Αφηρημένο

Ιστορικό

ανθρώπινων καρκίνων καταναλώνουν μεγαλύτερες ποσότητες γλυκόζης σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς με τα περισσότερα που μετατρέπεται και αποβάλλεται ως γαλακτικό παρά άφθονη διαθεσιμότητα του οξυγόνου (Warburg αποτέλεσμα). Η υποκείμενη υψηλότερο ποσοστό γλυκόλυση είναι επομένως στη ρίζα του σχηματισμού όγκων και της ανάπτυξης. Κανονικό έλεγχο των γλυκολυτικών ενζύμων αλλοστερική εμφανίζεται μειωμένη σε όγκους? Ωστόσο, το φαινόμενο δεν έχει πλήρως επιλυθεί.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Στην παρούσα εργασία, αποδεικνύουν ότι η μητρική 85-kDa 6-φωσφοφρουκτο-1-κινάση (PFK1) , ένα βασικό ρυθμιστικό ένζυμο της γλυκόλυσης που κανονικά είναι υπό τον έλεγχο της αναστολής ανάδρασης, υποβάλλεται σε μετα-μεταφραστική τροποποίηση. Μετά πρωτεολυτική διάσπαση του C-τερματικό τμήμα του ενζύμου, ένα ενεργό, βραχύτερο θραύσμα 47-kDa σχηματίστηκε ότι ήταν ευαίσθητα στην κιτρικό και αναστολή ΑΤΡ. Σε ογκογόνα κυτταρικές σειρές, μόνο τα βραχέα θραύσματα, αλλά όχι ο φυσικός 85-kDa PFK1 ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Παρόμοια θραύσματα ανιχνεύθηκαν επίσης σε έναν ιστό όγκου που αναπτύχθηκαν σε ποντικούς μετά τον υποδόριο μόλυνση με ογκογόνα κύτταρα Β16-Ρ10. Με βάση την περιορισμένη πρωτεολυτική πέψη του μυός κουνελιού PFK-M, ένα ενεργό κιτρικό αναστολή ανθεκτικών βραχύτερη μορφή ελήφθη, υποδεικνύοντας ότι ένα μοναδικό μετα-μεταφραστική τροποποίηση βήμα ήταν δυνατή. Οι ακριβείς μοριακές μάζες των ενεργών μικρότερα θραύσματα PFK1 προσδιορίστηκαν με την προσθήκη των περικομμένο γονίδια κατασκευασμένο από ανθρώπινο μυ PFK1 cDNA σε ένα

PFK

null

Ε. coli

στέλεχος. Δύο

Ε. coli

μεταμόρφωσης που κωδικοποιούν για τα τροποποιημένα PFK1s των 45.551 Da και 47.835 Da αυξήθηκαν σε μέσο γλυκόζης. Η εισαγωγή των τροποποιημένων περικομμένης ανθρώπινης

PFK

γονίδια Μ τόνωσε επίσης την κατανάλωση γλυκόζης και γαλακτικού απέκκριση σε σταθερά επιμολυσμένα μη ογκογόνων κυττάρων ανθρώπινης ΗΕΚ, υποδηλώνοντας τον σημαντικό ρόλο των βραχύτερων θραυσμάτων PFK1 στην ενίσχυση γλυκολυτικής ροής.

Συμπεράσματα /Σημασία

μετα-μεταφραστική τροποποίηση του ενζύμου PFK1 μπορεί να είναι το κεντρικό στοιχείο της απελευθερωμένης γλυκολυτικής ροής σε όγκους που σε συνδυασμό με αλλαγμένη μηχανισμούς σηματοδότησης υποστηρίζει, κατ ‘ουσίαν γρήγορο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

Αιτιολογική αναφορά.: Šmerc Α, Sodja Ε, Legiša Μ (2011) μετα-μεταφραστική τροποποίηση της 6-φωσφοφρουκτο-1-κινάση ως ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του Καρκίνου του μεταβολισμού. PLoS ONE 6 (5): e19645. doi: 10.1371 /journal.pone.0019645

Επιμέλεια: Anil Kumar Tyagi, Πανεπιστήμιο του Δελχί, Ινδία

Ελήφθη: 10η Δεκεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 12η Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 4 Μαΐου 2011

Copyright: © 2011 Šmerc et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από τον Οργανισμό της Σλοβενίας Ερευνών (Σύμβαση αρ J4-9606 και 1000-07-310027? https://www.arrs.gov.si/sl/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μια συνεπής χαρακτηριστικό των κακοηθών κυττάρων είναι η κατανάλωση μιας μεγαλύτερης ποσότητας γλυκόζης σε σύγκριση με εκείνη των φυσιολογικών κυττάρων και τη μετατροπή της πλειοψηφίας της γλυκόζης σε γαλακτικό οξύ. Τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν κατά προτίμηση γλυκόλυση πάνω μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση για την παραγωγή ΑΤΡ εξαρτώμενη από τη γλυκόζη ακόμη και υπό την παρουσία της άφθονης οξυγόνου προς καύσιμο μιτοχονδριακή αναπνοή. [1]. Αυτή η αποκλίνουσα ενεργητικός μεταβολισμό, γνωστό ως το «φαινόμενο Warburg,» είναι ως εκ τούτου στη ρίζα του σχηματισμού όγκων και της ανάπτυξης και να έχει ακόμη και συζητήθηκε ως πιθανή σήμα κατατεθέν του καρκίνου [2].

Κατά την τελευταία δεκαετία, η ανακάλυψη των ογκογονιδίων έστρεψε το ενδιαφέρον μακριά από τις μελέτες του κυτταρικού μεταβολισμού σε όγκους έναντι εκείνων που αποσκοπούν στην αποκάλυψη της λειτουργίας των ογκογονιδίων που ελέγχουν τον μεταβολισμό. Μέχρι στιγμής, οι κρίσιμοι παράγοντες αναγνωρίζονται για την παραγωγή του καρκίνου του μεταβολικού φαινοτύπου φαίνεται να είναι οι ογκογόνους μεταλλάξεις που μεταβάλλουν αυξητικού παράγοντα σηματοδότηση μέσω του ΡΙ3Κ /Akt /mTOR μονοπάτι [3]. Η ενεργοποίηση αυτού του μονοπατιού ενισχύει μεταβολικές δραστηριότητες της γλυκόλυσης από δύο σημαντικά γεγονότα. Πρώτον, η σύνθεση του GLUT1 μεταφορέα ζάχαρη επάγεται για να διευκολύνει την πρόσληψη γλυκόζης από τα κύτταρα [4], [5]. Δεύτερον, η δραστικότητα της μεταγραφής συμπλόκου HIF-1α είναι αυξημένη, η οποία σε συνεργασία με τον παράγοντα μεταγραφής c-Myc ενισχύει την σύνθεση της πλειοψηφίας των γλυκολυτικών ενζύμων [6]. Αυξημένες ποσότητες ενζύμων άγριου τύπου, κατά συνέπεια, να οδηγήσει σε αυξημένες συγκεκριμένες δραστηριότητες. Ωστόσο, γλυκολυτικής ροής σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς ελέγχεται αυστηρά από αλλοστερικά ένζυμα τα οποία διατηρούν τη ρύθμισή τους με αναστολή ανάδρασης παρά τις αυξημένες δραστηριότητες των ενδιάμεσων ενζύμων. Η δήλωση αυτή έχει επιβεβαιωθεί από πειράματα σε

