Αφηρημένο

Οι τοποϊσομεράσες είναι μια οικογένεια ζωτικής σημασίας ένζυμα ικανά επίλυση τοπογραφικών προβλημάτων στο DNA κατά τη διάρκεια διαφόρων γενετικών διεργασίες. Τοποϊσομεράσης δηλητήρια, μπλοκάροντας επανένωση του διασπασμένου έλικες του DNA και τη σταθεροποίηση συγκρότημα διάσπασης DNA ένζυμο μεσολάβηση, είναι κλινικά σημαντικές αντινεοπλασματικών και αντι-μικροβιακών παραγόντων. Ωστόσο, η ταχεία αύξηση της αντίστασης στα φάρμακα που εμποδίζει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα αυτών των ζωτικών φαρμάκων κάνει το ανακάλυψη νέων ενώσεων μολύβδου όλο και πιο επιτακτική. Αναφέρουμε εδώ μια εύκολη σύστημα διαλογής υψηλής απόδοσης για τους πράκτορες που στοχεύουν ανθρώπινης τοποϊσομεράσης ΙΙα (Top2α). Η δοκιμασία βασίζεται στη μέτρηση της ανισοτροπίας φθορισμού ενός 29 bp επισημασμένο με φθοροφόρο ολιγονουκλεοτίδιο διπλής όψης. Από Top2α δεσμευμένο φάρμακο σταθεροποιημένο DNA έχει μια υψηλότερη ανισοτροπία σε σύγκριση με το ελεύθερο DNA, αυτή η δοκιμασία μπορεί να λειτουργήσει εάν κάποιος μπορεί να χρησιμοποιήσει ένα παράγοντα διαχωρισμού να διαταράξει ειδικά τις ενζύμου /δυαδικά σύμπλοκα DNA αλλά όχι τα ναρκωτικά σταθεροποιημένα τριμερών συμπλεγμάτων. Εδώ αποδεικνύουμε ότι NaClO

4, ένα χαοτροπικό παράγοντα, εξυπηρετεί ένα κρίσιμο ρόλο στη μέθοδο διαλογής μας για διαφοροποίηση των συμπλοκών ενζύμου /DNA φάρμακο σταθεροποιημένο από εκείνους που δεν είναι. Με αυτή τη στρατηγική θα προβληθεί μια χημική βιβλιοθήκη 100.000 ενώσεων και έλαβε 54 θετικές επιτυχίες. Εμείς χαρακτηρίζεται τρεις από αυτούς σε αυτόν τον κατάλογο και να καταδείξει τις επιπτώσεις τους στις Top2α μεσολάβηση αντιδράσεις. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η νέα αυτή στρατηγική ελέγχου μπορεί να είναι χρήσιμη στην ανακάλυψη επιπλέον υποψηφίους των αντικαρκινικών παραγόντων

Παράθεση:. Lin YS, Huang WC, Chen MS, Hsieh Ts (2014) Προς την ανακάλυψη νέων Anti-Cancer Πράκτορες στόχευση τοποϊσομεράση ΙΙα: μία εύκολη στρατηγική Screening Προσαρμόζεται σε πλατφόρμα υψηλής απόδοσης. PLoS ONE 9 (5): e97008. doi: 10.1371 /journal.pone.0097008

Επιμέλεια: Μαρία Spies, Πανεπιστήμιο της Αϊόβα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26η Δεκεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 14 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Πρόγραμμα Έρευνας για Biopharmaceuticals (ChemBank και High-Throughput Screening Resource Center, NSC-101 με 2.325-B-001-029), και NSC (NSC102-2325 και NSC103-2811). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

συναλλαγών DNA που μεταδίδουν και να αποκαταστήσει τις γενετικές πληροφορίες αφορούν πάντα χαλάρωση και περιέλιξη της διπλής έλικας δομές. Λόγω της τοπολογική σχέση μεταξύ δευτεροβάθμιας και τριτοβάθμιας δομές DNA της τάξης, η ελικοειδής ξετύλιγμα /κουρδίζεται αποτέλεσμα την εμπλοκή και την σύμπλεξη των χρωμοσωμάτων και το DNA. Αυτές οι τοπολογικές εμπλοκές θα πρέπει να επιλυθεί κατά τρόπο έγκαιρο και ακριβή τρόπο, χωρίς την οποία τα κύτταρα δεν μπορούν να επιβιώσουν. Τοποϊσομεράσες είναι λύση της φύσης σε αυτά τα φαινομενικά δυσεπίλυτα τοπολογικές πολυπλοκότητα [1] – [6]. Μπορούν πραγματοποίηση αυτών των τοπολογικών μετασχηματισμών μέσω ενός κύκλου αναστρέψιμη μετεστεροποιήσεως μεταξύ του ενεργού υπόλειμμα θέση τυροσυλ και το φωσφορικό σκελετό του DNA. Η παροδική προϊόν προσθήκης ενζύμου /DNA δημιουργεί μια πύλη DNA μέσω της οποίας μπορούν να μεταφερθούν και τα αποτελέσματα άλλο τμήμα DNA σε τοπολογικές αλλαγές. Με βάση την δομή και το μηχανισμό, οι τοποϊσομεράσες ταξινομούνται σε δύο τύπους: τον τύπο Ι ένζυμο μεσολαβεί στην μεταφορά κλώνο μέσω ενός και μόνο πύλη κλώνο DNA ενώ ένζυμο τύπου II μεταφέρει τμήμα DNA μέσω ενός διπλού πύλη κλώνο. Και οι δύο τύποι τοποϊσομερασών ταξινομούνται περαιτέρω σε δύο οικογένειες, Α και Β, και αυτά τα ένζυμα είναι πανταχού παρόντα χαρακτήρα και έχουν ουσιαστικές λειτουργίες για την ανάπτυξη και την ανάπτυξη όλων των οργανισμών [7], [8].

