Αφηρημένο

Στην παρούσα μελέτη αξιολόγησε την έκφραση του ενδιάμεσου αγωγιμότητας ενεργοποιημένων από ασβέστιο κάλιο (KCa3.1 ) κανάλι σε ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ) και διερευνήθηκαν ρόλο της στην κυτταρική κινητικότητα. Ενώ το κανάλι KCa3.1 δεν εκφράζεται σε neuronal- και προέρχεται από γλοία ιστούς υγιών ατόμων, τόσο το mRNA KCa3.1 και η πρωτεΐνη υπάρχουν σε πληθυσμό καρκινικών γλοιοβλάστωμα, και ενισχύονται σημαντικά σε ΚΕΠ που προέρχονται τόσο από καθιερωμένη κυτταρική γραμμή U87MG και ένα πρωτογενές κύτταρο γραμμή, FCN9. Συνεπής με αυτά τα δεδομένα, η τάση-ανεξάρτητη και ΤΡΑΜ-34 ευαίσθητο καλίου ρεύματα μπορεί να καταλογιστεί στο κανάλι KCa3.1 καταγράφηκαν στο μυϊκό GL261 κυτταρική σειρά και αρκετές κύριες γραμμές ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος κύτταρα. Επιπλέον, σημαντικά υψηλότερο ρεύμα KCa3.1 καταγράφηκε σε U87MG-CD133 θετικά κύτταρα σε σύγκριση με τον αρνητικό υποπληθυσμό U87MG-CD133. Περαιτέρω, βρήκαμε ότι το κύτταρο όγκου κινητικότητα συνδέεται στενά με την έκφραση κανάλι KCa3.1. Ο αποκλεισμός του διαύλου KCa3.1 με τον συγκεκριμένο αναστολέα ΤΡΑΜ-34 έχει στην πραγματικότητα μεγαλύτερη επίδραση επί της κινητικότητας του ΚΕΠ (μείωση 75%), τα οποία εκφράζουν ένα υψηλό επίπεδο καναλιού KCa3.1, από ό, τι το γονικό πληθυσμό FCN9 ( μείωση κατά 32%), όπου το κανάλι KCa3.1 εκφράζεται σε χαμηλότερο επίπεδο. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης με τις ΚΕΠ που προέρχονται από U87MG. Επειδή εισβολή των γύρω ιστών είναι μία από τις κύριες αιτίες της αποτυχίας της θεραπείας σε γλοιοβλάστωμα, τα ευρήματα αυτά μπορεί να έχουν σημασία για τη μελλοντική ανάπτυξη νέων θεραπευτικών φαρμάκων καρκίνου

Παράθεση:. Ruggieri P, Mangino G, Fioretti Β, Catacuzzeno L , puca R, Ponti D, et al. (2012) Η αναστολή της KCa3.1 Κανάλια δραστηριότητα μειώνει κυτταρική κινητικότητα στο γλοιοβλάστωμα Προέρχεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (10): e47825. doi: 10.1371 /journal.pone.0047825

Επιμέλεια: Massimo ΑνοΜ, το Πανεπιστήμιο McGill, Καναδάς

Ελήφθη: May 30, 2012? Αποδεκτές: 17 Σεπτεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 22, Οκτωβρίου 2012

Copyright: © Ruggieri et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Fondazione Cassa di Risparmio, Περούτζια (FF) και από COFIN-MIUR (Ministero dell’Università e della Ricerca Scientifica) 812.111, 2007 (AC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (λειτουργική GBM) είναι η πιο συχνή κακοήθης Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ) των όγκων σε ενήλικες, και το πιο δύσκολο να θεραπεύσει παρά τις προόδους στη θεραπεία χειρουργική και ανοσοενισχυτικό [1]. Αντιπροσωπεύει 30 έως 60% των πρωτογενών όγκων του ΚΝΣ, με συχνότητα 2 έως 3 περιπτώσεις ανά 100 000 άτομα ανά έτος [2], [3]. Μόνο το 30% των ασθενών GBM ζουν περισσότερο από ένα έτος μετά τη διάγνωση, και ο μέσος όρος του προσδόκιμου ζωής παραμένει περίπου 14-18 μήνες [4], [5]. Η κακή πρόγνωση για τους ασθενείς GBM δεν έχει βελτιωθεί σημαντικά κατά τις τελευταίες δεκαετίες, κυρίως λόγω των δυσκολιών και των προκλήσεων στην ανίχνευση και τη θεραπεία αυτού του θανατηφόρου καρκίνου.

Πολλές ιδιότητες του καρκίνου, που περιλαμβάνει το γλοιοβλάστωμα, επηρεάζονται από την απορρύθμιση των ιόντων έκφραση κανάλι ή λειτουργία [6] – [8]. Μειωμένη έκφραση του προς τα μέσα ανορθωτή καναλιών K [9] και αυξημένη έκφραση της αμιλορίδης-εξαρτώμενων διαύλων Na [10], που ενεργοποιούνται με τάση Cl κανάλια [11], και τα κανάλια BK [12] έχουν αναφερθεί σε αρκετές γλοιώματα, σε σύγκριση με την κανονική αστροκύτταρα. έκφραση κανάλι KCa3.1 μπορεί επίσης να απελευθερωθεί το γλοιοβλάστωμα. Το κανάλι KCa3.1, επίσης γνωστή ως IK1, SK4, KCNN4, IKCa είναι ένα μέλος της οικογένειας των διαύλων ασβεστίου που ενεργοποιείται καλίου (KCa), με ένα μοναδιαίο αγωγιμότητα 20-60 PS σε συμμετρική 150 mMK [13], [14 ]. Διακρίνεται από τις λειτουργικά σχετικές ασβέστιο ενεργοποιούμενη διαύλων καλίου του μεγαλύτερου (100-200 pS? BK) και μικρότερα (2-20 pS? SK) μοναδιαία αγωγιμότητα από φαρμακολογία, βιοφυσικής και της φυσιολογίας [13] του, [14]. Και τα τρία μέλη της οικογένειας των διαύλων KCa δείχθηκε από την ομάδα Sontheimer για να μεταγραφεί σε κύτταρα γλοιώματος, αν και μόνο τα κανάλια ΒΚ ήταν λειτουργικά στον όγκο, και η αναστολή τους επηρεάζεται έντονα την κυτταρική μετανάστευση in vitro [15]. Πρόσφατα η ομάδα μας ανέφερε τη λειτουργική έκφραση του καναλιού KCa3.1 σε κυτταρικές γραμμές γλοιοβλαστώματος και έδειξαν ότι αυτά τα κανάλια έχουν βαθιές επιδράσεις στην προώθηση της μετανάστευσης κυττάρων, όπως φαίνεται από Transwell δοκιμασία μετανάστευσης σε παρουσία ειδικών αναστολέων διαύλου KCa3.1 [16]. Στη συνέχεια, η έκφραση και λειτουργική δραστηριότητα του καναλιού KCa3.1 εδραιώθηκε στους δύο γλοιώματος κυτταρικές σειρές και σε κύτταρα από μία πρωτογενή καλλιέργεια [17].