Ε. coli

[7] και

S. cerevisiae

[8], όπου η υπερέκφραση του συνόλου των γλυκολυτικών ενζύμων δεν είχε καμία επίδραση στο ρυθμό κατανάλωσης γλυκόζης ή /και την παραγωγή αιθανόλης. Ως εκ τούτου, αναγκάζεται κανείς να συμπεράνει ότι οι σημαντικές τροποποιήσεις της κινητικής των ρυθμιστικών ενζύμων πρέπει επίσης να εμπλέκονται σε μεταβολικές αλλαγές που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της μεταμόρφωσης των φυσιολογικών κυττάρων θηλαστικού σε καρκινικά κύτταρα.

Η γλυκόλυση είναι κεντρικής σημασίας για πρωτογενή μεταβολισμό, και κανονικά, ρυθμίζεται στενά από τρεις αλλοστερικά ένζυμα, εξοκινάση, 6-φωσφοφρουκτο-1-κινάση (PFK1) και κινάση πυροσταφυλικού (ΡΚ), τα οποία καταλύουν άτομο μη αναστρέψιμη βήματα. Εξοκινάση, που εμπλέκονται στο πρώτο κανονιστικό βήμα, εμφανίζεται κυρίως σε μορφή ισοενζύμου HK2 σε όγκους που είναι συνδεδεμένο με το μιτοχονδριακό εξωτερική μεμβράνη που αντιμετωπίζει το κυτταρόπλασμα. Microlocation αυτού του ενζύμου επιτρέπει την προτιμησιακή πρόσβαση σε νεοσυντιθέμενη ΑΤΡ για τη φωσφορυλίωση της γλυκόζης, και είναι ανθεκτική σε αναστολή προϊόντος [9]. Μια άλλη αλλοστερική ένζυμο είναι πυροσταφυλική κινάση, η οποία ρυθμίζει ροή του μεταβολισμού μέσω του τερματικού μέρος της γλυκόλυσης. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν δειχθεί ότι εκφράζουν αποκλειστικά την εμβρυϊκή M2 ισομορφή του ΡΚ που μπορεί να ενεργοποιηθεί με φρουκτόζη-1,6-διφωσφορικής. Ωστόσο, η δέσμευση του τυροσίνη-φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων σε ΡΚ-M2 αποτέλεσμα την απελευθέρωση της αλλοστερικής ενεργοποιητή, που οδηγεί σε αναστολή της ενζυματικής δραστηριότητας. Απενεργοποίηση του PK-M2 σε καρκινικά κύτταρα πιστεύεται ότι για την εκτροπή του μεταβολισμού της γλυκόζης από την παραγωγή ενέργειας με αναβολικές διαδικασίες [10].

Ωστόσο, το πιο πολύπλοκο έλεγχο γλυκολυτικής ροής αποδίδεται στην PFK1 (ΕΚ 2.7.1.11), η οποία ξεπερνά τα ρυθμιστικούς ρόλους των άλλων δύο αλλοστερικά ένζυμα. PFK1 καταλύει την φωσφορυλίωση της φρουκτόζης-6-φωσφορική φρουκτόζη-1,6-διφωσφορικής, χρησιμοποιώντας MgATP ως δότης φωσφορυλο [11]. PFK1 διεγείρεται από φρουκτόζη-2,6-διφωσφορική (F-2,6-BP), ιόντα ADP /ΑΜΡ και αμμωνίου, ενώ το κιτρικό και ΑΤΡ δρουν ως ισχυροί αναστολείς [11], [12].

κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, τα ευκαρυωτικά ένζυμα PFK1 αναπτύχθηκε από την επικάλυψη, παράλληλα σύντηξης και απόκλιση των καταλυτικών και δεσμευτικών τελεστή περιοχές της προκαρυωτικών πρόγονο [12]. Ωστόσο, η αυστηρή διατήρηση μεταξύ ενεργών καταλοίπων θέση στη Ν-τερματικό τμήμα του ευκαρυωτικού ενζύμου και εκείνων της βακτηριακής PFKs υποδεικνύουν ότι το ενεργό κέντρο των ευκαρυωτικών PFK1 βρίσκεται μόνο στο Ν-τερματικό τμήμα [12]. Από την άλλη πλευρά, οι αλλοστερικοί θέσεις πρόσδεσης προσδέματος που αναπτύχθηκαν κατά τη διάρκεια της εξέλιξης από μεταλλάξεις στο Ο-άκρο επιτρέπουν λεπτή ρύθμιση του ρυθμιστικού ενζύμου από τα αυξημένα επίπεδα συγκεκριμένων κατάντη μεταβολιτών. Μία από τις αλλοστερικές συνδέτες είναι το κιτρικό, το οποίο δρα ως ένας ισχυρός αναστολέας του συνόλου των ισομορφών PFK1 θηλαστικών. Μελέτες σχετικά με κιτρικό τοποθεσίες αλλοστερική στο μυ κουνελιού PFK1 κατέληξε στο συμπέρασμα ότι αυτές οι τοποθεσίες που έχουν διαμορφωθεί από το φωσφοενολοπυροσταφυλικό (PEP) /ADP αλλοστερική του

Escherichia coli

. Τα υπολείμματα αμινοξέων που αποτελούν το κιτρικό αλλοστερική θέση που βρίσκεται τόσο στο Ν- και C-άκρα του μορίου [13].

