Αφηρημένο

TRAIL είναι ένας πολλά υποσχόμενος θεραπευτικός παράγοντας για την ανθρώπινη κακοήθειες. TRAIL απαιτεί συχνά μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, που αναφέρεται ως οδού του υποδοχέα Τύπου II θανάτου, για την προώθηση της κυτταροτοξικότητα. Ωστόσο, πολυάριθμες κακοήθη κύτταρα είναι ανθεκτικά TRAIL οφείλεται στην αναστολή της παρούσας μιτοχονδριακής οδού. Χρησιμοποιώντας κύτταρα χολαγγειοκαρκίνωμα ως μοντέλο της αντίστασης TRAIL, βρήκαμε ότι ο αποκλεισμός της σηματοδότησης Hedgehog ευαισθητοποιημένα αυτά τα καρκινικά κύτταρα για να TRAIL κυτταροτοξικότητα ανεξάρτητη από μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, που αναφέρεται ως σηματοδότηση υποδοχέα θανάτου τύπου Ι. Αυτός ο διακόπτης στην απαίτηση TRAIL από τύπου ΙΙ είναι τύπου σηματοδότηση υποδοχέα Ι θάνατο καταδείχθηκε από την έλλειψη λειτουργικής εξάρτησης από την προσφορά /Bim και Bax /Bak, προαποπτωτικής συστατικά της μιτοχονδριακής οδού. Hedgehog σηματοδότηση διαμορφωμένο έκφραση του αναστολέα φυλοσύνδετη απόπτωσης (ΧΙΑΡ), η οποία χρησιμεύει για την καταστολή της οδού του υποδοχέα θανάτου τύπου Ι. siRNA στοχευμένη εξουδετέρωση των

ΧΙΑΡ

μιμείται ευαισθητοποίηση στα μιτοχόνδρια-ανεξάρτητη θανάτωση TRAIL επιτυγχάνεται με την αναστολή Hedgehog. Ρύθμιση έκφρασης ΧΙΑΡ με Hedgehog σηματοδότηση διαμεσολαβείται από το γλοίωμα που σχετίζεται ογκογονίδιο 2 (GLI2), ένα προς τα κάτω παράγοντα μεταγραφής του Hedgehog. Συμπερασματικά, τα δεδομένα αυτά παρέχουν πρόσθετους μηχανισμούς διαμόρφωσης κυτταρικού θανάτου από TRAIL και να προτείνει την αναστολή σκαντζόχοιρος ως θεραπευτική προσέγγιση για την TRAIL ανθεκτικά νεοπλάσματα

Παράθεση:. Kurita S, Mott JL, Cazanave SC, Fingas CD, Guicciardi ME, Bronk SF, et al. (2011) σκαντζόχοιρος Αναστολή Προωθεί ένα διακόπτη από Type II του τύπου Ι κυτταρικό θάνατο σηματοδότησης υποδοχέων στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (3): e18330. doi: 10.1371 /journal.pone.0018330

Επιμέλεια: Ανδρέας Bergmann, Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4, Ιανουαρίου 2011? Αποδεκτές: 25 του Φεβρουαρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 31 του Μαρτίου, 2011

Copyright: © 2011 Kurita et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας R01 Επιχορηγήσεις DK59427 (GJG), Τμήμα Ογκολογίας Έρευνας, Mayo Clinic Κέντρο Καρκίνου, Mayo Clinic του παγκρέατος SPORE Ρ50 CA102701, και Mayo Clinic Center for Cell Signaling στη Γαστρεντερολογία ΝΙϋϋΚ Ρ30 DK084567 (ΥΠΟΙΟ-Z) και η Mayo Ίδρυμα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