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι γλοιοβλαστώματα προέρχονται από μια δεξαμενή STEM- σαν κύτταρα που μοιράζονται κοινές ιδιότητες με νευρωνικών βλαστικών κυττάρων. Βλαστική ικανότητα συμπεριφορά και τη μεταναστευτική ικανότητα είναι στενά συνδεδεμένες και ρυθμίζονται με κοινή μονοπάτια σηματοδότησης [18]. Με βάση αυτά τα δεδομένα μας ήταν να διερευνηθεί αν τα κανάλια KCa3.1 που εμπλέκονται στη διαδικασία μεταναστευτικών των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν απομονώνονται από μόνιμες κυτταρικές σειρές που προέρχονται πρωτογενούς όγκου και. Βρήκαμε μια έντονη έκφραση ενεργά λειτουργικά κανάλια KCa3.1 στο εμπλουτισμένο κλάσμα των κυττάρων με ιδιότητες βλαστικών-όπως και ότι η επιλεκτική τους παρεμπόδιση δραματικά ανέστειλε την κυτταρική κινητικότητα.

Αποτελέσματα

Λειτουργική KCa3.1 τα κανάλια Εκφράζεται στο U87MG και GL261 τηλέφωνα γραμμές

για να προσδιοριστούν τα επίπεδα των KCa3.1 mRNA σε καρκινικά κύτταρα γλοιοβλαστώματος, μετρήσαμε την έκφραση τους από την Real-time PCR σε δύο καλά χαρακτηρισμένο κυτταρικές σειρές, η ανθρώπινη U87MG και η GL261 ποντικού.

KCa3.1

mRNA ανιχνεύεται σαφώς σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα σε σύγκριση με την ανθρώπινη και ποντικού φυσιολογική αστροκύτταρα. επίπεδα τους ήταν 118,47 ± 14,6 φορές υψηλότερη στην U87MG και 76.13 ± 16.52 σε κύτταρα GL261 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου, για να αξιολογηθεί η έκφραση πρωτεΐνης, έδειξε μια ζώνη -48 kDa στις δύο κυτταρικές σειρές συν-μεταναστεύει με το θετικό μάρτυρα που παρέχεται από το συγκεκριμένο παραγωγό αντίσωμα (Σχήμα 1Α). Η ποσότητα της πρωτεΐνης KCa3.1 ανιχνεύεται στο U87MG είναι σαφώς υψηλότερη σε σύγκριση με αυτή που παρατηρήθηκε από την GL261 κυτταρική γραμμή. Οπτική πυκνότητα (OD) μετρήσεις της έντασης μπάντα, μετά από κανονικοποίηση, εκτιμάται ότι το επίπεδο KCa3.1 στο U87MG να είναι περίπου 4 φορές υψηλότερη από ό, τι στο GL261. Αξιολογήσαμε επίσης τη συχνότητα των θετικών κυττάρων στις δύο κυτταρικές σειρές με ανάλυση κυτταρομετρίας (Σχήμα 1Β, C). Το ποσοστό των KCa3.1 θετικών κυττάρων ήταν 72.66% στην κυτταρική σειρά U87MG και 37,51% στην κυτταρική σειρά GL261. Αυτές οι συχνότητες είναι σχετικά υψηλές σε σύγκριση με εκείνη των KCa3.1 θετικά κύτταρα (2,82%) βρέθηκαν σε ενήλικα αστροκύτταρα ποντίκι φυσιολογικά, λαμβάνεται ως κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 1 D).

(Α) ανάλυση ανοσοκηλίδος των U87MG και GL261 έδειξαν έκφραση των καναλιών KCa3.1 συσχετίζονται με τα επίπεδα μεταγραφής. (Β) (C) κυτταροφθορισμομετρική ανάλυση των KCa3.1 επί U87MG, GL261 και ποντίκι φυσιολογικό ενήλικα αστροκύτταρα (ΝΜΑ). Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-KCa3.1 που ακολουθείται από αντι-κουνελιού αντίσωμα συζευγμένο AlexaFluor488-Goat όπως αναφέρεται στο τμήμα Υλικά και μέθοδοι. Δέκα χιλιάδες συμβάντα καταγράφηκαν και αναλύθηκαν με Cyflogic. Γκρι ιστογράμματα: κυτταρικό αυτοφθορισμό? μαύρα ιστογράμματα: AlexaFluor488 συζευγμένο Goat anti-Rabbit μόνο? πράσινο ιστογράμματα: αντι-KCa3.1 (D) Τυπική χρονική πορεία της τρέχουσας KCa3.1 από ένα κύτταρο GL261, καταγράφονται από IV καμπύλες σε 0 mV, υπό συνθήκες ελέγχου, μετά την εφαρμογή του DC-EBIO (100 μΜ) + ιονομυκίνης ( 500 ηΜ), και μετά την εφαρμογή του 3 μΜ ΤΡΑΜ-34 στην συνεχή παρουσία του DC-EBIO + ιονομυκίνη. ράμπες τάσης εφαρμόστηκαν κάθε 5 s. Γεμιστά κύκλοι είναι τα σημεία δεδομένων που λαμβάνονται αμέσως πριν από τις καμπύλες IV φαίνεται στον πίνακα Ε (Ε) Αντιπροσωπευτική IV καμπύλες προκύπτουν από την εφαρμογή ράμπες τάσης από -100 mV να +50 από ένα δυναμικό κράτησης 0 mV, υπό συνθήκες ελέγχου (CTRL), μετά η εφαρμογή της DC-EBIO + ιονομυκίνη, και μετά την προσθήκη του ΤΡΑΜ-34 στην συνεχή παρουσία του DC-EBIO + ιονομυκίνη. Μέση πυκνότητα (F) KCa3.1 ρεύμα που μετρήθηκε στο ποντίκι ΝΜΑ, ως έλεγχος, σε κυτταρικές γραμμές γλοιοβλαστώματος U87MG GL261 και σε 0 mV, αξιολογήθηκε ως η διαφορά μεταξύ της πυκνότητας ρεύματος κορυφής σε DC-EBIO + ιονομυκίνη και το υπολειμματικό ρεύμα μετά την προσθήκη της ΤΡΑΜ 34-(πρβλ μαύροι κύκλοι στο πάνελ D).

