Αφηρημένο

Για να μελετήσουν τις επιμέρους λειτουργίες της υαλουρονικό πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τον καρκίνο του προστάτη (προστάτη ) κινητικότητα μέσω συνδετικών ιστών, έχουμε αναπτύξει μια νέα τρισδιάστατη 3D) δοκιμασία υδρογέλης (υαλουρονικό οξύ (ΗΑ) που παρέχει ένα ευέλικτο, ποσοτικά, και φυσιολογικώς σχετικό εναλλακτική λύση για τρέχουσες μεθόδους. Εισβολή στο σύστημα αυτό αντανακλά την επικράτηση της ΗΑ σε συνδετικούς ιστούς και το ρόλο του στην προαγωγή του καρκίνου κυτταρικής κινητικότητας και προσβολή ιστού, καθιστώντας το σύστημα ιδανικό για τη μελέτη εισβολή μέσω του μυελού των οστών ή άλλων ΗΑ πλούσια συνδετικούς ιστούς. Η διαδικασία διασταυρούμενη σύνδεση βιοσυμβατή χρησιμοποιήσαμε επιτρέπει την άμεση ενθυλάκωση των καρκινικών κυττάρων εντός του πηκτώματος, όπου θεσπίζει διακριτό, σύμπλεγμα-όπως μορφολογία. Μεταστατικά κύτταρα του προστάτη σε αυτές τις υδροπηκτές αναπτύξουν στενόμακρα δομές, «invadopodia», σύμφωνα με την επεμβατική τους ιδιότητες. Ο αριθμός των invadopodia, καθώς και το μέγεθος του συμπλέγματος, το σχήμα και τη σύγκλιση, μπορεί να παρέχει ένα μέτρο της ποσοτικώς επεμβατική δυναμικό. Μεταξύ πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν υποψήφιος υαλουρονάνη που θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για τη συμπεριφορά που παρατηρήσαμε, βρήκαμε ότι καλλιέργεια στην υδρογέλη ΗΑ προκαλεί μεταστατικών κυττάρων προστάτη σε διαφορικά εκφράσουν και να εντοπίσουν υποδοχέας για μεσολάβηση υαλουρονάνη κινητικότητα (RHAMM) /CD168 το οποίο, εν απουσία CD44, φαίνεται να συνεισφέρει προς PCA κινητικότητα και εισβολή από την αλληλεπίδραση με τα συστατικά υδρογέλης ΗΑ. PCa εισβολή κυττάρου μέσω της υδρογέλης ΗΑ επίσης βρέθηκε να εξαρτάται από τη δραστικότητα του υαλουρονιδασών. Μελέτες που παρουσιάζονται εδώ αποκαλύπτουν ότι ενώ η δραστηριότητα υαλουρονιδάση είναι απαραίτητη για invadopodia και διασυνδεόμενων σχηματισμό συμπλέγματος, δραστηριότητα από μόνη της δεν είναι αρκετή για να συμβεί εξαγορά της εισβολής. Συνεπώς, προτείνουμε ότι η ανάπτυξη των χωροκατακτητικών συμπεριφορά στα συστήματα 3D HA-based απαιτεί την ανάπτυξη πρόσθετων κυτταρικών χαρακτηριστικών, όπως η ενεργοποίηση σχετίζεται κινητικότητας μονοπατιών που ρυθμίζουν τον σχηματισμό της invadopodia. Έτσι, αναφέρουμε την ανάπτυξη ενός συστήματος 3D επιδέχονται διαχωρισμό των βιολογικών διεργασιών που σχετίζονται με τον καρκίνο των κυττάρων κινητικότητα μέσω ΗΑ πλούσια σε συνδετικούς ιστούς

Παράθεση:. Gurski LA, Xu Χ, Labrada LN, Nguyen NT, Xiao L, van Golen KL, et al. (2012) Η υαλουρονάνη (ΗΑ) πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν RHAMM και υαλουρονιδάσης Επιπτώσεων του προστάτη Cancer Cell Συμπεριφορά και Invadopodia Σχηματισμός σε 3D HA-Based υδρογέλες. PLoS ONE 7 (11): e50075. doi: 10.1371 /journal.pone.0050075

Επιμέλεια: Sharon Ζερέκ, Johns Hopkins University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 του Ιούν του 2012? Αποδεκτές: 15 του Οκτ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 του Νοεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Gurski et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (www.nih.gov) P01CA098912 (MCFC) και P20RR016458, P20RR017716, R01DC008965 (XJ), το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (www.nsf.gov) DMR 0643226 (XJ) και IGERT 0221651 (LG) και Delaware Υγεία Επιστήμη Alliance (DHSA) (www.delawarehsa.org) (XJ), το Υπουργείο άμυνας (www.defense.gov) PCRP W81XWH-05-1-0005 και W81XWH-08-1-0356 ( KLVG) και PCRP W81XWH-11-1-0564 (LG), και το Κέντρο Μεταγραφική Έρευνα του Καρκίνου (www.udel.edu/ctcr). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η πλειοψηφία των ασθενών που πεθαίνουν από συμπαγείς όγκους κάθε χρόνο υποφέρουν από οστικές μεταστάσεις [1]. Τα τρία συνηθέστερα διαγνωστεί τύπους καρκίνου, του προστάτη, του πνεύμονα, και μαστού, μετάσταση στα οστά. Μετάσταση στα οστά μειώνει δραματικά την ποιότητα ζωής λόγω του πόνου, κατάγματα, και υπερασβεστιαιμία [2]. Επιπλέον, η παρουσία των μεταστάσεων στα οστά μειώνει τα ποσοστά επιβίωσης. Για τον καρκίνο του προστάτη (PCA), το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για την τοπική ασθένεια είναι 100%, ενώ το ποσοστό πέφτει στο 30% για προχωρημένη νόσο με απομακρυσμένες μεταστάσεις [1]. Επί του παρόντος, υπάρχουν λίγες αποτελεσματικές θεραπείες για την αντιμετώπιση μετάστασης στα οστά ή για την πρόληψη της μετάστασης στα οστά ή άλλες θέσεις [2]. έτσι Μια καθορισμένη κλινική ανάγκη υπάρχει για την ανάπτυξη νέων θεραπειών για τη θεραπεία και την πρόληψη οστικών μεταστάσεων που περιλαμβάνουν κινητικά, επεμβατική καρκινικά κύτταρα που μπορεί εύκολα να αποικίσουν συνδετικούς ιστούς όπως ο μυελός των οστών.