νέκρωσης όγκου παράγοντα που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL), ένας ισχυρός συνδέτης θανάτου που επάγει προνομιακά απόπτωση σε μετασχηματισμένα κύτταρα, κινεί καταρράκτες σηματοδότησης δια προσδέσεως δύο υποδοχείς θανάτου, DR4 (TNFRSF10A, που αναφέρεται επίσης ως υποδοχέας TRAIL 1) και DR5 (TNFRSF10B, που αναφέρεται επίσης ως υποδοχέας TRAIL 2 /KILLER /τέχνασμα-2) [1]. TRAIL επαγόμενη ομαδοποίηση και ολιγομερισμό των DR4 και DR5 οδηγεί σε διαμορφωτικές αλλαγές των πεδίων θανάτου εντός κυτταροπλασματικές ουρές τους, διευκολύνοντας στρατολόγηση και ενεργοποίηση των κασπασών 8 και 10 εντός ενός θανάτου που επάγει σύμπλεγμα σηματοδότησης (ΔΙΣΚΟΣ) [2], [3], [ ,,,0],4]. Εάν η ενεργοποίηση αυτών των κασπασών εκκινητή είναι επαρκώς ισχυρή, ενεργοποιούν άμεσα κασπάσης 3, η οποία με τη σειρά του οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο με τη λεγόμενη τύπου Ι οδού του υποδοχέα θανάτου απόπτωσης [5], [6]. Ωστόσο, αν το μέγεθος της κασπάσης 8 και 10 η ενεργοποίηση δεν είναι επαρκής για να ενεργοποιήσει άμεσα κασπάσης 3, TRAIL μπορεί ακόμη να επάγει απόπτωση μέσω διάσπασης του προαποπτωτικών ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη Bid να παράγουν κολοβωμένο Bid (tBID). tBid πρωτεΐνη ενεργοποιεί μιτοχονδριακής διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης με την προώθηση ολιγομερισμό του προ-αποπτωτικών Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών Bak ή /και Bax εντός αυτής της μεμβράνης. Μιτοχονδριακή εξωτερικής αποτελέσματα διαπερατοποίηση μεμβράνης σε έξοδο του προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών από το χώρο των μιτοχονδρίων intermembrane (δηλαδή, το κυτόχρωμα c, Smac /DIABLO, HtrA2, ΟΕΕ, και ενδονουκλεάση G), η οποία κορυφώνεται με μιτοχονδριακό μονοπάτι της απόπτωσης [7], [8 ]? η εξάρτηση από μιτοχονδριακή δυσλειτουργία για κυτταρικό θάνατο αναφέρεται ως οδού του υποδοχέα θανάτου Τύπου II της απόπτωσης [6]. σηματοδότηση Ι υποδοχέα θανάτου Τύπος φαίνεται να ρυθμίζεται στο επίπεδο της κασπάσης-3 ενεργοποίησης, ενώ σηματοδότηση υποδοχέα θανάτου Τύπου II ρυθμίζεται στο επίπεδο των μιτοχονδρίων από μέλη της αντιαποπτωτικών οικογένειας πρωτεϊνών Bcl-2 [7], [8], [ ,,,0],9], [10]. TRAIL συνήθως σημάτων μέσω του Τύπου II, τα μιτοχόνδρια εξαρτώμενη οδό [11], ένα μονοπάτι το οποίο συχνά παρεμποδίζεται σε καρκίνους με αποτέλεσμα την αντίσταση TRAIL [12], [13].

Εδώ, αποδεικνύουμε ότι η αναστολή του ογκογόνο οδό Hedgehog καταστέλλει την έκφραση του ΧΙΑΡ και ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα να TRAIL κυτταροτοξικότητα, χρησιμοποιώντας κύτταρα χολαγγειοκαρκίνωμα ως μοντέλο για τη μελέτη αντοχής TRAIL. Αυτά τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν άφθονα αντιαποπτωτικό οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών, ειδικά Mcl-1, η οποία μεσολαβεί αντίσταση TRAIL [14], [15]. Mcl-1 αναστολή της μιτοχονδριακής οδού του κυτταρικού θανάτου είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τα κύτταρα χολαγγειοκαρκίνωμα καθώς παραδόξως εκφράζουν TRAIL