γονιδιωμάτων των θηλαστικών, τρία διαφορετικά γονίδια PFK1 είναι παρόντες και οι διαφορετικά εκφράζονται σε επιμέρους ιστούς. Σε ανθρώπινους ιστούς, τα προϊόντα τους σε πρωτεΐνες έχουν τις ακόλουθες μοριακές μάζες: μυϊκού τύπου (PFK-Μ), 85.051 Da [14]? τύπο του ήπατος (PFK-L) 84.917 Da [15]? και το είδος των αιμοπεταλίων (PFK-P), 85.596 Da [16].

Και οι τρεις ισοένζυμα αναστέλλονται έντονα από την κιτρική, με IC

50 τιμές 0,08, 0,13 και 0,18 mM για τον εγκέφαλο (αιμοπεταλίων), μυς, το ήπαρ και PFK1, αντίστοιχα [17]. Όλες οι ισομορφές του ανθρώπινου PFK1 αναφέρονται επίσης να αναστέλλεται έντονα από τις συγκεντρώσεις ΑΤΡ υψηλότερες από 0.05 mM, ακόμη (F-2,6-BP) μπορεί να ανταγωνιστεί τις αρνητικές επιπτώσεις της ΑΤΡ σε κάποιο βαθμό [18].

Σήμερα , σε καρκινικά κύτταρα, η δραστικότητα των ενζύμων PFK1 πιστεύεται ότι είναι up-ρυθμίζονται μόνο από την απώλεια της λειτουργίας ρ53, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρύθμιση της πρωτείνης Tigar που δρα ως φρουκτόζη-2,6-διφωσφορικής [19 ]. Κατά συνέπεια, το επίπεδο της F-2,6-BP παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα στους όγκους και λειτούργησε ως ένα ισχυρό θετικό ερέθισμα.

Ωστόσο, μια ισομορφή PFK1 που ήταν λιγότερο ευαίσθητη σε κιτρικό αναστολής (Κ

i = 0,75 mM κιτρικό) και πιο ευαίσθητα σε ενεργοποίηση από την F-2,6-BP περιγράφηκε στο ανθρώπινο γλοίωμα [20]. Μια ισομορφή PFK1 με παρόμοια χαρακτηριστικά κινητικής παρατηρήθηκε επίσης σε ταχέως αναπτυσσόμενη τρωκτικό AS-30D κύτταρα ηπατώματος, η οποία έδειξε πλήρη έλλειψη ευαισθησίας στην αλλοστερική αναστολείς του, κιτρικό και ΑΤΡ, παρουσία φυσιολογικών συγκεντρώσεων F-2,6-BP. Επιπλέον, το ένζυμο ήταν ιδιαίτερα ενεργοποιείται από ενεργοποιητές του NH

4

+, ΑΜΡ, και F-2,6-BP [21]. Ωστόσο, η φύση του PFK1 ισομορφών που εμφανίζουν αλλαγές στην κινητική του ενζύμου δεν μελετήθηκε λεπτομερώς.

Α κιτρικού αναστολή ανθεκτική μορφή PFK1 που ενεργοποιήθηκε σε ένα υψηλότερο επίπεδο από αλλοστερική ενεργοποιητές περιγράφηκε πρόσφατα στο εμπορικά σημαντικό μύκητα,

Aspergillus niger

[22] – [24]. Αυτά τα κινητικά χαρακτηριστικά αποδόθηκαν σε 49-kDa υπομονάδες, οι οποίες είναι σχετικά μικρά μόρια PFK1 σε σχέση με άλλα ευκαρυωτικά PFK1s περίπου 85 kDa. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι τα μικρότερα θραύσματα 49-kDa που σχηματίζεται από ένα μετα-μεταφραστική τροποποίηση δύο σταδίων του φυσικού ενζύμου 85-kDa [23] – [25].

Στην παρούσα έκθεση, παρουσιάζουμε ενδείξεις ότι ένα παρόμοιες μετα-μεταφραστική τροποποίηση του φυσικού μυϊκού τύπου PFK1 μπορεί επίσης να εμφανιστεί σε καρκινικά κύτταρα θηλαστικών, κατά συνέπεια οδηγεί στο σχηματισμό του δραστικού βραχύτερων θραυσμάτων PFK1 με αλλαγμένες κινητικές παραμέτρους.

Αποτελέσματα

αναλύσεις αμινοξέος αλληλουχίες του ανθρώπινου PFK-M πρωτεΐνη

Η προέλευση των γονιδίων θηλαστικών που κωδικοποιούν ένζυμα PFK1 με επικάλυψη των προκαρυωτικών γονιδίων πρόγονος [12] μπορεί να επιβεβαιωθεί με την ευθυγράμμιση των αλληλουχιών υπολείμματος αμινοξέος των μισών Ν- και C- του ανθρώπινου PFK-M ισοένζυμο, δείχνοντας σημαντική ομολογία (συμπληρωματική Σχ. S1). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε από CLUSTALW [26] έδειξε 25,4% ταυτότητα, 21,6% ισχυρή ομοιότητα, 11,6% αδύναμη ομοιότητα και 41,8% η διαφορά μεταξύ των υπολειμμάτων αμινοξέων και των δύο μισών του πρωτογενούς δομής.

Οι μελέτες για την μετα-μεταφραστική τροποποίηση των

A. niger

PFK1 έδειξε ότι το φυσικό ένζυμο πρώτα διασπάται από την πρωτεάση της σερίνης σε βραχύτερη πρωτεΐνη που ήταν αρχικά ανενεργό, αλλά ανέκτησε δραστηριότητα μετά την φωσφορυλίωση ενός ειδικού υπολείμματος θρεονίνης που βρίσκεται στο ένζυμο ενεργό κέντρο [25]. Ένα αρνητικά φορτισμένο υπόλοιπο αμινοξέος (φωσφορυλιωμένη θρεονίνη) ήταν απαραίτητη για την παραγωγή του ενζύμου δραστηριότητα [25]. Με την αντικατάσταση του κωδικωνίου για το υπόλειμμα θρεονίνης με μία για γλουταμικό οξύ στην κολοβωμένη

A. niger PFK

Α, η ανάγκη για φωσφορυλίωση αρχικά ανενεργών βραχύτερων θραυσμάτων PFK1 εξαλείφθηκε και ενεργών βραχύτερων θραυσμάτων PFK1 κωδικοποιήθηκαν απ ‘ευθείας από το τροποποιημένο

PFK

Μια γονίδια [25]. Με ευθυγράμμιση των αλληλουχιών αμινοξέων των τριών ανθρώπινων ισοενζύμων με εκείνη του

A. niger

ένζυμο (συμπληρωματική Σχ. S2), ένα αρνητικά φορτισμένο υπόλοιπο αμινοξέος (ασπαρτικό οξύ) βρέθηκε μόνο στην αλληλουχία του PFK-M στη θέση που αντιστοιχεί στο υπόλειμμα θρεονίνης στο

A. niger

πρωτεΐνη. Τα άλλα δύο ισοένζυμα, PFK-L και PFK-P, περιείχε ένα μη πολικό κατάλοιπο αλανίνης στην θέση που να ταιριάζουν. Ως εκ τούτου, PFK-M με ένα αρνητικά φορτισμένο υπόλειμμα ασπαρτικού οξέος σε αυτή την κρίσιμη θέση εξήχθη το συμπέρασμα ότι είναι ο πιο πιθανός υποψήφιος για τη δημιουργία ενεργών θραυσμάτων μικρότερη PFK1 μετά από μία μόνο μετα-μεταφραστική τροποποίηση βήμα.

