Αφηρημένο

Ανθρώπινο επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs) θα επαναπρογραμματιστούν από παροδική έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων σε σωματικά κύτταρα. Περίπου το 1% των σωματικών κυττάρων μπορεί να επαναπρογραμματιστεί σε iPSCs, ενώ τα υπόλοιπα σωματικά κύτταρα διαφορικά επαναπρογραμματιστούν. Εδώ, ιδρύσαμε επαγόμενα πολυδύναμα καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (iCSCs), όπως αυτο-ανανέωση των πολυδύναμων κυτταρικών κλώνων. Σταθερές γραμμές ICSC καθιερώθηκαν από ασταθή γραμμές που προκαλείται επιθηλιακών βλαστικών κυττάρων (iESC) μέσω νέου περιβλήματος που ακολουθείται από εμβρυοειδή σχηματισμό του σώματος και το σειριακό μεταμόσχευση. iCSCs μοιράζονται την έκφραση των πολυδύναμων γονιδίων σήμανσης με iPSCs, εκτός από

REX1

και

LIN28

, ενώ παρουσίασαν την έκφραση των σωματικών γονιδίων σήμανσης

EMP1

και

PPARγ

. iESCs και iCSCs θα μπορούσε να δημιουργήσει τερατώματα με υψηλή απόδοση από την εμφύτευση σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια. Το δεύτερο iCSCs απομονώνονται από διαχωρισμένα κύτταρα από τεράτωμα από τις πρώτες iCSCs διατηρήθηκαν σταθερά, που εμφανίζει ένα προφίλ γονιδιακής έκφρασης παρόμοια με τα πρώτα iCSCs. Στο πρώτο και στο δεύτερο iCSCs, διαγονιδίου που προέρχονται από

Oct4

,

Sox2

,

Klf4

, και

c-Myc

εκφράστηκαν. Οι αναλύσεις Συγκριτική παγκόσμια γονιδιακής έκφρασης κατέδειξε ότι τα πρώτα iCSCs ήταν παρόμοιες με iESCs, και σαφώς διαφορετικό από το ανθρώπινο iPSCs και σωματικά κύτταρα. Σε iCSCs, κινητική έκφραση των γονιδίων του πυρήνα παράγοντα pluripotency και την Myc σχετίζονται παράγοντας ήταν πολυδύναμα τύπου, ενώ η Polycomb συγκρότημα παράγοντας ήταν σωματικά τύπου. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι πολυδύναμα ογκογενετικότητας μπορούν να ανατίθενται σε σωματικά κύτταρα μέσω up-ρύθμιση του πυρήνα pluripotency και Myc που σχετίζονται με παράγοντες, πριν από την εγκατάσταση του μοριακού δικτύου iPSC με πλήρη επαναπρογραμματισμό μέσω ρύθμισης προς τα κάτω της Polycomb συγκρότημα παράγοντα.

Παράθεση: Nagata S, Hirano Κ, Kanemori Μ, Sun LT, Τάντα T (2012) αυτο-ανανέωση και πλειοδυναμία αποκτώνται μέσω σωματικών επαναπρογραμματισμός με τα ανθρώπινα καρκινικά βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (11): e48699. doi: 10.1371 /journal.pone.0048699

Εκδότης: Martin Πέρα, Πανεπιστήμιο της Μελβούρνης, στην Αυστραλία

Ελήφθη: 18 Ιούλ 2012? Αποδεκτές: 28 Σεπτέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 8, Νοεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Nagata et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το JSPs Kakenhi, αριθμός επιχορήγηση 23390067. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ), τα οποία είναι υποπληθυσμών των καρκινικών κυττάρων, τη λειτουργία στη διατήρηση καρκίνους μέσα από την έναρξη και διάδοση της διαιώνισης της ανάπτυξης του όγκου [1]. ΚΕΠ πιστεύεται ότι είναι βασικοί στόχοι των θεραπειών του καρκίνου, αλλά οι λεπτομέρειες των γενετικών και επιγενετικών υπογραφές τους είναι ασαφείς. Ως ένα χρυσό πρότυπο για να καθορίσει τις ιδιότητες CSC, μια σειριακή δοκιμή μεταμόσχευσης βασίζεται στην ικανότητα να αυτο-ανανέωση και τη δημιουργία όγκων έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως [2]. Ένα κρίσιμο συμβάν στην έναρξη των καρκίνων είναι η ενεργοποίηση του μηχανισμού αυτο-ανανέωση, η οποία περιορίζεται συνήθως σε βλαστικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι ΚΕΠ μοιράζονται μερικές υπογραφές γονιδιακή έκφραση ανιχνεύεται σε πολυδύναμα βλαστοκύτταρα. Στην πραγματικότητα, τα γονίδια πολυδύναμα δείκτη,

Oct4

και

Nanog

, εκφράζονται σε ορισμένες μορφές καρκίνου [3], [4], και ογκογονίδιο

Myc εμπλέκεται στην παραγωγή από πολλούς καρκίνους [5].

