Abstract

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα είναι καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από ιδιότητες βλαστικών κυττάρων και αντιπροσωπεύουν ένα μικρό πληθυσμό κυττάρων όγκου που οδηγεί την ανάπτυξη του όγκου, της προόδου, της μετάστασης και της αντίστασης στα φάρμακα. Μέχρι σήμερα, οι μοριακοί μηχανισμοί που δημιουργούν και ρυθμίζουν καρκινικά βλαστικά κύτταρα δεν είναι σαφώς καθορισμένες. BORIS (αδελφός του Ρυθμιστή του Τυπωμένες Sites) ή CTCFL (CTCF-παρόμοια) είναι μια πρωτεΐνη σύνδεσης ϋΝΑ που εκφράζεται σε φυσιολογικούς ιστούς μόνο σε γεννητικά κύτταρα και επανενεργοποιείται σε όγκους. Πρόσφατες αποδείξεις έχουν αναδείξει τη συσχέτιση των

BORIS /CTCFL

έκφρασης με κακή συνολική επιβίωση των διαφορετικών ασθενών με καρκίνο. Δείξαμε προηγουμένως μια ένωση του BORIS κυττάρων που εκφράζουν με βλαστική ικανότητα έκφρασης γονιδίου σε εμβρυονικά κύτταρα καρκίνου. Εδώ, μελετήσαμε το ρόλο της BORIS στα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. Χρησιμοποιώντας BORIS-μοριακών φάρων που είχε ήδη επικυρωθεί, ήμασταν σε θέση να αποδείξει την παρουσία του

BORIS

mRNA σε πληθυσμούς του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων εμπλουτισμένο (πλευρά του πληθυσμού και σφαίρες) του τραχήλου της μήτρας, του παχέος εντέρου και τα καρκινικά κύτταρα του μαστού. BORIS μελέτες φίμωση παρουσίασαν μείωση της ικανότητας σχηματισμού σφαίρας στα κύτταρα του μαστού και του όγκου του παχέος εντέρου. Είναι σημαντικό, BORIS-αποσιώπηση οδήγησε προς τα κάτω ρύθμιση των

hTERT

, βλαστικών κυττάρων (

Nanog

,

Oct4

,

SOX2

και

BMI1

) και οι δείκτες του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων (

ABCG2

,

CD44

και

ΑΙ_ϋΗ1

) γονίδια. Αντιστρόφως, BORIS-επαγωγή οδήγησε σε αυξητική ρύθμιση των ίδιων γονιδίων. Αυτές οι φαινότυποι παρατηρήθηκαν σε τραχήλου της μήτρας, του παχέος εντέρου και επεμβατικές καρκινικά κύτταρα του μαστού. Ωστόσο, μια εντελώς διαφορετική συμπεριφορά παρατηρήθηκε στις μη επεμβατικές καρκινικά κύτταρα του μαστού (MCF7). Πράγματι, αυτά τα κύτταρα απέκτησε επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης φαινοτύπου μετά BORIS αποσιώπηση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι BORIS συνδέεται με τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων εμπλουτισμένο πληθυσμοί αρκετών επιθηλιακών κυττάρων του όγκου και των διαφόρων φαινοτύπων εξαρτώνται από την προέλευση των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Alberti L, Losi L, Leyvraz S, Benhattar J (2015) διαφορετικά αποτελέσματα της BORIS /CTCFL σε βλαστική ικανότητα Gene Expression, Σφαίρα Σχηματισμός και κυττάρων επιβίωσης στον καρκίνο επιθηλιακά βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (7): e0132977. doi: 10.1371 /journal.pone.0132977

Επιμέλεια: Gabriele Saretzki, Πανεπιστήμιο του Newcastle, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 2 Απριλίου του 2015? Αποδεκτές: 19, Ιουν 2015? Δημοσιεύθηκε: 17 του Ιούλη 2015