Η μελέτη των οδών που ελέγχουν την προσβολή καρκινικών κυττάρων ή μετανάστευση , και η ανάπτυξη νέων φαρμάκων για την πρόληψη αυτών των διαδικασιών απαιτεί συστήματα που μπορεί να μετρήσει τις επεμβατικές ιδιότητες αυτών των κυττάρων [3], [4]. Προς το παρόν διαθέσιμες δοκιμασίες εισβολής και της μετανάστευσης είναι λιγότερο από το ιδανικό στο ότι συχνά: 1) είναι δύσκολο να ποσοτικοποιηθούν, 2) είναι δύσκολο να προσαρμοστεί στις ατομικές καρκινικών κυττάρων συμπεριφορές, ή 3) χρησιμοποιούν μήτρες όπως προκύπτουν ζώων Matrigel ™ που περιέχει αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι περιπλέκουν πειραματικά αποτελέσματα [3], [5], [6].

Η μήτρα του μυελού των οστών αποτελείται από μαλακό, σαν ζελέ συνδετικού ιστού πλούσια σε υαλουρονικό οξύ (ΗΑ) [7], [8]. Το ΗΑ είναι ένα μεγάλο, μη θειωμένη γλυκοζαμινογλυκάνη αποτελούνται από επαναλαμβανόμενες β-1,4-συνδεδεμένη ϋ-γλυκουρονικό οξύ και β-1,3 Ν-ακετυλο-D-γλυκοζαμίνης δισακχαρίτη μονάδες [9]. ΗΑ βρίσκεται παντού στην εξωκυτταρική μήτρα (ECM) όλων των τύπων κυττάρων, αλλά είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένο σε συνδετικούς ιστούς. Τα κύτταρα μπορούν να δεσμεύουν ΗΑ μέσω διαφόρων υποδοχέων, περιλαμβανομένων συστάδας διαφοροποιήσεως 44 (CD44) ή τον υποδοχέα για υαλουρονάνη μεσολάβηση κινητικότητα (RHAMM) [10]. Στα καρκινικά κύτταρα, RHAMM έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύουν CD44 στην κυτταρική επιφάνεια, και δεσμευτική ΗΑ σε αυτό το σύνθετο προωθεί κατάντη σηματοδότησης με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση Rho ΟΤΡάσης και αυξημένη κυτταρική μετανάστευση [11], [12]. Και οι δύο έχουν τα επίπεδα RHAMM και την έκφραση CD44 έχει συνδεθεί με την εξέλιξη ενός αριθμού καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων προστάτη [13], [14].

Ένας άλλος τρόπος ότι τα κύτταρα αλληλεπιδρούν με ΗΑ είναι υποβαθμίζοντας αυτό, με την έκφραση και την έκκριση του υαλουρονιδασών (HAases). Σχετική προς PCA εισβολή είναι οι HAases, Hyal-1 και Hyal-2, των οποίων η έκφραση των επιπέδων έχουν ενοχοποιηθεί σε PCa μετάσταση [13], [15], [16]. Hyal-1 είναι ενεργή και σε χαμηλές PHS ώστε 3.5-3.8 και διασπά κάθε ΗΑ μοριακού βάρους σε τετραμερή [17]. Hyal-2 δείχνει βέλτιστη δραστικότητα σε ρΗ 6.0-7.0 και διασπά μεγάλου μοριακού βάρους ΗΑ στα ενδιάμεσα, 20 τεμάχια μεγέθους kDa [18]. Μία γλυκοζυλιωμένη, 57 kDa μορφή της Hyal-1 μπορεί να εκκρίνεται από τα κύτταρα [19]. έκκριση ΗΑάση μπορεί να διευκολύνει PCa μετάσταση επιτρέποντας καρκινικά κύτταρα να εισβάλουν στο ΗΑ-πλούσια μήτρα του συνδετικού ιστού.

Είναι σημαντικό ότι, HAases είναι druggable στόχους, υποδεικνύοντας την πιθανή χρήση τους ως στόχοι για την επιβράδυνση εισβολή και ενδεχομένως την πρόληψη της μετάστασης [20], [21]. Ένας αναστολέας ΗΑάση, χρωμογλυκικό δινάτριο (DSC) [22], [23] είναι εγκεκριμένο από τον FDA για χρήση για την ανακούφιση των συμπτωμάτων της αλλεργίας και του άσθματος, και εμφανίζει χαμηλή τοξικότητα σε ασθενείς [24], [25]. Η ικανότητά της να αναστέλλει PCa εισβολή και μετάσταση δεν έχει διερευνηθεί.

περιγράφηκε προηγουμένως την ανάπτυξη μιας υδρογέλης HA-based για καλλιέργεια των κακώς προσκολλημένα οστών μεταστατικά κύτταρα προστάτη [26]. Η υδρογέλη αποτελείται από δύο χημικώς τροποποιημένα συστατικά ΗΑ, αλδεϋδης που φέρει ΗΑ (HAALD) και αδιπικό οξύ διυδραζίδιο προερχόμενο ΗΑ (HAADH). Αυτά τα συστατικά σταυροειδείς δεσμούς μέσω του σχηματισμού δεσμών υδραζίνης, απελευθερώνοντας νερό ως το μόνο υποπροϊόν [27]. κύτταρα προστάτη μπορούν να ενθυλακωθούν στην υδρογέλη ΗΑ κατά τη διάρκεια της διαδικασίας σταυροσύνδεσης. Η βιωσιμότητα των ενθηκευμένων κυττάρων παραμένει υψηλή επί τουλάχιστον μία εβδομάδα [26]. Επειδή η ΗΑ είναι βακτηριακής προέλευσης, στερείται των ευκαρυωτικών αυξητικοί παράγοντες που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ανάπτυξη των κυττάρων, την εισβολή και τη μετανάστευση.