In vitro

μετα-μεταφραστική τροποποίηση των θηλαστικών PFK1

Για να επαληθεύσετε ότι, PFK1 απομονώθηκε από μυ κουνελιού. Το καθαρισμένο ένζυμο επωάστηκε με διάφορες πρωτεάσες και ελέγχονται για την παρουσία του που δημιουργήθηκε πρόσφατα, ενεργό, κιτρικό βραχύτερα θραύσματα PFK1 αναστολή ανθεκτικά. Διάφορα εμπορικώς διαθέσιμα πρωτεασών από διάφορα είδη χρησιμοποιήθηκαν στα επιμέρους πειράματα.

Το πείραμα διεξήχθη σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει 5 mM κιτρικό άλας, το οποίο λειτουργεί ως ισχυρός αναστολέας του φυσικού ενζύμου αλλά όχι των βραχύτερων θραυσμάτων. Μετά περιορισμένη πρωτεόλυση της καθαρισμένης φυσικής PFK1 με πρωτεϊνάση Κ (0.001 mg /ml), ανιχνεύθηκε δραστικότητα PFK1. Μια σταδιακή αύξηση της δραστηριότητας PFK1 ανιχνεύθηκε στα δείγματα που έχουν εκτεθεί σε πρωτεολυτική δράση για παρατεταμένο χρονικό διάστημα (Σχ. 1). Με SDS-PAGE, θραύσματα περίπου 45 kDa παρατηρήθηκαν μετά από περιορισμένη πρωτεόλυση μετά 0,001 mg /ml Πρωτεϊνάσης Κ (συμπληρωματική Σχ. S3), ενώ η επώαση με πρωτεϊνάση Κ σε μία υψηλότερη συγκέντρωση (0.01 mg /ml) που παράγεται ανενεργό, ελαφρώς μικρότερη θραύσματα. Δεν δραστικά θραύσματα θα μπορούσαν να ανιχνευθούν μετά τη διάσπαση του φυσικού ενζύμου με άλλα εμπορικά διαθέσιμα ένζυμα μικροβιακής ή θηλαστικής προέλευσης.

Δραστηριότητες της φυσικής PFK1 απομονώθηκε από μυ κουνελιού μετά από περιορισμένη πρωτεόλυση από Πρωτεϊνάση Κ (σκοτάδι) και το μη επεξεργασμένο αυτοφυές ενζύμου (φως) όπως μετράται σε ένα σύστημα που περιέχει 5 mM κιτρικό άλας. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων μετρήσεων και παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση.

Η

Αυτό το πείραμα έδειξε ότι μια πρωτίστως σε ένα στάδιο μετα-μεταφραστική τροποποίηση του PFK1 θηλαστικών ήταν δυνατό να δώσουν ενεργό βραχύτερα θραύσματα PFK1. Η πρωτεάση που είχε πράγματι εμπλέκεται στην παραγωγή τέτοιων θραυσμάτων σε ανθρώπινα κύτταρα παραμένει να προσδιοριστεί, αλλά οι πιο πιθανοί υποψήφιοι είναι σερινοπρωτεάσες που πρέπει να ενεργοποιηθεί ενδοκυτταρικά.

Ανίχνευση βραχέων θραυσμάτων PFK-M στο μεταστατικό κύτταρο όγκου γραμμές με ανοσοκηλίδωση

για να εξεταστεί ποια PFK1 μορφές είναι παρούσες σε κύτταρα όγκου, τέσσερις διαφορετικές νεοπλασματικές κυτταρικές σειρές που είναι γνωστό ότι επάγουν μεταστατικών όγκων μετά χρησιμοποιήθηκαν εισαγωγή μέσα πειραματόζωα. Οι ακόλουθες κυτταρικές σειρές δοκιμάστηκαν: ανθρώπινου καρκινώματος κύτταρα HeLa? μελανώματος ποντικού κύτταρα Β16-Ρ10? και δύο λεμφώματα, ο αρουραίος Nb2-11 γραμμή και η ανθρώπινη γραμμή TF-1. Για στύπωμα Western, ένα αντίσωμα που εγείρεται έναντι ενός επιτόπου του δραστικού κέντρου του ενζύμου που ήταν ταυτόσημη σε διάφορες ισομορφές PFK1-M θηλαστικών, αλλά όχι σε L ή Ρ ισομορφές, χρησιμοποιήθηκε.

Στα προϊόντα ομογενοποίησης όλων των νεοπλασματικών κυττάρων γραμμές, η ποσότητα του φυσικού PFK1 85 kDa ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης ανοσοκηλιδώσεως (Εικ. 2). Ωστόσο, κηλιδώθηκαν ένας αριθμός θραυσμάτων χαμηλότερου μοριακού βάρους. Σε όλες τις ομογενοποιήματα κυττάρου, θραύσματα περίπου 47 kDa ήταν παρόντες, ενώ κάποια άλλα θραύσματα εμφανίστηκαν σποραδικά. Σε αντίθεση με τα ογκογόνα κυτταρικές σειρές, μόνο τα φυσικά ένζυμα 85 kDa PFK1 παρατηρήθηκαν σε λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν από περιφερικό ανθρώπινο αίμα. Εγγενής ένζυμα ήταν κυρίαρχη επίσης σε εμβρυϊκά κύτταρα ανθρώπινου νεφρού (ΗΕΚ 293 κυτταρική σειρά) χρησιμοποιώντας μια πανομοιότυπη μέθοδο ανοσοκηλιδώσεως. ΗΕΚ κύτταρα αθανατοποιημένα με αδενοϊό, αλλά δεν ήταν ογκογόνο. Αν και δεν 47 kDa θραύσμα χαμηλού μοριακού βάρους ανιχνεύθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ, ορισμένες ελαφρώς συντομευμένη φυσικές μορφές του ενζύμου παρατηρήθηκε ότι ενδέχεται να είναι ένα προϊόν εναλλακτικού ματίσματος. Στο ανθρώπινο μυ, μία εναλλακτική μεταγραφής που κωδικοποιεί ένα ισοένζυμο PFK-M έχει αναφερθεί, αποδίδοντας ένα δραστικό ένζυμο με υπολείμματα 749 αμινοξέων και μια μοριακή μάζα των 81776 Da [27]. Αποδεικτικά στοιχεία για εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου PFK-M έχει επίσης αναφερθεί σε ποντικούς [28].