Copyright: © 2015 Alberti et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση δόθηκε από το ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (31003A-113505) και Emma Ίδρυμα Muschamp. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Ένας από τους συγγραφείς (JB) απασχολείται από ένα εργαστήριο μοριακής παθολογίας (Biopath Lab). Biopath Lab παρέχεται υποστήριξη με τη μορφή των μισθών, αλλά δεν έχουν κανένα πρόσθετο ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ένας από τους συγγραφείς (JB) απασχολείται από ένα εργαστήριο μοριακής παθολογίας (Biopath Lab). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Τεράστια αποδεικτικά στοιχεία υποστηρίζουν την άποψη ότι ο καρκίνος του ανθρώπου θα μπορούσε να θεωρηθεί ως ασθένεια βλαστικών κυττάρων [1- 3]. Ο καρκίνος βλαστοκύτταρα (ΚΕΠ) θεωρία υποθέτει ότι οι καρκίνοι θεωρούνται ως συγκρότημα ιστούς όπου ανώμαλη αύξηση των κυττάρων κινείται από έναν μικρό πληθυσμό κυττάρων που ορίζεται ως ογκογενή κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά χαρακτηρίζονται από τρεις κύριες ιδιότητες: ανεξέλεγκτη ικανότητα πολλαπλασιασμού, την ικανότητα της αυτο-ανανέωση και την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ένα μη-CSC απογόνων [3, 4]. Είναι ενδιαφέρον ότι οι ιδιότητες αυτών των κακοήθων κυττάρων είναι στενά παρόμοια με τα τρία χαρακτηριστικά που χαρακτηρίζουν φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων: το δυναμικό να πολλαπλασιάζονται εκτενώς, η αυτο-ανανέωση και η ικανότητα να αναπτυχθεί σε πολλαπλές σειρές. Συνεπώς, τα καρκινικά κύτταρα με αυτές τις ιδιότητες που ονομάζεται επίσης καρκινικά βλαστικά κύτταρα. Οι πρώτες παρατηρήσεις της παρουσίας του ΚΕΠ διεξήχθησαν σε ανθρώπινης οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας [5] και, κατά συνέπεια, αναπτύχθηκαν σε διαφορετικούς τύπους ανθρώπινων συμπαγών όγκων, όπως του μαστού [6], του εγκεφάλου [7], του παχέος εντέρου [8, 9], του παγκρέατος [10 ] και των ωοθηκών [11] όγκους. Έχει δειχθεί ότι πολλοί ασθενείς με καρκίνο, ειδικά με συμπαγείς όγκους, μικρή ανταπόκριση στις συμβατικές θεραπείες, όπως η χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, και μετά από μια αρχική μερική ύφεση, όγκους υποτροπή. Οι λόγοι αυτής της αποτυχίας θα μπορούσε να εξηγηθεί από το φάρμακο και ραδιο- αντίσταση των ΚΕΠ. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι τα ΚΕΠ είναι πιο συχνές σε εξαιρετικά επιθετική και πυρίμαχων όγκους [6-7]. Ως εκ τούτου, καθίσταται εξαιρετικά σημαντικό για τον προσδιορισμό των πληθυσμών CSC και δείκτες τους να αναπτύξουν CSC-στοχευμένες θεραπείες για να ξεπεραστεί η αντίσταση των ΚΕΠ με τις συμβατικές αντικαρκινικά φάρμακα. Χρησιμοποιώντας πειραματικές προσεγγίσεις, οι ΚΕΠ πολλών τύπων όγκων έχουν χαρακτηριστεί φαινοτυπικά και αρκετές δείκτες CSC έχουν ταυτοποιηθεί [4, 12]. Ωστόσο, οι περισσότερες από τις προσδιοριζόμενες δείκτες δεν είναι πλήρως ειδικά για ΚΕΠ, επειδή εκφράζονται επίσης σε φυσιολογικά κύτταρα, και ως εκ τούτου, απαιτείται η χρήση πολλαπλών δεικτών. Πολλές προσπάθειες για την έρευνα για τον καρκίνο θα είναι απαραίτητη για τη βελτιστοποίηση στόχευσης ΚΕΠ θεραπείες. Υπάρχουν διάφορες προσεγγίσεις για τον εμπλουτισμό των πληθυσμών των ΚΕΠ, τα οποία χρησιμοποιούνται κυρίως για

in vitro

αναλύσεις και μεθόδους διαλογής. Μια προσέγγιση βασίζεται στην επιλογή ενός κυττάρου υποπληθυσμού που είναι σε θέση να εκρέει βαφές. Η εκροή αυτών των χρωστικών είναι η ικανότητα του ΚΕΠ τα οποία εκφράζουν γονίδια που κωδικοποιούν τις μεταφορείς σύνδεσης ΑΤΡ κασέτας (ABC) φαρμάκου, όπως ABCG2 [13-15]. Η πιο χρησιμοποιείται βαφή είναι Hoechst 33342, η οποία είναι μία χρωστική δέσμευσης DNA. Η υποπληθυσμός επιλέγεται από την παρούσα μέθοδος ονομάζεται πλευρά του πληθυσμού (SP). Η αφυδρογονάση αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ) δραστηριότητα είναι μια άλλη λειτουργική ιδιότητα των βλαστοκυττάρων, η οποία χρησιμοποιείται για την απομόνωση εμπλουτισμένο πληθυσμό ΚΕΠ [16, 17]. Ένα πρόσθετο

in vitro

προσέγγιση βασίζεται σε μη-προσκολλημένα ελεύθερο ορού πολιτισμό [8, 18]. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, τα κύτταρα από διαφορετικό τύπο όγκων (συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου, του μαστού και του παχέος εντέρου), τα οποία έχουν την ικανότητα της αυτο-ανανέωσης και να διατηρούν τις ιδιότητες βλαστικών κυττάρων, μπορούν να σχηματίσουν σφαιροειδή αποικίες ονομάζεται σφαίρες [19].

BORIS (αδελφός του ρυθμιστή της Τυπωμένες τοποθεσίες) είναι μια πρωτεΐνη που δεσμεύεται με DNA το οποίο μοιράζεται με παράλογο της CTCF, μια περιοχή 11 ψευδαργύρου-δακτύλου, έτσι ονομάζεται επίσης CTCFL (CTCF-όπως) [20]. BORIS πρωτεΐνη εμπλέκεται σε επιγενετικές επαναπρογραμματισμό και ανήκει στην οικογένεια αντιγόνο του καρκίνου των όρχεων, όπως αυτή εκφράζεται σε φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα και επανενεργοποιήθηκε σε όγκους. Πρόσφατες αναφορές δείχνουν ότι η έκφραση BORIS σχετίζεται με προχωρημένο στάδιο σε διάφορες μορφές καρκίνου, όπως των ωοθηκών, του προστάτη, του οισοφάγου και του ηπατοκυτταρικού καρκίνους [21-24]. Σε καρκίνους των ωοθηκών, η έκφραση BORIS μπορεί επίσης να παρέχει φτωχή πρόγνωση [21]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε την συσχέτιση της έκφρασης BORIS με γονίδια δείκτη CSC βλαστικών κυττάρων και σε εμβρυονικά κύτταρα καρκινώματος [25]. Συνολικά αυτές οι αποδείξεις μας ώθησε να διερευνήσει περαιτέρω την παρουσία και τα μοριακά λειτουργίες των BORIS στα ΚΕΠ εμπλουτισμένο πληθυσμούς σε άλλους τύπους κυττάρων όγκου και συγκεκριμένα στην αυχενική, του παχέος εντέρου και όγκου μαστού κύτταρα. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει ακόμη επικυρωθεί αντίσωμα έναντι BORIS, χρησιμοποιήσαμε το BORIS-μοριακών φάρων (BORIS-MB) που είχε προηγουμένως δοκιμαστεί και πιστοποιηθεί για

in vivo

ανίχνευση

BORIS

mRNA [25 ]. BORIS-ΜΒ μας επέτρεψε να απεικονίσει τις BORIS-θετικών κυττάρων που αναλύθηκαν στα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι

BORIS

εκφράζεται έντονα στο CSC εμπλουτισμένο πληθυσμούς που απομονώθηκαν από SP και σφαίρες. Επιπλέον, λειτουργικές μελέτες αποκάλυψαν ότι BORIS θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην αυτο-ανανέωση των όγκων και στην απόκτηση των επιθηλιακών μεσεγχυματικών μετάβασης (EMT) υπογραφή στη βάση της καταγωγής των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells και σφαίρες προετοιμασία

Ο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (HeLa, αδενοκαρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας? ΗΤ29, αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου? NCCIT, εμβρυϊκά καρκίνωμα) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και της ανθρώπινης κυτταρικές σειρές του μαστού (MCF-7 και MDA-MB-231) δόθηκαν από Δρ Στέφανι Renaud (Βιοτεχνολογίας Ινστιτούτο του Πανεπιστημίου της Λωζάνης). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2, είτε σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ? Gibco, Invitrogen) για HeLa και κύτταρα ΗΤ29, ή σε μέσο RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) για NCCIT, MCF7 και MDA-MB-231 κυττάρων, συμπληρωμένο με 10% της θερμότητας απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό. (FBS? Invitrogen) και 1% Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη (Gibco, Invitrogen)

Για καλλιέργεια σφαίρα, κύτταρα (ΗΤ29, MCF7 και ΜϋΑ-ΜΒ-231) έχουν πρώτα αποκολλήθηκαν με διάλυμα 0,25% τρυψίνης (Invitrogen) και πλύθηκαν δύο φορές σε PBS (Invitrogen). Στη συνέχεια, τα κύτταρα διηθήθηκαν δύο φορές χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο-σουρωτήρι 40 μm μέγεθος πλέγματος (Falcon) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο άνευ ορού που περιέχει ϋΜΕΜ /Ρ-12 θρεπτικό μέσο (Invitrogen) συμπληρωμένο με Β27 (Invitrogen), 5 μg /ml ηπαρίνης (Sigma ), 20 ng /ml EGF (επιδερμικό αυξητικό παράγοντα, BD Biosciences), 20 ng /ml FGF (Αυξητικός Παράγοντας ινοβλαστών, BD Biosciences) και 5 μg /ml ινσουλίνη (Sigma). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση 6 φρεατίων (Corning) σε πυκνότητα 1000 κύτταρα /ml για 10-15 ημέρες. Σφαίρες μετρήθηκαν και συλλέχθηκαν για εξαγωγή RNA. Ένα κλάσμα των σφαιρών σπάρθηκε σε κανονικό μέσο με ορό για να επιτραπεί η διαφοροποίηση.

ανάλυση φθορισμού χρησιμοποιώντας BORIS-ΜΒ

Τα κύτταρα παρασκευάζονται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, κύτταρα σε εναιώρημα (1 χ 10

6 κύτταρα /ml) επωάζονται στους 37 ° C για 1.5 ώρες σε μέσο DMEM ελεύθερο ορού με Cy3-BORIS MB (200 ηΜ) και Hoechst 33342 (5 μg /mL) σε παρουσία ενός αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine RNAiMAX siRNA (Invitrogen). Τα κύτταρα πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS-5 mM EDTA και cytocentrifugated επάνω σε γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα χρησιμοποιώντας μια φυγόκεντρο cytospin και στη συνέχεια εξετάστηκαν υπό φθορίζον (Axioplan2 Imaging, Zeiss) ή ένα συνεστιακό (LSM 710 Quasar, Zeiss) μικροσκόπιο.

Για τη χρώση φθορισμού ABCG2, τα κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται πιο πέρα. Μετά κυτταροφυγοκέντρησης, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με παγωμένο ακετόνη για 8 λεπτά και βάφονται στους 4 ° C όλη τη νύκτα με αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ABCG2 κουνελιού (Sigma) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:20 σε PBS. Τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με γαϊδάρου αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα επισημασμένο με Alexa Fluor 488 (Sigma) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1: 500 σε PBS. Οι πλάκες στη συνέχεια εξετάστηκαν υπό μικροσκόπιο φθορισμού.

Ανάλυση

FACS και διαλογής SP

κύτταρα HeLa (1 χ 10

6 κύτταρα /ml) επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό στους 37 ° C για 1,5 ώρα με Hoechst 33342 (Invitrogen) σε τελική συγκέντρωση 12,5 μg /ml είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με 50 μΜ βεραπαμίλη (Sigma) ως μάρτυρα. Τα κυτταρικά εναιωρήματα αναμίχθηκαν περιοδικά κατά τη διάρκεια της επώασης. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επαναιωρήθηκαν σε PBS-5 mM EDTA. Πριν από την ανάλυση, τα κύτταρα επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (2 μg /ml) και διηθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο-σουρωτήρι μέγεθος ματιών μm 40 (Falcon). αναλύσεις SP πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση LSRII (Becton Dickinson) και η διαλογή των SP και NSP (μη-SP) χρησιμοποιώντας FACS Aria (Becton Dickinson) στις εγκαταστάσεις του EPFL (Ecole Polytechnique Fédérale της Λωζάνης). Χρωστική Hoechst 33342 ήταν ενθουσιασμένος στα 355 nm και φθορισμού του αναλύθηκε χρησιμοποιώντας διπλού μήκους κύματος της εκπομπής, 445 nm για Hoechst μπλε και 650 nm για Hoechst κόκκινο.