in vivo

, και πιθανότατα πρέπει συνεχώς να παρακάμψουν TRAIL κυτταροτοξική σηματοδότηση για επιβίωση [16]. Με δεδομένη την αναδυόμενη στοιχεία που εμπλέκουν ογκογόνο σηματοδότησης Hedgehog στο γαστρεντερικό βιολογία του όγκου [17], [18], θα διερευνηθούν σκαντζόχοιρος σηματοδοσίας ως μηχανισμός που συμβάλλει στην αντίσταση TRAIL από τα καρκινικά κύτταρα. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η οδός Hedgehog είναι ουσιαστικά δραστική σε αυτά τα κύτταρα και ότι η αναστολή της ευαισθητοποιεί κύτταρα χολαγγειοκαρκίνωμα να TRAIL κυτταροτοξικότητα που συμπίπτει με τα πάνω ρύθμιση του υποδοχέα TRAIL DR4 [19]. Ωστόσο, δεν ήταν σαφές πώς τα πάνω ρύθμιση των DR4 και μόνο θα μπορούσε να ξεπεράσει τον αποκλεισμό Mcl-1 της μιτοχονδριακής οδού απόπτωσης. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αποδείξει ότι κάτω ρύθμιση των ΧΙΑΡ με αναστολή Hedgehog μετατρέπει τύπου ΙΙ σηματοδότησης TRAIL σε ένα μονοπάτι Τύπου Ι. Έτσι, τα δεδομένα μας ορίζουν ένα μηχανισμό με τον οποίο Hedgehog σηματοδότηση ρυθμίζει TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα και προτείνουν αναστολή αυτού του καταρράκτη ως πιθανοί θεραπευτική προσέγγιση για TRAIL-ανθεκτικών νεοπλασμάτων ..

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

η Κλινική Επιτροπή IRB Mayo ελεγχθεί και εγκριθεί για ανθρώπινη μελέτες της με τίτλο το πρωτόκολλο «ανάλυση της έκφρασης του γονιδιώματος του ανθρώπινου χολαγγειοκαρκίνωμα (CCC).» η επιτροπή διαπίστωσε ότι αυτό αποτελεί ελάχιστη έρευνα κινδύνου. Τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα.

Cell Culture

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές χολαγγειοκαρκίνωμα, KMCH, HuCCT-1, και Μζ-Cha-1, καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100.000 μονάδες /L πενικιλλίνη, 100 mg /L στρεπτομυκίνη και 100 mg /L γενταμυκίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20], [21].

Ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT- PCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA), και cDNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές και ιού λευχαιμίας ποντικού Moloney αντίστροφη μεταγραφάση όπως περιγράφηκε προηγουμένως λεπτομερώς [22]. Το προϊόν cDNA ενισχύθηκε με PCR με Taq DNA πολυμεράση με τη χρήση τυποποιημένων πρωτοκόλλων. Οι εκκινητές PCR απεικονίζονται στον Πίνακα 1. Εκκινητές για 18S ριβοσωμικό RNA (rRNA) αγοράστηκαν από Ambion Inc. (Austin, ΤΧ). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με την Roche LightCycler χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο ως το φθορισμοφόρο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Ο αριθμός αντιγράφων του mRNA στόχου σε κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε ως αναλογία χρησιμοποιώντας τον αριθμό αντιγράφων για 18S rRNA στον παρονομαστή.

Η

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

λύματα ολόκληρων κυττάρων ελήφθησαν ως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς λεπτομερώς [21]. Τα δείγματα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με πηκτώματα SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, και γίνεται αποτύπωμα με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα σε αραίωση 1: 500 έως 1: 1000. δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση (Biosource International, Camarillo, CA) επωάστηκαν σε αραίωση 1: 3000 έως 1: 5000. Τα δεσμευμένα αντισώματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας (Amersham, Arlington Heights, IL) και φιλμ Kodak Χ-ΟΜΑΤ (Eastman Kodak, Rochester, ΝΥ). Πρωτοβάθμια αντιοροί εκείνα που τίθενται σε ακτίνη, Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1, και λειανθούν (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA: C11, B19, S18, S19, και Η-300, αντίστοιχα), προσφοράς και CIAP-1 (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ), ΒΙΜ και ΧΙΑΡ (BD Biosciences, San Jose, CA), και c-IAP2 (Novus Biologicals, Littleton, CO). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της πρωτεΐνης ΧΙΑΡ με ανοσοστύπωμα, φιλμ αναλύθηκαν με πυκνομετρία και η σχετική ένταση σήματος του σήματος ΧΙΑΡ κανονικοποιήθηκε προς ακτίνη σε τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η απόπτωση

Η απόπτωση ποσοτικοποιήθηκε μορφολογικά με χρώση οι πυρήνες με 4 ‘, 6-διαμινο-2-φαινυλινδόλιο διυδροχλωρίδιο (ϋΑΡΙ). Οι χαρακτηριστικές πυρηνικές μεταβολές απόπτωσης (

δηλ

. Συμπύκνωση χρωματίνης και πυρηνική κατάτμηση) εκτιμήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος 380 και 430 nm, αντίστοιχα. Caspase-3/7 Δράση σε καλλιέργειες κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει την απόπτωση βιοχημικά και μετρήθηκε με ποσοτικοποίηση απελευθέρωση φθοροφόρο από κασπάσης-3/7 υπόστρωμα χρησιμοποιώντας το Αρο-ΟΝΕ

TM ομοιογενής κασπάσης-3/7 kit (Promega, Madison , WI).

