Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι ένα μικρό υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων σε θέση να αυτο-ανανέωσης και του όγκου συντήρηση. Η εξάλειψη του καρκίνου βλαστικών κυττάρων, η ρίζα της καταγωγής του όγκου και υποτροπή, έχει αναδειχθεί ως μία πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη βελτίωση της επιβίωσης του καρκίνου του πνεύμονα. Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα αναφερθεί διαμένουν στο πλευρό του πληθυσμού (SP) των καλλιεργημένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Αναφέρουμε εδώ την συνύπαρξη ενός ξεχωριστού πληθυσμού κυττάρων μη-SP (NSP) που έχουν ισοδύναμη ικανότητα αυτο-ανανέωσης σε σύγκριση με κύτταρα SP σε μια δοκιμασία σφαίρα όγκου του πνεύμονα. Σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα σε καλλιέργειες μονοστιβάδας, σφαίρες όγκου του πνεύμονα, που σχηματίζεται από ανθρώπινα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές καρκινώματος Α549 ή Η1299, παρουσίαζαν σημαντική μορφολογική διαφορές και αυξημένη έκφραση των δεικτών βλαστικών κυττάρων CD133 και OCT3 /4. Lung σφαίρες όγκου επίσης παρουσίασαν αυξημένη ογκογόνο δυναμικό, καθώς μόνο 10.000 κύτταρα πνεύμονα σφαίρα όγκου που απαιτείται για να παραχθεί ξενομοσχεύματα όγκων σε γυμνούς ποντικούς, ενώ ο ίδιος αριθμός κυττάρων μονοστοιβάδας απέτυχε να επάγει όγκους. Μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι οι σφαίρες όγκου πνεύμονα έδειξε μειωμένη 26S ενεργότητα του πρωτεασώματος σε σύγκριση με μονοστιβάδας. Με τη χρήση του ZsGreen-cODC (Ο-τερματική αλληλουχία που κατευθύνει την υποβάθμιση της δεκαρβοξυλάσης ορνιθίνης) δοκιμασία ρεπόρτερ σε κυτταρικές σειρές NSCLC, μόνο λιγότερο από 1% καλλιέργειες μονοστοιβάδας ήταν ZsGreen θετικά υποδεικνύοντας χαμηλά 26S πρωτεασώματος, ενώ σφαίρα όγκου πνεύμονα παρουσίασαν αυξημένο αριθμό ZsGreen- θετικών κυττάρων, υποδεικνύοντας τον εμπλουτισμό των ΚΕΠ σε καλλιέργειες σφαίρα

Παράθεση:. Παν J, Ζανγκ Q, Wang Υ, μπορείτε Μ (2010) 26S πρωτεασώματος Δραστηριότητα ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκίνο του πνεύμονα Stem-όπως τα κύτταρα Πολλαπλασιάζονται

In Vitro

. PLoS ONE 5 (10): e13298. doi: 10.1371 /journal.pone.0013298

Επιμέλεια: Xinwei Wang, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, ΝΙΗ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Απρίλη 2010? Αποδεκτές: 17 του Σεπτέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 11 Οκτώβρη του 2010

Copyright: © 2010 Pan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ επιχορήγηση R01CA134682. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι μια μικρή δεξαμενή για αυτοσυντηρούμενη κυττάρων με την αποκλειστική ικανότητα για αυτο-ανανέωση και όγκο συντήρησης [1]. Μόνο ένα μικρό υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων εντός ενός όγκου έχουν τα χαρακτηριστικά των βλαστοκυττάρων, και μπορεί έτσι να κινήσει έναν όγκο όταν μεταμοσχεύονται [3], [4]. Υποθετικές CSCs σε οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML) απομονώθηκαν για πρώτη φορά το 1994 [5]. Με τις προόδους στον φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS), και πρόσφατα ταυτοποιημένοι δείκτες κυτταρικής επιφάνειας όπως Sca-1, και CD133, ΚΕΠ μπορούν να απομονωθούν όχι μόνο από καρκίνους του αίματος, αλλά και από συμπαγείς όγκους [1].

οι ΚΕΠ στο καρκίνωμα του μαστού του ανθρώπου έχει αναγνωριστεί ως ένα σπάνιο πληθυσμό των CD44

+ /CD24

– /χαμηλή /ESA

+ κύτταρα [6]. 100 από αυτά τα κύτταρα ήταν σε θέση να σχηματίσουν νέους όγκους, ενώ άλλα κύτταρα όγκου απέτυχαν να σχηματίζουν όγκους σε SCID ποντίκια. ΚΕΠ του μαστού επίσης αταξινόμητους ως CD44

+ /CD24

– /Oct-4

+ από Πόντι

et al

. το 2005 [7]. ΚΕΠ σε καρκίνο του παχέος εντέρου βρέθηκαν να είναι λιγότερο από το 2,5% του πληθυσμού με θετική έκφραση CD133 [8], και πρόσφατα ορίστηκε ως CD44