Είναι ενδιαφέρον ότι η παροδική και αναστρέψιμη διαλείμματα του DNA που προκαλούνται από τοποϊσομεράσες, τόσο κρίσιμη για βιοχημικές και βιολογικές λειτουργίες τους, δημιουργούν επίσης τακούνι ενός Αχιλλέα για τα κύτταρα. Πολλοί κυτταροτοξικών παραγόντων, τεχνητές ή τη φύση-που παράγεται, στόχος σε αυτό το στάδιο της αντίδρασης τοποϊσομεράσης και τη σταθεροποίηση της διάσπασης ενδιάμεσο δημιουργώντας έτσι δυνητικά θανατηφόρα ρηγμάτων της έλικας DNA [5], [9] – [14]. Μερικοί από αυτούς τους παράγοντες τοποϊσομεράσης-στόχευση έχει αποδειχθεί ότι είναι κλινικά σημαντική αντικαρκινικά φάρμακα και αντιβιοτικά. Η θεραπευτική αποτελεσματικότητα αυτών των ζωτικών φαρμάκων συχνά σε κίνδυνο λόγω της ανόδου της φαρμακευτικής αντίστασης σε καρκινικά κύτταρα ή μικροβιακής. Ψάχνοντας για τις νέες ρυθμίσεις και ναρκωτικά γίνεται όλο και πιο επιτακτική, αν θέλουμε να συμβαδίσει με την απειλή της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Λόγω των ουσιαστικό ρόλο των τοποϊσομερασών στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επειδή έχουν αποδειχθεί στόχους της κλινικά χρήσιμων φαρμάκων, είναι λογικό να αναμένεται ότι η εντατική προσπάθεια θα πρέπει να αφιερωθεί για να ανακαλύψετε περισσότερα φάρμακα που στοχεύουν τοποϊσομεράσες. Ωστόσο, οι βιοχημικές δοκιμασίες που χρησιμοποιούνται πιο συχνά για την παρακολούθηση της τοποϊσομεράσης δραστηριότητες δεν είναι εύκολα προσαρμόσιμο για την αυτοματοποίηση και την υψηλή πλατφόρμα απόδοση. Για βιοχημικές δοκιμασίες είναι η πλέον ευέλικτη δοκιμασίες που βασίζονται στη χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης, δεδομένου ότι μπορεί να ανιχνεύσει το DNA δομική μεταβάσεις που σχετίζονται με τις δραστηριότητες διάσπασης κλώνου και πέρασμα του τοποϊσομερασών. Η φύση εντάσεως εργασίας και η δυσκίνητη διαδικασία για την απόκτηση των στοιχείων κάνουν ηλεκτροφόρηση γέλης απίθανο μια μέθοδος επιλογής για την αυτοματοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό.

Για να διορθωθεί αυτή η δυσκολία, υπάρχουν μια σειρά από προσεγγίσεις που αναπτύχθηκαν πρόσφατα ότι είναι προσαρμόσιμο για την αυτοματοποιημένη υψηλή πλατφόρμα απόδοσης για την ταυτοποίηση ενώσεων τοποϊσομεράσης-στόχευση [15] – [18]. Είναι όλα προσδιορισμούς δραστικότητας τοποϊσομεράσης με βάση φθορισμό, έτσι πιο δεκτικά για την αυτοματοποιημένη ποσοτικοποίηση. Ωστόσο αυτοί χαρακτηρίζονται επίσης με τη χρήση ενός πλασμιδίου DNA κατά τη διαδικασία της δοκιμασίες. Αναφέρουμε εδώ την προσπάθειά μας για την ανάπτυξη μιας νέας προσέγγισης χρησιμοποιώντας ένα φθοροφόρο-tagged διπλό ολιγονουκλεοτίδιο ως υπόστρωμα για την δοκιμασία του σχηματισμού σταθεροποιημένων συμπλεγμάτων τοποϊσομεράσης /DNA με την παρουσία ενός συγκεκριμένου υποψήφιου παράγοντα. Περιγράφουμε την αρχική μας οθόνη χρησιμοποιώντας αυτήν την τεχνική προσδιορισμό μιας χημικής βιβλιοθήκης με 100.000 ενώσεων και χαρακτηρισμός τριών από τις θετικές επιτυχίες. Αυτή η μέθοδος διαλογής μπορεί να παρέχει μια εναλλακτική προσέγγιση για να ανακαλύψει νέους παράγοντες τοποϊσομεράσης-στόχευση και να εμπλουτίσουν το οπλοστάσιο μας για την καταπολέμηση των όγκων και των μικροβιακών παθογόνων.

Υλικά και Μέθοδοι

Καθαρισμός των Ανθρωπίνων Top2α

Χρησιμοποιήσαμε τεχνητή YEpWob6, ένα φορέα με εξαϊστιδίνη-tagged ανθρώπινη Top2α κάτω από ένα

GAL1

επαγόμενου υποκινητή, για να εκφράσουν ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Top2α σε ζύμη [19]. Τα κύτταρα ζύμης μετά την επαγωγή γαλακτόζης συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε υπερτονικό ρυθμιστικό (1 Μ σορβιτόλη, 20 mM φωσφορικό κάλιο ρΗ 7.4, 20 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη) και λύθηκαν με την προσθήκη λυτικό ένζυμο (Zymolyase 100Τ, Amsbio). Πυρήνες συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (20 λεπτά στους 55,000X

g

), επαναιωρήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα 20 mM φωσφορικού καλίου ρΗ 7,4, 0,2% Triton Χ-100, 5 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη με ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης συμπεριλαμβανομένων 1 mM PMSF, 2 μg /ml λευπεπτίνη, και 1 μg /mL πεπστατίνη Α, και ομογενοποιείται. Εμείς εξάγεται Top2α από πυρήνες με αύξηση της συγκέντρωσης NaCl σε 500 mM και απομακρύνθηκε πυρηνικό σφαιρίδιο με φυγοκέντρηση στα 15,000X

g

για 25 λεπτά. Το υπερκείμενο κλασματοποιήθηκε με 3 στάδια χρωματογραφίας (GE Healthcare). Η πρώτη ήταν ένας HisTrap FF ακάθαρτο στήλη Νί-χηλώσεως και Top2α εκλούστηκε σε 40 mM ιμιδαζόλης με μια βαθμίδα 20-200 mM ιμιδαζολίου, σε 20 mM φωσφορικού καλίου ρΗ 7.4, 500 mM NaCl και 0,1% Triton Χ-100. Τα συγκεντρωμένα κλάσματα αραιώθηκαν τρεις φορές με 20 mM φωσφορικό κάλιο ρΗ 7.4, και καθαρίστηκε περαιτέρω μέσω στήλης HiTrap SP. Top2α εκλούεται σε 500 mM NaCl σε βαθμίδωση 200-800 mM NaCl. Τα συγκεντρωμένα κλάσματα αραιώθηκαν τρεις φορές με 20 mM φωσφορικό κάλιο ρΗ 7,4, και φορτώθηκε σε στήλη Μοηο S 5/50 GL. Top2α εκλούστηκε στα 500 mM NaCl και τα κλάσματα συνενώθηκαν, υποβλήθηκαν σε διαπίδυση όλη τη νύχτα έναντι 50% γλυκερόλη, 15 mM φωσφορικό νάτριο ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM PMSF και 5 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη, και αποθηκεύεται στους -20 ° ΝΤΟ. Το τελικό κλάσμα Top2α είναι πάνω από 90% καθαρό και έχει μια ειδική δραστικότητα τουλάχιστον 10

