειραματική χαρακτηρισμούς των πληθυσμών καρκίνου βλαστικών κυττάρων μπορεί να βοηθήσει σε αυτά τα θέματα. Σε αρουραίους, nucleostemin εκφράζεται έντονα στο πυρηνίσκους του κεντρικού νευρικού συστήματος SCs, αλλά όχι σε διαφοροποιημένους απογόνους τους, όπως το γονίδιο φαίνεται να κλείσει απότομα κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης πριν τελικά στάδια [22]. Οι παρατηρήσεις μας από nucleostemin που εκφράζεται ακόμη και μετά ΚΕΠ αναγκάστηκαν να διαφοροποιηθούν σε καλλιέργεια, συνεπάγεται μια νέα υπογραφή για την ΚΕΠ και μια σημαντική διαφορά με την ΠΚ, δεν έχουν αναφερθεί στο παρελθόν.

Χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση RNAi για την προώθηση ειδικά υποβάθμιση της nucleostemin mRNA. Προηγούμενη δεδομένα έχουν δείξει ότι χτυπούν τα κάτω nucleostemin έκφραση προκάλεσε σοβαρή μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα κύστης [39] και μείωσε την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας σε ανθρώπινο καρκίνο του μαστού βλαστικά κύτταρα [40]. Μια σημαντική μείωση στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου σε διαφορετικούς τύπους ανθρώπινων όγκων του εγκεφάλου και στους ανθρώπινους προέρχονται κυτταρικές γραμμές γλοιοβλαστώματος επίσης αναφερθεί [41]. Ωστόσο, βρήκαμε ότι το μόνο shRNAi που μειώνει αποτελεσματικά την πρωτεΐνη, δεν καταστέλλει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, δεν μειώνει την ανάπτυξη των ΚΕΠ καλλιεργειών, και δεν μειώνεται ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν σε μαλακό άγαρ, σε σύγκριση με τους ελέγχους που έχουν μολυνθεί με ένα άδειο lentivirus. Οι διαφορές μπορεί να οφείλεται σε διαφορές στις χτυπήσει κάτω επίπεδα nucleostemin επιτευχθεί σε προηγούμενες εκθέσεις (μεγαλύτερη από 75% και μερικές φορές περισσότερο από το 90%) και στις ΗΠΑ (51%).