κηλίδες Western των τεσσάρων ογκογονικών κυτταρικών σειρών (παραπάνω) έδειξε την παρουσία θραυσμάτων διαφορετικών μηκών, με ένα θραύσμα 47 kDa τακτικά το παρόν, ενώ θα μπορούσε να παρατηρηθεί καμία εγγενή 85-kDa PFK1. Σε μη-νεοπλασματικών κυτταρικών σειρών (κάτω) (κύτταρα ΗΕΚ), η μητρική μορφές PFK1 ήταν κυρίαρχη, ενώ σε φυσιολογικά λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν από περιφερικό ανθρώπινο αίμα μόνο μία πρωτεϊνική ζώνη ανιχνεύθηκε που αντιστοιχεί στο 85 kDa μητρική PFK1. Στο στύπωμα Western των λεμφοκυττάρων δύο όγκους κυτταρολύματος εφαρμόσθηκαν στο πήκτωμα:. 10 μΐ (αριστερά), και 20 μΐ (δεξιά)

Η

Κατά τον έλεγχο, δεν παρατηρήθηκαν ζώνες όταν ένα δείγμα του μέσου ανάπτυξης ανοσοστυπώθηκαν με τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση PFK1.

ανίχνευση βραχέων θραυσμάτων PFK-M σε όγκους με ανοσοκηλίδωση

σε έναν όγκο που έχει αναπτυχθεί σε ένα C57BL /6 ποντίκι, 10 ημερών μετά την υποδόρια ένεση των κυττάρων Β16-Ρ10, σχεδόν ταυτόσημα θραύσματα ανιχνεύθηκαν όπως στο Β16-Ρ10 κύτταρα που αναπτύσσονται σε μια καλλιέργεια ιστού (Εικ. 3). Ωστόσο, σε έναν όγκο, μια ισχυρή ζώνη που αντιστοιχεί με το φυσικό ένζυμο PFK-M ήταν παρούσα η οποία πιθανότατα προέρχεται από μη ογκογόνων ιστός που υποστηρίζουν όπως τα αιμοφόρα αγγεία, στρώμα ή φλεγμονώδη κύτταρα. Πιο λεπτομερή επιθεώρηση των μικρότερων θραυσμάτων από κύτταρα Β16-F10 και τα αντίστοιχα του όγκου αποκάλυψε ότι το 47 kDa θραύσμα ήταν παρούσα σε ατομικά αναπτυσσόμενα κύτταρα, ενώ αυτά που αναπτύσσονται σε έναν όγκο που εκφράζεται ένα θραύσμα 45 kDa.

Όχι φυσικό ένζυμο PFK1 ήταν ανιχνεύθηκε στα κύτταρα που αναπτύσσονται σε μια καλλιέργεια ιστών, ενώ σε έναν όγκο, ένα ισχυρό σήμα που αντιστοιχεί με το φυσικό ένζυμο ήταν παρόν. Μικρότερες θραύσματα ανιχνεύθηκαν στα δύο ομογενοποιήματα με 47 θραύσμα παρούσα σε ατομικά αναπτυσσόμενα κύτταρα και ένα θραύσμα 45 kDa υπάρχει σε ένα ιστό όγκου.

Η

περικομμένη ανθρώπινη μυϊκή PFK1 cDNA κωδικοποιεί δραστικά βραχύτερα θραύσματα PFK-Μ σε

E.coli

κύτταρα με διαταράσσεται η μητρική

PFK

μια

στο επόμενο βήμα, η αποτελεσματικότητα των ενεργών μικρότερα θραύσματα ανθρώπινου PFK-M δοκιμάστηκε σε ένα

Ε. coli

στέλεχος που έλειπε δική φυσικές πρωτεΐνες PFK1 του. Αν και η ακριβής μοριακή μάζα των βραχύτερων θραυσμάτων δεν μπορούσε να προσδιοριστεί από κηλίδες Western, μία σειρά από κομμένα γονίδια παρασκευάζονται από ανθρώπινο μυ PFK1 cDNA. Κομμένα γονίδια εισήχθησαν εντός του

E. coli

RL 257 [29] το στέλεχος, και τα προϊόντα μετασχηματισμού εξετάστηκαν για αλλαγμένη χαρακτηριστικά ανάπτυξης σε ένα μέσο που περιέχει γλυκόζη. Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από κομμένα γονίδια διέφεραν από αρκετά υπολείμματα αμινοξέων και καλύπτονται μοριακές μάζες που κυμαίνονται από 45 kDa έως 46 kDa και 47 kDa έως 48 kDa (συμπληρωματικός Πίνακας S2). Δύο προϊόντα μετασχηματισμού ικανά να αναπτύσσονται σε συμπληρωμένο ελάχιστο μέσο γλυκόζης αποκαλύφθηκαν, ένα από κάθε ομάδα μοριακές μάζες (Εικ. 4). Το πρώτο στέλεχος συντίθεται αριθμό θραύσμα 4 (συμπληρωματικός Πίνακας S2) με τα κατάλοιπα 422 αμινοξέων και μια μοριακή μάζα των 45551 Da, ενώ το άλλο στέλεχος κωδικοποιημένο αριθμό Θραύσμα 9 (συμπληρωματικός Πίνακας S2) με τα κατάλοιπα 443 αμινοξέων και μια μάζα από 47.835 Da. Τα κύτταρα και των δύο στελεχών πολλαπλασιάζεται σε οπτική πυκνότητα από 2 σε περίπου 24 ώρες, η οποία έδειξε ότι και οι δύο ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ήταν ενεργά και είναι σε θέση να συμμετέχουν αποτελεσματικά σε βακτηριακό μεταβολισμό. Καμία ανάπτυξη των προϊόντων μετασχηματισμού που κωδικοποιούν άλλα βραχύτερα θραύσματα PFK-M μπορεί να παρατηρηθεί, αν και συντίθεται ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με κηλίδες Western (συμπληρωματική Σχ. S4). Όχι ανάπτυξη σε μέσο γλυκόζης θα μπορούσε να ανιχνευθεί από ένα στοιχείο ελέγχου, το γονικό στέλεχος RL257 φέρει το πλασμίδιο ρΑίΤΕΚ-E × 1 χωρίς εισαχθέν γονίδιο. Παραδόξως, το μετασχηματισμένο που κωδικοποιεί την αυτοφυή ανθρώπινη PFK-M (85.051 Da) δεν ήταν σε θέση να πολλαπλασιάζονται υπό τις ίδιες συνθήκες, αν και η υψηλή ενζυματική δραστηριότητα (πάνω από 600 mU /ml) ανιχνεύθηκε στο ελεύθερο κυττάρων εκχύλισμα.