Εξαναγκασμένη έκφραση ενός συνδυασμού μεταγραφικών παραγόντων, Oct4, Sox2, Klf4, και c-Myc (OSKM), μπορεί να προωθήσει την άμεση επαναπρογραμματισμό των σωματικών κυττάρων ανθρώπου και ποντικού σε πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα κύτταρα (iPSCs) [6], [7]. Σε άμεση επαναπρογραμματισμό,

Oct4

και

Sox2

, τα οποία αποτελούν βασικά στοιχεία πλειοδυναμίας, λειτουργούν ως ρυθμιστές των αναπτυξιακών και μεταγραφής που σχετίζονται με τις διαδικασίες [8],

Myc

στοχεύει γονιδίων κατά κύριο λόγο που εμπλέκονται στον κυτταρικό μεταβολισμό, τον κυτταρικό κύκλο, και μονοπάτια πρωτεϊνικής σύνθεσης [9]. Επιπλέον,

Myc

λειτουργίες για την αύξηση της απόδοσης με τη ρύθμιση του p53 οδό [10]. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι η κοινή μονοπάτια θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί τόσο για την απόκτηση πλειοδυναμίας και ογκογένεση. Στους ανθρώπους, CSC-όπως κύτταρα μετασχηματίζονται από πρωτογενείς ινοβλάστες δέρματος από την σταθερή έκφραση του hTERT, Η-RasV12, και SV40 LT και αντιγόνα ST [11]. Στα ποντίκια, ΚΕΠ δημιουργήθηκαν από πολυδύναμα βλαστοκύτταρα που επάγεται ποντικού (iPSCs) με καλλιέργεια με ένα ρυθμισμένο μέσο από κυτταρικές γραμμές καρκίνου, η οποία ήταν μια μιμητική του μικροπεριβάλλοντος καρκινώματος [12]. Έτσι, παγκόσμια αλλαγή της υπογραφής της μεταγραφής μέσω της άμεσης επαναπρογραμματισμό ή εναλλακτικές συνθήκες καλλιέργειας θα μπορούσε να προωθήσει τη μετατροπή σε ΚΕΠ. Στο πλαίσιο αυτό, είναι πιθανό ότι αναγκαστικές έκφραση OSKM σε σωματικά κύτταρα επάγει την άμεση επαναπρογραμματισμό σε ΚΕΠ. Για την αντιμετώπιση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στα κύτταρα των εμβρυϊκών βλαστικών (ES) και ΚΕΠ, τρία λειτουργικά διαφορετικά σύνολα γονίδιο, που ονομάζεται ο πυρήνας (core παράγοντες πλειοδυναμίας), ΛΔΚ (Polycomb κατασταλτικά σύνθετων παραγόντων), και Myc (Myc που σχετίζονται με παράγοντες) ενότητες, που προτείνονται πρόσφατα χρησιμοποιήθηκαν για συγκριτικές αναλύσεις της παγκόσμιας οικονομικής δραστηριότητας γονιδίων μεταξύ διαφορετικών τύπων κυττάρων [9].

Εδώ, προκειμένου να αντιμετωπιστούν τα ζητήματα αν προκαλείται από ανθρώπινα καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (iCSCs) μπορεί να παραχθεί από το σωματικό επαναπρογραμματισμό μέσω συμβατικών ιογενή επαγωγής OSKM, και πώς τα ανθρώπινα iCSCs, αλλά δεν iPSCs, παράγονται, πρώτα απομονώνεται iCSCs από κυτταρικούς πληθυσμούς, η οποία απέκτησε την ικανότητα να ανανεωθούν μετά την αναγκαστική έκφραση εξωγενών OSKM σε ανθρώπινα σωματικά ινοβλάστες TIG1. iCSCs έχουν την ιδιότητα του πλειοδυναμίας όπως επαληθεύεται από το σχηματισμό τεράτωμα μέσω σειριακής μεταμόσχευση σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η υπογραφή έκφρασης γονιδίου έδειξαν ότι εξακολουθούν να υπάρχουν iCSCs σωματικών κυττάρων μνήμης, ακόμη και μετά τη ρύθμιση των πολυδύναμων γονιδίων δεικτών μέσω επαναπρογραμματισμού. Τα ευρήματά μας αποκάλυψε ότι πάνω ρύθμιση των συνόλων γονιδίων για τις ενότητες πυρήνα και Myc αρκεί για να προσδώσει τις ιδιότητες της αυτο-ανανέωσης και pluripotency, και διαδοχική κάτω ρύθμιση της γονιδιακής σύνολα για τη μονάδα ΛΔΚ απαιτείται για την εγκατάσταση τη σωστή υπογραφή iPSC για σωματικά κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι iCSCs και iPSCs μοιράζονται ένα μονοπάτι επαναπρογραμματισμό από πυρήνων σωματικών σε πολυδύναμα και αυτο-ανανεώσιμων πυρήνες, και στη συνέχεια να αποκλίνουν σε iCSCs ή iPSCs.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