τεχνολογίας RNAi έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε κύτταρα θηλαστικών για να καταστείλουν το επίπεδο έκφρασης των μεμονωμένων γονιδίων, βοηθώντας έτσι να καθορίσουν τις λειτουργικές τους ρόλους των γονιδίων, ιδιαίτερα σε ασθένειες. Πολλή δουλειά έχει επικεντρωθεί γύρω από αλγορίθμων σχεδιασμού shRNA, με έμφαση στην ιδιαιτερότητα του γονιδίου-στόχου και της αποτελεσματικότητας [42], [43]. Παρ ‘όλα αυτά εκτός στόχου επιδράσεις είναι ευρέως διαδεδομένη, και οι μεμονωμένοι Τα siRNAs δειχθεί ότι ρυθμίζει προς τα κάτω ένα ή περισσότερα άλλα «ανεπιθύμητο» γονίδια [44], [45], μερικές φορές με σύνδεση σε ένα μικρο (mi) RNA τρόπο παρόμοιο προς το 3 «UTRs των mRNAs [46]. Βρήκαμε από shRNA22 είναι δεσμευτική σε άλλα /s από τον επιδιωκόμενο γονίδιο στόχο. Off-στόχο ενέργειες που αναφέρθηκαν σε προηγούμενες μελέτες RNAi ήταν διαμεσολαβείται από μερική συμπληρωματικότητα μεταξύ Τα siRNAs και των 3 ‘UTRs των γονιδίων εκτός στόχου, που περιλαμβάνει ένα επταμερέε ή εξαμερών «σπόροι» αγώνα του σκέλους shRNA στο 5’ άκρο στις θέσεις 2-8 ή 2 έως 7, αντίστοιχα [46], [47]. Ο μηχανισμός είναι παρόμοια με εκείνη του miRNAs. Παρά το γεγονός ότι η βιβλιοθήκη BLAST χρησιμοποιείται περιλαμβάνονται τα 3’UTRs των αγγελιοφόρων, μια παράμετρος αγώνας 7-νουκλεοτιδίων δεν είχε συμπεριληφθεί στην ανάλυση της οθόνης, καθώς θα αντιπροσωπεύουν μια σοβαρή χαλάρωση των όρων και μια μεγάλη αύξηση στην υποθετική αγώνες. Ένα κοινό πρωτεύον στόχος για shRNA20 και shRNA22 τεκμαίρεται, καθώς οι αλληλουχίες είναι μόνο 66 νουκλεοτίδια χώρια σε nucleostemin εξόνιο 10. Είναι πιθανό ότι μια αλληλουχία nucleostemin συμπεριλαμβανομένης της shRNA22, την περιοχή μεταξύ των δύο Τα siRNAs και shRNA20 (ίσως εν μέρει), θα ήταν επίσης να είναι παρόν σε μια άλλη περιοχή του γονιδιώματος, που κωδικοποιούν για μία διαφορετική πρωτεΐνη της οποίας mRNA δευτεροταγούς δομής θα ήταν πιο προσιτή σε shRNA22 και shRNA20 από το ένα στο mRNA nucleostemin. Παρ ‘όλα αυτά, δεν υπάρχουν νέες εγγραφές δίπλα nucleostemin βρέθηκαν σε ένα ανθρώπινο γονιδίωμα-ευρεία έρευνα για συμπληρωματικές περιοχές στις ακολουθίες δύο-shRNA και τα νουκλεοτίδια μεταξύ τους, πραγματοποιείται με τη χρήση της βασικής εργαλείο αναζήτησης τοπικής ευθυγράμμισης (BLAST).

Η γονίδιο προφίλ έκφρασης του ΚΕΠ-5 με την παρουσία ή απουσία του shRNA22 δεν το έκανε κατηγορηματικά δείχνουν πρωταρχικός στόχος της. Αντίθετα, πολλαπλές επιδράσεις στόχος είναι εύλογη πιθανότητα για αυτό το shRNA. Ο μεγαλύτερος αριθμός των γονιδίων σιγήσει είχε σχέση με τη ρύθμιση της μεταγραφής όταν επιτυχίες ομαδοποιήθηκαν με βάση τη λειτουργία, και υπερ-εκπροσώπηση των γονιδίων που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης ΜΑΡΚ ήταν κάτω-ρυθμίζονται από την έκφραση shRNA22. Υπερ-έκφραση ενός ή περισσοτέρων γονιδίων της οδού σηματοδότησης ΜΑΡΚ είναι κοινή σε γλοιοβλαστώματα, και διάφορα μικρά μόρια που αναστέλλουν την οδό σηματοδότησης της κινάσης Akt-ΡΙ3 είναι σε κλινική ανάπτυξη. Αν και πολλά από αυτά τα μόρια ήταν αποτελεσματικά σε προκλινικά μοντέλα, παραμένει ασαφές αν η στρατηγική αυτή και μόνο θα είναι επαρκής για να διακόψει τα μοριακά γεγονότα που ξεκίνησε και διατηρείται από τη σηματοδότηση κατά μήκος των οδών, λόγω της ενεργοποίησης άλλων οδών που αντισταθμίζουν για την αναστολή του στοχευόμενου κινάσης. Προσπάθειες έχουν γίνει πρόσφατα για την ταυτοποίηση γονιδίων ή πορείες των οποίων η αδρανοποίηση, σε συνδυασμό με τους αναστολείς ΡΙ3Κ PX-866 και NVPBEZ-235, μπορεί να οδηγήσει σε θανατηφόρο φαινότυπο σε κύτταρα πολύμορφο γλοιοβλάστωμα [48]. Το ταυτοποιημένο shRNA22, όταν εκφράζεται σε ΚΕΠ από ασθενείς γλοιοβλάστωμα, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αυτο-ανανέωση, προκαλεί απόπτωση και μειώνει σημαντικά ογκογόνο δυναμικό τους όταν ξενομεταμοσχευμένων στους εγκεφάλους γυμνών αρουραίων. Το γεγονός ότι ο πρωταρχικός στόχος της shRNA22 δεν περιορίζεται στο ΚΕΠ είναι σημαντική, διότι όταν προσπαθούμε να εξαλείψει όγκο πρέπει επίσης στοχεύουν τα κύτταρα στρώματος του όγκου και μικρογλοία επειδή τα κύτταρα αυτά συμβάλλουν στην διατήρηση και την εξέλιξη του όγκου. Η χρήση αυτής της shRNA μόνη της ή σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πιθανή κλινική θεραπευτική στρατηγική.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση για τη φροντίδα των ζώων