έκφραση έκτοπη BORIS

Τα κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με pCMV-BORIS πλασμιδίου με χρήση αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

BORIS νοκ ντάουν από επαγώγιμου shRNA λεντοϊού σύστημα

κυτταρικές σειρές Στάβλοι με επαγώγιμα εκφράζει Τα siRNAs που στοχεύουν ανθρώπινη

BORIS

mRNA παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. HeLa, ΗΤ29, MCF7 και ΜϋΑ-ΜΒ-231 κυτταρικές γραμμές όγκου χρησιμοποιήθηκαν σε αυτά τα πειράματα.

BORIS cDNA έκφρασης με επαγώγιμο λεντοϊού σύστημα

Σταθερές κυτταρικές γραμμές με επαγώγιμο εκφράζουν ανθρώπινη

BORIS

cDNA δημιουργήθηκαν με τη χρήση της δοξυκυκλίνης επαγόμενο βραδέος σύστημα [26]. BORIS cDNA από ρΟΜν-BORIS πλασμιδίου κλωνοποιήθηκε σε pINDUCER20 από το σύστημα πύλης Cloning (Invitrogen). Ο φορέας λεντοϊού pINDUCER20 περιέχει το αντιβιοτικό δείκτη επιλογής του G418 (Geneticin), το οποίο επιτρέπει να επιλέξετε μόνο τα μετατραπέντα κύτταρα. Αυτός ο φορέας περιέχει επίσης μια κασέτα με δοξυκυκλίνη επαγώγιμο προαγωγέα που ελέγχει την μεταγραφή του κλωνοποιημένου cDNA. Για την παραγωγή του ιού Ιβηίί, ακολουθήσαμε διαδικασία μας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Το ιικό εναιώρημα σε συνδυασμό με 8 μg /ml polybrene (Sigma) χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα-στόχους (HeLa, ΗΤ29, MCF7 και ΜϋΑ-ΜΒ-231). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη μόλυνση το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο συμπληρωμένο με 500 μg /ml G418 (Roche). Μετά από 2 εβδομάδες αντιβιοτικής επιλογής, 2 μg /ml δοξυκυκλίνης (Sigma) προστέθηκε στο μέσον για να επιτρέψει την επαγωγή του

BORIS

έκφρασης cDNA και μεσαίου δοξυκυκλίνη περιέχον αναζωογονήθηκε κάθε 3 ημέρες.

ποσοτική ανάλυση RT-PCR

αναλύσεις qRT-PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [25]. Η μέθοδος ΔΔCt χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης, τα οποία κανονικοποιήθηκαν σε

GAPDH

επίπεδο. Όπως έχει ήδη αναφερθεί [25], για όλα τα ενισχυμένα γονίδια-στόχους απόδοσης PCR επεκτάθηκε από 94 με το 101%, με συντελεστή συσχέτισης (r2) που κυμαίνονται από 0,96 1,0. Οι τιμές Ct του GAPDH μετρήθηκαν τα παρόμοια επίπεδα (Ct = 10,07 ± 0,25) για όλες τις αναλύθηκαν κύτταρα.

Οι αλληλουχίες του εκκινητή χρησιμοποιείται επιπλέον φαίνεται στον Πίνακα S1.

CD44 + /CD24 – ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

CD44 + /CD24- έκφραση αναλύθηκε σε κύτταρα μηχανικής με σταθερά εμφανίζουν νοκ ντάουν

BORIS

mRNA ή εκφράζουν

BORIS

cDNA. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και 10

6 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μL PBS-1% FBS. Προστέθηκαν μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπινο αντίσωμα CD44-APC-H7 (BD Pharmingen) και ένα αντι-ανθρώπινο CD24-Alexa Fluor 647 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (BD Pharmingen) σε αραιώσεις 1:20 και 1: 5, αντίστοιχα, όπως προτείνεται από το κατασκευαστής, και επωάστηκαν για 40 λεπτά στους 4 ° C. DAPI προστέθηκε σε συγκέντρωση 1 μg /ml κατά τη διάρκεια του τελευταίου 10 λεπτά επώασης. Μετά από πλύση με PBS-1% FBS, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Γάλλιο κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter). Τουλάχιστον 5 χ 10

4 συμβάντα μετρήθηκαν για όλα τα δείγματα. Η ανάλυση του ποσοστού των CD44 + /CD24- κυττάρων εκτιμήθηκε μετά την αφαίρεση των νεκρών κυττάρων (DAPI θετικά κύτταρα) και περίφραξη σε eGFP και TRFP θετικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo. Τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε μέσο. Τριακόσια κύτταρα σπάρθηκαν σε 6 καλά /πλάκες εις τριπλούν. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο που περιέχει ντοξυκυκλίνη. Μετά από 2 εβδομάδες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 1 ml 4% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και κηλιδώθηκαν με 1 ml 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 10 λεπτά. Μετά την πλύση με PBS, κάθε φρεάτιο φωτογραφήθηκε και οι αποικίες (που προσδιορίζεται ως & gt? 50 κύτταρα /αποικία). Μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας πρόγραμμα ImageJ

δοκιμασία Μετανάστευση

μετανάστευση κυττάρων καθορίστηκε χρησιμοποιώντας ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας (BD Falcon) με μέγεθος πόρων 8 μm. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο απαλλαγμένο από ορό, 5 χ 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν στην κορυφή του ένθετα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων. Στο κάτω μέρος και των ενθέτων προστέθηκαν 500 μL μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS. Μετά από 48 ώρες επώασης, τα μη μεταναστεύοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα και τα μεταναστεύοντα κύτταρα (στην κάτω επιφάνεια του ενθέτου) σταθεροποιήθηκαν με 1 ml 4% φορμαλδεΰδη και στη συνέχεια βάφονται με 1 ml 0.1% κρυσταλλικό ιώδες για 10 λεπτά. Μετά πλύση 3 φορές με PBS, τα μεταναστευτικά κύτταρα μετρήθηκαν υπό δέκα τυχαία υψηλής ισχύος μικροσκοπικά πεδία ανά ένθετο και ο μέσος αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν υπολογίστηκε για κάθε ομάδα κυττάρων.