Για να μελετήσουν την ανάπτυξη των χωροκατακτητικών ιδιότητες των κυττάρων του προστάτη σε μια μητρική μήτρα του συνδετικού ιστού, που χρησιμοποίησε την σειρά LNCaP ανθρώπινου υποσειρές κυττάρων προστάτη που αναπτύχθηκαν για να μιμηθεί τη διαδικασία του προστάτη μετάσταση στα οστά. Αυτά τα κύτταρα θεωρούνται ως ένα από τα καλύτερα μοντέλα της εξέλιξης του προστάτη διαθέσιμη λόγω της ικανότητάς τους να σχηματίζουν κλινικά σχετική οστεοβλαστικών βλαβών σε ποντικούς [28]. Ατομική sublines στη σειρά LNCaP αντανακλούν τα βήματα της εξέλιξης της νόσου με τα κύτταρα LNCaP που αντιπροσωπεύουν μια πρώιμη όγκου του προστάτη που έχει φτάσει σε ένα κοντινό λεμφαδένα, τα κύτταρα C4 αντιπροσωπεύει επιθετική, τοπικά επεμβατική τα καρκινικά κύτταρα που επιβιώνουν μετά τον ευνουχισμό, κύτταρα C4-2 αντιπροσωπεύει επιθετική, μεταστατικό ασθένεια, και C4-2B κύτταρα που εκπροσωπούν προστάτη ευνουχισμό ανθεκτικά οστικών μεταστάσεων [29]. Χρησιμοποιώντας αυτά τα κύτταρα και το νέο σύστημα εισβολή γέλη 3D ΗΑ αναπτύξαμε, διερευνήσαμε το ρόλο των υποδοχέων ΗΑ και HAases σε PCa εισβολή και τη μετανάστευση μέσω ενός ΗΑ-πλούσια συνδετικού ιστού σαν μήτρα. Για τους σκοπούς αυτής της εργασίας που περιγράφουν την κίνηση των κυττάρων του προστάτη σε 3D υδροπηκτές, η οποία διαφέρει από τη μετανάστευση σε όλη πλαστικές επιφάνειες, περιγράφουμε τη μετανάστευση ως την προφανή κίνηση των κυττάρων μέσω των πορωδών υδροπηκτές αποδεικνύεται από την επέκταση των κυτταρικών διεργασιών που ονομάζουμε «invadopodia» και από το συγχώνευση των πρώην χωρίζονται συστάδες στις υδροπηκτές.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Ηλεκτροφόρηση, καλλιέργειας κυττάρων, και τα αντιδραστήρια επιμόλυνσης και προμήθειες αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA) . TCM ™ αντικατάστασης ορίζεται ορού αγοράστηκε από βουλευτής Biomedicals (Solon, ΟΗ). Υαλουρονικό οξύ (άλας νατρίου, 500 KDa και 1.3 MDA) γενναιόδωρα δώρισε από την Genzyme Corporation (Cambridge, ΜΑ). RHAMM (HMMR) και CD44 αντισώματα αγοράστηκαν από Novus Biologicals (Littleton, CO). HYAL2 και αντίσωμα β-ακτίνης αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Equine-α-ποντικού-HRP δευτερογενούς αντισώματος αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). ΗγΑΙ 1 αντίσωμα, υαλουρονιδάση όρχεων βοοειδούς (BTH), β-μερκαπτοαιθανόλη (ΒΜΕ), γλυκίνη, Tween © 20, αλβουμίνη βόειου ορού (BSA), μυρμηκικό νάτριο, Coomassie brilliant blue, χρωμογλυκικό δινάτριο (DSC), και δεοξυχολικό οξύ αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ). δευτερεύον αντίσωμα αίγας-α-κουνελιού-ΗΚΡ, αναστολείς πρωτεάσης (ΡΙ), ρυθμιστικό δείγμα 5Χ, σουλφο-ΝΗδ-SS-βιοτίνη, και αβιδίνη αγαρόζης αγοράστηκαν από Thermo Scientific (Rockford, IL). Laemmli ρυθμιστικό δείγματος και μπλε της Αλσατίας αγοράστηκαν από τη Biorad (Richmond, CA). ρυθμιστικό Tris, κρυσταλλικό οξικό οξύ, μεθανόλη, χαμηλού σημείου τήξεως (LMP) άγαρ, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), δωδεκυλ θειικό νάτριο (SDS), Triton Χ-100, και χλωριούχο νάτριο (NaCl) αγοράστηκαν από την Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). Nonidet Ρ-40 αγοράστηκε από την Roche (Indianapolis, IL) και αιθανόλη αγοράστηκε από Οβοοη Labs, Inc (King of Prussia, ΡΑ). Όλες οι ενώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ποιότητας αντιδραστηρίου ή καλύτερη.

Cell Culture

Χαμηλή αριθμό πέρασμα κύτταρα του προστάτη διατηρήθηκαν σε Corning (Lowell, MA) καλλιέργειας ιστού φιάλες 75 χιλιοστά σε 37 ° C σε 5,0% ( ν /ν) CO

2 σε Τ-μέσο συμπληρωμένο με 5% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 100 U /ml πενικιλίνη G νατρίου και 100 μg /ml θειική στρεπτομυκίνη σε 0,085% (w /v ) αλατούχο διάλυμα (PS). Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 2-3 ημέρες. Τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν σε περίπου 80% συρροή, κρίνεται από το μάτι, με τη χρήση 0,25% (β /ο) τρυψίνη με αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) 4 • Na. sublines LNCaP [30] ήταν γενναιόδωρα από τον Dr. Leland Chung και τα κύτταρα PC3 αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA).

Προετοιμασία HAALD και HAADH

Για να συνθέσει την αλδεΰδη ΗΑ (HAALD ), η αντίδραση οξείδωσης του ΗΑ (1,3 MDa) πραγματοποιήθηκε με την παρουσία υπεριωδικού νατρίου υπό υδατικές συνθήκες. Αδιπικό διυδραζίδιο (ADH)-τροποποιημένα ΗΑ (HAADH) συνετέθη με τη μεσολάβηση καρβοδιιμιδίου σύζευξη ADH με τις καρβοξυλομάδες του ΗΑ (500 KDa) σε υδατικές συνθήκες. Οι λεπτομερείς διαδικασίες για τη σύνθεση και τον χαρακτηρισμό των δύο αυτών των παραγώγων ΗΑ αναφέρθηκε σε προηγούμενη μελέτη μας [26].