+ /CD166

+ /ESA

+ [9]. Βρογχιοκυψελιδικό βλαστοκύτταρα (BASCs) έχουν πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως το υποθετικό πληθυσμό αρχέγονων κυττάρων για αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, και θα μπορούσε να απομονωθεί ως CD45

–

/PECAM – /Sca-1

+ /CD34

+ κύτταρα με FACS [10]. ΚΕΠ σε μικροκυτταρικό και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα αναφέρθηκαν επίσης ως μια σπάνια πληθυσμός αδιαφοροποίητων CD133

+ κύτταρα [11]. Αυτά ήταν σε θέση να αυτο-ανανέωση ως σφαίρες όγκου σε μέσο άνευ ορού, και παράγει ξενομοσχεύματα όγκου φαινοτυπικά δεν διακρίνεται από τον αρχικό όγκο, όταν εγχέεται σε δΟΙϋ ποντικούς.

Μια εναλλακτική προσέγγιση για την απομόνωση βλαστικών κυτταρικών πληθυσμών είναι μέσω εμπλουτισμού από πλευράς πληθυσμού (SP) κυττάρων [2]. Τα κύτταρα SP προσδιορίζονται από την ικανότητα να εκρέει Hoechst χρωστική, μια διαδικασία που προκαλείται από το ΑΤΡ-δέσμευσης πρωτεΐνης αντίσταση μεταφορέα κασέτα καρκίνο του μαστού (BCRP-1) [12]. Από Goodell

et al

. αναφέρθηκε για πρώτη φορά ότι το SP είναι εμπλουτισμένο σε αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (HSCs) [13], τα κύτταρα SP έχουν ταυτοποιηθεί σε μία ποικιλία κανονικών και κακοηθών ιστών, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα [14]. BCRP-1 ανεπαρκή ποντίκια έλειπε η SP στο μυελό των οστών ακόμα δεν είχε κανένα ουσιαστικό αιμοποιητικών ανωμαλιών [15]. Έτσι, η ακριβής λειτουργική σχέση μεταξύ του φαινοτύπου SP και βλαστικών κυτταρική λειτουργία παραμένει ασαφής. Και οι δύο SP και NSP κλάσματα από την ϋΑΟΥ μυελοβλάστωμα κυτταρική γραμμή ήταν ικανά επανασύστασης του αρχικού γονική πληθυσμού, και μόνο ελαφρές κλωνογόνο εμπλουτισμός παρατηρήθηκε στο κλάσμα SP [16].

Τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (HSCs) αναφέρθηκε ότι διαμένουν στην SP κλάσμα του ενήλικου μυελού των οστών ποντικού (BM), ωστόσο, μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι η συνύπαρξη των ΜΑΠ HSCs που δεν διαφέρουν σημαντικά από SP HSCs σε αριθμούς, και την ικανότητα αυτο-ανανέωσης [17]. Επιπλέον, το CD34

– /lowc-Kit

+ Sca-1

+ δείκτη καταγωγή

– κυτταρικό πληθυσμό, η οποία είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένο σε HSCs ποντίκι, ήταν σχεδόν εξίσου διαιρείται σε SP και NSP κύτταρα. Αυτά ήταν σε μια κατάσταση ηρεμίας και έδειξαν ομοιόμορφη κινητική του κυτταρικού κύκλου, ανεξάρτητα από το αν ήταν στο SP ή NSP [17]. Περαιτέρω χαρακτηρισμός του SP σε καρκινικά κύτταρα, επομένως, απαιτείται να αξιολογηθεί πλήρως το ρόλο αυτά τα κύτταρα παίζουν στον καρκίνο του πνεύμονα.

Πρόσφατα ευρήματα έδειξαν ότι χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως η δοξορουβικίνη και σισπλατίνη, θα μπορούσε να προκαλέσει τη διάδοση των ΚΕΠ

in vitro

[18]. Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν ικανότητα αυτο-ανανέωσης τους, όπως αποδεικνύεται από την ανάπτυξη των σφαιρών όγκου

in vitro

, και είχαν υψηλά ογκογόνα και μεταστατικού δυναμικού μετά τον εμβολιασμό σε ποντίκια SCID. Χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως η σισπλατίνη και ιφοσφαμίδη, είναι επίσης γνωστό ότι καταστέλλουν την έκφραση του πρωτεασώματος υπομονάδων [19], και ρυθμίζουν προς τα κάτω ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος εξαρτώμενη πρωτεόλυση [20]. Μειωμένη 26S πρωτεασώματος δραστικότητα βρέθηκε να είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του CICs (καρκίνος κύτταρα έναρξης) σε γλοίωμα και ο καρκίνος του μαστού, που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση ΚΕΠ