Δοκιμασίες

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και χημειο-ευαισθησία

ανάλυση πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετά από BORIS αποσιώπηση και επαγωγή BORIS αξιολογήθηκαν με τη δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

In vitro

ανάπτυξη επίδραση της 5-φθοριοουρακίλη (5- FU) προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Εν συντομία, κάθε ομάδα κυττάρων, μετά BORIS σίγηση, σπάρθηκε εις τριπλούν σε πυκνότητα 1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων σε μέσο που περιέχει ντοξυκυκλίνη. Την ημέρα μετά, 5-FU (Sigma) προστέθηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις: 0.5, 5, 50 και 500 μg /ml. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ημέρες και στη συνέχεια η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Η αναστολή της ανάπτυξης ή κλάσμα επιβίωσης εκφράστηκε ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων ελέγχων που μετρήθηκαν ταυτόχρονα, χρησιμοποιώντας την εξίσωση: (απορρόφηση του επεξεργασμένου δείγματος /απορρόφηση του μη επεξεργασμένου δείγματος) χ 100.

Στατιστική ανάλυση

η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δύο-tailed ανάλυση Student t-test. P-value & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

BORIS

mRNA εκφράζεται σε πληθυσμό κυττάρων πλευρά

Για να διερευνηθεί η παρουσία του

BORIS

mRNA σε CSC εμπλουτισμένο πληθυσμοί των επιθηλιακών κυττάρων του όγκου, χρησιμοποιήσαμε ως μοντέλα του ανθρώπινου HeLa (τραχηλικό), ΗΤ29 (κόλον), MCF7 (μη επεμβατική μαστού) και ΜΟΑ-ΜΒ-231 (επεμβατική μαστού) καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η ανάλυση έκφρασης έδειξε ένα χαμηλότερο επίπεδο

BORIS

mRNA σε HeLa και ΗΤ29 σε σύγκριση με τα εμβρυϊκά κύτταρα όγκου (NCCIT), ενώ στην MCF7 και ΜϋΑ-MBA-231

BORIS

mRNA ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη ( Σχήμα 1Α). Ως εκ τούτου, τα καρκινικά κύτταρα HeLa, ΗΤ29, MCF7 και ΜϋΑ-MBA-231 μπορεί να ταξινομηθεί ως BORIS χαμηλή εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα.

(Α)

BORIS

έκφρασης σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου. Ολικό RNA από NCCIT (εμβρυϊκά), HeLa (τραχηλικό), ΗΤ29 (κόλον), MCF7 (μη επεμβατική μαστού) και ΜΟΑ-ΜΒ-231 (επεμβατική μαστού) καρκινικά κύτταρα εκχυλίστηκαν και

BORIS

έκφραση αναλύθηκε από qRT-PCR. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν σε

GAPDH

και σχετίζονται με κύτταρα NCCIT. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (η = 3). (Β)

BORIS

έκφρασης όπως ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας BORIS-MB. Εκπρόσωπος εικόνες της HeLa, ΗΤ29, MCF-7 και MDA ΜΒ-231 κύτταρα, 40X μεγέθυνση. Τα κύτταρα επωάστηκαν με Cy3-BORIS MB (200 ηΜ) και Hoechst 33342 (5 μg /mL) στους 37 ° C για 1,5 ώρα σε μέσο χωρίς ορό και στη συνέχεια εξετάζονται κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. Λευκά βέλη δείχνουν αρνητικά κύτταρα Hoechst, που είναι επίσης

BORIS

mRNA θετική, όπως ανιχνεύεται από BORIS-MB.

Η

Hoechst πλευρά πληθυσμού (SP) ανάλυση είναι μια δοκιμασμένη τεχνική για να εμπλουτίσουν στέλεχος και στις αρχές του προγονικά κύτταρα σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές [13-15]. ανάλυση απεικόνισης φθορισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας Hoechst 33342 σε συνδυασμό με

BORIS

ανίχνευση mRNA χρησιμοποιώντας BORIS-Molecular Beacon (BORIS-ΜΒ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Οι αναλύσεις απεικόνισης φθορισμού έδειξε ότι τα θετικά κύτταρα BORIS είναι μόνο ένα υποσύνολο των κυττάρων σε όλες τις αναλύθηκαν επιθηλιακών κυτταρικών γραμμών όγκου (Σχήμα 1Β), σύμφωνα με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε εμβρυϊκά κύτταρα όγκου [25]. Η εκτιμώμενη συχνότητα του BORIS θετικών κυττάρων είναι περίπου 0,1% σε HeLa, 0,5% το ΗΤ29 και λιγότερο από 0,05% σε MCF7 και ΜϋΑ-MBA-231? σε αντίθεση με ότι ήταν περίπου 5% σε NCCIT [25]. Είναι ενδιαφέρον, αναλύσεις απεικόνισης με φθορισμό έδειξε ότι η πλειοψηφία των BORIS θετικά κύτταρα ήταν επίσης Hoechst αρνητικά (λευκά βέλη στο σχήμα 1Β και S1 Εικ). Ως εκ τούτου,

BORIS

έκφραση θα μπορούσε να συνδεθεί με Hoechst αρνητικό φαινότυπο των κυττάρων SP σε τραχήλου, κόλου και κύτταρα όγκου του μαστού. Ωστόσο, ένα μικρό ποσοστό (λιγότερο από 10%) των BORIS θετικών κυττάρων ήταν Hoechst θετικά.