Cell Culture σε 2D και 3D Προϋποθέσεις

HAALD και HAADH διαλύθηκαν χωριστά σε ϋυΐββοοο αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (DPBS) σε συγκέντρωση 10 mg /mL διάρκεια της νύχτας στους 37 ° C. 2% (β /ο) άγαρ LMP σε DPBS παρασκευάστηκε και τήχθηκε σε ένα C heatblock 70 ° (Labnet International, Woodbridge, NJ) τουλάχιστον 1 ώρα πριν από τη χρήση. Διαλύθηκαν παράγωγα ΗΑ αποστειρώθηκαν με υπεριώδη ακτινοβολία στα 254 nm για 15 λεπτά πριν τη χρήση.

κύτταρα προστάτη απελευθερώθηκαν από φιάλη τους χρησιμοποιώντας 0.25% (w /v) Θρυψίνη EDTA 4Na και ο συνολικός αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο (Häusser Scientific, Horsham, ΡΑ). 100000 (για πλάκα 24 φρεατίων) ή 600000 (για 6 φρεατίων) κύτταρα σφαιροποιήθηκαν για κάθε καλλιέργεια. ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας (Millipore, Billerica, ΜΑ, το μέγεθος των πόρων: 0,4 mm, διάμετρος 12 mm για πλάκα 24 φρεατίων, 30 mm για 6 πλάκα καλά) προ-βρεγμένα σε Τ-μέσου στη συνέχεια τοποθετούνται σε φρεάτια μιας 24 φρεατίων ή πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων (Beckton-Dickenson Labware, Franklin Lakes, NJ). Για 2D καλλιέργειες, κυτταρικό ίζημα αναμίχθηκε με Τ-μέσο (1 mL για πλάκα 24 φρεατίων, 4 mL για 6 φρεατίων) και καλλιεργήθηκαν.

Για 3D ΗΑ καλλιέργεια υδρογέλης, κυτταρικό ίζημα αναμίχθηκε με 100 μl (πλάκα 6 φρεατίων) (για πλάκα 24 φρεατίων) ή 300 μΙ HAALD. Ένας ίσος όγκος HAADH προστέθηκε και η καλλιέργεια αναμίχθηκε καλά για να διασπαρούν ομοιόμορφα κύτταρα. Το διάλυμα υδρογέλης συνέχεια μεταφέρθηκε με αναρρόφηση σε ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας προ-βρεγμένο και αφέθηκε να στερεοποιηθεί για περίπου 10 λεπτά στους 37 ° C. T-μέσο (1 κ.εκ. για 24-φρεατίων, 4 mL για πλάκα 6 φρεατίων) συμπληρωμένο με 1% (ν /ν) PS και είτε 5% (ν /ν) FBS ή 2% (ν /ν) TCM ™ ήταν προστίθεται γύρω από το ένθετο και η καλλιέργεια επωάστηκε στους 37 ° C, 5% (ν /ν) CO

2. Αυτή η συγκέντρωση του TCM ™ είναι συνεπής με προηγούμενες μελέτες συμπλήρωσή C4-2 καλλιέργεια [31], [32].

Για καλλιέργεια άγαρ 3D, κυτταρικό ίζημα αναμίχθηκε με 85 μΙ (για πλάκα 24 φρεατίων) ή 510 μΐ (για πλάκα 6 φρεατίων) DPBS θερμαίνεται στους 37 ° C. Προ-λιωμένο 2% (w /v) LMP άγαρ προστέθηκε στο μίγμα /κύτταρο DPBS σε τελική συγκέντρωση 0.3% (β /ο) άγαρ LMP. Άγαρ καλλιέργεια επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 5 λεπτά πριν το πιπετάρισμα στην ενθέτου κυτταρικής καλλιέργειας για την πρόληψη γέλη άγαρ από διαρροή μέσω των πόρων της μεμβράνης. Μόλις τοποθετήθηκαν σε ένθετο, η γέλη άγαρ αφέθηκε να στερεοποιηθεί για περίπου 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στερεοποίηση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για να επισπεύσει πηκτωματοποίηση του μαλακού άγαρ. T-μέσο (1 mL για πλάκα 24 φρεατίων, 4 mL για πλάκα 6 φρεατίων) στη συνέχεια προστέθηκε γύρω από το ένθετο και η καλλιέργεια επωάστηκε στους 37 ° C, 5% (ν /ν) CO

2. Για όλες τις καλλιέργειες, οι αλλαγές ήμισυ μέσου διεξήχθησαν κάθε δύο ημέρες.

Η μεταβολική δραστηριότητα μετράει και κυττάρων διεξήχθησαν για τους τύπους κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας που περιγράφονται. Για τη μέτρηση της μεταβολικής δραστηριότητας των κυττάρων, υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου-1 (WST-1, Roche) αντιδραστήριο χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται [33] με τις ακόλουθες τροποποιήσεις: η δοκιμασία διεξήχθη σε πλάκα 24 φρεατίων σε κύτταρα καλλιεργούνται για τρεις ή έξι ημέρες. WST-1 αντιδραστηρίου (100 μλ) εφαρμόστηκε σε 1 mL μέσου καλλιέργειας και η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C για 1 ώρα. Μετά την επώαση, 100 μΐ μέσου καλλιέργειας απομακρύνθηκε και τοποθετήθηκε σε μια πλάκα 96 φρεατίων. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm σε έναν ανιχνευτή DTX880 πολύτροπη (Beckman Coulter, Brea, CA). Να μετρήσει τους αριθμούς των κυττάρων εντός της υδρογέλης ΗΑ, χρησιμοποιήθηκαν εικόνες αντίθεσης φάσης. Μέσα σε αυτές τις εικόνες, επελέγη μια μέση μεγέθους σύμπλεγμα κυττάρου με σαφή όρια των κυττάρων και ο αριθμός των κυττάρων του συμπλέγματος μετρήθηκε. Ο αριθμός αυτός πολλαπλασιάζεται με το συνολικό αριθμό των clusters στην εικόνα, δίνοντας μια κατά προσέγγιση συνολικός αριθμός κυττάρων ανά φωτογραφηθεί τομέα.