δύο

E.coli

μετασχηματισμοί που κωδικοποιούν θραύσμα 4 (⧫) και θραύσμα 9 (□) ήταν σε θέση να αναπτυχθούν σε συμπληρωμένο γλυκόζης ελάχιστο μέσο. Καμία ανάπτυξη του γονικού στελέχους, RL 257, που φέρει το ρΑίΤΕΚ-Ex-1 πλασμίδιο χωρίς εισαχθέν γονίδιο (•) θα μπορούσε να ανιχνευθεί. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων μετρήσεων και παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση.

Η

Και στις δύο μετασχηματισμοί που ήταν σε θέση να αναπτυχθούν σε μέσο γλυκόζης, δραστικότητα PFK1 ανιχνεύθηκε στα ομογενοποιήματα. Και στις δύο μετασχηματισμοί που ήταν σε θέση να αναπτυχθούν σε μέσο γλυκόζης, δραστηριότητες PFK1 ανιχνεύθηκαν στα ομογενοποιήματα. Στο προϊόν μετασχηματισμού που κωδικοποιεί Θραύσμα 9, ανθεκτικό σε ΑΤΡ και κιτρικό αναστολή δραστικότητας καταγράφηκε στα 0,5 mm του F6P που είναι κοντά φυσιολογική συγκέντρωση [30]. Το θραύσμα 9 έδειξε υψηλή συγγένεια προς το ΑΤΡ (K

m από περίπου 0,05 mm), ενώ σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από 0.2 mM, χωρίς ΑΤΡ αναστολή μπορούσε να ανιχνευθεί (σχ. 5Α). Αντιθέτως, η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη φυσικής 85 kDa PFK-M που απομονώθηκε από

E.coli

στέλεχος RL257 έδειξε μία κορυφή στις δραστηριότητες ενζύμου σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΑΤΡ. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις ΑΤΡ οι δραστηριότητες αυξήθηκε πιο αργά σε σχέση με το βραχύτερο θραύσμα, υποδεικνύοντας χαμηλότερη συγγένεια του φυσικού ενζύμου προς το ΑΤΡ (K

m~0,3 mM). Ωστόσο, οι συγκεντρώσεις ΑΤΡ πάνω από 0,6 mM προκάλεσε μία απότομη μείωση του φυσικού ενζύμου δραστικότητα και μόνο μία μέτρια δραστηριότητα PFK1 ανιχνεύθηκε σε συγκέντρωση ΑΤΡ 1 mM (Σχ. 5Α). Το κιτρικό νάτριο δεν αναστέλλει τη δραστηριότητα της PFK συντομότερη-M θραύσμα (Σχ. 5Β). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα κινητικά χαρακτηριστικά του ανασυνδυασμένου ανθρώπινου φυσικού ενζύμου PFK-M όπου μια ισχυρή ευαισθησία προς το κιτρικό αποκαλύφθηκε [31]. θα μπορούσε να ανιχνευθεί αριθ αναστολή του βραχύτερο θραύσμα με γαλακτικό είτε (Σχ. 5Β), ένας μεταβολίτης που προτάθηκε πρόσφατα να ρυθμίσει τις δραστηριότητές PFK1 ποντίκι [32].

Στο σχήμα 5Α σχετική ειδικές δραστηριότητες PFK1 ανιχνεύονται στο ομογενοποίημα του προϊόντος μετασχηματισμού που κωδικοποιεί θραύσμα 9 (□) και με φυσικό ένζυμο PFK-M που απομονώθηκε από

E.coli

μεταμόρφωσης (○) φαίνονται, που μετρήθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΑΤΡ. Στο σχήμα 5Β ειδικές δραστηριότητες PFK1 μετρήθηκαν στο ομογενοποίημα του προϊόντος μετασχηματισμού που κωδικοποιεί Θραύσμα 9 χωρίς αναστολέα (□), υπό την παρουσία 5 mM Na

3-κιτρικού (◊), και με 5 mM Na-γαλακτικού (Δ) . Οι μετρήσεις έγιναν με 0,5 mM του F6P. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων μετρήσεων και παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση.

Η

φρουκτόζη-6-φωσφορική καμπύλες κορεσμού χωρίς και με F-2,6-BP έδειξε μια αλλαγή στην PFK- Μ δραστηριότητες τόσο του φυσικού ενζύμου (Σχ. 6Α) και το θραύσμα 9 (Σχ. 6Β). Με την προσθήκη F-2,6-BP στο σύστημα μέτρησης, σε οικόπεδο σιγμοειδές μετατράπηκε σε Michaelis-Menten κινητική, χαρακτηρίζεται από μια απότομη αύξηση των δραστηριοτήτων σε σχέση με την συγκέντρωση του υποστρώματος. Αν και F-2,6-BP αύξησε την συγγένεια των δύο ενζύμων προς το F6P ως υπόστρωμα, ο ενεργοποιητής προκάλεσε επίσης μία σημαντική αύξηση στην μέγιστη ταχύτητα του βραχύτερο θραύσμα 9 (Εικ. 6Β), ενώ καμία τέτοια επίδραση θα μπορούσε να καταγραφεί με την φυσικό ένζυμο (Σχ. 6Α).

στο σχήμα 6Α καμπύλες F6P κορεσμός του απομονωμένου φυσικού ενζύμου PFK-M με (○) και χωρίς (◊) 4 μΜ F-2,6-BP παρουσιάζονται. Στο σχήμα καμπύλες κορεσμού 6Β F6P ανιχνεύεται στο ομογενοποίημα του προϊόντος μετασχηματισμού που κωδικοποιεί Θραύσμα 9 με (□) και χωρίς (Δ) 4 μΜ F-2,6-BP απεικονίζονται. Οι μετρήσεις έγιναν με 1 mM ΑΤΡ. Σε αμφότερες τις γραφικές παραστάσεις οι σχετικές ειδικές δραστηριότητες που φαίνεται. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων μετρήσεων και παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση.