παρεμβολή RNA

Ένα ειδικό δίκλωνου RNA αλληλουχία 21 νουκλεοτιδίων συμπληρωματική προς το μήνυμα στόχου χρησιμοποιήθηκε για να σιγήσει ανθρώπινο CIAP-1, ΧΙΑΡ, Bak ή Βαχ έκφρασης. Επικυρωμένη siRNAs που στοχεύουν CIAP-1 ή ΧΙΑΡ αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. siRNAs που στοχεύουν Bak ή Βαχ σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν με τη χρήση του λογισμικού που είναι διαθέσιμη www.ambion.com και το κιτ Silencer siRNA κατασκευών από Ambion (Austin, ΤΧ). Οι αλληλουχίες siRNA που χρησιμοποιούνται για να αναστέλλουν την έκφραση Bak ή Βαχ είχαν ως εξής:

Bak,

5′-AAG TAC GAA GAT TCT TCA ΑΑΤ CCT GTC TC-3 ‘?

Bax,

5′-AAG ACG AAC ΤΟΟ ACA GTA ACA ΚΔ GTC TC-3 ‘(μερική αλληλουχία Τ7 υποκινητή είναι έντονα γράμματα). Ως έλεγχος, τα κύτταρα επιμολύνονται με ένα κωδικοποιημένο RNA διπλής όψης με την ακόλουθη αλληλουχία: 5’-AAC GTG ΑΤΤ ΤΑΤ GTC ACC AGA-3 ‘. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πιάτα 6 φρεατίων επιμολύνθηκαν παροδικά με 30 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας 5 μL /mL siPORT

TM NeoFX

TM (Ambion Inc.). έκφραση της πρωτεΐνης-στόχου αξιολογήθηκε με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης μετά από επιμόλυνση με το siRNA.

Σύντομη φουρκέτα RNA (shRNA) για την προσφορά ήταν από την Sigma Aldrich [ΑΠΟΣΤΟΛΗ μικρή φουρκέτα RNA πλασμίδιο λεντοϊού, με στόχο νουκλεοτίδια 376-396, Genebank προσχώρηση # NM_001196 ]. Για τη δημιουργία του Bim στοχευμένη shRNA κατασκεύασμα, το πλασμίδιο pSSH1 που περιέχει τον ανθρώπινο προαγωγέα Η1 για την έκφραση των shRNA χρησιμοποιήθηκε. Ένα πρότυπο διπλής έλικας του DNA (5′-GAT CCC CGC ΑΑΤ ΑΓΓ CTT TAG GAA ΑΑΤ TCA AGA GAT ΤΤΤ ΚΔ ΑΑΑ GCC ΤΑΤ TGC ΤΤΤ TTG GAA Α-3 ‘) εισήχθη στο πλασμίδιο pSSH1 μετά το RNA υποκινητή Η1. Το ένθετο DNA περιέχει αίσθηση και αλληλουχίες αντινόημα (με έντονα τυπογραφικά στοιχεία) για το mRNA Bim και μία αλληλουχία συνδετήρα 9-νουκλεοτιδίων, αποδίδοντας μεταγραφή ενός shRNA Bim στόχευσης. Για σταθερή επιμόλυνση, τα κύτταρα KMCH επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας ΟΡΤΙ-ΜΕΜ Ι (GIBCO-Invitrogen, Carlsbad, CA) που περιέχει 5 μL /mL LipofectAMINE 2000 (Invitrogen), και 3 μg /mL DNA πλασμιδίου. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, φρέσκο ​​μέσο που περιείχε 2 μg /mL πουρομυκίνη προστέθηκε για shRNA πλασμίδιο στόχευσης Bid ή 1,2 g /L νεομυκίνη προστέθηκε για shRNA πλασμίδιο στόχευσης Bim. Επιβίωση κλώνοι διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας δακτυλίους κλωνοποίησης και μεμονωμένα καλλιεργήθηκαν. Λεντοϊών σωματίδια που περιέχουν shRNA να SMO κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το μπλοκ-iT επαγώγιμοι Η1 λεντοϊών RNAi System (Invitrogen), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ακολουθίες (εισάγεται pLenti4 /BLOCK-it-DEST) αποτυπώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς [19]. Για σταθερή επιμόλυνση, φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 10 μg /mL Blasticidine-S και 500 μg /mL Zeocin (Invitrogen) προστέθηκε σε κύτταρα 48 ώρες μετά την μεταγωγή. Επιβίωση κλώνοι διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας δακτυλίους κλωνοποίησης και μεμονωμένα καλλιεργήθηκαν. Η έκφραση προκλήθηκε με 1 mg /ml τετρακυκλίνης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Μετά από επιπλέον 48 ώρες τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα. καταστολή Target αξιολογήθηκε με ανάλυση ανοσοστυπώματος.