in vivo

[21]. Ωστόσο, βενζυλοξικαρβονυλ-Leu-Leu-Nle-CHO (LLNle), ένας αναστολέας γ-σεκρετάσης, αναφέρθηκε να σκοτώσει αποτελεσματικά ογκογενή κύτταρα ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος (GBM TIC)

in vitro

με αναστολή του πρωτεασώματος 26S . Ως εκ τούτου, η περαιτέρω αποσαφήνιση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος 26S απαιτείται προκειμένου να προσδιοριστεί πλήρως το ρόλο της στην ΚΕΠ και αντικαρκινική θεραπεία. Τελικά, αυτό μπορεί να βοηθήσει στην ταυτοποίηση νέων στόχων για το μέλλον της θεραπευτικής παρέμβασης.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε αν πνεύμονα ΚΕΠ κατοικούν αποκλειστικά στην πλευρά πληθυσμό και το κατά πόσον σφαίρες πνεύμονα όγκου με ικανότητα αυτο-ανανέωσης από NSCLC κυτταρικές σειρές θα μπορούσε να είναι μια πηγή για τον εμπλουτισμό των ΚΕΠ του πνεύμονα.

Μέθοδοι

Cell Culture

Ανθρώπινο NSCLC κυτταρικές σειρές Α549 και Η1299 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA), και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Gibco) και πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη κοκτέιλ (Gibco). 293 κύτταρα FT αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA), και καλλιεργήθηκαν σε ϋυΐββοοο Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco) με 10% FBS και πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη κοκτέιλ. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένη συσκευή επώασης στους 37 ° C σε 5% CO

2.

χρώση των κυττάρων με Hoechst 33342

Οι μέθοδοι για την ταυτοποίηση του ΚΕΕ προσαρμόστηκαν από προηγούμενες εκθέσεις [ ,,,0],22], [23]. Εν συντομία, τα κύτταρα trpsinized και επανεναιωρήθηκαν σε 1 χ 10

6 κύτταρα /ml σε DMEM με υψηλή γλυκόζη, 2% (ν /ν) FBS και 10 mM Ν- (2-υδροξυαιθυλ) πιπεραζινο-Ν ‘- (2 -αιθανοσουλφονικό οξύ) (HEPES)), επωάστηκαν με 5 μg /ml Hoechst 33342 χρωστική (με ή χωρίς Fumitremorgin C (ΜΡ Biomedicals, Eschwege, Γερμανία) για 90 λεπτά σε λουτρό ύδατος C 37 °, και οι σωλήνες ήπια κάθε 20 ανεστραμμένη min για την αποθάρρυνση των κυττάρων καθίζησης και συσσωμάτωση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 375 χ g για 6 λεπτά στους 4 ° C, και επαναιωρήθηκαν σε κατάλληλο όγκο διαλύματος ισορροπημένου άλατος κρύο Hank (HBSS) με 2% (ν /ν) FBS. Τα κύτταρα παρέμεινε σε 4 ° C για το υπόλοιπο του πειράματος. για νεκρός διάκριση των κυττάρων, προστέθηκαν 2 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) αμέσως πριν από την κυτταρομετρία ροής. δείγματα κυττάρων αναλύθηκαν σε MoFlo διαλογέα κυττάρου (Beckman Coulter), και εκπομπής συλλέχθηκε μέσω nm μακρινή πάσα διχροϊκό καθρέφτη 610 (DCLP) σε ένα φίλτρο 620 nm μακρύ πέρασμα (LP) για το κόκκινο συλλογή Hoechst και 424/44 nm ζωνοπερατού (BP) φίλτρο για την μπλε συλλογή Hoechst. Η πλευρά του πληθυσμού «SP» αναγνωρίστηκε ως μια ομάδα κυττάρων που είναι σε θέση να αποκλείσει τη χρωστική Hoechst, ένα χαρακτηριστικό καταργήθηκε με τη θεραπεία με 10 μΜ Fumitremorgin C [22].