6 μονάδες /mg με μία μονάδα ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που είναι απαραίτητο να χαλαρώσει 0,5 μg pUC19 DNA σε 30 λεπτά.

Τα υποστρώματα DNA

φθορισμού υποστρώματος DNA (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, ΙΑ) σχεδιάστηκε παρόμοιο με αυτό που περιγράφηκε προηγουμένως (Smiley, Collins et al. 2007), ένα 29-bp ολιγονουκλεοτιδίου που περιέχει ένα top2 θέση διάσπασης στο κέντρο και Alexa Fluor 488 στο άκρο 3 ‘. Πλασμίδιο pUC19 DNA καθαρίζεται με CsCl διπλό banding, εκχύλιση με φαινόλη-χλωροφόρμιο και καθίζηση αλκοόλης χρησιμοποιήθηκε για τη χαλάρωση και την διάσπαση δοκιμασίες (Sander και Hsieh 1983).

Pre-HTS (High Throughput Screening) Δοκιμασία Ανισοτροπίας

Σε 50 μΙ top2 ρυθμιστικού αντίδρασης που περιείχε 10 mM Tris-HCl ρΗ 7,9, 5 mM MgCl

2, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM ΑΤΡ. 50 ηΜ Alexa Fluor 488-σημασμένο DNA, 1,25 μΜ ανθρώπινη Top2α, και τενιποσίδη (VM26) σε ένα εύρος συγκεντρώσεων από 60 έως 300 μM, το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 37 ° C για 30 λεπτά. Πριν τη μέτρηση της ανισοτροπίας, NaClO

4 προστέθηκε για να δώσει τελική συγκέντρωση 250 mM. Πειράματα που εξετάζουν τις επιπτώσεις της NaClO

4 συγκεντρώσεις έδειξαν ότι μέσα σε ένα εύρος 100-750 mM έχει παρόμοια επίδραση στην διαμόρφωση ανισοτροπία φθορισμού (που πρέπει να περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Αποτελέσματα).

Για να ελέγξετε τα αποτελέσματα της σειρά προσθήκης, 50 ηΜ Alexa Fluor 488-σημασμένο DNA, 250 ηΜ ανθρώπινης Top2α, και 250 mM NaClO

4 με ή χωρίς 300 μΜ VM26 εισήχθησαν σε διαφορετική σειρά σε 50 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης. Ο συνολικός χρόνος αντίδρασης ήταν 30 λεπτά στους 37 ° C, εκτός αν σημειώνεται διαφορετικά.

Για να εξεταστούν οι θετικές επιτυχίες με δοκιμασία ανισοτροπία υπό συνθήκες χύμα, η αντίδραση πραγματοποιείται σε 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης που περιέχει 50 ηΜ Alexa Fluor 488 -επισημασμένο DNA, 250 ηΜ ανθρώπινης Top2α, και 15 μΜ ένωσης δοκιμής. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 37 ° C για 30 λεπτά πριν από την προσθήκη NaClO

4.

δοκιμασίες ανισοτροπίας υπό χύδην συνθήκες μετρήθηκαν με Fluorolog-3 Spectrofluorometer (HIROBA Scientific) εφοδιασμένο με δύο πολωτές στις διαδρομές για διέγερσης και εκπομπής χρησιμοποιώντας τη μέθοδο L-μορφή. Το μήκος κύματος διέγερσης και εκπομπής ήταν 492 nm και 515 nm, αντίστοιχα, το καθένα με ένα πλάτος σχισμής 2 nm, και η τιμή της απολαβής G ορίζεται σε 1.

High Throughput Ανισοτροπίας Screening

Για HTS , προβολές έγιναν στο Genomics Research Center της Academia Sinica στην Ταϊβάν, σύμφωνα με το πρωτόκολλο που δημοσιεύθηκε στο παρελθόν και χρησιμοποιώντας τη χημική βιβλιοθήκη που παράγεται και συλλέγεται εκεί [20]. Εν συντομία, προβολές πραγματοποιήθηκαν σε πλακίδια 1536-φρεατίων χρησιμοποιώντας σύστημα η διαλογή υψηλής απόδοσης (HTS) που κατασκευάζεται από συστήματα GNF (GNF, San Diego, CA). Το σύστημα HTS είναι ενσωματωμένη με διανομείς, ένα εργαλείο μεταφορά 1536-pin, θερμοκοιτίδες και ένας αναγνώστης Viewlux πλάκα (Perkin Elmer Inc.). Ο όγκος της αντίδρασης ήταν 4 μΙ ανά βοθρίο που περιείχε 100 ηΜ Alexa Fluor 488-σημασμένο DNA με 150 ηΜ ανθρώπινης Top2α στο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης. Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 37 ° C, 100 mM NaClO