τα πειράματα με ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα με το θεσμικό κατευθυντήρια γραμμή του Πανεπιστημίου του Κιότο, Ιαπωνία. πειράματα σε ζώα μας (W-3-6) αναθεωρούνται και επιτρέπεται από την έρευνα σε ζώα επιτροπής του Πανεπιστημίου του Κιότο, Ιαπωνία.

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο ινοβλάστες πνεύμονα εμβρύου (TIG1) που παρέχονται από την JCRB Τράπεζα κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (ϋΜΕΜ) (Sigma-Aldrich, USA) που περιέχει 10% FBS, και μολύνθηκαν με Oct4, Sox2, Klf4 και ρετροϊούς c-Myc. Την ημέρα 4 μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα επανασπάρθηκαν σε ένα δίσκο καλλιέργειας 10 cm από κύτταρα τροφοδότες. Την ημέρα 5 μετά την μόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε σε μέσο iPSC (DMEM /Θρεπτικό Μίγμα F-12 Ham (DMEM /F12) (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένου με 20% της αντικατάστασης knockout ορού (Invitrogen, USA), 10 ng /ml bFGF (Peprotech, USA), L-γλουταμίνη, και μη απαραίτητα αμινοξέα και 2-μερκαπτοαιθανόλη). Αποικίες, η οποία θα μπορούσε να αυτο-ανανέωση και την επέκταση, συνελήφθησαν και επανακαλλιεργήθηκαν σε κύτταρα τροφοδότη γύρω από την ημέρα 30. Για την απομόνωση του ανθρώπου iPSCs και προκαλείται από επιθηλιακά βλαστικά κύτταρα (iESCs), κάθε αποικία πάρθηκε και επανακαλλιεργήθηκαν σε επικαλυμμένα με Matrigel πιάτα με εμβρυϊκά ποντίκι ινοβλαστών (MEF) -conditioned μέσο iPSC.

Για το σχηματισμό εμβρυοειδή σώμα (ΕΒ), μικρά συσσωματώματα iESC σχηματίστηκαν από ολονύκτια καλλιέργεια κρέμεται πτώση ΥΠΟΙΟ-ρυθμισμένο μέσο iPSC. Αδρανή αναπτύχθηκαν σε πιάτα βακτηριακή καλλιέργεια για 5-7 ημέρες, και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε επικαλυμμένα με ζελατίνη πιάτο με DMEM που περιείχε 10% FBS.

Για καλλιέργεια κυττάρων που προέρχονται από όγκους, οι όγκοι κόπηκαν σε μικρά κομμάτια, διαχωρίστηκαν με κολλαγενάση, και απλώθηκε σε επικαλυμμένες με ζελατίνη πιάτα με 10% FBS που περιέχει DMEM. Εγκαθιδρυμένες σειρές ICSC διατηρήθηκαν σε επικαλυμμένες με ζελατίνη πιάτο με DMEM /F12 (Wako, Japan) συμπληρωμένο με 15% FBS, 1000 U /ml LIF (Chemicon, USA), L-γλουταμίνη, πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη, όξινο ανθρακικό νάτριο, πυροσταφυλικό νάτριο, και 2-μερκαπτοαιθανόλη μέσω της διόδου με τη χρήση 0,25% θρυψίνη /ΕϋΤΑ.