Σφαίρα Δοκιμασία Σχηματισμού

όγκου πνεύμονα σφαίρες απομονώθηκαν μέσω καλλιέργειας σε χαμηλή πυκνότητα σε συνθήκες καλλιέργειας χωρίς ορό όπως περιγράφεται προηγουμένως, η οποία επέτρεψε την επιλογή των αδιαφοροποίητων καρκινικά βλαστικά και τα προγονικά κύτταρα, ενώ τα κύτταρα διαφοροποιημένα καρκινικά ορό-εξαρτώμενη και μη μετασχηματισμένα βοηθητικά κύτταρα που επιλέγονται αρνητικά [8], [11], [24]. Α549 και Η1299 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα επιστρώθηκαν σε κλωνική πυκνότητα σε μέσο ελεύθερο DMEM-F12 ορού συμπληρωμένο με 5 mM HEPES, 0.1% διττανθρακικό νάτριο, 0.4% BSA, γλουταμίνη και αντιβιοτικά (Gibco-Invitrogen), και περιείχε 20 ng /ml EGF και 10 ng /ml bFGF. φιάλες καλλιέργειας ιστού χωρίς θεραπεία χρησιμοποιήθηκαν για τη μείωση της κυτταρικής προσκόλλησης και τη στήριξη της ανάπτυξης και αδιαφοροποίητο σφαίρες όγκου. Το μέσο αντικαθίσταται ή να συμπληρώνεται με φρέσκο ​​παράγοντες ανάπτυξης δύο φορές την εβδομάδα έως ότου τα κύτταρα άρχισαν να αυξάνονται και να σχηματίσουν συσσωματώματα επιπλέει. σφαίρες όγκων συλλέχθηκαν με ένα κύτταρο σουρωτήρι 100 μm (BD, Bedford, ΜΑ), και επεκτάθηκε με ενζυματική και μηχανική διάσπαση, ακολουθούμενη από εκ νέου επίστρωση των δύο απλών κυττάρων και των υπολειμματικών μικρά συσσωματώματα σε πλήρες φρέσκο ​​μέσο.

κυτταρομετρία ροής

για κυτταρομετρία ροής, σφαίρες όγκου ή μονοστρωματικές καλλιέργειες διαχωρίστηκαν μηχανικά σε μεμονωμένα κύτταρα, πλένονται και επωάζονται με την κατάλληλη αραίωση του ελέγχου ή ειδικού αντισώματος. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ΡΕ συζευγμένο αντι-CD133 /1 από τη Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Γερμανία), FITC συζευγμένο αντι-CD44 (eBioscience, San Diego, CA), και αντι-OCT3 /4 (Santa Cruz Biotechology, CA). Για ΡΕ συζευγμένο αντι-CD133 /1, τα κύτταρα πρώτα δεσμεύτηκαν με αντιδραστήριο δέσμευσης για 5 λεπτά, στη συνέχεια 20 λεπτά επώαση με αντίσωμα. Για OCT3 /4 έκφραση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με FIX & amp? αντιδραστήρια PERM® (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες κατασκευαστή, και επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechnology) για 20 λεπτά σε σκοτάδι, μετά πλύθηκαν με PBS, τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στο σκοτάδι με ένα συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα ( Invitrogen). Ως αρνητικός έλεγχος, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με το κατάλληλο έλεγχο ισότοπο. Για FITC συζευγμένο αντι-CD44, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντισώματα για 20 λεπτά σε σκοτάδι. Μετά πλύση με PBS, τα κύτταρα αναλύθηκαν σε FACS Calibur ροής κυτταρομετρητή (Becton Dickinson).

Δοκιμασίες λειτουργίας πρωτεασώματος

χυμοτρυπτικό, τρυπτικών και δραστηριότητες πρωτεασώματος κασπάσης μετρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25] με μερικές μικρές τροποποιήσεις. Α549, Η1299 και τα κύτταρά τους σφαίρα πρωτογενούς όγκου πνεύμονα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση. Τα κυτταρικά ιζήματα σε υπερήχους σε ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης (25 mM Tris [ρΗ 7,5], 100 mM NaCl, 5 mM ΑΤΡ, 0,2% (ν /ν) Nonidet Ρ-40 και 20% γλυκερόλη, και τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στους 4 ° C. η συγκέντρωση πρωτεΐνης στα προκύπτοντα ακατέργαστο κυτταρικά εκχυλίσματα προσδιορίστηκε με το πρωτόκολλο Micro (bicinchoninic οξύ) (Βίο Rad, Rockford, IL) με BSA (Sigma) ως πρότυπο. Για να μετρηθεί η δραστηριότητα πρωτεασώματος 26S, 100 μα πρωτεΐνης από ακατέργαστα κυτταρικά εκχυλίσματα κάθε δείγματος αραιώθηκε με ρυθμιστικό Ι (50 mM Tris [ρΗ 7,4], 2 mM διθειοθρεϊτόλη, 5 mM MgCl

2, 2 mM ΑΤΡ) σε τελικό όγκο 1 mL (προσδιορίστηκαν εις τετραπλούν). Τα φθορισμογόνα υποστρώματα του πρωτεασώματος Suc-LLVY-AMC (χυμοτρυπτικό υπόστρωμα? Biomol International, Plymouth Meeting, ΡΑ), Ζ-ARR-AMC (τρυπτικών υπόστρωμα? Calbiochem), και Ζ-LLE-AMC (κασπάση-σαν υπόστρωμα? Biomol International) διαλύθηκαν σε DMSO και προστίθεται σε μια τελική συγκέντρωση 80 μΜ. πρωτεολυτική δραστηριότητες παρακολουθούνταν συνεχώς σε 2 ώρες στους 37 ° C με μέτρηση της απελευθέρωσης του φθορίζουσα ομάδα, 7-αμιδο-4-μεθυλοκουμαρίνη (AMC), σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας φθορισμού (Spectramax Μ2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) με διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος 380 και 460 nm, αντίστοιχα.