4 προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να σταματήσει η αντίδραση και μετρήθηκε η τιμή ανισοτροπία. Η διαλογή πραγματοποιήθηκε με έναν εκπρόσωπο βιβλιοθήκη 100.000 χημικών σε συγκέντρωση 12,5 μΜ. 300 μΜ τενιποσίδη (VM26) συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος, ενώ το 5% DMSO ήταν ο αρνητικός μάρτυρας. Z υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη σύνθεση:. SD του ΜΑΧ και ΜΙΝ SD του είναι η τυπική απόκλιση των θετικών και αρνητικών ελέγχων. Μία μέθοδος διαλογής κατάλληλη για την πλατφόρμα HTS θα έχει ένας παράγοντας Ζ μεγαλύτερο από 0,5. Με τον πρώτο γύρο διαλογής του πάνω από 100.000 χημικές ουσίες, 107 ενώσεις δοκιμής βαθμολογήθηκαν θετικά με τα κριτήρια που θα περιγραφούν στο κείμενο. Δεύτερος γύρος διαλογής πραγματοποιήθηκε με δοκιμή των αναγνώσεις ανισοτροπία σε 8 διαφορετικές συγκεντρώσεις της κάθε υποψήφιας ένωσης χρησιμοποιώντας αραιώσεις δυο φορές ξεκινώντας από 12,5 μΜ. Μόνο οι ενώσεις που προκύπτουν σε 20% αυξήσεις ανιχνεύονται σήματα πάνω από τους αρνητικούς μάρτυρες, και δείχνοντας δοσο-εξαρτώμενη αποκρίσεις σε δύο ή περισσότερα σημεία ορίστηκαν ως επιτυχίες. Υπήρχαν 54 hits σκόραρε στο δεύτερο γύρο διαλογής.

Αναλύσεις

Χαλάρωση

Σε 20 μλ top2 ρυθμιστικό αντίδρασης που περιέχει 8,5 nM αρνητική υπερπεριελιγμένη pUC19, 0,125 nM ανθρώπινη Top2α είτε με 5% DMSO, ή 60 μΜ υπό δοκιμασία ενώσεων, οι αντιδράσεις διεξήχθησαν στους 37 ° C για 5, 10 ή 15 λεπτά, τερματίστηκε με προσθήκη SDS έως 0,25%, EDTA σε 10 mM και πρωτεϊνάση Κ έως 0.4 mg /ml, επωάστηκαν περαιτέρω στους 50 ° C για 1 ώρα, και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 1,2% πηκτή αγαρόζης.

διάσπαση Δοκιμασίες

σε ένα ρυθμιστικό αντίδρασης που περιέχει 8.5 ηΜ αρνητική υπερελικωμένο pUC19, 3,75 ηΜ ανθρώπινης Top2α και 150 τενιποσίδη μΜ (VM26) ή όπως προσδιορίζεται στα κείμενα, οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 37 ° C για 15 λεπτά, και τερματίζεται με την προσθήκη SDS και 0,25%, EDTA σε 10 mM και πρωτεϊνάση Κ έως 0.4 mg /ml, ή με την προσθήκη NaClO

4 έως 500 mM για 2 λεπτά ακολουθούμενο από την προσθήκη πρωτεϊνάσης Κ έως 0.4 mg /ml. Η επώαση συνεχίστηκε στους 50 ° C για 1 ώρα και τα δείγματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,2% που περιέχει 0,15 μg /ml βρωμιούχο αιθίδιο. Για τη δοκιμή των αντιδράσεων διάσπασης με μια γραμμική υπόστρωμα DNA, pUC19 υπέστη πέψη με ScaI για να παραχθεί ένα μόριο μονάδα μήκους. καθαρίστηκε και χρησιμοποιήθηκε στις αντιδράσεις διάσπασης Το ένζυμο περιορισμού αντιμετωπίζονται DNA.

Για να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα θετικές επιτυχίες σε αντίδραση διάσπασης, οι ενώσεις δοκιμής αραιώθηκαν σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις, 16, 64 και 256 μΜ, και οι αντιδράσεις διεξήχθησαν και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

γλυκερίνη Gradient Καθίζηση και Ανίχνευση τοποϊσομεράσης με ανοσοστυπώματα

μια κλίση 3,5 ml γλυκερόλης 30-60% σε top2 ρυθμιστικό αντίδρασης παρασκευάστηκε σε ένα σωλήνα πολυαλλομερούς φυγοκέντρηση , και επιστρώθηκε με 80 μΙ top2 μίγματα αντίδρασης όπως περιγράφεται στο κείμενο. Η φυγοκέντρηση διεξήχθη εις 55000 rpm επί 16 ώρες στους 20 ° C σε TFT-80.4 ρότορα (Thermo Scientific). Μια βελόνα 22-gauge χρησιμοποιήθηκε για να διαπεράσει το σωλήνα και τα κλάσματα συλλέχθηκαν από τον πυθμένα. 50 μΐ δείγμα από κάθε κλάσμα φορτώθηκαν σε ένα προ-εμποτισμένα μεμβράνη PVDF χρησιμοποιώντας μια πολλαπλή κηλίδος σχισμής (Hoefer PR 648) συσκευή. Μετά τη φόρτωση, η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα γίνονται σε ρυθμιστικό TBS (25 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 125 mM NaCl). Αποκλεισμένα μεμβράνη επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με κατσίκας αντίσωμα κατά της ανθρώπινης Top2α (1:5000? Santa Cruz Biotechnology, sc-5348). Η μεμβράνη στη συνέχεια σε επεξεργασία για χημικο-φωτοβολία με αντιδραστήριο ECL (Millipore, WBKLS0500) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

αξιολόγηση κυτοτοξικότητας εκτελέσθηκε με κύτταρα HCT116 χρησιμοποιώντας το CellTiter 96 AQ

ueous One Λύση Κυττάρου κιτ Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Promega). Εν συντομία, κύτταρα HCT116 σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα κυττάρων 7.500 κύτταρα ανά φρεάτιο σε ϋΜΕΜ για 24 ώρα. Μετά την αφαίρεση μέσου, εκθετικώς αναπτυσσόμενα κύτταρα επωάστηκαν με 1 μΙ ένωσης δοκιμής σε 6 διπλάσιες αραιώσεις σε τελικό όγκο 100 μΐ σε κάθε φρεάτιο. Μετά από επώαση 72 ωρών στους 37 ° C, τα κύτταρα αναπληρώνονται με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 10 μΙ MTS τετραζολίου και επωάστηκαν για μία ώρα. Η φορμαζάνης μετατρέπονται από τα ζωντανά κύτταρα παρακολουθήθηκε στα 490 nm. κύτταρα ελέγχου περιέχει 1% DMSO χωρίς ένωση δοκιμής. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Αποτελέσματα