ABCG2 περιγράφεται ως η κύρια αντλία εκροής υπεύθυνη για τη Hoechst αρνητικό φαινότυπο στα κύτταρα SP [27]. Ως εκ τούτου, μια πιθανή συν-έκφραση του

BORIS

με την ABCG2 πρωτεΐνη χημειοαντίσταση μεταφορέα, για πρώτη φορά ερευνώνται. HeLa κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχήμα 2Α, BORIS θετικά κύτταρα είναι αμφότερα αρνητικά για Hoechst (λευκά βέλη) και θετικά για την πρωτεΐνη ABCG2. Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του

BORIS

mRNA σε CSC-εμπλουτισμένο πληθυσμό κυττάρων HeLa, τα κύτταρα SP και επίσης τα κύτταρα μη-SP (NSP) ταξινομήθηκαν με FACS. Το ποσοστό των κυττάρων SP ήταν από 0,5% έως 1,5% του συνόλου των κυττάρων (Εικόνα 2Β), σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [15, 27]. Το κλάσμα SP ήταν εντελώς μειωθεί προσθέτοντας βεραπαμίλη, ένας αναστολέας της ABC-μεταφορείς, υποδεικνύοντας ότι ο πληθυσμός ήταν bona fide κύτταρα SP. Η ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι

BORIS

επίπεδο του mRNA των κυττάρων SP ήταν σημαντικά υψηλότερο (12 φορές, σ & lt? 0,05) σε σύγκριση με NSP και τη γονική κύτταρα HeLa (Σχήμα 2C). Επίσης, η

ABCG2

επίπεδο mRNA ήταν υψηλότερη (περίπου 1,5 φορές) στο SP ταξινομημένα κύτταρα σε σύγκριση με τα ΕΣΣ και γονικών κυττάρων (Σχήμα 2D). Για να επαληθεύσετε περαιτέρω την παρουσία της

BORIS

στο SP CSC εμπλουτισμένου πληθυσμού, η συχνότητα της SP αναλύθηκε σε pCMVBORIS-επιμολυσμένα κύτταρα HeLa (Σχήμα 2Ε). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν BORIS ήταν σημαντικά πιο εμπλουτισμένο σε κύτταρα SP (2 φορές, ρ = 0.01) σε σύγκριση με γονικά κύτταρα HeLa. Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απομόνωση του BORIS-θετικών κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε εμπλουτισμό του πληθυσμού CSC σε καρκινικά κύτταρα HeLa.

(Α) ανάλυση ανοσοφθορισμού των ABCG2 σε κύτταρα HeLa. Τα κύτταρα επωάστηκαν με BORIS-ΜΒ και Hoechst 33342 στους 37 ° C για 1,5 ώρες σε μέσο χωρίς ορό. Μετά cytocentrifugation τα πλακίδια σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή ακετόνη και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό ABCG2. Ο BORIS θετική /ABCG2 θετικών /αρνητικών κυττάρων Hoechst υποδεικνύονται με λευκά βέλη. 10x. (Β) Εκπρόσωπος οικόπεδο dot της ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του SP. κύτταρα HeLa επωάστηκαν με Hoechst 33342 (12,5 μg /mL), είτε μόνο του ή σε συνδυασμό με βεραπαμίλη (50 μΜ). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση LSRII και τη διαλογή χρησιμοποιώντας FACS Aria. Οι πύλες δείχνουν τα ταξινομημένα κύτταρα SP και NSP. (C)

BORIS

mRNA και (D)

ABCG2

έκφραση mRNA σε SP και NSP απομονώθηκε από κύτταρα HeLa. Ολικό RNA εκχυλίστηκε και αναλύθηκε με qRT-PCR. Γραφήματα δείχνουν τα επίπεδα του mRNA της

BORIS

και

ABCG2

γονίδια κανονικοποιούνται στο

GAPDH

και σχετίζονται με τα γονικά κύτταρα HeLa. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Αστερίσκος υποδηλώνει p & lt? 0,05. (Ε) ανάλυση SP στον BORIS υπερεκφράζεται κύτταρα. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα φορέα έκφρασης BORIS (HeLa pCMVBORIS). Μετά από 2 ημέρες, 1 χ 10

6 κύτταρα επωάστηκαν με Hoechst 33342 (12,5 μg /mL), είτε μόνο του (πάνω) ή σε συνδυασμό (κάτω) με 50 μΜ βεραπαμίλη. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση LSRII κυτταρομετρία ροής και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Colon-σφαίρες και mammo-σφαίρες εκφράζουν υψηλά επίπεδα του

BORIS

mRNA

Η ανάπτυξη των κυττάρων σε εναιώρημα, με ένα μέσο (πολιτισμός σφαίρα) ελεύθερο ορού, είναι μια κοινή προσέγγιση για την CSC-εμπλουτισμό [7-8]. Καθώς αυτή η ιδιότητα έχει αναφερθεί να περιορίζεται σε βλαστικά /προγονικά κύτταρα [19],

BORIS

έκφραση διερευνήθηκε επίσης στη διαμόρφωση-σφαίρες του παχέος εντέρου (ΗΤ29) και του μαστού (MCF7) καρκινικών κυττάρων. Ένα κλάσμα των σφαιρών σπάρθηκαν σε μέσο που περιέχει ορό για να επιτραπεί η διαφοροποίηση. Είναι ενδιαφέρον,