Η

Η λειτουργική έκφραση των καναλιών KCa3.1 σε U87MG και κύτταρα γλοιοβλαστώματος GL261 επιβεβαιώθηκε με μετρήσεις καθήλωσης σε όλη την κυττάρων διάτρητο διαμόρφωση. ΤΕΑ (3 mM) και octanole (1 mM) ήταν παρούσα σε όλα τα διαλύματα για να εμποδίσει την ΒΚ και μεσοκυττάριου κανάλια, συνήθως συν-εκφράζεται με κανάλια KCa3.1 σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος (βλέπε Μέθοδοι, [16]). Ένα τυπικό πείραμα απεικονίζει το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται για να αξιολογήσει την τρέχουσα KCa3.1 φαίνεται στο Σχήμα 1 Ε και F. Τα κύτταρα επανειλημμένως διεγέρθηκαν με ράμπες τάσης από -100 έως +50 mV από ένα δυναμικό κράτησης 0 mV, και την τρέχουσα KCa3.1 αξιολογήθηκε εφαρμόζοντας πρώτα τον ενεργοποιητή κανάλι KCa3.1 /SK DC-EBIO (100 μΜ) συν ιονομυκίνη (500 ηΜ? DC-EBIO + ιονομυκίνη), και στη συνέχεια προσθήκη του ειδικού αναστολέα κανάλι KCa3.1 ΤΡΑΜ-34 (3 μΜ) στη συνεχή παρουσία του DC-EBIO + ιονομυκίνη. Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, μετά από την εξωκυττάρια αιμάτωσης με DC-EBIO + ιονομυκίνη, παρατηρήσαμε την ανάπτυξη μιας τρέχουσας τάσης ανεξάρτητη με δυνατότητα αναστροφής (μέση -85 ± 3 mV για κύτταρα GL261, η = 3, και -82 ± 4 για τα κύτταρα U87MG, n = 4) κοντά στο δυναμικό ισορροπίας K σε συνθήκες εγγραφής μας (-90 mV). Το DC-EBIO + ιονομυκίνη-επαγόμενο ρεύμα είχε στα περισσότερα κύτταρα σε μια πρώτη μεταβατική φάση που προηγείται μια διαρκή οροπέδιο. Τόσο η παροδική και σταθερή συστατικά θα μπορούσαν στην πραγματικότητα να αποδοθεί στην τρέχουσα KCa3.1, καθώς ποτέ δεν παρατηρήθηκαν κατά την εφαρμογή των DC-EBIO + ιονομυκίνη σε ΤΡΑΜ-34-προεπωασμένα κύτταρα. Η μέση πυκνότητα του U87MG και κύτταρα GL261 (παροδική συν παρατεταμένη, εκτιμάται σε 0 mV) ρεύμα KCa3.1 ήταν 16,2 ± 5,0, η = 18, και 11,5 ± 3,9, η = 7, αντίστοιχα. Αντιθέτως, δεν DCEBIO + ενεργοποιημένης ιονομυκίνης ΤΡΑΜ-34 ευαίσθητο ρεύμα παρατηρήθηκε σε φυσιολογικό ενήλικα ποντικού αστροκύτταρα (n = 7) (Σχήμα 1 G).

Επαγωγή των νευροσφαιρών και CD133 ακολουθείται από διέγερση του KCa3.1 κανάλια έκφραση, στην γραμμή κυττάρων U87MG

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να εξετάσει την έκφραση και τη λειτουργία των καναλιών KCa3.1 στα κύτταρα U87MG καλλιεργήθηκαν σε βλαστικά κύτταρα ανεκτική μέσο. κλιματισμού κυττάρων αξιολογήθηκε με οπτική μικροσκοπία και κυτοφθορομετρία επαληθεύοντας την εμφάνιση των νευροσφαιρίων και CD133

+ κύτταρα, τα οποία παρακολουθήθηκαν μέχρι και τρεις εβδομάδες αργότερα (Σχήμα 2Α, Β, C). CD133 είναι ένας δείκτης των περισσότερων όγκων βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, ειδικά σε όγκους του εγκεφάλου [19]. CD133

+ κύτταρα σωρευτικά σε ένα μέγιστο 6,3% (Σχήμα 2D) μετά από 10 ημέρες κλιματισμού (U87MG-NS), και ήταν ακόμα θετική μετά από 16 ημέρες (4,6%, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) μικροσκοπία φάσης εικόνα δείχνει κύτταρα U87MG υποσυρρέοντα και προερχόμενα από U87MG νευροσφαιρών μετά από 7 (Β) και 14 ημέρες (C) του κλιματισμού μέσο χωρίς ορό. (D) κυτταροφθορισμομετρικής ανάλυση των CD133 για U87MG και U87MG-NS. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΕ-συζευγμένο αντι-CD133 (1) ή histotype συμφωνημένα αντισώματα όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Δέκα χιλιάδες συμβάντα καταγράφηκαν και αναλύθηκαν με Cyflogic. Γκρι ιστόγραμμα: κυτταρικό αυτοφθορισμό? μαύρο ιστόγραμμα: Ισοτυπικός ελέγχου? πορτοκάλι ιστόγραμμα: αντι-CD133 (1) (Ε) Ανάλυση ανοσοστυπώματος του U87MG και U87MG-NS έδειξαν έκφραση των καναλιών KCa3.1 συσχετίζονται με τα επίπεδα μεταγραφής. (F) αντίθεση φάσης (επάνω) και ανοσοφθορισμού (κάτω) εικόνες μηχανικά διαχωρισμένα κύτταρα U87MG-NS ακόλουθη επώαση 30 λεπτών με το αντίσωμα αντι-CD133, δείχνοντας CD133

+ και CD133

– κύτταρα (υποδεικνύεται με παχιά και λεπτή βέλη, αντίστοιχα). (G) οικόπεδο Bar που δείχνει τη μέση KCa3.1 πυκνότητα ρεύματος που μετράται σε 0 mV στο CD133

+ και CD133

– κύτταρα U87MG-NS. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στη λεζάντα του σχήματος 1D-F. * Τεστ ANOVA, p & lt?. 0.05

Η

Για να επαληθεύσει τα βλαστικά-όπως ιδιότητες των U87MG-NS εκτελέσαμε PCR πραγματικού χρόνου για να εξετάσει την έκφραση του

νεστίνη

και

GFAP.