ανάλυση Alamar Blue

η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με Alamar Μπλε [26]. Α549 και Η1299 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (BD Falcon) σε πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο. Για πολιτισμούς σφαίρα όγκου, μόνο κύτταρο ήταν ενζυματική και μηχανική διαχωριστεί. 24 ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα εξετέθησαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης ή δοξορουβικίνης όπως υποδεικνύεται για 48 ώρες. Alamar Blue (BioSource, Camarillo, CA) προστέθηκε απευθείας στο μέσο καλλιέργειας σε 10% του όγκου των μέσων ενημέρωσης κατά τη διάρκεια των τελευταίων 10 h της περιόδου έκθεσης 48 h. Φθορίζει με τη διέγερση των 544 nm και εκπομπή ανιχνεύθηκε σε 590 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακός.

δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών που εκφράζουν ZsGreen-cODC σύντηξης πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας ρετροϊική μεταγωγή

Ο ρετροϊικός φορέας έκφρασης pQCXIN-ZsGreen-cODC ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Φρανκ Pajonk (Τμήμα Μοριακής και Κυτταρικής Ογκολογίας, Τμήμα Ακτινοθεραπευτικής Ογκολογίας, David Geffen της Ιατρικής Σχολής στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Λος Άντζελες, Λος Άντζελες, Καλιφόρνια), στο οποίο η καρβοξυλομάδα άκρο του μυϊκού αποκαρβοξυλάσης ορνιθίνης (cODC) degron, η αλληλουχία που κατευθύνει την αρχική θέση της υποβάθμισης, συγχωνεύθηκε με ZsGreen ρεπόρτερ [21]. pQCXIN-ZsGreenc-ODC συν-επιμολύνθηκε με pVSV-G σε GP2-293 παντροπική ρετροϊικά συσκευαστικά κύτταρα (Clontech) και το υπερκείμενο ρετροϊός χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει Α549 και Η1299 κύτταρα. 48 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα επελέγησαν με G418 (Invitrogen). Η συσσώρευση των ZsGreen-cODC πρωτεΐνη παρακολουθήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού και κυτταρομετρία ροής (FL-1channel).

Δημιουργία Υποδόρια Καρκίνο του Πνεύμονα ξενομοσχεύματα σε Γυμνά ποντίκια

Για ξενομοσχεύματα ποντικών, τόσο μονοστιβάδας και του όγκου κύτταρα σφαίρα θρυψινοποιήθηκαν και μηχανικά διαχωρίστηκαν για να ληφθούν εναιωρήματα απλού κυττάρου πριν υποδόρια ένεση. Χρησιμοποιήθηκαν έξι εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών (Harlan Lab, Indianapolis, ΙΝ). σφαίρα όγκου (1 × 10

4) και μονοστρωματική (1 × 10

4) κύτταρα υποδορίως εγχέεται στο αριστερό και το δεξί πλευρές του ίδιου ποντικού για να αξιολογηθεί ογκογόνο δραστικότητα. Τα ποντίκια παρακολουθούνταν καθημερινά για την εμφάνιση υποδόριων όγκων. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν κατά την ημέρα 60 και καρκινικό ιστό συλλέχθηκε. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε από τον τύπο 0.52 x μήκος x πλάτος

2. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση ακολουθούμενη από ανάλυση IHC διεξήχθησαν για να αναλύσουν ιστολογία του όγκου. Τμήματα επίσης χρωματίστηκαν με αντίσωμα έναντι της β-κατενίνης με πρότυπο πρωτόκολλο IHC.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD. Οι διαφορές προσδιορίστηκαν με δοκιμή t δύο ουρά Student. AP αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

SP και NSP κύτταρα σχηματίζουν σφαίρα όγκου με την ίδια συχνότητα σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος

κύτταρα SP έχουν. ενοχοποιηθεί ως υποθετικό ΚΕΠ καθώς δείχνουν αυξημένη ογκογονικότητα σε γυμνούς /scid ποντίκια σε σύγκριση με τα κύτταρα NSP [27]. Για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα SP έχουν μεγαλύτερη ικανότητα αυτο-ανανέωσης από τα κύτταρα ΜΑΠ σε καλλιέργεια, SP και NSP κύτταρα από δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου ανθρώπινου πνεύμονα ταξινομήθηκαν με βάση την ικανότητα να εκρέει χρωστική Hoechst 33342 για να δημιουργήσει ένα Hoechst μπλε-κόκκινο προφίλ. Ένας εκλεκτικός αναστολέας ABCG2, Fumitremorgin C (FTC), συν-επωάζεται με Hoechst 33342 για να εμποδίσει τη δραστηριότητα του μεταφορέα, και η πύλη SP ορίσθηκε ως η μειωμένη περιοχή με την παρουσία του FTC. Οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος Α549 και Η1299 περιείχε 17,7% και 0,2% τα κύτταρα SP, αντίστοιχα (Εικ. 1Α). Καλλιέργεια του SP και NSP κύτταρα σε σφαίρα όγκου σχηματισμού των μέσων ενημέρωσης, το οποίο επιτρέπει μόνο την επιλογή των μη διαφοροποιημένων κλώνων ή στέλεχος του καρκίνου και των προγονικών κυττάρων [11], είχε ως αποτέλεσμα πνεύμονα σχηματισμό σφαίρα όγκου και από τις δύο υποπληθυσμών χωρίς διαφορά στην ταχύτητα σχηματισμού (Σχ. 1Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). κύτταρα SP συνήθως οδηγούν σε SP και NSP κυττάρων μέσω ασύμμετρης κυτταρικής διαίρεσης, ενώ τα κύτταρα NSP δεν έχουν τη δυνατότητα αυτή [28]. Με την εκ νέου χρώση την διαλογή SP και κύτταρα NSP από Α549 και κύτταρα Η1299 μία εβδομάδα μετά, FACS ανάλυση αποκάλυψε ότι τα κύτταρα SP οδήγησε σε σημαντική αναλογία των κυττάρων NSP. Επιπλέον, απομονωμένα κύτταρα NSP έδωσε επίσης αφορμή για παρόμοια αναλογία SP κύτταρα (Εικ. 1Γ).

Α. Χαρακτηριστική Hoechst 33342 προφίλ χρώσης χρωστικής ουσίας που αποδεικνύουν την ύπαρξη της SP (πολύγωνο οριοθετημένα) και NSP (έλλειψη οριοθετημένα) κύτταρα στο ανθρώπινο Α549 και κύτταρα αδενοκαρκινώματος Η1299. Ποσοστό κυττάρων SP ενδείκνυται. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 mg /ml Hoechst33342 (ΗΟ), και τα κύτταρα ελέγχου ήταν επίσης συν-βάφονται με 10 mM fumitremorgin C (FTC), για να καθορίσετε τα κύτταρα SP. Κύτταρα ταξινομήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Beckman MoFlo κυτταρομετρητή και τα δεδομένα που σχολιάστηκαν χρησιμοποιώντας FCS Express. Β Φάση-αντίθεση φωτογραφίες των σφαιρών όγκου πνεύμονα που προέρχονται από τα κύτταρα SP και NSP. SP και κυττάρων NSP (1000 κύτταρα /ml) απλώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλές φιάλες προσκολλημένα σε μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένο με αυξητικούς παράγοντες και καλλιεργούνται όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Γ Re-χρώση των κυττάρων SP και NSP από Α549 και Η1299 με χρωστική Hoechst 33342. Ποσοστό των κυττάρων SP είναι χαρακτηρισμένα.

Η

πνεύμονα χαρακτηριστικά σφαίρες όγκου εμφανίζουν καρκίνο βλαστικών κυττάρων

Από τα κύτταρα ικανά να αυτο-ανανέωση διαμένουν σε δύο πλευρά και μη-side πληθυσμούς, ερευνήσαμε αν κύτταρα σφαίρα όγκου έδειξε κάποια χαρακτηριστικά CSC, όπως την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων, όπως CD44, CD133 και OCT3 /4. Πρώτον, για να αποκλειστεί η επίδραση της CSC μέσων στην έκφραση, μονοστιβάδα κύτταρα που αναπτύσσονται σε μέσα μαζικής ενημέρωσης CSC ελέγχθηκαν, και δεν διαπιστώθηκε καμία διαφορά μεταξύ των κυττάρων αναπτύσσονται σε μέσα CSC και μέσα ενημέρωσης τακτική ανάπτυξη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Κύτταρα από μονοστοιβάδα και σφαίρα καλλιέργειες από Α549 και τα κύτταρα Η1299 στη συνέχεια συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για CD44 και CD133. Πάνω από το 90% των Α549 και Η1299 κυττάρων σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας ήταν CD44

+, ενώ μόνο ένα πολύ μικρό μέρος των κυττάρων ήταν CD133

+ (0,2% σε κύτταρα Α549, και 0,55% στις Η1299 κύτταρα.). Ωστόσο, στις σφαίρες των όγκων του πνεύμονα, CD133

+ κύτταρα σε μεγάλο βαθμό εμπλουτισμένο σε πάνω από 10% το Α549, και 1,7% το Η1299 (Σχ. 2Α). Ο μεταγραφικός παράγοντας OCT3 /4 θεωρείται ένας κεντρικός ρυθμιστής των ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων pluripotency και αυτο-ανανέωση ικανοτήτων. Η έκφρασή του φαίνεται να είναι σημαντική για τη διατήρηση της αδιαφοροποίητη κατάσταση του εμβρυονικό καρκίνωμα, όπως επίσης και σε άλλους καρκίνους [29], [30]. /4

+ κύτταρα OCT3 στο Α549 και μονοστιβάδες Η1299 ήταν λιγότερο από το 4%, ενώ οι αριθμοί ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε τομείς των όγκων στο 36% και 50%, ξεχωριστά.