Χρησιμοποιήσαμε καθαρισμένη πλήρους μήκους ανθρώπινο Top2α και επισημασμένο με φθοροφόρο, δίκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο που περιέχει μία θέση σύνδεσης τοποϊσομεράση να αναπτύξει ο φθορισμός που βασίζεται δοκιμασίας (Σχήμα 1Α). Το σύστημα διαλογής για ενώσεις Top2α-στόχευση απεικονίζεται διαγραμματικά στο Σχήμα 1Β. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται στη μέτρηση του πολωσιμότητα φθορισμού (ανισοτροπία) ως ένδειξη εάν μια πρωτεΐνη δεσμεύεται με φθοροφόρο-tagged DNA. Κατά την διέγερση με πολωμένο φως, η εκπομπή από το φθοροφόρο του υποστρώματος DNA αν διαμένουν σε ακινησία, είναι επίσης πολωμένο. Περιστρεφόμενη διάχυσης αλλάζει την κατεύθυνση της μετάβασης στιγμή και προκαλεί αποπόλωση. Το συγκρότημα τοποϊσομεράση-ΟΝΑ, ομοιοπολική ή μη ομοιοπολική, έχει ένα χαμηλότερο ποσοστό ανατροπή και οδηγεί σε μια υψηλότερη ανισοτροπία. Από την άλλη πλευρά, το ελεύθερο DNA έχει υψηλότερο ποσοστό πέφτοντας και έτσι ένα χαμηλότερο ανισοτροπία. Από δοκιμασία ανισοτροπία μπορεί εύκολα να αυτοματοποιηθεί, μπορούμε να πραγματοποιήσει διαλογή υψηλής απόδοσης (HTS) για την ταυτοποίηση δυνητικών ενώσεων μολύβδου που στοχεύουν ενάντια Top2α. Ωστόσο, μια βασική πρόκληση για αυτή η δοκιμασία διαλογής για να λειτουργήσει σωστά είναι η διαφοροποίηση των συμπλοκών Top2α-DNA ναρκωτικών σταθεροποιήθηκε από τα διμερή σύμπλοκα Top2α-DNA. Θα χρειαστεί ένα αντιδραστήριο για να διαταράξει τη τελευταίου συμπλόκου αλλά διατηρούν την προηγούμενη ένα.

(Α) Το φθορίζον υπόστρωμα DNA συνετέθη με μια γνωστή θέση διάσπασης top2 (υποδεικνύονται με βέλη). Alexa Fluor 488 σημειώνονται με αστερίσκο σημάνθηκε στο 3 ‘άκρο. (Β) Σχηματική αναπαράσταση της ανισοτροπίας που βασίζεται διαλογής φαρμάκων Top2α. Το συγκρότημα τοποϊσομεράση-ΟΝΑ, ομοιοπολική ή μη ομοιοπολική, έχει μια πιο αργή περιστροφική διάχυση και έχει ως αποτέλεσμα μια υψηλότερη ανισοτροπία. Μετά από κατεργασία με ένα παράγοντα πρωτεϊνικής διαστάσεως, η μη-ομοιοπολική δεσμευμένο Top2α απομακρύνθηκε, και το ελεύθερο DNA έχει χαμηλότερη ανισοτροπία. Εάν ένας πράκτορας Top2α στόχευση σταθεροποιημένα σύμπλοκα ενζύμου-ϋΝΑ ομοιοπολική, η ανισοτροπία θα παραμείνει υψηλή.

Η

Η θεραπεία με NaClO

4 μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της ανισοτροπίας εξαρτάται από την παρουσία ενός αντι- τενιποσίδη καρκίνος φάρμακο (VM26)

Χρήση τενιποσίδη (VM26) ως πρότυπη ένωση για δοκιμασία διαλογής μας, ελέγξαμε κατά πόσο ένας αριθμός κοινώς χρησιμοποιούνται μετουσίωσης αντιδραστήρια συμπεριλαμβανομένων αλκαλίων και SDS μπορεί να επιτρέψει για την ανίχνευση της ενισχυμένης σταθερότητας του Top2α -DNA σύμπλοκα παρουσία ενός αντικαρκινικού φαρμάκου. Από αλκαλίων μορφές πρόστιμο ιζήματα με Mg

++ στο ρυθμιστικό αντίδρασης και SDS δημιουργεί μικροσκοπικά φυσαλίδες, αμφότερα τα αντιδραστήρια δημιουργούν απαράδεκτες τεχνήματα για τις δοκιμασίες φθορισμού μικροτίτλων με βάση. Ωστόσο, ανακαλύψαμε ότι ένας ισχυρός χαοτροπικό αντιδραστήριο NaClO

4 πληροί τις απαιτήσεις μας ως αντιδραστήριο διάσταση των στις δοκιμασίες φθορισμού. Μετά την προσθήκη του NaClO

4 για 250 mM τον δεσμευτικό μείγμα της αντίδρασης, η σταθερότητα των συμπλοκών Top2α-DNA όπως παρακολουθείται από το ανισοτροπία φθορισμού δείχνει μια σαφή δοσοεξαρτώμενη αύξηση ως συγκεντρώσεις VM26 που κυμαίνεται από 0 έως 300 μΜ (Σχ 2Α ). Χωρίς την προσθήκη NaClO

4 η ανισοτροπία παραμένει η ίδια ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση VM26. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι η VM26 που προκαλείται από την αλλαγή ανισοτροπίας είναι ένζυμο που εξαρτάται, πραγματοποιήσαμε τη μέτρηση ανισοτροπίας χωρίς τοποϊσομεράσης σε κατά τα άλλα ίδιες συνθήκες αντίδρασης. Από τα αποτελέσματα που δείχνονται στο Σχήμα 2Β, επιβεβαιώσαμε ότι φαρμάκου εξαρτώμενη αύξηση του ανισοτροπίας μετά τη θεραπεία με NaClO

4 Top2α μεσολάβηση.

(Α) Αντιδράσεις Alexa Fluor 488 σημασμένο DNA με ανθρώπινη Top2α ήταν διεξάγεται με συγκεντρώσεις VM26 60, 120, 180, 240 και 300 μΜ. Μία δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην ανισοτροπία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις VM26 παρατηρήθηκε αν οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με NaClO

4 (στερεό τετράγωνο), αλλά όχι χωρίς αυτό (άδειο τρίγωνο). (Β) Η δοσοεξαρτώμενη αύξηση της ανισοτροπίας με την αύξηση VM26 παρατηρήθηκε όταν οι αντιδράσεις περιείχαν ανθρώπινο Top2α (στερεό τετράγωνο), αλλά όχι χωρίς αυτό (κενό τετράγωνο).