αλλαγές στην έκφραση του

νεστίνη

, έναν δείκτη των νευρικών βλαστικών κυττάρων, και

GFAP

, ένας δείκτης διαφοροποιημένων αστροκυττάρων, είναι ενδεικτικά της διαφοροποίησης

σε vitro

των βλαστικών κυττάρων, όπως προκύπτουν από γλοιοβλάστωμα [1]. Σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα U87MG,

νηστίνη

έκφραση αυξήθηκε 2,68 ± 0,56 φορές (p & lt? 0.001), ενώ

GFAP

βρέθηκε να μειώνεται (0,516 ± 0,05, p & lt? 0,05). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με χρώση ανοσοφθορισμού των U87MG και U87MG-NS με αντισώματα κατά του CD133, GFAP, και νεστίνη (βλέπε συμπληρωματικά στοιχεία).

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση κανάλι KCa3.1 σε U87MG-NS. Η έκφραση του

KCa3.1

mRNA ήταν 2,02 ± 0,10 φορές υψηλότερο από ό, τι στα μη επεξεργασμένα κύτταρα (p & lt? 0.001). Επίσης, η ποσότητα της πρωτεΐνης KCa3.1 ανιχνεύεται στο U87MG-NS είναι υψηλότερη από ό, τι στην U87MG (ο λόγος OD είναι 1,8), όπως αναμένεται από τα υψηλά επίπεδα του mRNA (Σχήμα 2Ε). Η ηλεκτροφυσιολογική ανάλυση να πραγματοποιηθεί στο CD133

+ κύτταρα που προέρχονται από U87MG-NS κατέδειξε επίσης την υψηλότερη δραστικότητα των καναλιών σε αυτά τα κύτταρα. Συγκεκριμένα, εκτελούνται οι μετρήσεις patch-clamp επί είτε CD133 αρνητικά ή θετικά κύτταρα, μετά από χρώση με αντι-CD133 αντισώματα με ανοσοφθορισμό (Σχήμα 2F). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2G, αμφότερα τα κύτταρα εμφανίζονται KCa3.1 ρεύματα, όπως αξιολογείται από την εφαρμογή το πρότυπο πρωτόκολλο στη διαμόρφωση ολικού κυττάρου. Αξιοσημείωτα, CD133

+ κύτταρα βρέθηκαν να εκφράζουν ένα σημαντικά υψηλότερο επίπεδο πυκνότητας ρεύματος KCa3.1 (21,3 ± 3,7 ρΑ /pF, n = 7, vs 8,1 ± 3,5 ρΑ /pF, n = 5, αντίστοιχα? Ρ & lt? 0.05).

η υποομάδα του CD133

+ U87MG κύτταρα εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα

KCa3.1

mRNA

Δεδομένου ότι ο κύριος στόχος των μελετών μας είναι η εμ

KCa3.1

έκφραση κανάλι σε κύτταρα όγκου του εγκεφάλου με ιδιότητες στέλεχος-όπως, μπορούμε στη συνέχεια κατευθύνεται έρευνά μας προς CD133

+ υποπληθυσμών κλασματοποιηθεί από U87MG-NS. Χρησιμοποιώντας διαλογή κυττάρων που έχουμε λάβει τα κλάσματα κυττάρου με έως και 32% του CD133

+ κύτταρα (Σχήμα 3) και με ένα επίπεδο

CD133

μεταγραφές περισσότερο από 11 φορές υψηλότερη (11,63 ± 3,23, ρ & lt? 0.001 ).

KCa3.1

επίπεδο mRNA σε CD133-εμπλουτισμένα κλάσματα, αναλύθηκαν επίσης από την Real-time PCR, ήταν περίπου 4 φορές υψηλότερη (3,99 ± 0,195, p & lt? 0.05). Σε σχέση με το CD133-εξαντλημένο υποσύνολα

κυτταροφθορισμομετρική ανάλυση των συσκευασμένων U87MG-NS διεξήχθησαν με χρώση των κυττάρων με ΡΕ-συζευγμένο αντι-CD133 αντισώματος όπως αναφέρθηκε στην ενότητα Υλικά και μέθοδοι. Ποσοστό CD133

+ κύτταρα πριν (αριστερό πάνελ) και μετά τη διαδικασία διαλογής (δεξιός πίνακας) δείχνονται με κόκκινο χρώμα. Δέκα χιλιάδες εκδηλώσεις αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FACs ντίβα.

Η

Η KCa3.1 ειδικός αναστολέας ΤΡΑΜ-34 Μειώνει την κινητικότητα των U87 MG-NS

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η διαμόρφωση συλλιπασμάτων ιόντων μέσω καναλιών μεμβράνη είναι απαραίτητη για την διέγερση του γλοιοβλαστώματος κυτταρική κινητικότητα. Από ΤΡΑΜ-34 αναστέλλει επιλεκτικά την τρέχουσα ιόντων μέσω των διαύλων KCa3.1, ελέγξαμε την υπόθεση ότι αλλοιώνοντας τρέχουσα ιόντων με ΤΡΑΜ-34 θα έχει επίδραση στις

in vitro

κινητικότητα των U87MG-NS (αξιολογήθηκε από φιβρονεκτίνη επικαλυμμένο δοκιμασίες φρεατίων). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α βρήκαμε ότι η ΤΡΑΜ-34 σε συγκέντρωση 1 και 3 μΜ ανέστειλε κινητικότητα κατά 49,5% ± 21.52 (η = 10, ρ & lt? 0.001), και 65,4% ± 27.46, (η = 10, ρ & lt? 0.001 ), αντίστοιχα.