Α. Πνεύμονα σφαίρες όγκου έδειξαν αυξημένη έκφραση CD133. Η έκφραση του CD44 και CD133 σε μονοστιβάδα και σφαίρα καρκινικά κύτταρα, όπως προσδιορίζεται με δύο χρωμάτων κυτταρομετρία ροής ανάλυση. Που ταιριάζουν στον ισότυπο μονοκλωνικά αντισώματα και ένα προάνοσο αντιορό δευτερόλεπτα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Το ποσοστό των μονής και διπλής-θετικών κυττάρων υποδεικνύονται. Β πνεύμονα σφαίρες όγκου έδειξαν αυξημένη OCT3 4 έκφραση /. Μια μέση ένταση φθορισμού των OCT3 /4 στον έλεγχο (γκρίζα περιοχή), κύτταρα μονοστοιβάδας (διακεκομμένη γραμμή) και σφαίρες όγκου (συνεχής γραμμή) παρουσιάζεται. Τα ποσοστά των θετικών κυττάρων που αναφέρονται στον πίνακα.

Η

πνεύμονα σφαίρες όγκου έχουν υψηλή ογκογόνο δυναμικό

Για να προσδιορίσετε αν σφαίρες καρκινικών όγκων από Α549 και Η1299 κύτταρα διαφέρουν σε ογκογόνο δυναμικό τους σε σύγκριση με το κύτταρα που αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα, ενέθηκε υποδορίως 10.000 κύτταρα από κάθε ένα από αυτούς τους πληθυσμούς στα πλευρά γυμνών ποντικών. Η ανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε σε όλους τους ποντικούς που εμβολιάσθηκαν με κύτταρα όγκου προερχόμενα σφαίρα από Α549, ενώ δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη όγκου μετά τον εμβολιασμό με μονοστοιβάδα Α549 κύτταρα (Πίνακας 1). Tumor σφαίρα κυττάρων από κύτταρα Η1299 αυξήθηκε σε 2 από 3 γυμνών ποντικών, ενώ ο ίδιος αριθμός κυττάρων μονοστοιβάδας απέτυχε να προκαλέσει οποιονδήποτε όγκο ακόμη και με ένα εκτεταμένο 4 ακόμη εβδομάδες παρατήρησης (Πίνακας 1 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η &? Χρώση Ε αποκάλυψε μια ιδιαίτερα κυτταρική μάζα με μεγάλους πυρήνες και εξέχοντα πυρήνια (Εικ. 3). τομές όγκου από ξενομόσχευμα σφαίρες όγκου χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον β-κατενίνης, η οποία είναι ένας ρυθμιστής κλειδί της οδού Wnt το οποίο λειτουργεί για τον έλεγχο των βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση. Η μετατόπιση της β-κατενίνης στον πυρήνα οδηγεί στην αυξημένη έκφραση των γονιδίων στόχων β-κατενίνης που προωθούν εγκατάσταση όγκου, ανάπτυξη, και εισβολή [31]. Παρατηρήσαμε ότι β-κατενίνης εκφράστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα, ενώ η έκφραση στους πυρήνες παρατηρήθηκε σε τομές όγκων που προκαλείται από τα τμήματα του όγκου (Εικ. 3). Η μετατόπιση του β-κατενίνης στον πυρήνα οδηγεί στην αυξημένη έκφραση των γονιδίων στόχων β-κατενίνης που προωθούν εγκατάσταση όγκου, ανάπτυξη, και εισβολή [31].

αφαιρεθεί χειρουργικά όγκου καθορίστηκε σε ρυθμισμένη φορμαλίνη και στη συνέχεια αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία (IHC) με πρότυπο πρωτόκολλο.