RT-PCR

Για τις αναλύσεις RT-PCR, το ολικό RNA των καλλιεργημένων κυττάρων εκχυλίζεται με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). cDNA συντέθηκε από 1 μα ολικού RNA με Superscript III (Invitrogen) με τη χρήση τυχαίων εξαμερών σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα πειράματα PCR πραγματοποιήθηκαν με τη θερμοκρασία ανόπτησης στους 57 ° C. Οι αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη συνοψίζονται στον Πίνακα S1.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Τα καλλιεργημένα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA (παραφορμαλδεΰδη) /PBS (ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου , πλύθηκε με PBST (0,1% Triton Χ-100 σε PBS), στη συνέχεια προ-κατεργασία με διάλυμα αποκλεισμού (3% BSA και 2% αποβουτυρωμένο γάλα (Difco, USA) σε PBST) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα? αντι-Oct4 (1:50? Santa Cruz Biotechnology, USA), αντι-SOX2 (1:500? Abcam, Ηνωμένο Βασίλειο) και αντι-Nanog (1:200? ReproCELL, Ιαπωνία), αντι-Cdh1 (1:200? TaKaRa , Japan), αντι-SSEA4 (1:500? Hybridoma Bank, USA), και αντι-TRA-1-60 (1:500? Millipore, USA) αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Αυτά στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα? IgG αντι-κουνελιού IgG ή αντι-ποντικού συζευγμένο με Alexa 488 (1:500? Molecular Probes, USA) σε ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη) και συναρμολογείται με ένα SlowFade κιτ φως αντιξεθωριάσματος (Invitrogen).

σχηματισμός όγκων

Ένα κυτταρικό εναιώρημα από 5,0 × 10

5 iESCs ή iCSCs σε 200 μλ DMEM εγχύθηκε υποδόρια μέσα στην βουβωνική περιοχή ή μεταμοσχεύονται σε κάψουλες νεφρό ανοσοανεπαρκών ποντικών SCID (CLEA, Ιαπωνία). Οι όγκοι αποκόπηκαν χειρουργικά 5-7 εβδομάδες μετά την εμφύτευση, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS και εμπεδώθηκε σε παραφίνη. Τα τμήματα 5 μm σε πάχος βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη.

Microarray και επεξεργασίας δεδομένων

Για αναλύσεις μικροσυστοιχίας, 1 μα ολικού RNA σημάνθηκε σύμφωνα με τυπικά πρωτόκολλα Affymetrix και υβριδοποιήθηκε με το ανθρώπινο γονιδίωμα Affymetrix U133 Plus 2.0 Array (δείγματα ανθρώπινης προέλευσης). Ανεπεξέργαστα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν από το 5,0 μεθόδου MAS χρησιμοποιώντας το πακέτο βιομεταβιβαστή σχετικά με το πρόγραμμα R (https://www.r-project.org/). χάρτες θερμότητας του προφίλ γονιδιακής έκφρασης για όλα τα γονίδια σε κάθε κυτταρική σειρά έγιναν ορατά με πρόγραμμα MeV (https://www.tm4.org/mev/). Ιεραρχικές συστάδες υπολογίστηκαν με συντελεστή συσχέτισης του Pearson (r) και οπτικοποιείται από το πακέτο pvclust για το πρόγραμμα Ε. Για τις αναλύσεις διάγραμμα διασποράς, τα ανεπεξέργαστα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν από Στιβαρή πολλαπλών μικροπλακετών Μέση (RMA). διαγράμματα διασποράς απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο βιομεταβιβαστή σχετικά με το πρόγραμμα Ε.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Απομόνωση iESCs και iCSCs