(Α) Ποσοτική ανάλυση της κυτταρικής εισβολής με δοκιμασία θαλάμου Boyden ινονεκτίνη επικαλυμμένα περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι τμήμα. Διαφορετικές συγκεντρώσεις της ΤΡΑΜ-34 (1 και 3 μΜ) ανέστειλε την κυτταρική κινητικότητα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η αναστολή ήταν στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (*** p & lt? 0.001). Οι ράβδοι είναι μέση τιμή ± SD. (B, C, D) Αντιπρόσωπος μικροσκοπικά πεδία από U87MG-NS γλοιοβλαστώματος βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν που έχουν μεταναστεύσει για 48 ώρες μέσω ενός φίλτρου μεγέθους πόρων 8 μm σε απουσία (Β) και υπό την παρουσία 1 μΜ (C) και 3 μΜ (D) ΤΡΑΜ-34.

Η

KCa3.1 Κανάλια απουσιάζουν σε ενήλικες υγιή εγκέφαλο και την παρεγκεφαλίδα, αλλά εκφράζεται έντονα στο γλοιοβλάστωμα δείγματα όγκων και Παράγωγα κύριες γραμμές κυττάρων

Για να προσδιορίσετε αν τα ευρήματά μας θα μπορούσε να έχει σημασία για τη μελέτη των όγκων του εγκεφάλου, επεκτείναμε ερευνών μας στην έκφραση κανάλι KCa3.1 φυσιολογικών ανθρώπινων αστροκυττάρων (ΝΗΑ), εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές από ανθρώπινο νευρογλοιακά όγκους, και τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος πρωτογενή (CRL8 , FCN9 και MZC12). Τα επίπεδα της έκφρασης KCa3.1 διέφερε σημαντικά μεταξύ των δειγμάτων διερευνηθεί. Η μέση μεταβολή φορές σε σχέση με το ΝΗΑ ήταν 318,9 ± 21,13 για CRL8, 176 ± 34.64 (FCN9) και 57.6 ± 2.4 (MZC12) (ρ & lt? 0.001) στις τρεις πρωτογενείς κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Α). Ανοσοϊστοχημική χρώση αποκάλυψε ότι τα κανάλια KCa3.1 ήταν απούσα σε φυσιολογικό εγκέφαλο λευκή ουσία, εκτός από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφόρων αγγείων (Σχήμα 5Β), ενώ είχαν εντόνως εκφρασμένο σε τομές από τρία διαφορετικά καρκινώματα (Σχήμα 5C, D, E). Ένα αστροκύτωμα βαθμού Ι φαίνεται στο Σχήμα 5F με KCa3.1 θετική χρώση περιορίζεται σε περιοχές εμπλουτισμένα σε νέα αιμοφόρα αγγεία. Στο Σχήμα 5G ένα τμήμα ιστού από φυσιολογικό πνεύμονα παρουσιάζεται ως θετικός έλεγχος

(Α) σε πραγματικό χρόνο PCR σε τρία βασικά ανθρώπινες κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστωμάτων (CRL8, λωρίδα 1?. FCN9, λωρίδα 2? MZC12, λωρίδα 3) έδειξαν ότι η έκφραση KCa3.1 μεταγραφές είναι υψηλότερη σε σύγκριση με ΝΗΑ (λωρίδα 4). (Β-G) Ανοσοϊστοχημική χρώση σε φυσιολογικό ανθρώπινο ιστό εγκεφάλου αποκάλυψε παρουσία πρωτεΐνης KCa3.1 μόνο σε ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφόρων αγγείων (Β), ενώ παρατηρήσαμε διάχυτη χρώση σε υψηλή όγκους Βαθμός (CRL8, Γ? FCN9, D, MZC12, Ε ) και ένα σήμα KCa3.1 μόνο στην περιοχή νεο-αγγείωση (glio χαμηλής ποιότητας, F). Ως θετικό έλεγχο χρησιμοποιήσαμε φυσιολογικό πνευμονικό ιστό (G). (H) Τυπική χρονική πορεία της τρέχουσας καταγράφηκε σε -40 mV από ένα κύτταρο FCN9 εφαρμόζοντας επαναλαμβανόμενες (κάθε 5S) ράμπες τάσης από -100 να +100 mV. 3 mM ΤΕΑ και 1 mM octanole προστέθηκαν για να εμποδίσει την BK και συνδετική χάσμα κανάλι, αντίστοιχα, συνήθως συν-εκφράζεται με κανάλια KCa3.1 σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος (21? 22). DC-EBIO (100 μΜ) + ιονομυκίνη (0,5 μΜ) και DC-EBIO + ιόντων 3 μΜ ΤΡΑΜ-34 εφαρμόστηκαν διαδοχικά για να επαληθεύσει την λειτουργική έκφραση της KCa3.1 ρεύματα (βλ κείμενο). (Ι) Εκπρόσωπος Ι-V οι σχέσεις με την παρουσία του DC-EBIO + ιονομυκίνη, και DC-EBIO + ιονομυκίνη + ΤΡΑΜ-34. Τα δεδομένα στον πίνακα (H) και (Ι) είναι από το ίδιο πείραμα.

Ένθετο

: I-V σχέση της τρέχουσας KCa3.1 λαμβάνεται αφαιρώντας τις τρέχουσες ράμπες καταγράφονται σε DC-EBIO + ιόντων + ΤΡΑΜ-34 από αυτό που καταγράφηκε στο DC-EBIO + ιόντων. (L) Οικόπεδο αναφορά την πυκνότητα KCa3.1 ρεύματος σε 0 mV (αξιολογηθεί ως στον πίνακα Ι) μετρήθηκε σε τρεις πρωτογενείς κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος. Επειδή σε πολλά κελιά ένα τασεοελεγχόμενων K ρεύμα ενεργοποίησης σε δυναμικά μεμβράνης υψηλότερη από -20 mV ήταν παρούσα, σε αυτές τις περιπτώσεις οι μετρήσεις της πυκνότητας KCa3.1 τρέχουσα διεξήχθησαν στους -40 mV, και η πυκνότητα αξιολογούνται ρεύμα στη συνέχεια μεταφέρθηκε αναλογικά σε 0 mv υποθέτοντας μια γραμμική σχέση ρεύματος-τάσης. * Τεστ ANOVA, p & lt?. 0.05