BORIS

ανάλυση της έκφρασης αποκάλυψε μια σημαντική υψηλότερο επίπεδο

BORIS

mRNA στο παχύ έντερο-σφαίρες (37,2 ± 7,3 φορές, n = 4), καθώς και σε mammo-σφαίρες (30,9 ± 6,4 φορές, η = 4), σε σύγκριση με γονικά κύτταρα και διαφοροποιημένα-σφαιρών (Σχήμα 3). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι

BORIS

εκφράζεται στα CSC εμπλουτισμένα σφαίρες παχέως εντέρου και όγκου μαστού κύτταρα.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (1000 κύτταρα /ml) σε μέσο καλλιέργειας σφαίρα σε χαμηλή πλάκες στήριξης. Μετά από 10-15 ημέρες σφαίρες συλλέχθηκαν για εκχύλιση του RNA και ένα κλάσμα των σφαιρών σπάρθηκε σε κανονικό μέσο με ορό για να επιτραπεί η διαφοροποίηση (διαφοροποιημένες-σφαίρες).

BORIS

έκφραση αναλύθηκε με qRT PCR σε (Α) του παχέος εντέρου-σφαίρες (σφαίρες ΗΤ29) και διαφοροποιημένων-σφαίρες (σφαίρες ΗΤ29 ΔΠ) και (Β) mammo-σφαίρες (MCF7 σφαίρες) και διαφοροποιημένων-σφαίρες ( MCF7 DIFF σφαίρες). Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε

GAPDH

και σχετίζονται με γονικά κύτταρα (κύτταρα). Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από 4 ανεξάρτητα πειράματα. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05) μεταξύ των σφαιρών και των γονικών κυττάρων. (C) Εκπρόσωπος εικόνες του παχέος εντέρου-σφαίρες και mammo-σφαίρες φαίνεται, 4X μεγέθυνση. Μαύρο κλίμακα μπάρες δείχνουν 250 μm.

Η

Η γονιδιακή έκφραση και φαινότυπο CSC στα κύτταρα νοκ ντάουν BORIS

Για να διερευνήσουν τον πιθανό ρόλο του BORIS στο ΚΕΠ, επιλέξαμε ένα νοκ ντάουν στρατηγική χρήση λεντοϊού σύστημα με επαγώγιμα εκφράζει Τα siRNAs που στοχεύουν ανθρώπινη

BORIS

mRNA. Ο BORIS SH-3, BORIS SH-4 και ομελέτα-shRNA (CTR sh) φακοϊούς είχαν προηγουμένως δημιουργηθεί και επικυρωθεί [25]. Αυτά φακοϊούς χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν τα καρκινικά κύτταρα HeLa, ΗΤ29, MCF7 και MBA-MD-231.

Έχει αποδειχθεί ότι BORIS ενεργοποιεί

hTERT

έκφραση [28] και επηρεάζει την έκφραση των βλαστική ικανότητα γονιδίων σε εμβρυϊκά κύτταρα όγκου [25]. Σε αυτή τη μελέτη, οι συσχετισμοί αυτοί διερευνήθηκαν σε επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. Μετά από 2 εβδομάδες BORIS νοκ ντάουν, έκφραση αναλύσεις

hTERT

,

CTCF

, οι πιο κοινοί δείκτες CSC (

ABCG2

,

CD44

,

ΑΙ_ϋΗ1

) και βλαστικών κυττάρων (

Nanog

,

Oct4

,

SOX2

,

γονίδια BMI1

) πραγματοποιήθηκαν. Σχήμα 4Α δείχνει, για όλες τις ανάλυσης των γονιδίων, ο μέσος όρος των φορές μεταβολής BORIS sh-3 και BORIS sh-4 κύτταρα σε σύγκριση με κύτταρα CTR sh κάθε μηχανική κυτταρική γραμμή όγκου.

hTERT

έκφραση ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε όλα τα καρκινικά κύτταρα που αναλύθηκαν κατά την εξαίρεση του MCF7, στην οποία παρατηρήθηκε μια σημαντική ρύθμιση προς τα πάνω (13 φορές).

CTCF

έκφραση ήταν μειωμένη σε όλα τα κύτταρα, ακόμη και αν η μείωση δεν ήταν σημαντική (από 40% σε 20% σε σύγκριση με τον έλεγχο). Αξίζει να σημειωθεί ότι, απουσία BORIS trigged μείωση του

ABCG2

έκφραση (93% για MCF7, 25% για MDA-MB-231, 80% για ΗΤ29 και 60% για HeLa).

CD44

ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε όλες εκτός από μία κυτταρική γραμμή, MCF7, στην οποία παρατηρήθηκε μια 2,5 φορές αύξηση.

ΑΙ_ϋΗ1

,

Nanog

,

Oct4

,

SOX2

και

BMI1

ήταν γενικά κάτω-ρυθμίζονται σε όλα τα κύτταρα του όγκου μετά BORIS σιγαστήρα. Όλα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι BORIS θα μπορούσε να επηρεάσει σημαντικά την ρύθμιση του

hTERT

/τελομεράσης, τα βλαστικά γονίδια των κυττάρων και δείκτη CSC στα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου.