Η

Τα βραχύτερα θραύσματα PFK-M φάνηκε να είναι εξαιρετικά ασταθής σε in vitro συνθήκες. Η δραστηριότητα θα μπορούσε να σταθεροποιηθεί σε έναν ορισμένο βαθμό σε ένα ελεύθερο κυττάρων εκχύλισμα που περιείχε περίπου 10 mg πρωτεϊνών ανά ml με προσθήκη φρουκτόζης-6-φωσφορικής προς τελική συγκέντρωση 6 mM. Ωστόσο, η ταχεία απενεργοποίηση καταγράφηκε στο φιαλίδιο μέτρησης (συμπληρωματική Σχ. S5), όταν η ποσότητα της διαλυμένης πρωτεΐνες ήταν σημαντικά μειωμένη. Μετά από περίπου 10 λεπτά επώασης στους 30 ° C, δεν κατανάλωση NADH θα μπορούσε να ανιχνευθεί στο σύστημα.

Έκφραση h

PFK

MFrg9 σε μη ογκογόνα κύτταρα ΗΕΚ 293 προωθεί την ανάπτυξη, την κατανάλωση γλυκόζης και γαλακτικό

παραγωγή

Για να καθοριστεί εάν τροποποιημένα ένζυμα PFK-M έχουν παρόμοιες φυσιολογικές επιδράσεις σε μη ογκογονικά ανθρώπινα κύτταρα (Flp-in Τ-Rex ΗΕΚ κυτταρική σειρά 293), σταθερά επιμολυσμένα παρασκευάστηκαν που επέτρεψε συστατική έκφραση του h

PFK

Μ που κωδικοποιεί την φυσική PFK-M και h

PFK

MFrg9 κωδικοποιεί την PFK-M θραύσμα ρυθμό 9. ανάπτυξη, κατανάλωση γλυκόζης και γαλακτικού συσσώρευση συγκρίθηκαν με αυτά σε προϊόντα επιμόλυνσης που φέρει την ολοκληρωμένη κενό πλασμίδιο υπό ταυτόσημες συνθήκες ανάπτυξης. Τα κύτταρα που εκφράζουν h

PFK

Μ και η

PFK

MFrg9 πολλαπλασιαστεί πιο γρήγορα σε σύγκριση με τα μητρικά κύτταρα, όπως παρατηρήθηκε σε ημι-λογαριθμική γραφική παράσταση, ωστόσο, λεπτομερείς αναλύσεις της γραμμικής οικόπεδο στα ίδια δεδομένα πρότεινε μια ελαφρώς μικρότερη φάση υστέρησης των επιμολυσμένων κυττάρων σε σχέση με το πατρικό στέλεχος (Σχ. 7Α). παρατηρήθηκε η πιο δραστική διαφορά μεταξύ δοκιμαστεί επιμολύνσεις για γαλακτικό απέκκριση. Στις 24 ώρες επώασης, η ποσότητα του γαλακτικού συσσωρεύεται στο μέσο και ομαλοποιήθηκε ως προς 1 εκατομμύριο κύτταρα αποκάλυψε τέσσερις πτυχώσεις υψηλότερη παραγωγικότητα από το στέλεχος σύνθεση Θραύσμα 9 σε σχέση με το στέλεχος που κωδικοποιεί τον φυσικό PFK-M και έξι πτυχώσεις υψηλότερο σε σύγκριση με το πατρικό στέλεχος. Κατά τη δεύτερη ημέρα, η ποσότητα του γαλακτικού συσσωρευμένων ήταν ακόμη περίπου 30% υψηλότερη από τα κύτταρα με Θραύσμα 9, ενώ αργότερα, παρόμοιες τιμές ελήφθησαν με τις τρεις κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν (Σχ. 7C). Η αυξημένη παραγωγή γαλακτικού οξέος από τα κύτταρα που εκφράζουν το h

PFK

γονίδιο MFrg9 αντανακλάται και στα ποσοστά κατανάλωσης γλυκόζης. Στις 24 ώρες, το υψηλότερο ποσό της γλυκόζης, κανονικοποιημένη με το σταθερό αριθμό κυττάρων, έχει ληφθεί από τα κύτταρα που κωδικοποιεί το θραύσμα 9, περίπου 40% λιγότερο γλυκόζη καταναλώθηκε από τα κύτταρα συνθέτουν το φυσικό ένζυμο PFK-M, ενώ το γονικό κύτταρα μεταβολίζεται ακόμη λιγότερο γλυκόζης (Εικ. 7Β).

Στην ανάπτυξη 7Α σχήμα της Flp-In T-Rex ΗΕΚ 293 κύτταρα με ενσωματωμένο h

PFK

MFrg9 (h

PFK

MFrg9 /HEK – ▪) που κωδικοποιεί το θραύσμα 9? ολοκληρωμένη h

PFK

Μ (h

PFK

M /HEK – •) που κωδικοποιεί το φυσικό ένζυμο PFK-M? και τα κύτταρα με ενσωματωμένο κενό πλασμίδιο (ΗΕΚ – ◊) παρουσιάζονται σε λογαριθμική λειτουργία. Στο σχήμα 7Β κατανάλωσης γλυκόζης από μορφομετατροπέων κανονικοποιημένο σε 1 εκατομμύριο κύτταρα δείχνεται. Στο σχήμα παραγωγής 7C γαλακτικού υπολογίστηκαν εκ νέου για 1 εκατομμύριο κύτταρα παρουσιάζεται. Ταυτόσημα σύμβολα για επιμέρους προϊόντα μετεμβολιασμού χρησιμοποιούνται σε όλα τα σχήματα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων μετρήσεων και παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση.