Η

Η προσθήκη του NaClO

4 καταργεί Top2α δέσμευση στο DNA, αλλά διατηρεί τα συγκροτήματα τριμερών ένζυμο DNA ναρκωτικά σταθεροποιήθηκε

για να εξεταστεί κατά πόσον η αύξηση της ανισοτροπίας μετά την προσθήκη του NaClO

4 προέρχεται από τις Top2α-συνδεδεμένα σύμπλοκα DNA, εξετάσαμε τις επιδράσεις της μεταβολής της σειράς προσθήκης των βασικών στοιχείων σε αυτές τις αντιδράσεις. Σε περίπτωση απουσίας του NaClO

4, η ανισοτροπία των συμπλοκών DNA-ένζυμο είναι 0.19 (Σχήμα 3Α-II), και η προσθήκη του NaClO

4 μειώνει τη ανισοτροπία έως 0,06 (Σχήμα 3Α-III), μία τιμή κοντά προς εκείνη του ελεύθερου ολιγονουκλεοτιδίου (Σχήμα 3Α-Ι). Αυτό το αποτέλεσμα καταδεικνύει ότι NaClO

4 είναι ικανές διαχωρισμού ενζύμου από το DNA. Ενώ ο σχηματισμός του ενζύμου DNA και τενιποσίδη (VM26) τριμερούς συμπλόκου οδηγεί σε NaClO

4-ανθεκτικά ανισοτροπία (Σχήμα 3Α-IV), επώαση χωρίς Mg

++ (Σχήμα 3Α-V) ή προ-επώαση των το ένζυμο με NaClO

4 πριν από την προσθήκη του DNA, ανεξάρτητα από την παρουσία του VM26, οδηγεί σε χαμηλότερη ανισοτροπία (Σχήμα 3Α-VI και VII). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι NaClO

4 είναι σε θέση να απενεργοποιηθεί το ένζυμο και αναστέλλουν την ικανότητα του ενζύμου να σχηματίσουν σύμπλοκα δεσμεύονται DNA. Από Mg

++ απαιτείται για τις ενζυματικές δραστηριότητες της τοποϊσομεράσες, την απαίτηση Mg

++ δείχνει ότι απλή σύνδεση δεν είναι αρκετή για το σχηματισμό της NaClO

4-ανθεκτικά συγκρότημα. Εκτός από τις VM26 σταθεροποιημένη τριμερών συμπλόκων, η θεραπεία με NaClO

4 σε όλες τις άλλες συνθήκες μειώνει την ανισοτροπία σε μια τιμή παρόμοια με την ελεύθερη υπόστρωμα DNA, επιβεβαιώνοντας ότι NaClO

4 είναι σε θέση να διαταράξει σύμπλοκα ενζύμου-ϋΝΑ χωρίς ένας παράγοντας Top2α στόχευση. Για να αποδειχθεί η εξάρτηση από την συγκέντρωση του NaClO

4 για να επιτρέψει ειδικά για την ανίχνευση των VM26-σταθεροποιημένα σύμπλοκα ενζύμου-DNA, αναλύσαμε την ανισοτροπία του δυαδικού συμπλόκου μετά την προσθήκη διαφορετικό ποσό του NaClO

4 (Εικόνα 3Β). Τα μέγιστα επίπεδα διαχωρισμού επιτεύχθηκαν σε NaClO

4 συγκέντρωση 100 mM, με την IC

50 στα 40 mM, και υπάρχουν μικρές παραλλαγές έως 750 mM. Έχουμε αποδείξει έτσι ότι NaClO

4 είναι ένας αποτελεσματικός παράγων για να διαταράξει σύμπλοκα πρωτεΐνης /DNA με ένα ευρύ φάσμα συγκέντρωσης μεταξύ 100-750 mM, και μπορεί να προσαρμοστεί για χρήση σε HTS για Top2α στόχευση παραγόντων.

(Α) το VM26-εξαρτώμενη αύξηση στην ανισοτροπία παρατηρήθηκε όταν η αντίδραση τερματίστηκε με NaClO

4 (αντίδραση IV vs αντίδρασης III), και όχι όταν NaClO

4 προστέθηκαν με την παρουσία Top2α πριν η προσθήκη του DNA, ανεξαρτήτως της προσθήκης του VM26 (αντιδράσεις VI και VII vs Αντίδραση IV). Ανισοτροπίας που παρατηρείται στους ελέγχους ήταν μόνο DNA (Αντίδραση Ι), DNA /Top2α χωρίς VM26 (Αντίδραση II), και η επώαση χωρίς Mg

++ (Αντίδραση V). (Β) Βελτιστοποίηση της NaClO

4 συγκέντρωσης για προσδιορισμό ανισοτροπία. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης top2 με 300 μΜ VM26, 50 ηΜ Alexa Fluor 488-σημασμένο DNA και 250 ηΜ ανθρώπινης Top2α. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 37 ° C για 30 λεπτά. Πριν τη μέτρηση της ανισοτροπίας, NaClO

4 προστέθηκαν σε κάθε μίγμα αντίδρασης για να δώσει μια τελική συγκέντρωση μέχρι και 750 mm. Η μέγιστη έκταση της διαστάσεως επιτεύχθηκε σε συγκέντρωση 100 mM ή παραπάνω. (Γ) Ανισοτροπίας παρατηρούμενη με ετοποσίδη (VP16), mAMSA, μιτοξαντρόνη (ΜΧΤ), και με τενιποσίδη (VM26) ως θετικοί έλεγχοι, μετά από θεραπεία με 200 mM NaClO

4. Οι συγκεντρώσεις αυτών των γνωστών φαρμάκων Top2α χρησιμοποιείται εδώ ήταν 300 μΜ για VP 16 και VM26, και 15 μΜ για mAMSA και MXT.

Η

Για να ελέγξετε ότι προσδιορισμοί ανισοτροπίας μας μπορεί να είναι αποτελεσματική στον εντοπισμό άλλων γνωστών Top2α στόχευση αντικαρκινικά φάρμακα, εκτός από τενιποσίδη (VM26), μετρήσαμε ανισοτροπία μετά NaClO

4 θεραπεία με ετοποσίδη (VP16), mAMSA, και μιτοξαντρόνη (Σχ. 3C). Παρόμοια με εκείνη που μετρήθηκε με τενιποσίδη, και οι τρεις είναι γνωστό αντικαρκινικά φάρμακα που παράγονται αναγνώσεις ανισοτροπία πάνω από τους μάρτυρες.