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA)

εκχυλίσματα Πυρηνική κυττάρου παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας NE-PER αντιδραστήρια πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχύλισης (Pierce, Rockford, IL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την EMSA, 20 μg πυρηνικών πρωτεϊνών επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (25 mM HEPES, ρΗ 7,5, 0,1 Μ NaCl, 2 mM EDTA, 6% γλυκερίνη, 0,1% Triton Χ-100, 0,1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλο φθορίδιο, 0,4 mM διθειοθρεϊτόλη, 0.5 μg /μL poly (dI-dC), 0.5 μg /μL σπέρματος σολωμού) με 0.04 pmol του Cy5.5-επισημασμένου διπλόκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου DNA (που συντέθηκε από την Mayo Clinic Προηγμένη Genomics βασική τεχνολογία, Rochester ΜΝ) που περιέχει τις υποθετικές αλληλουχίες σύνδεσης GLI άγριου τύπου εντός της περιοχής του υποκινητή του ανθρώπινου

ΧΙΑΡ

γονίδιο. σύμπλοκα πρωτεΐνης-ϋΝΑ διαχωρίστηκαν από το μη δεσμευμένο ανιχνευτή DNA με ηλεκτροφόρηση μέσω γελών φυσικής πολυακρυλαμίδης 5% που περιέχει 0,5Χ Tris βορικό-ΕϋΤΑ. Ο φθορισμός οπτικοποιήθηκε απευθείας επί της πηκτής χρησιμοποιώντας ένα απεικονιστή φθορισμού Οδύσσεια (Licor Biosciences, Lincoln, ΝΕ). Για τις δοκιμασίες ανταγωνισμού, μία 200-πλάσια γραμμομοριακή περίσσεια μη επισημασμένου διπλόκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης 20 λεπτά πριν από την προσθήκη του φθορίζοντος ανιχνευτή.

χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση

ChIP διεξήχθη από κύτταρα KMCH σε επεξεργασία με 250 ηΜ ανασυνδυασμένη Sonic Hedgehog για 5 ώρες χρησιμοποιώντας ολικό κυτταρικό DNA διατέμνεται σε -500 θραύσματα bp, χρησιμοποιώντας κιτ ExactaCHIP χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (R &? συστήματα D) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή και τα δείγματα προ-καθαριστεί χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αγαρόζης συν πολτός σπέρματος σολομού (Upstate, Lake Placid, ΝΥ) πριν από την ανοσοκαθίζηση. Θετική εκκινητές ελέγχου που παρέχονται από τον κατασκευαστή του ήταν για το

Bcl-2

υποκινητή (δεσμεύεται από GLI1 και GLI2) και το

GLI1

υποκινητή (δεσμεύεται από GLI3). Αστάρια για το

ΧΙΑΡ Ιστοσελίδα υποστηρικτής μου ήταν, forw: 5 ‘TTACTGCAGCCTCCAACTCC? Rev:. 5 ‘CATCTCTCCATGCTCTGAACTC

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα που αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SE. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ANOVA με Bonferroni post hoc διόρθωση

Υλικά