Η

Λειτουργική Σπουδών στην Πρωτοβάθμια γλοιοβλάστωμα Γραμμές κυττάρων

Η λειτουργική έκφραση των καναλιών KCa3.1 στις τρεις κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος πρωτογενή επαληθεύτηκε με εμπλάστρου μετρήσεις σφιγκτήρα στην ολικού κυττάρου διάτρητη διαμόρφωση (Σχήμα 5Η, Ι, L). Σε όλα τα κύτταρα που δοκιμάστηκαν (CRL8, η = 8? FCN9, η = 5, και MZC12, n = 4), η τρέχουσα KCa3.1 ταυτοποιήθηκε ως το εξωτερικό ρεύμα που ενεργοποιείται από εξωκυτταρικό αιμάτωση του DC-EBIO + ιονομυκίνη, και αναστέλλεται από το KCa3.1 κανάλι-εκλεκτικός αναστολέας ΤΡΑΜ-34 (3 μΜ) (Εικόνα 5Η, Ι). Εικόνα 5L, που δείχνει την πυκνότητα ρεύματος μέσης KCa3.1 αξιολογούνται στις τρεις κυτταρικές γραμμές, υποδεικνύει ότι η κυτταρική γραμμή CRL8 έχει σημαντικά υψηλότερη πυκνότητα από κυτταρικές σειρές FCN9 και MZC12. Παρατηρήστε ότι σε αντίθεση με σταθερές κυτταρικές σειρές, στην πρωτογενή κύτταρα τα ρεύματα KCa3.1 για την κατασκευή του οικοπέδου έχουν ληφθεί σε -40 mV αντί του 0 mV, διότι σε αυτή την πιο αποπολωμένα τάσης σημαντική τασεοελεγχόμενων DRK σημερινή ήταν μερικές φορές παρουσιάζουν ότι ήταν λογικά αναστέλλεται από τη λύση ενεργοποίηση KCa3.1 DC-EBIO + ιονομυκίνη. Ως εκ τούτου, για να επιτρέψει μια άμεση σύγκριση με τις πυκνότητες ρεύματος KCa3.1 αξιολογήθηκε σε κυτταρικές γραμμές γλοιοβλαστώματος, τα δεδομένα δείχνονται στο Σχήμα 5L δίδονται σε 0 mV. Τα δεδομένα ελήφθησαν με γραμμική προσαρμογή παρέκταση του IV σχέση στο εύρος τάσης -100 /-40.

την κινητικότητα του Stem-σαν Υποπληθυσμοί κυττάρων που προέρχονται από πρωτεύουσες γραμμές κυττάρων Τα αναστέλλεται ισχυρά από την ΤΡΑΜ-34

Τελευταία εξετάσαμε το

KCa3.1

mRNA έκφραση και η ικανότητα των μεταναστευτικών ρευμάτων βάσει ΤΡΑΜ-34 της θεραπείας σε ένα πρωτογενές κύτταρο γραμμή (FCN9) και κλωνικά προέρχεται υποκουλτούρα που χαρακτηρίζει τις ιδιότητες των βλαστικών όπως του (2B5) [ ,,,0],20].

KCa3.1

μεταγραφή mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης βρέθηκε να ενισχύεται σε 2Β5 κύτταρα σε σύγκριση με FCN9 (1,5 φορές ± 0.2, ρ & lt? 0,05 για mRNA, και βλέπε Σχήμα 6Β για ανοσοστύπωμα). Μια σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών βρέθηκε επίσης με κυτταρομετρία ροής (μέση ένταση φθορισμού των 1061,97 και 1716,37 για KCa3.1 βρέθηκε σε FCN9 και 2B5, αντίστοιχα). Το ποσοστό των θετικών κυττάρων ήταν επίσης διαφορετική μεταξύ των δύο κυτταρικές γραμμές (51,86% σε 70,68 FCN9 και% το 2B5). Περαιτέρω, το σχήμα ιστόγραμμα (δηλαδή ένα επικαλυπτόμενα δικόρυφη Gaussian καμπύλη σε 2Β5 σε σύγκριση με μία Gaussian καμπύλη σε FCN9) αποκαλύπτει την παρουσία στο 2Β5 κύτταρα ενός υποπληθυσμού που εκφράζουν υψηλά επίπεδα KCa3.1, η οποία είναι απούσα σε FCN9 (Σχήμα 6Α). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το στέλεχος ομοιάζει με 2Β5 που προέρχεται κλώνος εκφράζει υψηλότερα επίπεδα KCa3.1 από τα γονικά κύτταρα FCN9.

(Α) κυτταροφθορισμομετρική ανάλυση των KCa3.1 επί FCN9 (άνω πάνελ) και παράγωγα 2Β5 κλώνου (κάτω πίνακας). Τα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-KCa3.1 ακολουθούμενη από AlexaFluor488-συζευγμένο Goat-anti Rabbit. Δέκα χιλιάδες συμβάντα καταγράφηκαν και αναλύθηκαν με το λογισμικό Cyflogic. Γκρι ιστογράμματα: κυτταρικό αυτοφθορισμό? πράσινο ιστόγραμμα αντι KCa3.1? μαύρο ιστόγραμμα: AlexaFluor488 συζευγμένο Goat-anti Rabbit. (Β) Ανάλυση ανοσοστυπώματος του FCN9 και 2Β5 παρουσίασαν αυξημένη έκφραση των καναλιών KCa3.1 σε κλωνικά προέρχονται υποκαλλιέργεια χαρακτηρίζει ιδιότητες στέλεχος που μοιάζει (2B5). (Γ) Ποσοτική ανάλυση της κυτταρικής εισβολής εκτελείται σε ινονεκτίνη επικαλυμμένα Boyden θάλαμο, χρησιμοποιώντας 3 μΜ ΤΡΑΜ-34. Τα αποτελέσματα, που απεικονίζεται ως ποσοστό της αναστολής της κινητικότητας σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, ήταν στατιστικά σημαντικές (*** ρ & lt? 0.001). Οι ράβδοι είναι μέση τιμή ± SD.