NaClO

4 μπορεί να προωθήσει την παραγωγή κομμένων DNA στα ναρκωτικά σταθεροποιημένα Top2α τριμερών συμπλόκων

Τα αποτελέσματα της NaClO

4 σε διατάραξη Top2α-δεσμεύεται συμπλέγματα DNA ερευνήθηκαν με ένα υπόστρωμα ολιγονουκλεοτιδίου παρακολουθείται από ποσοτικούς προσδιορισμούς ανισοτροπία φθορισμού. Να εξετάσει περαιτέρω τα πιθανά μηχανιστική ρόλους των NaClO

4 στις αντιδράσεις Top2α, έχουμε αποφασίσει να χρησιμοποιήσει το πλασμίδιο DNA ως υπόστρωμα το οποίο παρέχει την εφαρμογή των ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης για να εξετάσει τις διαρθρωτικές αλλαγές του DNA. Με ισχυρή SDS μετουσιωτή να τερματίσει αντιδράσεις με DNA πλασμιδίου, παρουσία ενός αντικαρκινικού φαρμάκου, όπως τενιποσίδη (VM26) μπορεί εγκλωβίζουν τις διασπώμενων σύμπλοκα και να αυξήσει τα προϊόντα γραμμικοποιημένου και nicked DNA. Πραγματοποιήσαμε πειράματα για τη διερεύνηση των προϊόντων DNA που παράγεται από ένα μείγμα αντίδρασης που περιέχει Top2α-DNA-VM26 τριμερών συμπλόκων που τερματίστηκαν με είτε SDS ή NaClO

4. Για να αφαιρέσετε τις πρωτεΐνες που συνδέονται με DNA μετά την αγωγή με αυτά τα αντιδραστήρια διαστάσεως, οι σταμάτησαν μείγματα αντίδρασης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ πριν από την ανάλυση τους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Τα προϊόντα της αντίδρασης μετά τερματίζεται με SDS έδειξε το αναμενόμενο πρότυπο για την εμφάνιση του γραμμοποιημένου DNA κυρίως, και μερικά κομμένη ειδών, καθώς και (Σχήμα 4Α). Σε μια ενδιαφέρουσα αντίθεση, τα προϊόντα της αντίδρασης που δημιουργούνται από NaClO

θεραπεία 4 έδωσε περισσότερο κομμένο DNA προϊόντα και λιγότερο γραμμικοποιημένο μορφή. Με NaClO

4 για να σταματήσουν οι αντιδράσεις, η παραγωγή κομμένων και γραμμοποιημένου μορφές αυξήθηκαν παράλληλα με την αύξηση της συγκεντρώσεις VM26 σε αυτές τις αντιδράσεις (Σχήμα 4Β), καταδεικνύοντας ότι αμφότερα τα προϊόντα ήταν πιθανό παράγεται μέσω της δράσης VM26 στον εγκλωβισμό διασπώμενων συγκροτήματα. Προηγούμενη έκθεση ήδη έδειξε ότι VM26 προωθεί το σχηματισμό της έλικας nicks μόνο DNA, επιπρόσθετα σε δίκλωνο διαλείμματα, ανάλογα με την concertedness της διάσπασης από δύο πρωτομερή σε top2 διμερές [21]. Τόσο βιοχημικές και δομικές βιολογικά δεδομένα κατέδειξαν ότι κάθε protomer μπορούν να δεσμεύουν ένα μόνο μόριο του φαρμάκου, η παρουσία των οποίων μπορεί να επηρεάσει την διάσπαση /επανασύνδεση την μεσολάβηση του διμερούς ενζύμου [22], [23]. Το αποτέλεσμα ότι NaClO

4 τείνει να δημιουργήσει λιγότερο γραμμικοποιημένο προϊόντα διάσπασης, και πιο ανοιχτή μορφή, είναι πιθανόν να οφείλεται στο ότι είναι λιγότερο ισχυρός από μετουσιωτικό SDS και λιγότερο αποτελεσματική για να επάγει τον σχηματισμό συμπλοκών διάσπασης. έτσι μπορεί κανείς να περιμένει να παρατηρήσουν πιο γραμμικοποιημένη προϊόντα με την παρουσία περισσοτέρων ενζύμων και κατά συνέπεια πιο διασπάσιμο συγκροτήματα. Θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι με την αύξηση του ενζύμου στο DNA στοιχειομετρία, τα γραμμικοποιημένο ϋΝΑ προϊόντα αυξήθηκε ταυτόχρονα με την ανοιχτή μορφή όταν οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με NaClO

4 (Εικόνα 4C). Υπό τις ίδιες συνθήκες αντίδρασης, αλλά τερματίζεται με SDS, τα προϊόντα ήταν γραμμικοποιημένο περαιτέρω υποβαθμισμένη ώστε να παραχθούν θραύσματα DNA μικρότερο από το μόριο μονάδα μήκους. διάσπαση του DNA και χάραξης που προκαλείται από NaClO

4 δεν περιορίζονται στα κυκλικό υποστρώματα DNA. Θα μπορούσαμε να αποδείξει εύκολα διάσπαση του DNA με γραμμική υπόστρωμα σε υψηλότερες αναλογίες ενζύμου /DNA (Σχήμα 4D). Η αποικοδόμηση του DNA για να δημιουργήσει μόρια υπο-πλήρους μήκους από NaClO

4 μεταχείριση οφείλεται στη στενή απόσταση μεταξύ δύο εγκοπές για αντιπαρατίθενται σκέλη και επίσης κάποιο διπλό διάσπαση κλώνου υπό τέτοιες συνθήκες. Ωστόσο, υπό τις ίδιες συνθήκες η προσθήκη του SDS μπορεί να προκαλέσει πιο εκτεταμένη υποβάθμιση του DNA, αποδεικνύοντας ότι SDS είναι μια ισχυρότερη μετουσίωσης και πιο αποτελεσματική στην πρόκληση της αντίδρασης διάσπασης Top2α. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν SDS και NaClO

4 προστέθηκαν διαδοχικά, SDS μπορεί να προωθήσει την παραγωγή μικρότερων προϊόντων DNA ακόμη και όταν προστέθηκε μετά NaClO

4. Το αποτέλεσμα αυτό και πάλι υποδηλώνει ότι NaClO

4 δεν διαταράσσει πλήρως ενζύμου /DNA /φαρμάκου τριμερή συμπλέγματα, εξακολουθεί να διατηρεί την ευαισθησία τους απέναντι SDS στην προώθηση πιο συγκροτήματα διάσπασης.