Αυτή η μελέτη διεξήχθη αυστηρά σύμφωνα με τη νομοθεσία και τις κατευθυντήριες γραμμές για τη φροντίδα των ζώων και το χειρισμό στην Ισπανία (ισπανικό βασιλικό διάταγμα 1201/2005 BOE δημοσιεύθηκε στις 21 Οκτώβριος 2005), καθώς και εκείνων που προέρχονται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (2003/65 /ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου τον Ιούλιο του 2003) . Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα από το Αυτόνομο Πανεπιστήμιο της Μαδρίτης (άδεια που σχετίζεται με την προβολή ΔΔΠ 2009-07259 εκδίδεται στη Μαδρίτη 11

Μαρτίου 2009) και από τη θεσμική Επιτροπή για την Βιοασφάλεια CBMSO. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό ισοφλουορανίου αναισθησία αερίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Δήλωση για τον ασθενή Συναίνεση

Έχουμε λάβει δύο νέες γραμμές καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7 ) από την πρωτοβάθμια γλοιοβλάστωμα χειρουργικά δείγματα από ασθενείς που υποβάλλονται σε εκτομή για νεοδιαγνωσθέντες γλοίωμα, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την ηθική Επιτροπή Θεσμικών του Ramón y Cajal Νοσοκομείο. Γραπτή συγκατάθεση για να αξιοποιήσει περίσσεια ιστού για την έρευνα λήφθηκε από κάθε ασθενή, και απο-προσδιορίζονται ιστών, για την προστασία της ανωνυμίας, χρησιμοποιήθηκαν (άδεια που σχετίζεται με την προβολή SAF 2009 έως 07259, που εκδόθηκε στη Μαδρίτη το 26

ης Φεβρουαρίου 2009, η Ισπανία .)

Δήλωση για

δεδομένων μικροσυστοιχιών

Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ είναι MIAME συμβατό και η ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί στη βάση δεδομένων συμβατή GEO (αριθμός πρόσβασης: GSE30448)

. απομόνωση και καλλιέργεια κυττάρων

Οι νέες κουλτούρες, ΚΕΠ-5 και ΚΕΠ-7, καθιερώθηκαν από φρέσκα χειρουργικά δείγματα που συλλέγονται απευθείας από το χειρουργείο σε PBS συν 0,6% γλυκόζη και αμέσως μεταφέρονται σε πάγο για το κύτταρο δωμάτιο καλλιέργειας και υποβάλλονται σε επεξεργασία ως ακολούθως: τα κομμάτια του όγκου πλύθηκαν και κιμά λεπτότατα με μικρό ψαλίδι, αυτά στη συνέχεια επωάστηκαν σε 0,1% θρυψίνη και 0,04% DNase (τύπος ΙΙ, Sigma) σε PBS για 1 ώρα στους 37 ° C . Χωνευμένο ιστός πλύθηκε δύο φορές και μηχανικά διαχωρίστηκαν με πέρασμα μέσα από τη φωτιά-γυαλισμένο pippetes Pasteur.