Εισβολή Δοκιμασία Μέθοδοι Ποσοτικοποίηση

Για όλους τους προσδιορισμούς εισβολής, ελήφθησαν εικόνες αντίθεσης φάσης από κάθε καλλιέργεια κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse TE2000-U (Tokyo, Japan) μικροσκόπιο και ένα αντικειμενικό φακό 10Χ. Ο μέσος αριθμός των invadopodia προσδιορίστηκε μετρώντας τον συνολικό αριθμό των invadopodia ανά φωτογραφήθηκε πεδίο για τρεις βιολογικούς επαναλήψεις. Ένα «invadopodium» ορίστηκε ως μία λεπτή κυτταρική διαδικασία που εκτείνεται προς τα έξω από ένα σύμπλεγμα κύτταρο, και αρκετά σαφής για να αναγνωριστούν εύκολα με το μάτι. Το ποσοστό της συγχώνευσης clusters υπολογίστηκε μετρώντας τόσο τον αριθμό των clusters σε φυσική επαφή με ένα άλλο σύμπλεγμα και τον αριθμό των ελεύθερων clusters για τρεις βιολογικούς επαναλήψεις. Από αυτές τις τιμές, το ποσοστό των συγχωνευόμενων clusters υπολογίστηκε και θεωρείται ένας δείκτης της μετανάστευσης σε 3D υδρογέλες. Σε δείγματα όπου παρατηρήθηκαν τα δίκτυα των κυτταρικών συστάδων, ένα μοναδικό σύμπλεγμα κύτταρο ορίστηκε ως διακριτή, στρογγυλεμένη περιοχή του κυψελοειδούς δικτύου μερικές φορές εμφανίζονται να περιέχουν υψηλότερη πυκνότητα κυττάρου. Για τους δύο τύπους της ποσοτικοποίησης, ελήφθη μέριμνα ώστε να διασφαλιστεί η συνέπεια όταν εκτελούνται μετρήσεις.

Ρεολογία

Ρεολογικές χαρακτηρισμός των δειγμάτων υδρογέλης πραγματοποιήθηκαν σε ένα άγχος-ελεγχόμενο ροόμετρο (AR-G2, TA Instruments, New Castle, DE) με διάμετρο 20 χιλιοστά πρότυπο χάλυβα γεωμετρία παράλληλης πλάκας και σε ένα κενό 100 μm. Δυναμική ταλάντωσης σκουπίσματα φορά διεξήχθησαν στους 25 ° C ή 37 ° C για άγαρ και τζελ ΗΑ αντίστοιχα, και η αποθήκευση (G ‘) και απώλειας (G «) συντελεστές καταγράφηκαν. διάλυμα άγαρ 30 μl (0.3% β /ο) ή μείγμα HAADH /HAALD (1% w /v) φορτώθηκε μέσα στην γεωμετρία που στη συνέχεια καλύπτεται με ορυκτέλαιο στην άκρη για να αποτραπεί η εξάτμιση του νερού. Αυτά τα μίγματα αφέθηκαν να στερεοποιηθούν

in situ

ως ελήφθησαν οι μετρήσεις. Δυναμική ταλάντωσης σαρώνει χρόνο συλλέχθηκαν σε γωνιακές συχνότητες των 6 rad /s και το 1% της τάσης που επιλέγονται από τη γραμμική ιξωδοελαστική καθεστώτος [34]. Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν για τουλάχιστον τρία δείγματα και ο μέσος όρος τα δεδομένα παρουσιάζονται.

Protein Extraction

Τα κύτταρα συνδυάζονται από δύο φρεάτια μιας καλλιέργειας πλακός 6 φρεατίων χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα εκχύλιση πρωτεϊνών. BTH (180 μΐ σε 10 mg /mL) εφαρμόστηκε και οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά. Οι καλλιέργειες μεταφέρθηκαν σε σωλήνες φυγοκέντρησης και τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε 3000 RPM. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με DPBS. Ραδιοανοσοκαταβύθιση (RIPA) ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM Tris ρυθμιστικό ρΗ 8.0, 150 mM NaCl, 0,5% (β /ο) δεοξυχολικό οξύ, 1% (ν /ν) Nonidet Ρ-40, 0.1% (w /v) SDS, αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O, 200 μΐ) που περιείχε ΡΙ εφαρμόστηκε στα κυτταρικά ιζήματα. Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν σε πάγο για 45 λεπτά με περιστασιακή περιδίνηση. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στις 13.000 στροφές ανά λεπτό (RPM) για 10 λεπτά. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης από τα προϊόντα λύσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία δικινχονινικού οξέος (BCA) πρωτεΐνη (Thermo Scientific) ακολουθώντας ένα πρότυπο πρωτόκολλο. Τα λύματα αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C.

Western Blotting

Πρωτεΐνη (50 μg) αναμίχθηκε με ρυθμιστικό RIPA και 5Χ Lane Marker Ρυθμιστικού Διαλύματος Δείγματος και βΜΕ (3% (ν /ν) τελικό ) σε ένα συνολικό όγκο 25 μΙ. Τα δείγματα έβρασαν για 5 λεπτά, στη συνέχεια ψύχθηκε και γρήγορα περιστράφηκε. Δείγματα και μια σκάλα πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε 4-12% NuPAGE Bis-Tris γέλης χρησιμοποιώντας ένα Χ-Cell Surelock ™ κύτταρο ηλεκτροφόρηση και MOPS ρυθμιστικού τρέξιμο. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας μια συσκευή μεταφοράς X-Cell ™ II και ένα ρυθμιστικό μεταφοράς που αποτελείται από 1,5125 mg /mL Tris, 7,2 mg /mL γλυκίνη, και 0,01% (β /ο) SDS σε μια ρύθμιση των 21V για 1.5 ώρα.

Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε 3% (w /v) BSA σε DPBS που περιείχε 0.1% Tween® 20 (PBST) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ήπια ανακίνηση. Πρωτογενή αντισώματα (1:10,000 για RHAMM, 1:5000 για CD44 και β-ακτίνη, 1:500 για ΗγΑΙ 1 και HYAL2) σε 3% (w /v) BSA σε PBST επωάστηκαν με την μεμβράνη για 2,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με κλονισμός. Η μεμβράνη πλύθηκε 3 φορές, 10 λεπτά κάθε φορά, με PBST. Δευτερογενής αντισώματα (HRP 1:5000 κατσίκα-α-κουνέλι ή 1:10,000 ιπποειδών-α-ποντικού HRP) σε 3% (w /v) BSA (για ΗγΑΙ 1, HYAL2, και β-ακτίνη blots) ή 3% (w /v) σκόνη άπαχου γάλακτος (για RHAMM και CD44 στυπώματα) επωάστηκαν με την μεμβράνη για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ανακίνηση. Η μεμβράνη πλύθηκε 3 φορές, 10 λεπτά κάθε φορά, με PBST. Supersignal® West Dura παρατεταμένη διάρκεια Υπόστρωμα (Thermo Scientific) παρασκευάστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες και εφαρμόστηκε στη μεμβράνη για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με ανακίνηση. Η κηλίδα εκτέθηκε χρησιμοποιώντας BioMax Light Film (Kodak, Rochester, NY) και αναπτύχθηκε σε έναν προγραμματιστή SRX-101A (Konica Minolta Ιατρική & amp? Γραφικών Inc, Tokyo, Japan). PC-3 κυτταρικής λύσης (50 μg) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για CD44 γουέστερν.

Πρωτόκολλο ανοσοχρώση

κύτταρα αναπτύσσονται σε 2D καλλιεργήθηκαν σε 8 καλά Lab-Tek II θάλαμο coverglass ( Nalge Nunc, Naperville, IL). Το μέσο απομακρύνθηκε και οι θάλαμοι πλύθηκαν 2 φορές με DPBS. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν για 10 λεπτά σε 4% (ν /ν) παραφορμαλδεϋδη (PFA) (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, ΡΑ) σε ddH2O. Η περίσσεια PFA απομακρύνθηκε και οι θάλαμοι πλύθηκαν δύο φορές με DPBS. Triton Χ-100 σε DPBS (0.2% (ν /ν)) παρασκευάστηκε και εφαρμόστηκε σε θαλάμους για 10 λεπτά. Η περίσσεια του διαλύματος Triton Χ-100 απομακρύνθηκε και θάλαμοι πλύθηκαν δύο φορές με DPBS. Οι καλλιέργειες μπλοκαριστεί στο 3% (β /ο) BSA σε DPBS σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 1:1000 (ν /ν) διάλυμα του RHAMM ή CD44 πρωτογενή αντισώματα σε 3% BSA στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Ένα διάλυμα 1:1000 (v /v) του DRAQ5 (Biostatus Limited, Leicestershire, UK) σε DPBS εφαρμόσθηκε επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Επιμελητήρια και πάλι πλύθηκαν με DPBS και Gel /Όρος ™ (Biomeda, Foster City, CA) προστέθηκε σε θαλάμους για την πρόληψη φωτολεύκανση. Τα κύτταρα οπτικοποιήθηκαν με τη χρήση ομοεστιακού μικροσκοπίου σε ένα Zeiss LSM 510 VIS (Carl Zeiss, Maple Grove, ΜΝ).

Τα κύτταρα σε 3D καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων, όπως περιγράφεται παραπάνω. συστάδες κυττάρων απομακρύνθηκαν απαλά από την υδρογέλη χρήση μικροπιπέτας. Clusters πλένονται απαλά με 1 mL DPBS 2 φορές, φυγοκέντρηση γρήγορα να συγκεντρώσει ομάδες κυττάρων κάθε φορά. Clusters επαναιωρήθηκαν προσεκτικά σε 4% (ν /ν) PFA και μεταφέρεται σε ένα 8 καλά θάλαμο coverglass. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Μόλις μεταφερθεί στο θάλαμο coverglass, χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιες διαδικασίες χρώσης όπως χρησιμοποιείται για 2D καλλιέργεια. Ακραία ελήφθη μέριμνα να διατηρήσει όσες ομάδες κυττάρων όσο το δυνατόν κατά τη διάρκεια κάθε σταδίου απομάκρυνσης υγρού.

Cell Surface Βιοτινυλίωση Δοκιμασία

C4-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μια φιάλη Τ-75 έως περίπου 90% συρροή. Τα κύτταρα αποδεσμεύτηκαν από την φιάλη, εναιωρήθηκε σε Τ-μέσον και μετρήθηκαν. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές σε παγωμένο PBS (ρΗ 8.0, 5 mL). Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο PBS (ρΗ 8.0) σε τελική συγκέντρωση 20 × 10

6 κύτταρα /mL. Προσφάτως παρασκευασμένα, 10 mM σουλφο-ΝΗδ-SS-βιοτίνη (80 μΙ) προστέθηκε στο μίγμα κυττάρου και το μίγμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά με ανακίνηση. 50 mM Tris (ρΗ 8,0, 2 mL) προστέθηκε για την απενεργοποίηση της αντίδρασης βιοτινυλίωσης, και το κυτταρικό ίζημα στην συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με PBS (ρΗ 8.0, 2 mL). Η τελική πλύση PBS απομακρύνθηκε εντελώς από το κυτταρικό ίζημα, και ρυθμιστικό διάλυμα RIPA που περιέχει ΡΙ (500 μλ) εφαρμόστηκε στο κυτταρικό ίζημα. Η αντίδραση λύσεως επωάζεται επί πάγου επί μία ώρα. Το προϊόν λύσης καθαρίστηκε με φυγοκέντριση στα 12.000 rpm για 10 λεπτά, μετά την οποία αφαιρέθηκε το υπερκείμενο και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C