(Α) Αντιδράσεις ανθρώπινων Top2α και pUC19 πλασμίδιο DNA τερματίστηκαν είτε με NaClO

4 ή SDS. Η προσθήκη του NaClO

4 σε 100 mM οδηγεί στο σχηματισμό των περισσότερων κομμένο προϊόντων DNA ενώ η προσθήκη των αποτελεσμάτων SDS σε μία προτίμηση των γραμμικών αυτών. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν με 8,5 nM pUC19, 3,75 ηΜ Top2α, και 100 μΜ VM26, τερματίζεται με την προσθήκη είτε NaClO

4 ή SDS, τα προϊόντα της αντίδρασης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ, και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 1,2% πηκτή αγαρόζης που περιέχει 0,15 μg /ml βρωμιούχο αιθίδιο. (Β) ποσοτικού προσδιορισμού διάσπασης DNA εκτελέστηκαν υπό παρόμοιες συνθήκες εκτός με αυξανόμενες συγκεντρώσεις VM26 ακολουθούμενη από προσθήκη NaClO

4. Μια αύξηση των nicked προϊόντα διάσπασης DNA παρατηρήθηκε με υψηλότερες ποσότητες VM26. ποσοτικού προσδιορισμού διάσπασης (C) Πλασμίδιο DNA διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας διαφορετικό ένζυμο να αναλογίες DNA όπως υποδεικνύεται. Προϊόντα ξύλου DNA (πλήρους μήκους ή υπο-πλήρους μήκους) από την επεξεργασία SDS, και οι δύο με εγκοπή και γραμμική DNA από NaClO

4 αύξηση θεραπεία με υψηλότερες ενζύμου σε αναλογίες DNA. (Δ) Οι αντιδράσεις σε παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων VM26 περιέχονται γραμμικών pUC19 ως υπόστρωμα με αναλογία ενζύμου /DNA του 20, που ακολουθείται από την προσθήκη NaClO

4 ή SDS, ή και τα δύο διαδοχικά, για να σταματήσουν οι αντιδράσεις. Οι δείκτες μεγέθους, και γραμμική pUC19 φορτώθηκαν στα αριστερότερα δύο λωρίδες. Θέσεις του DNA χαρακτηρίστηκαν ως NC (τσακισμένοι κυκλική), L (γραμμική), NSC (αρνητικό υπερελικωμένο), και RC (χαλαρή).

Η

NaClO

4-θεραπεία τριμερή συμπλέγματα αναλύθηκαν με υπερφυγοκέντρηση σε βαθμίδες γλυκερόλης

Εφαρμόσαμε υπερφυγοκέντριση σε βαθμίδες γλυκερόλης για τη διερεύνηση της σταθερότητας των συμπλοκών Top2α-DNA μετά από τη θεραπεία του NaClO

4, και το αποτέλεσμα ενός αντικαρκινικού φαρμάκου. φυγοκέντρηση διαβάθμισης γλυκερόλη συχνά χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μακρομορίων με βάση το μέγεθος και το σχήμα τους. Επωάσαμε Top2α με DNA πλασμιδίου είτε παρουσία ή απουσία VM26, και την εφάρμοσε στην κλίση γλυκερόλης άμεσα ή μετά από την επεξεργασία με NaClO

4. Τα κλάσματα συλλέγονται μετά την φυγοκέντρηση και οι θέσεις των Top2α προσδιορίστηκαν με κηλίδες Western με αντίσωμα έναντι Top2α. Σε περίπτωση απουσίας του VM26, Top2α καθιζάνουν περισσότερο προς τα κάτω χωρίς NaClO

4 θεραπεία (Σχήμα 5, λωρίδες 1 vs 3). Η παρουσία του NaClO

4 βάρδιες Top2α σε ένα ελαφρύτερο κλάσμα, σε μία θέση που αντιστοιχεί στο ελεύθερο ένζυμο (Σχήμα 5, λωρίδες 3 vs 5), επιβεβαιώνοντας έτσι την ικανότητα του NaClO

4 να διαταράξουν συμπλόκου ενζύμου-ϋΝΑ στο απουσία ενός αντικαρκινικού φαρμάκου. Με την παρουσία του VM26, η θεραπεία με NaClO

4 δεν άλλαξε χονδροειδώς την καθίζηση του Top2α, γεγονός που υποδηλώνει ότι NaClO

4 εξακολουθεί να διατηρεί το μεγαλύτερο μέρος των τριμερών συμπλόκων (Σχήμα 5, λωρίδες 2 έναντι 4). Πειράματα τόσο από ανισοτροπία φθορισμού και υποστήριξη γλυκερίνης κλίση καθίζηση η αντίληψη ότι NaClO

4 θεραπεία παρέχει ένα μέσο για τη διαφοροποίηση της σταθερότητας των συμπλοκών Top2α-DNA ανάλογα με την παρουσία ενός αντικαρκινικού φαρμάκου, προσφέροντας ως εκ τούτου μας μια προσέγγιση για την αυτοματοποιημένη διαλογή δοκιμασία και καθιστώντας δυνατό για χρήση σε πλατφόρμα HTS.

το διάλυμα κλίση γλυκερόλης επιστρώνεται σε ένα σωλήνα πολυαλλομερούς ξεκινώντας από 60% σε 30% γλυκερίνη. Η αντίδραση για το σχηματισμό συμπλόκου /DNA Top2α διεξήχθη σε 80 μΐ ενός διαλύματος που περιέχει 100 μΜ VM26, 34 ηΜ pUC19 και 3,75 ηΜ ανθρώπινης Top2α. Το μίγμα της αντίδρασης φορτώθηκε πάνω σε μία κλίση γλυκερόλης 30-60%, και σωλήνας ολοκληρώνονται με ορυκτέλαιο.