Η

Συζήτηση

Μια ποικιλία ογκογονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των Akt [33], BCR-Abl [34], c-Myc και HIF [35], την προώθηση του μεταβολισμού της γλυκόζης σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, η ενεργοποίηση της Akt και μόνο, το οποίο κωδικοποιεί μια κινάση σερίνης /θρεονίνης η οποία είναι υπό τον έλεγχο του phosphatidylinositide-3-κινάσης ΡΙ3Κ, έχει αποδειχθεί επαρκής για να διεγείρει το διακόπτη για να αερόβια γλυκόλυση [36]. Ωστόσο, οι υποκείμενες μοριακές αλλαγές στο επίπεδο των ρυθμιστικών γλυκολυτικών ενζύμων παραμένουν ελάχιστα κατανοητοί. Συστατική ενεργοποίηση της Akt έχει ενοχοποιηθεί στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [37] και πρότεινε να συμμετέχουν σε δραστικότητα προαγωγής μεταφορέα GLUT1 [4]. Επιπλέον, η διεγερτική ρόλος του /Akt μονοπατιού σηματοδότησης ΡΙ3Κ έχει αναφερθεί σε ορμονικά εξαρτώμενο πρωτεολυτική επαγωγή (έκφραση γονιδίου καλλικρεϊνης) στο μητρικό [38] και του προστάτη [39] καρκινικές κυτταρικές σειρές. καλλικρεϊνες Ανθρώπινος ιστός ανήκουν σε μια υποομάδα των πρωτεασών σερίνης που είναι παρόμοια με Πρωτεϊνάση Κ, τα οποία έχουμε επιδείξει εδώ για να διασπάσει φυσικά ένζυμα PFK1 να σχηματίσει δραστικό, κιτρικό αναστολή ανθεκτικά βραχύτερα θραύσματα PFK1. Ως εκ τούτου, μεσολαβεί η ΑΚΤ επαγωγή της αερόβιας γλυκόλυσης μπορεί επίσης να εμπλέκεται στην μετα-μεταφραστική τροποποίηση του PFK1 ενεργοποιώντας πρωτεολυτικά ένζυμα.

Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από τα παρόμοια αποτελέσματα που ελήφθησαν με επιμολυσμένα κύτταρα που εκφράζουν ιδιοσυστατικά Akt [36] και το κύτταρα συνθέτουν υψηλής δραστικότητας βραχύτερα θραύσματα PFK1 σε αυτή τη μελέτη. Και οι δύο τύποι κυττάρων που καταναλώνεται γλυκόζη ταχύτερα και αποβάλλεται γαλακτικό σε υψηλότερες αποδόσεις σε σύγκριση με τα μη-επιμολυσμένα κύτταρα.

Με κηλίδωση Western πειράματα ογκογονικών και φυσιολογικών κυττάρων όχι φυσικό ένζυμο 85 kDa μπορούσε να ανιχνευθεί σε νεοπλασματικά κύτταρα, ενώ ένα θραύσμα 47 kDa ήταν χαρακτηριστικά παρόν. Ωστόσο, κάποια άλλα μικρότερα θραύσματα κηλιδώθηκαν επίσης. Μπορούν πιθανότατα προήλθε από την φυσική PFK1 αφού το αντίσωμα που χρησιμοποιείται, αποδείχθηκε ότι είναι αρκετά ειδικές και δεν χαμηλού μοριακού πεπτίδια εμφανίστηκε στο λύμα των λεμφοκυττάρων και των κυττάρων ΗΕΚ. Εκτός αυτού, λίγα είναι γνωστά για την κυτοσολικό πρωτεολυτική δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα ως εκ τούτου, είναι δύσκολο να κάνουμε υποθέσεις σχετικά με τον αριθμό των πρωτεασών που θα μπορούσαν να προσβάλλουν το ένζυμο PFK1. Αναμφίβολα, καλύτερη πληροφόρηση σχετικά με την τροποποίηση μετα-μεταφραστική θα μπορούσε να επιτευχθεί με τη χρήση ενός επισύναψη επιτόπου PFK1 αλληλόμορφο. Στην πραγματικότητα θα δοκιμαστεί ετικέτα επιτόπου AU1 [40], που ήταν Ν-τερματικώς συντηγμένη προς το φυσικό PFK-M. Παρά το γεγονός ότι με ετικέτα

PFK

-M γονίδιο εκφράστηκε και ανιχνεύθηκε πρωτεΐνη, καμία δραστηριότητα του ενζύμου θα μπορούσε να ανιχνευθεί (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πιστεύουμε ότι η επέκταση των έξι υπολείμματα αμινοξέων επηρέασαν την αναδίπλωση της πρωτεΐνης στα κύτταρα και εμπόδισε τη σωστή σύνδεση των monomeres σε μια ενεργή tertameric ολοένζυμο. Δυστυχώς, ανενεργό ένζυμο δεν θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τις μελέτες των μετα-μεταφραστική τροποποίηση με πρωτεολυτική διάσπαση.

Είναι ενδιαφέρον, ελαφρώς διαφορετική βραχύτερα θραύσματα ανιχνεύθηκαν σε Β16-Ρ10 κύτταρα που αναπτύσσονται μεμονωμένα και σε ιστό όγκου. Αν και, in vivo πειράματα που διεξήχθησαν σε

E.coli

μετασχηματισμοί αποκάλυψε ότι και οι δύο 45 και 47 kDa θραύσματα PFK-M μπορούσε συνδέσει σε ένα δραστικό ολοένζυμο. Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες ενδέχεται να επηρεάσει την μετα-μεταφραστική τροποποίηση του PFK-Μ σε κύτταρα Β16-Ρ10.

Μετά την μετα-μεταφραστική τροποποίηση του PFK-M, ενζυμική δραστηριότητα διατηρείται, δεδομένου ότι η ενεργή θέση του ευκαρυωτικών PFK1s είναι που βρίσκεται στο Ν-άκρο [12]. Ωστόσο, τα κινητικά χαρακτηριστικά των βραχύτερων θραυσμάτων PFK-M αλλάξει (Εικ. 5-6). Το πιο σημαντικό τροποποιημένα ένζυμα γίνει αναίσθητη σε κιτρικό και αναστολή ΑΤΡ. Με πρωτεολυτική διάσπαση του C-τερματικό τμήμα του φυσικού μορίου ορισμένα συστατικά της θέσης δέσμευσης κιτρικό χάνονται, καθώς και ένα μοτίβο υπεύθυνη για την αναστολή από ΑΤΡ (συμπληρωματική Σχ. S1). Παρόμοιες κινητικές μεταβολές των τροποποιημένων θραυσμάτων PFK1 παρατηρήθηκαν επίσης μετά από την μετα-μεταφραστική τροποποίηση του φυσικού ενζύμου PFK1 στο νηματοειδή μύκητα

Aspergillus niger

[24]. 5′-AATTATGGATCCATGACCCATGAAGAGCACC-3′.

doi:10.1371/journal.pone.0019645.s006

(TIF)

Table