Μια δοκιμασία BCA διεξήχθη επί του βιοτινυλιωμένου κυτταρολύματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως.? περίπου ελήφθησαν 1,5 mg πρωτεΐνης. Αβιδίνη αγαρόζης (1 mL) εφαρμόστηκε σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρου και η ρητίνη διευθετήθηκε με φυγοκέντρηση 1 λεπτό σε 2000 rpm. Η ρητίνη πλύθηκε τρεις φορές με ρυθμιστικό RIPA (500 μΙ). Το προϊόν της λύσεως εφαρμόστηκε στη ρητίνη και το μίγμα επωάστηκε σε συσκευή περιστροφής σωλήνα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Η ρητίνη διευθετήθηκε με φυγοκέντρηση 1 λεπτό στα 2000 RPM και το αδέσμευτο λύμα αφαιρέθηκε. Χωρίς περιορισμούς λύμα (10 μΐ) αναμίχθηκε με Laemmli ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος που περιέχει 5% (ν /ν) βΜΕ (10 μΙ). Η ρητίνη πλύθηκε τρεις φορές με RIPA που περιείχε ΡΙ (500 μΙ). Laemmli ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος που περιέχει 5% βΜΕ (50 ml) εφαρμόζεται στα σφαιρίδια. Laemmli περιέχουν μείγματα έβρασαν για 5 λεπτά, στη συνέχεια περιστρέφονται στις 13.000 RPM. Το βιοτινυλιωμένο pulldown και αδέσμευτο κλάσμα ηλεκτροφορήθηκαν και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Bone μεταστατικού PCa κυττάρων (PC3) προϊόν λύσης (10 μΙ) αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli που περιέχει βΜΕ (10 μλ) συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος για έκφραση CD44. Western blotting για CD44, RHAMM και GAPDH διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στην ενότητα «Western Blotting».

RHAMM Knockdown

C4-2 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ελεύθερο από αντιβιοτικά για τρεις ημέρες πριν την επιμόλυνση. Μικτή 6 pmol /cm

2 Stealth RNAi ™ siRHAMM διπλής όψης (GGCGUCUCCUCUAUGAAGAACUAUA και UAUAGUUCUUCAUAGAGGAGACGCC) και 0.5 μl /cm

2 Lipofectamine ™ RNAiMAX στο Optimem® Ι για RHAMM νοκ ντάουν ή 6 pmol /cm

2 χαμηλά GC Stealth RNAi ™ duplex αρνητικού ελέγχου και 0,5 μl /cm

2 Lipofectamine σε Optimem για τον έλεγχο της επιμόλυνσης. μείγματα Επιμόλυνση επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την εφαρμογή στα κύτταρα. Αντιδράσεις Η επιμόλυνση επωάστηκαν για έξι ώρες στους 37 ° C και οι πλάκες ανακινείται ήπια κάθε ώρα για να αναμειχθεί αντιδραστήρια επιμόλυνσης.

Το μείγμα επιμόλυνσης αναρροφήθηκε από τα κύτταρα, και τα κύτταρα πλύθηκαν με ϋΡΒδ. Αντιβιοτικό μέσο ελεύθερο εφαρμόστηκε στα κύτταρα και επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C όλη τη νύχτα πριν από τη χρήση για πειράματα. Αποτελεσματικότητα του RHAMM νοκ ντάουν αξιολογήθηκε μέσω της Western blotting για RHAMM, όπως περιγράφεται στην ενότητα «Western Blotting».

Δοκιμασία υαλουρονιδάση Δραστηριότητα

ΗΑάση δραστηριότητα εξετάστηκε με ηλεκτροφόρηση σε γέλη υποστρώματος [35], [36 ]. Χαμηλού μοριακού βάρους ΗΑ διαλύθηκε όλη τη νύχτα στους 37 ° C σε απεσταγμένο ύδωρ (0,17 mg /mL). Αυτό το διάλυμα ΗΑ χρησιμοποιείται αντί του νερού στην παρασκευή ενός 12% (β /ο) ακρυλαμίδιο ProtoGel® γέλη (National Diagnostics, Cherry Hill, NJ). LNCaP, C4, C4-2 και προϊόντα λύσης C4-2B ή 50 μg BTH αναμίχθηκαν με ίσους όγκους ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος Lamelli (5% (ν /ν)) και φορτώνονται στο ΗΑ που περιέχει γέλη. Η γέλη ηλεκτροφορήθηκε χρησιμοποιώντας ένα X-Cell Surelock ™ ηλεκτροφόρηση κυττάρων και MOPS τρέχον ρυθμιστικό. Η πηκτή στη συνέχεια απομακρύνθηκε από την κασέτα και πλύθηκε επί μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε 3% (ν /ν) Triton Χ-100 σε PBS. Η πηκτή στη συνέχεια επωάστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα μυρμηκικού-NaCl (0.1 Μ μυρμηκικό νάτριο και 0.15 Μ χλωριούχο νάτριο διαλύονται σε αποσταγμένο νερό, ρΗ 4,6) για 16-20 ώρες στους 37 ° C. Η πηκτή πλύθηκε δύο φορές με απεσταγμένο νερό κατόπιν επωάζονται με ένα 0,5% (β /ο) μπλε της Αλσατίας σε 3% (ν /ν) κρυσταλλικού διαλύματος οξικού οξέος για μία ώρα για να ανιχνεύσει την παρουσία του ΗΑ. Η πηκτή πλύθηκε τρεις φορές επί μία ώρα κάθε μία με 7% (ν /ν) διάλυμα οξικού οξέος για αποχρωματισμού και στερέωση. Η πηκτή στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με απεσταγμένο νερό, και δύο φορές με ένα μίγμα μεθανόλης 50% (ν /ν), 10% παγετώδους διάλυμα (ν /ν) οξικό οξύ. Για την ανίχνευση της παρουσίας πρωτεΐνης στο πήκτωμα, αυτό στη συνέχεια επωάζεται με 0,25% (β /ο) Coomassie brilliant blue σε 9% (ν /ν) αιθανόλη, 45.5% (ν /ν) κρυσταλλικού οξικού οξέος για μία ώρα. Αυτό ακολουθήθηκε από τρεις πλύσεις μία ώρα με την μεθανόλη /οξικό οξύ διάλυμα πλύσης.

Θεραπεία Καλλιέργειες με ΗΑάση Αναστολέα

Ένα διάλυμα από 125 mM DSC παρασκευάστηκε σε 40% (ν /ν) DMSO και διηθείται σε ένα φίλτρο Steriflip (Millipore) για την αποστείρωση. DSC (3,33 ή 10 μΐ 125 mM) προστέθηκε σε 800 μλ ή 2,4 mL Τ-μέσου σε 24 ή 6 φρεατίων, αντίστοιχα, σε μία τελική συγκέντρωση 500 μΜ DSC, το IC-50 τιμή αυτού του αναστολέα [37] . Μία ίση ποσότητα από 40% (ν /ν) DMSO χρησιμοποιήθηκε ως ελέγχου του οχήματος. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε τρεις ημέρες και φρέσκο ​​διάλυμα DSC ή DMSO εφαρμόστηκε όπως περιγράφεται.