Η

Μια σημαντική μείωση της κινητικότητας προκλήθηκε με 3 μΜ ΤΡΑΜ-34 στις δύο κυτταρικές σειρές. Η μείωση που παρατηρείται σε κύτταρα 2Β5 (75%) ήταν ωστόσο πολύ μεγαλύτερη από ό, τι σε FCN9 κύτταρα. (32%? Σχήμα 6C)

Συζήτηση

μαζί με τα περισσότερα συμπαγείς όγκους που αποτελείται από ετερογενή καρκινικών κυττάρων ως καθώς και αγγειώσεις, στρωματικά στοιχεία και φλεγμονώδη κύτταρα [21], GBMs εμφανίζουν αξιοσημείωτη ετερογένεια εντός του όγκου και της κυτταρικής ιεραρχία. Αυξανόμενες αποδείξεις, επίσης, υποστηρίζει σθεναρά την ιδέα ότι ένα υποπληθυσμό καρκινικών κυττάρων στη μάζα του όγκου έχει μεγαλύτερες δυνατότητες για την έναρξη και την αύξηση του πληθυσμού [22] του καρκίνου – [27]. Αυτά τα κύτταρα είναι γνωστά ως Cancer Stem Cells (ΚΕΠ) ή ογκογενή κύτταρα που έχουν πολλά κοινά κρίσιμες ιδιότητες με τυπικά βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της ικανότητας για αυτο-ανανέωση, διαφοροποίηση multi-γενεαλογία, και διατηρήθηκαν πολλαπλασιασμό [28] – [31] . Σύμφωνα με την πρόσφατη βιβλιογραφία, γλοίωμα βλαστικά κύτταρα προωθήσει επίσης ραδιοαντοχή, αγγειογένεση του όγκου [32], [33] και το αυτοκίνητο μετάσταση [34]. Ένα σημαντικό πρόβλημα με τα κύτταρα GBM είναι πολύ διηθητική φύση τους. Κατά συνέπεια, επιθετική εισβολή των καρκινικών κυττάρων GBM στον φυσιολογικό ιστό εγκεφάλου και νωτιαίου μυελού εμποδίζει συχνά την πλήρη απομάκρυνση των καρκινικών κυττάρων [35]. Μετανάστευση αρχίζει όταν ένα κύτταρο αποκρίνεται σε ένα εξωτερικό σήμα που οδηγεί στο πόλωση και επέκταση ενός «που οδηγεί μέτωπο» προς την κατεύθυνση της κίνησης [36]. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι τα κανάλια ιόντων είναι απαραίτητα συστατικά του συμπλόκου μηχανήματα υπεύθυνο για την κυτταρική μετανάστευση. Συγκεκριμένα, τα κανάλια ιόντων καταστεί δυνατή μετανάστευσης μέσω οσμωτικής ροών και η συνακόλουθη συρρίκνωση και διόγκωση του κυτταρικού σώματος. Βρίσκονται τόσο στην πίσω πλευρά του στοιχείου και από την κορυφαία μέτωπο, στο οποίο ασκούν επίσης μια επεμβατική ρόλο μέσω οξίνισης της περιοχής ECM και την προώθηση της μεταλλοπρωτεϊνάσης πρωτεολυτική δραστηριότητα [37]. Η παράβαση της ομοιοστατική αρχιτεκτονικής επιθηλίου, σε συνδυασμό με την απόκτηση ενός μεταναστευτικών φαινότυπο, είναι μια σημαντική στιγμή στην εξέλιξη του όγκου όλων των συμπαγών όγκων. Δεν είναι ακόμη σαφές κατά πόσον είναι κυρίως η συνιστώσα των βλαστικών κυττάρων του όγκου, που ήδη εμφανίζει επεμβατική ιδιότητες in vivo, η οποία αποκτά το μεταναστευτικό φαινότυπο [34]. Περιορισμένη γνώση είναι διαθέσιμες σχετικά με τις μεταναστευτικές ιδιότητες των κυττάρων γλοιώματος όγκου in vitro σε σχέση με τη δραστηριότητα του καναλιού KCa3.1. Το κανάλι KCa3.1 είναι κυρίως δραστικές εις το πίσω άκρο του κυττάρου [38] και διευκολύνει την κυτταρική διόγκωση και συρρίκνωση σε κύτταρα όγκου κατά την διάρκεια της μετανάστευσης [37]. Επιπλέον, το κανάλι KCa3.1 έχει εμπλακεί στη μεταναστευτική απόκριση παραγγελθεί από CXCL12, το συνδετήρα χημειοκινών των CXCR4 [39]. Πρόσφατα έχουμε δείξει ότι η τρέχουσα αναστολή πυκνότητα των δύο KCa3.1 και τα κανάλια χλωρίδιο σε U87MG παρεμποδίζει σχεδόν πλήρως μετανάστευση χωρίς να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό [40]. Οι δίαυλοι ιόντων διερευνηθεί σε βλαστικά κύτταρα από διαφορετικούς τύπους φυσιολογικών ιστών, όπως τα κανάλια KCa3.1 σε μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών ποντικού [41]. Ωστόσο, η γνώση σε σχέση με τα κανάλια ιόντων στα ΚΕΠ, αντιθέτως, πολύ περιορισμένη [41]. Αυτό μας ώθησε να διερευνήσει την ύπαρξη και τη λειτουργία του καναλιού KCa3.1 στην ανθρώπινη ΚΕΠ γλοιοβλαστώματος και πώς αυτές συνδέονται με το κινητό φαινότυπο σε αυτά τα κύτταρα.

Κατ ‘αρχάς, θα δείξουμε ότι οι μεταγραφές κανάλι KCa3.1 εκφράζονται σε διαφορετικούς τύπους καλλιεργημένων κυττάρων όπως μόνιμα εγκατεστημένος και πρωτογενείς κυτταρικές γραμμές. Τα επίπεδα που καταγράφονται από Real Time-PCR είναι μέχρι 118 φορές υψηλότερο στην U87MG, 76 φορές στο GL261, και 318,9, 176, και 57,6 φορές σε τρεις πρωτογενείς κυτταρικές σειρές, σε σύγκριση με την κανονική αστροκύτταρα. έχουν χαμηλότερο αλλά εξίσου σημαντικές διαφορές βρέθηκαν μεταξύ του ΚΕΠ και τη γονική ομόλογό του στο U87MG και πρωτογενή κυτταρική σειρά FCN9. Οι διαφορές στην ένταση φθορισμού του KCa3.1 αντισώματος το δεσμευμένο κανάλι και το κλάσμα των θετικών κυττάρων παρατηρήθηκαν επίσης, για πρώτη φορά, με κυτταροφθορισμομετρία.