Ανθρώπινο iPSCs συνελήφθησαν ως αποικίες περίπου 30 ημέρες μετά την ρετροϊική μεταγωγή Oct4, Sox2, Klf4 και c-Myc στα σωματικά ινοβλάστες TIG1, μια κυτταρική σειρά απομονώθηκε από ανθρώπινο εμβρυϊκό πνεύμονα (Εικ. 1Α). Η αποτελεσματικότητα της παραγωγής iPSC ήταν μικρότερη από 1%, και οι άλλοι πληθυσμοί κυττάρων διαφορικά επαναπρογραμματιστούν. Μερικά από τα διαφορικά επαναπρογραμματιστούν σωματικά κύτταρα έδειξε την ιδιότητα της αυτο-ανανέωσης σχηματίζονται αποικίες που αποτελούνται από κύτταρα (iESCs) με επιθηλιακό κύτταρο μορφολογία σε MEF-ρυθμισμένο μέσο iPSC (Εικ. 1Α). iESCs διατηρήθηκαν με επιθηλιακών κυττάρων μορφολογία για περίπου 10 περάσματα, δεδομένου ότι ήταν επιρρεπείς να διαφοροποιηθούν (Εικ. S1 Α). Επομένως, για να αναλύσει τις δυνατότητες διαφοροποίησης των iESCs, σχηματισμός EB προκλήθηκε με καλλιέργεια σε εναιώρημα (Εικ. 1Β). Επιτυχής σχηματίζεται iESC EBs δείχνει πλειοδυναμία όπως αναλύεται με RT-PCR (Σχ. 2Α) προσαρτήθηκαν στον πυθμένα να τρυβλία καλλιέργειας για την απομόνωση βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση. Κατά συνέπεια, τα πρώτα (1ο) ICSC γραμμές απομονωθεί επιλέγοντας κύτταρο συστάδες επεκτάθηκε EBs σε τρία ανεξάρτητα πειράματα διατηρήθηκαν σταθερά για περισσότερα από 20 περάσματα, ή την εκ νέου επίστρωση από κατεψυγμένα-αποθηκευμένα κύτταρα (Σχ. 1Β). Για την επαλήθευση της ταυτότητας των 1ου iCSCs, το δεύτερο (2ο) iCSCs απομονώθηκαν από όγκους που δημιουργούνται από σειριακή μεταμόσχευση με έγχυση του 1ου iCSCs στις βουβωνικό περιοχές ανοσοανεπαρκών ποντικών SCID σε δύο ανεξάρτητα πειράματα (Σχ. 1 C). Το 2ο iCSCs που μοιάζει με τα 1ο iCSCs διατηρήθηκαν σταθερά με τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα των επιθηλιακών κυττάρων μορφολογία και ισχυρή κυτταρική ανάπτυξη για περισσότερα από 20 περάσματα (Εικ. 1 C). Στη συνέχεια, για να διερευνήσει τη πλειοδυναμίας του iESCs, 1ο iCSCs, και 2ο ΚΕΠ, τα κύτταρα μεταμοσχεύθηκαν σε κάψουλες νεφρό ή βουβωνική περιοχές SCID ποντίκια. Σχηματισμός τερατώματα περιέχουν ecotoderm, μεσόδερμα και παράγωγα ενδόδερμα ανιχνεύθηκε με χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης σε υψηλή συχνότητα σε όλους τους τύπους κυττάρων (Εικ. 2Β), υποδεικνύοντας ότι οι τρεις τύποι κυττάρων ήσαν βλαστικά κύτταρα αποκτούν πλειοδυναμίας, παρά το γεγονός ότι τα επιθηλιακά κυτταρική μορφολογία.

(Α) Δημιουργία iPSCs και iESCs μέσω της άμεσης επαναπρογραμματισμό του πρωτογενούς εμβρύου ινοβλάστες (TIG1). (Β) Παραγωγή του πρώτου (1ου) iCSCs επιλέγοντας μια συστάδα κυττάρων (κίτρινος κύκλος) μέσω εμβρυοειδή σώματα iESCs που προέρχονται από (iESC ΕΒ) σχηματισμό. (C) Γενιάς του δεύτερου (2ου) iCSCs επιλέγοντας μια συστάδα κυττάρων (κίτρινος κύκλος) μέσω σειριακής μεταμόσχευση του 1ου iCSCs.

Η

(Α) Έκφραση εξωγενών, πολυδύναμων δείκτη και δείκτη γενεαλογία γονιδίων σε εμβρυοειδή σώματα (EBS) σχηματίζονται με iESCs και iPSCs με RT-PCR αναλύσεις. τμήματα (Β) Παραφίνη του τερατώματα, τα οποία παράγονται από iESCs, 1ο iCSCs, και 2ο iCSCs εμφύτευση, βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. NE, νευροεπιθήλιο (εξώδερμα)? CA, χόνδρος (εξώδερμα)? MU, των μυών (μεσόδερμα)? RE, αναπνευστικό επιθήλιο (ενδόδερμα). Το προφίλ

Η

Η γονιδιακή έκφραση των iESCs και iCSCs

Για να εξεταστεί η έκφραση γονιδίων σε iESCs και iCSCs, παγκόσμια προφίλ γονιδιακής έκφρασης ανιχνεύεται από αναλύσεις μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης συγκρίθηκαν. Μεταξύ TIG1, iESCs, 1ο iCSCs και iPSCs, iESCs και iCSCs μοιάζουν πολύ ο ένας τον άλλον. Είναι ενδιαφέρον, iESCs και iCSCs ήταν περισσότερο παρόμοια με σωματικά κύτταρα, και TIG1 παρά ανθρώπινα κύτταρα πολυδύναμα (iPSCs και των κυττάρων ES), ακόμη και με τη συνεπή υψηλή έκφραση του εξωγενούς

Oct4

,

Sox2

,

Klf4

, και

c-Myc

(Εικ. S2 και το Σχ. 3Α και 3Β). Σύμφωνα με αυτό, τα δεδομένα σχετικά με τη θερμότητα χάρτη αναλύσεις έδειξαν ότι iESCs διατήρησε μια ενδιάμεση κατάσταση μεταξύ σωματικών ινοβλάστες TIG1 και πολυδύναμα iPSCs (Εικ. 3Α). Αναλυτικότερα, διάγραμμα διασποράς αναλύσεις έδειξαν ότι, σε iESCs, έκφραση των σωματικών γονιδίων σήμανσης