αποκλεισμό trypan blue

Η τοξικότητα του DSC σε κύτταρα προστάτη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα μπλε της τρυπάνης δοκιμασία αποκλεισμού. 600.000 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων με μέσο Τ, 5% (ν /ν) FBS, 1% (ν /ν) PS (4 mL). Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας, οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DSC ή όχημα ελέγχου όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Στις τρεις και έξι ημέρες χρονικά σημεία, το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα απελευθερώθηκαν με θρυψίνη (250 μΙ). Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν, μετά επαναιωρήθηκαν σε 500 μέσο υί Τ. 50 υί ενός 0.4% (β /ο) διάλυμα κυανού τρυπανίου σε ρυθμιστικό διάλυμα ισοτονικό άλας προστέθηκε σε κάθε δείγμα. Ο συνολικός αριθμός των λευκών (live) και τα κύτταρα μπλε (νεκρά) προσδιορίστηκε με απαρίθμηση σε ένα αιμοκυτταρόμετρο. Το ποσοστό των ζωντανών κυττάρων προσδιορίστηκε από τα δεδομένα αυτά.

Στατιστική Ανάλυση

Οι ράβδοι σφάλματος σε όλα τα σχήματα εμφανίζουν τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε με τη χρήση δύο δειγμάτων δύο-tailed t-test του Student με ρ & lt?. 0,05 θεωρείται σημαντική

Αποτελέσματα

Invadopodia και Σχηματισμός Cluster σε 3D ΗΑ υδρογέλες

Invadopodia και διασποράς απάντηση σχηματισμό σε μιτογονική παράγοντες.

σε αρχικά πειράματα, αξιολογήσαμε τη μορφολογία των κυττάρων C4-2 στο σύστημα υδρογέλης κυτταρικής καλλιέργειας ΗΑ για να προσδιοριστεί εάν οι διαφορές θα μπορούσε να θεωρηθεί ως απάντηση στην FBS χρησιμοποιείται ως μιτογονική παράγοντας για την τόνωση της κινητικότητας. Οι καλλιέργειες ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TCM ™, ένα φυτό που βασίζεται αντικατάσταση του ορού να διατηρηθεί η ανάπτυξη και βιωσιμότητα κυττάρου, χωρίς τη δυνατότητα να προωθήσει εισβολή και τη μετανάστευση. Ενώ TCM ™ κατεργάζεται C4-2 κύτταρα έδειξαν χαμηλότερη μεταβολική παραγωγή σε σύγκριση με FBS, αξιολογήθηκε με προσδιορισμό WST, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο εκτιμώμενο μετρήσεις κυττάρων για κύτταρα που αναπτύσσονται σε κάθε κατάσταση είτε σε τρεις ή έξι χρονικά σημεία ημέρα (βλέπε πίνακα S1). Παρατηρήσαμε και να ποσοτικοποιηθούν οι διαφορές μορφολογίας των κυττάρων σε αυτά τα πηκτώματα, ως μέτρο της δυνητικής κυτταρικής εισβολής και ικανότητα μετανάστευσης.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, και στα δύο τρία και έξι χρονικές στιγμές ημέρα, το TCM ™ κατεργάζεται C4-2 καλλιέργειες έδειξε μικρότερα, καλά καθορισμένες κυτταρικές συστάδες ως επί το πλείστον άνευ επεμβατικές κυτταρικές διεργασίες (invadopodia). Σε αντίθεση, οι FBS-επεξεργασμένες καλλιέργειες έδειξαν μεγαλύτερες συστάδες κυττάρων που εμφανίστηκε πιο ανομοιόμορφα στο σχήμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι FBS αντιμετωπίζονται συστάδες παρατηρήθηκαν συχνά να συγχωνεύονται μαζί και να εμφανίζεται ένα σημαντικό αριθμό προφανής invadopodia σε κάθε χρονική στιγμή. Το ένθετο του Σχήματος 1Α εμφανίζει μια μεγεθυμένη εικόνα αυτών των δομών invadopodia. Οι συστάδες κυττάρων εμφανίστηκε μεγαλύτερη μετά από έξι ημέρες από μετά από τρεις ημέρες για κάθε αγωγή, αλλά ο αριθμός των invadopodia ήταν σχετικά σταθερή μεταξύ των δύο χρονικά σημεία.

Εικόνες κυττάρων C4-2 καλλιεργήθηκαν για τρεις ή έξι μέρες είτε με 2 % TCM ™ (έλεγχος) ή 5% FBS (μιτογονική παράγοντας) στη δοκιμασία υδρογέλης εισβολή ΗΑ. Arrow και ένθετο δείχνουν μια μεγεθυσμένη προβολή της εικόνας στην καλύτερη invadopodia οθόνη. Μαύρο κλίμακα ράβδοι αντιπροσωπεύουν 200 μm, λευκή γραμμή κλίμακας στο ένθετο αντιπροσωπεύει 50 μm (Α). Ποσοτικοποίηση για μέσο αριθμό invadopodia (Β) ή επί τοις εκατό συγχώνευση συστάδες (C) σε κάθε απεικονίζεται πεδίο. Οι ράβδοι σφάλματος = SEM, η = 3, *** ρ & lt?. 0.001

Η

Ποσοτικοποίηση του αριθμού των invadopodia αποκάλυψε ότι ο αριθμός των δομών αυτών ήταν σημαντικά υψηλότερη (ρ & lt? 0,0001) για θεραπεία FBS από για θεραπεία TCM ™ σε αμφότερα τα τρία χρονικά σημεία και έξι ημέρες (Σχήμα 1Β). Ο αριθμός των invadopodia δεν αυξήθηκε για κάθε μεταχείριση μεταξύ των δύο χρονικά σημεία. Ποσοτικοποίηση της συγχώνευσης ποσοστού διασποράς έδειξε ότι FBS αντιμετωπίζονται συστάδες κυττάρων C4-2 είχαν περισσότερες πιθανότητες να είναι συγχώνευση σε σύγκριση με το ™ επεξεργασμένα κύτταρα TCM και για τις δύο τριών και έξι χρονικές στιγμές την ημέρα (Σχήμα 1C). Σας ευχαριστούμε Δρ.