(Α) MCF7, MDA-MB- 231, ΗΤ29 και HeLa κύτταρα κατασκευαστεί για να σταθερά εμφανίζουν νοκ-κάτω

BORIS

mRNA. BORIS SH-3, SH-4 και CTR sh (shRNA ελέγχου που περιέχουν κωδικοποιημένα αλληλουχία) φακοϊούς χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν τα κύτταρα αυτά. Κάθε μεταγωγή κύτταρα καλλιεργήθηκαν με δοξυκυκλίνη για να επαχθεί έκφραση BORIS shRNA. Μέσο που περιέχει δοξυκυκλίνη αντικαταστάθηκε κάθε 3 ημέρες. Μετά από 2 εβδομάδες, το RNA απομονώθηκε από BORIS SH-3, SH-4 και CTR sh κάθε υποστεί μεταγωγή κυτταρική γραμμή. mRNA επίπεδα των υποδεικνυόμενων γονιδίων αναλύθηκαν με qRT-PCR. Γραφήματα αντιπροσωπεύουν για κάθε γονίδιο των μέσων πλάσια επαγωγή τόσο BORIS shRNA (BORIS sh-3 και SH-4) που σχετίζεται με εκείνη του ελέγχου οποιωνδήποτε κυττάρων. Τυπικά σφάλματα υπολογίστηκαν θεωρώντας διάδοσης των σφαλμάτων και των δύο BORIS shRNA αναλύσεις. Γραφήματα δείχνουν ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. (Β) Εκπρόσωπος κυτταρομετρία ροής οικόπεδα dot των CD44 και CD24 έκφρασης σε MCF7, MDA-MB-231, ΗΤ29 και HeLa κύτταρα μηχανικής με σταθερά εμφανίζουν νοκ-κάτω

BORIS

mRNA. Τα μοτίβα CD44 και CD24 έκφραση των δύο BORIS shRNA (BORIS sh-3 και SH-4) και ο έλεγχος (CTR sh) απεικονίζεται. Αντι-CD24 αντίσωμα σημασμένο με AlexaFluor 647 και αντι-CD44 αντίσωμα σημασμένο με ΑΡΟ-H7 χρησιμοποιήθηκαν. Το ποσοστό των CD44 + /CD24- πληθυσμός εκτιμήθηκε μετά gating για eGFP και TRFP θετικά κύτταρα (σε μεταγωγή και DOX-επαγόμενη shRNA, αντίστοιχα) και οι τελικές πύλες βασίζονται στον έλεγχο ισότυπο που αντιστοιχεί σε κάθε κυτταρική γραμμή. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν ανεξάρτητα τρεις φορές και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται για κάθε ομάδα κυττάρων.

Η

CD44 + /CD24- υποπληθυσμό έχει βρεθεί να εμπλουτιστεί με χαρακτηριστικά ογκογενή, ειδικά στα καρκινικά κύτταρα του μαστού [6, 29]. Σε αυτή τη μελέτη, CSC υποπληθυσμός αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής σε BORIS-knockdown κυττάρων όγκου. Μία διαφορετική συμπεριφορά των MCF7 σε σύγκριση με τα άλλα κύτταρα παρατηρήθηκε (Σχήμα 4Β). Οι αναλύσεις αποκάλυψαν μια αξιοσημείωτη απόκτηση CD44 + /CD24- φαινοτύπου σε BORIS-knockdown MCF7 κύτταρα προερχόμενα, από κανένα CD44 + CD24- κύτταρα /στον έλεγχο σε 70% περίπου στις BORIS-knockdown κυττάρων. Μια μη σημαντική μείωση του CD44 + /CD24- υποπληθυσμός παρατηρήθηκε σε BORIS-shRNA MDA-MB-231-προερχόμενα κύτταρα. Στα μη μαστού καρκινικά κύτταρα, ΗΤ29 και HeLa, καμία αλλαγή της έκφρασης παρατηρήθηκε με τα δύο κύτταρα που εμφανίζουν ένα τυπικό CD44 + /CD24- επιθηλιακά φαινότυπο.

Νοκ ντάουν του BORIS επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα του μαστού MCF7

η επιβίωση των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από BORIS νοκ ντάουν. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η ικανότητα να σχηματίσουν αποικίες μετρήθηκαν κάθε εβδομάδα για ένα μήνα. Η δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (ή κλωνογόνο) παρακολουθεί την ικανότητα ενός καρκινικών κυττάρων να παράγουν ένα βιώσιμο αποικία μετά την αγωγή [30] και χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της

in vitro

ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να σχηματίσουν αποικίες μετά BORIS knockdown. Τα αποτελέσματα δεν έδειξαν σημαντική διαφορά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε όλες εκτός από μία κυτταρική γραμμή όγκου. Η εξαίρεση αφορά MCF7 κύτταρα στα οποία μία σημαντική αύξηση (3-4 φορές, ρ & lt? 0.0001) του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου παρατηρήθηκε (Σχήμα 5Α). δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 5Β). Μετά από ένα μήνα από τον Boris-knockdown, οι αριθμοί των αποικιών δεν διέφεραν σημαντικά για HeLa, ΗΤ29 και MDA-MB-231, σε σύγκριση με τους ελέγχους. Αντίθετα, ο αριθμός των αποικιών ήταν σημαντικά υψηλότερη στην MCF7. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, κατά την εξαίρεση των MCF7 κυττάρων καρκίνου του μαστού, BORIS φίμωση σε επιθηλιακά κύτταρα του όγκου δεν είχε σημαντική επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων.

(Α) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, πάνω από 1 μήνα από ϋΟΧ επαγόμενης BORIS – κύτταρα και CTR- shRNA, αναλύθηκε κάθε εβδομάδα με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα των δύο συγκεκριμένων BORIS-shRNA (BORIS sh-3 και SH-4) αναφέρεται ως ποσοστό σε σύγκριση με το κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων ελέγχου (ομελέτα shRNA, CTR sh). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (η = 3). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05) μεταξύ του BORIS sh και CTR sh. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες της δοκιμασίας σχηματισμού αποικίας μετά από 1 μήνα BORIS νοκ ντάουν. Τριακόσια κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών 6 φρεατίων με μέσο που περιέχει ντοξυκυκλίνη, κάθε ομάδα κυττάρων παρασκευάστηκαν εις τριπλούν.