MAB21L1

και

NR2F2

ήταν υψηλή για να iPSCs, ενώ η έκφραση των γονιδίων πολυδύναμων δείκτη Τ

DGF1, Nanog, ZIC2,

και

TPD52

παρόμοια με iPSCs (Εικ. 3Α). Παρόμοια με iESCs, 1ο iCSCs χαρακτηρίστηκαν με έκφραση ορισμένων σωματικών γονιδίων δεικτών. αναλύσεις RT-PCR επαληθεύεται ότι η έκφραση των ενδογενών γονιδίων πολυδύναμων δείκτη,

Oct4

,

SOX2

,

Nanog

,

REX1

,

LIN28 ,

ήταν προφανώς χαμηλό, ενώ τα γονίδια σωματικών δείκτη,

EMP1

,

PPARγ

,

FOXF2

, και

NR2F2

ήταν άκρως εκφράζονται στην 1ο και 2ο iCSCs (Εικ. 3Α και 3Β), δείχνοντας ότι επιγενετικές επαναπρογραμματισμό πήγε στα μισά του δρόμου για τη διαγραφή του σωματικά μνήμη και για την ίδρυση πολυδύναμων δίκτυο της μεταγραφής. Χαμηλή έκφραση του Nanog ανιχνεύθηκε με ανοσοκυτταροχημεία στο 1ο και 2ο iCSCs, ενώ η υψηλή έκφραση του ενδογενούς Oct4 /εξωγενών και ενδογενών Oct4 SOX2 /εξωγενές Sox2 ανιχνεύθηκε (Σχ. 3C). αναλύσεις ανοσοκυτταροχημεία απέδειξε ότι πολυδύναμα δείκτες Cdh1 και SSEA4 ήταν ασθενώς εκφράζεται σε iESCs και iCSCs, ενώ ιδιαίτερα στην iPSCs. Επιπλέον, η έκφραση του TRA-1-60 ανιχνεύθηκε σε iPSCs, αλλά όχι iESCs και iCSCs (Εικ. S3). Συλλογικά, iESCs και iCSCs διατήρησε μια κυτταρική κατάσταση μεταξύ TIG1 και iPSCs.

(Α) Γονιδιακή έκφραση ανάλυση μικροσυστοιχιών μεταξύ TIG1, iESCs, iCSCs και iPSCs. χάρτης θερμότητας (άνω πάνελ) δείχνει διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων των σωματικών και πολυδύναμα γονίδια. διαγράμματα διασποράς (κάτω πίνακας) δείχνουν τη σύγκριση των παγκόσμιων προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Κίτρινος; γονίδια στη μονάδα πυρήνα, μπλε? γονίδια στη μονάδα ΛΔΚ, και κόκκινο? γονίδιο στη μονάδα Myc. (Β) ανάλυση έκφρασης των πολυδύναμων γονίδια δείκτες, σωματικών γονίδια δείκτες κυττάρου και εξωγενών γονιδίων σε TIG1, iPSCs, iESCs, 1ο iCSCs, και 2ο iCSCs με RT-PCR αναλύσεις. (Γ) έκφραση των πολυδύναμων πρωτεϊνών δείκτη (πράσινο) σε iESCs, 1ο iCSCs, και 2ο iCSCs με ανοσοκυτταροχημεία. Οι πυρήνες των κυττάρων αντιχρώσθηκαν μπλε με DAPI (μπλε). Εξω-, εξωγενείς? Ενδο-, ενδογενής.

Η

Acquisision της πλειοδυναμίας πριν από την ίδρυση του iPSC ταυτότητας

Κατά τη διαδικασία επαναπρογραμματισμού των σωματικών κυττάρων σε iPSCs, τα κύτταρα αλλάζουν σταδιακά μοτίβα έκφρασή τους και τη μορφολογία. Έτσι, για να συγκρίνουν τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης των διαφορετικών τύπων κυττάρων επαναπρογραμματισμού, ένα ολοκληρωμένο σύστημα ανάλυσης για προφίλ έκφρασης, από την άποψη της κινητικής των ενοτήτων, απαιτείται. Τρεις μονάδες ES κυττάρων, Πυρήνας, ΛΔΚ, και Myc (CPM), οι οποίες είναι λειτουργικά διαχωρισθούν, έχουν καθοριστεί [9]. Η μονάδα πυρήνα περιλαμβάνει γνωστούς παράγοντες στον πυρήνα ρυθμιστικές κύκλωμα, όπως

Nanog, Oct4, SOX2, TCF3

, και

REX1

. Η μονάδα ΛΔΚ περιλαμβάνει το γονίδιο γενικά κατασταλεί σε ES κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των