Στο φυσιολογικό εγκέφαλο ποντικού ενήλικα η τρέχουσα KCa3.1 έχει μόνο έχουν αναφερθεί σχετικά με ενεργοποιημένη μικρογλοία [42], τον εγκέφαλο τριχοειδή ενδοθηλιακά κύτταρα [43], τα κύτταρα Purkinje [44], και σε υποπληθυσμό των αστροκυττάρων που εμπλέκονται στην νευροαγγειακή σύζευξη [45] – [47] [8]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα θα προτείνουν ότι στον εγκέφαλο του ποντικού η λειτουργική έκφραση του καναλιού KCa3.1 περιορίζεται σε συγκεκριμένες αστροκυττάρων υποπληθυσμούς κυττάρων. Ως εκ τούτου, εμείς εδώ αναφέρουν ότι η κανονική αστροκύτταρα ενήλικου ποντικού ουσιαστικά δεν εκφράζουν KCa3.1 ρεύμα. Αυτό το εύρημα είναι επίσης συνεπής με το πολύ χαμηλό ποσοστό (περίπου 2,5%) από KCa3.1 θετικών κυττάρων που βρέθηκαν με ανάλυση FACS σε φυσιολογικά αστροκύτταρα. Διερευνήσαμε επίσης την παρουσία Ca-ενεργοποιημένων διαύλων καλίου από ανοσοϊστοχημεία σε τομές ιστών και από τα δύο ανθρώπινα κανονικά και καρκινικά δείγματα. Το κανάλι KCa3.1 παρουσιάζονται με μια διάχυτη και έντονη χρώση μόνο στα δείγματα από υψηλής ποιότητας όγκους.

έκφραση Κανάλι μας επέτρεψε να εξετάσει το ζήτημα του ρόλου του καναλιού KCa3.1 στη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων από εκτελούν Transwell δοκιμασίες κινητικότητα, με την παρουσία και απουσία του ειδικού αναστολέα του καναλιού. Αξιοσημείωτα παρατηρήθηκαν διαφορές στην ικανότητα μετανάστευση υπό την επίδραση του αναστολέα διαύλου KCa3.1, ΤΡΑΜ-34. Σε ένα προηγούμενο έγγραφο βρήκαμε ότι 3 μΜ ΤΡΑΜ-34 ανέστειλε U87MG κινητικότητα κατά 58,5% [40]. Στην παρούσα εργασία θα δείξουμε ότι η ίδια συγκέντρωση του αναστολέα των διαύλων μείωσε την κινητικότητα των U87MG-NS, το στέλεχος που μοιάζει προέρχεται υποπληθυσμό U87MG, κατά 66%.

Με τη χρήση τεχνικών patch-clamp έχουμε επίσης τη δυνατότητα για να εξετάσει τις σημερινές διαφορές δραστηριότητα μεταξύ CD133 θετικά και αρνητικά κλάσματα υπάρχουν στον πληθυσμό U87MG-NS. Αυτό μας επέτρεψε να εκτιμήσουμε ένα Κ τρέχον 2,6 φορές υψηλότερη στην CD133

+ δείγμα. Ακόμη πιο εντυπωσιακό ήταν η μείωση του 2Β5 κινητικότητας (-75%) υπό την επίδραση της ΤΡΑΜ-34 σε σύγκριση με την μείωση που παρατηρήθηκε σε FCN9 (-32%). Η παρατηρούμενη μείωση της κινητικότητας καλά συσχετίζεται με τα επίπεδα της έκφρασης του καναλιού KCa3.1 στις δύο κυτταρικές σειρές, λόγω της μεγαλύτερης ευαισθησίας του 2Β5 σε ΤΡΑΜ-34. Το βρήκε συσχέτιση φαίνεται πιο σημαντική, υπό το φως του γεγονότος ότι το κανάλι KCa3.1 είναι μόνο ένα από μια σειρά διαφορετικών τύπων διαύλων ιόντων προώθηση της κινητικότητας των κυττάρων. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση του καναλιού KCa3.1 και η λειτουργία είναι πιο έντονη στις λιγότερο διαφοροποιημένες πληθυσμών, ευνοώντας έναν πιο σημαντικό ρόλο στο φαινότυπο κινητικότητα.

Η ιδιαίτερα επεμβατική ικανότητα in vivo είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των βλαστικών κύτταρα. Επιπλέον, έχει επίσης γίνει η υπόθεση ότι υπάρχουν δύο τύποι ΚΕΠ, ένας ακίνητος και ο άλλος κινητός [48]. Αυτό εγείρει το ερώτημα κατά πόσον η μείωση της ροής ιόντων που λειτουργούν από την ΤΡΑΜ-34 μεταβάλλει άμεσα ή μέσω ενός σήματος που ενεργεί με την φαινοτυπική μετάβαση από σταθερές στο κινητό, μέσω μιας άγνωστης κανονιστικής οδού την κυτταρική κινητικότητα. Αυτή η τελευταία υπόθεση είναι ελκυστική λόγω των πολύ πρόσφατες παρατηρήσεις δείχνουν ότι η παρεμπόδιση του συμπλόκου διαύλου νατρίου μεμβράνης πλάσματος αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων γλοιώματος, εκτός από την μετανάστευση, και ότι αυτό συνεπάγεται πιθανότατα μεταβολές στο πρόγραμμα γονιδιακή έκφραση μέσω ενός μηχανισμού που δεν έχουν ακόμη επιλυθεί [49]. Επίσης, για τα κανάλια KCa3.1 δεν μπορούμε να αποκλείσουμε μια σύνδεση μεταξύ της διαμόρφωσης της τρέχουσας δραστηριότητας και τον επαναπρογραμματισμό της γονιδιακής έκφρασης. Αυτό το ερώτημα παραμένει άλυτο.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιεργειών

Η καθιερωμένη ανθρώπινες κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος του ποντικιού και, (GL261 και U87MG) αναπτύχθηκαν αντίστοιχα στο D-ΜΕΜ F -12 και D-ΜΕΜ μέσο (Invitrogen) συμπληρωμένο με 1% μη απαραίτητα αμινοξέα, 1% Ε-γλουταμίνη, 100 IU /ml πενικιλίνη, 100 IU /ml στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS, Flow Laboratories) στους 37 ° C σε 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα στον αέρα. Mouse και καλλιέργειες ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος U87MG GL261 και ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rochville, MD, USA). Αστροκύτωμα πρωτοβάθμια MZC12, CRL8 και FCN9 (WHO βαθμού IV) έγιναν σε μια προηγούμενη εργασία από την ομάδα μας από δείγματα όγκων των ασθενών [50]. Οι λεπτομέρειες της θεσμικής έγκριση της επιτροπής και εν επιγνώσει συναίνεση από τους ασθενείς που αναφέρονται στην παραπάνω αναφορά.