HOX

γονίδια συμπλέγματος. Η μονάδα Myc αποτελείται από τα γονίδια που είναι κοινοί στόχοι των επτά παράγοντες, MYC, MAX, NMYC, DMAP1, E2F1, E2F4, και ZFX. Επιπλέον, το ES κύτταρο-σαν μονάδα ορίστηκε να γίνει διάκριση μεταξύ των ES κυττάρων, ενήλικα βλαστικά κύτταρα των ιστών, και ανθρώπινων καρκίνων [13]. Εδώ, έχουμε αποδείξει δεδομένων με μονάδες CPM, δεδομένου ότι η ανάλυση με στοιχεία του ES κυττάρων όπως μονάδα ήταν συγκρίσιμα με τα στοιχεία της μονάδας πυρήνα των ενοτήτων CPM, η οποία περιελάμβανε πολυδύναμα γονίδια σήμανσης.

Για να επαναπρογραμματίσει TIG1 σε iESCs, πάνω ρύθμιση των ενοτήτων Core και Myc απαιτήθηκε (Εικ. 4 και το Σχ. S4). iESCs και iCSCs χαρακτηρίζονται από την υψηλή δραστηριότητα της ΛΔΚ και Myc μονάδες, ενώ η μονάδα πυρήνα ήταν υψηλή σε iESCs και χαμηλή σε iCSCs. Ήταν σημαντικό να επιβάλει ένα εμπόδιο για τη διαγραφή σωματικά μνήμη ότι η μονάδα ΛΔΚ διατήρησε υψηλή δραστηριότητα σε όλα τα TIG1, iESCs και iCSCs όπως φαίνεται από

FOXF2

και

NR2F2

(Εικ. 3Α). Για να επαναπρογραμματιστούν πλήρως στο iPSCs από TIG1, επαγωγή της ρύθμισης προς τα κάτω της μονάδας ΛΔΚ ήταν απαραίτητο (Εικ. 4 και Εικ. S4), υποδεικνύοντας ότι η ολοκλήρωση της εγκατάστασης του iPSC-μεταγραφική δίκτυο συνδέεται με ρύθμιση προς τα κάτω της η μονάδα ΛΔΚ.

Ιδιότητες της αυτο-ανανέωσης και πλειοδυναμία συνδέονται με παροδική ή συνεχή ανοδική ρύθμιση των ενοτήτων Core και myc, αλλά όχι ΛΔΚ μονάδα. C, Core Module? P, ΛΔΚ μονάδα? Μ, Myc μονάδα.

Η

σταθερές κυτταρικές σειρές, TIG1, ICSC, και iPSC, χαρακτηρίζονται από την αμοιβαία δραστηριότητα των μονάδων Core και ΛΔΚ, ενώ η ασταθής iESCs έδειξε ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα πάνω των δύο ενοτήτων , γεγονός που υποδηλώνει ότι τα γονίδια κατηγοριοποιούνται σε δύο ενότητες λειτουργούσαν ανταγωνιστικά σε επαναπρογραμματισμό. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η απόκτηση της αυτο-ανανέωσης και πλειοδυναμία συνδέθηκε με τη ρύθμιση του πυρήνα και myc, αλλά όχι ΛΔΚ, ενότητες (Εικ. 4). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η ιδιότητα της αυτο-ανανέωσης και πλειοδυναμία θα μπορούσαν να ανατεθούν στην πυρήνων σωματικών πριν από την πλήρη επαναπρογραμματισμό σε iPSCs. Το εύρημα ότι ένα συγκεκριμένο κυτταρικό πληθυσμό της iESCs ήταν επαναπρογραμματιστούν σε iPSCs υποστηρίζεται αυθόρμητα αυτήν την έννοια (Εικ. S1B). Τα κριτήρια της αυτο-ανανέωσης και πλειοδυναμία χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό της ανθρώπινης iPSCs. Ωστόσο, η ιδιότητα της αυτο-ανανέωσης και πλειοδυναμία μπορεί να ανατεθεί σε μια ποικιλία κυτταρικών τύπων μέσω του επαναπρογραμματισμού περισσότερο από ό, τι περιμέναμε, και είναι αναγκαία, αλλά όχι επαρκή, για τον καθορισμό iPSC ταυτότητας.

Για να επαναπρογραμματίσει σωματικά κύτταρα για να iCSCs, αυξητική ρύθμιση της μονάδας Myc είναι ένα γεγονός κλειδί. Οι περιοχές προαγωγέα δεσμεύονται από MYC συνδέονται με ιστόνης Η3 lysin4 trimethylation (H3K3me3), η οποία συσχετίζεται θετικά με το σχηματισμό του ανοικτού χρωματίνης, και η ενεργοποίηση του γονιδίου ως επιγενετική υπογραφή [9]. Επιπλέον, MYC αλληλεπιδρά με ακετυλτρανσφεράσες ιστόνης, οι οποίες συνδέονται με σύμπλοκα ενεργοποίησης μεταγραφής [14]. Η μονάδα Myc διευκολύνει το μεταβολισμό των κυττάρων ενεργοποιώντας γενική γονίδια. Γονίδια στη μονάδα πυρήνα είναι επίσης επάνω-ρυθμίζονται μέσω σωματικών επαναπρογραμματισμό να iCSCs.

Oct4

,

SOX2

, και

Nanog

, οι οποίες αποτελούν βασικούς παράγοντες μονάδα πυρήνα, καταστέλλουν αναπτυξιακά σημαντικές πρωτεΐνες ομοπεδίου μέσω συν-κατάληψη των γονιδίων στόχων τους, ενώ προωθούν αυτο- ανανέωση και πλειοδυναμία με θετική ρύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν συνιστώσες των βασικών οδών σηματοδότησης [15]. Λαμβάνοντας αυτά υπόψη, οι μονάδες Core και Myc παίζουν ρόλο στην ανάθεση των χαρακτηριστικών της αυτο-ανανέωσης και πλειοδυναμία για πυρήνων σωματικών, ενώ συνεχώς υψηλή δραστηριότητα της μονάδας ΛΔΚ στην TIG1, iESCs και iCSCs εμποδίζει την επαναφορά του σωματικά μνήμη του ορισμένα αναπτυξιακά σημαντικό ομοπεδίου πρωτεΐνες (Εικ. 4). Οι Polycomb κατασταλτικά συγκροτήματα, ειδικά Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 περιέχει ΕΖΗ2, Eed και Suz12, είναι ζωτικής σημασίας καταστολείς των γονιδίων σε συνδυασμό με H3K27me3 [16]. Για να επαναφέρετε τη σωματική μνήμη των γονιδίων με ομοπεδίου στην iESCs και iCSCs και πάνω-γράψει το κύτταρο-όπως επιγενετικές υπογραφή ES στα επαναπρογραμματιστούν πυρήνες των iESCs, η δραστηριότητα της μονάδας ΛΔΚ θα πρέπει να μειωθεί συνεχώς ή παροδικά. Σχετικά μειωμένη δραστηριότητα της μονάδας ΛΔΚ μπορεί να είναι ένα σημαντικό γεγονός για τον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων σε iPSCs. Πιθανολογείται ότι η έλλειψη H3K27me3 παίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση της επαναπρογραμματισμό από την προ-iPSCs να iPSCs στην όψιμη φάση του επαναπρογραμματισμού [17]. Η μοίρα των σωματικών κυττάρων, αν έχουν επαναπρογραμματιστεί σε iCSCs ή iPSCs, θα μπορούσε να προσδιοριστεί από τη δραστηριότητα της μονάδας ΛΔΚ, μετά την απόκτηση της ικανότητας της αυτο-ανανέωσης και πλειοδυναμία (Εικ. 4).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Αυθόρμητη διαφοροποίηση των iESCs και μετατροπή σε iPSCs. (Α) Διαφοροποίηση των iESCs μετά από μακροχρόνια καλλιέργεια. (Β) με συμβατικό iPSCs (δεξιά πλευρά) δημιουργήθηκαν από μια μικρή αποικία (κίτρινος κύκλος στο αριστερό πάνελ) που εμφανίζονται στον πολιτισμό iESC σε υψηλή πυκνότητα κυττάρων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0048699.s001

(ΔΕΘ )

Εικόνα S2.

Παγκόσμια ανάλυση γονιδιακής έκφρασης των iESCs και iCSCs. Συγκριτική ανάλυση των παγκόσμιων προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε iPSC, ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών (ES) κυττάρων, iESC, 1ο ICSC, και TIG1 γραμμές με τη δοκιμασία των μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0048699.s002

( TIF)

Εικόνα S3.

Έκφραση των πολυδύναμων πρωτεϊνών δείκτη σε iESCs και iCSCs. Έκφραση των πρωτεϊνών της κυτταρικής επιφάνειας δείκτη, Cdh1, SSEA4, και TRA-1-60 ανιχνεύθηκε ως πράσινο φθορισμό, ενώ οι πυρήνες των κυττάρων ήταν όπως μπλε με DAPI

doi:. 10.1371 /journal.pone.0048699.s003

( TIF)

Εικόνα S4.

μέσες τιμές της γονιδιακής έκφρασης (log2) των μονάδων CPM στο σωματικά κύτταρα και πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0048699.s004

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Αστάρια για RT-PCR αναλύσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0048699.s005

(DOC)