η

σφαίρες όγκων του πνεύμονα είναι πιο ανθεκτικά στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες

μονόφυλλο και σφαίρα καρκινικά κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων επί του παρόντος σε χρήση σε κλινικό περιβάλλον, όπως η σισπλατίνη και η δοξορουβικίνη. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ανάλυση Alamar Blue 2 ημέρες μετά την υποβολή μονοστιβάδας και σφαίρα καρκινικών κυττάρων στη σισπλατίνη ή δοξορουβικίνη. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4, η βιωσιμότητα των καλλιεργειών μονοστοιβάδας μειώθηκε σημαντικά μετά τα δύο χημειοθεραπευτικούς παράγοντες θεραπείες σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων σφαίρα όγκου. Η σχετική βιωσιμότητα ήταν περίπου 20% και για τα δύο Α549 και καλλιέργειες μονοστοιβάδας Η1299 όταν έλαβαν θεραπεία με 12,5 μΜ δοξορουβικίνη, ενώ πάνω από το 50% των κυττάρων του όγκου σφαίρας (50,4% για Η1299 και 64,8% για το Α549) επέζησε. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 25 μΜ της σισπλατίνης, η σχετική βιωσιμότητα ήταν 11,7% για Α549 και 25,3% για Η1299 μονοστρωματική καλλιέργεια, ενώ το 65,4% της σφαίρας του όγκου Α549 και 79,3% των Η1299 κυττάρων σφαίρας όγκου επιβίωσαν αυτής της αγωγής, υποδεικνύοντας μονοστρωματική καλλιέργεια μπορεί να είναι περισσότερο ευαίσθητοι στη σισπλατίνη και δοξορουβικίνη σε σύγκριση με σφαίρες του όγκου, όπως αποδεικνύεται από την μικρότερη ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων μετά από in vitro έκθεση στο φάρμακο.

A. σισπλατίνη, Β αντίσταση δοξορουβικίνη των μονοστρωματική καλλιέργεια και σφαίρες όγκου αναλύθηκαν. Κύτταρα διαχωριστεί από σφαίρες όγκων του πνεύμονα ή μονοστοιβάδες επιστρώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε 2 × 10

4 κύτταρα /ml, 24 ώρες αργότερα, προστέθηκαν μέσα που περιέχουν διάφορες συγκεντρώσεις σισπλατίνης ή δοξορουβικίνη. Μετά από 48 ώρες καλλιέργειας, 10% Alamar Μπλε προστέθηκε και αναγνώστηκε στα 544/590 nm, το ποσοστό βιωσιμότητας υπολογίστηκε σε σχέση με τα κύτταρα που δεν εκτέθηκαν σε καμία χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD.

Η

πνεύμονα σφαίρες όγκου εμφανίζουν μειωμένη ενεργότητα του πρωτεασώματος

κάτω ρύθμιση της ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος εξαρτώμενη πρωτεόλυση παρατηρήθηκε σε απάντηση σε διάφορους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, όπως η σισπλατίνη [19], ιφωσφαμίδη [19] και Bortezomib [32]. Πρόσφατα ευρήματα έδειξαν ότι χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως η σισπλατίνη, μπορεί επίσης να οδηγήσει σε πολλαπλασιασμό των ΚΕΠ [18]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο μειωμένη δραστηριότητα του πρωτεασώματος παρατηρείται στο ΚΕΠ του πνεύμονα, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις φθορογόνου λειτουργία του πρωτεασώματος χρησιμοποιώντας μονοστρωματικές και σφαίρας καλλιέργειες από Α549 και ανθρώπινα κύτταρα NSCLC Η1299. Το πρωτεάσωμα 26S έχει τουλάχιστον τρία διακριτά είδη των πρωτεολυτικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένων chymotrypsin-, trypsin-, και τις δραστηριότητες της κασπάσης-όπως. Για την παρακολούθηση ειδικών δραστηριοτήτων πρωτεάσης του πρωτεασώματος 26S, τρία φθορισμογόνα υποστρώματα: Suc-LLVY-AMC για τύπου χυμοθρυψίνης, Ζ-ARR-AMC για θρυψίνη-όπως, και Ζ-LLE-AMC για δραστικότητα κασπάσης-όπως, επωάστηκαν με κύτταρο λύματα είτε από μονής στιβάδας ή των πνευμόνων πολιτισμών σφαίρα όγκου. Κασπάση-όπως και χυμοθρυψίνης δραστηριότητες από μονοστιβάδες αυξήθηκε κατά 2 ώρες επώασης με τα υποστρώματα, αλλά παρέμεινε αμετάβλητος σε λύματα σφαίρα όγκου. δραστηριότητες τύπου χυμοθρυψίνης ομοίως αυξήθηκαν σε καλλιέργειες μονοστιβάδας και λιγότερο σε σφαίρες όγκου πνεύμονα (Εικ. 5Α, Β). Παρόμοια με τρυψίνη δραστικότητα δεν ήταν σημαντικά διαφορετική στις δύο ομάδες (Εικ. 5C). Χυμοθρυψίνης δραστηριότητα, η κυρίαρχη δραστηριότητα του πρωτεασώματος 26S, μειώθηκε σε περίπου 30% στις καλλιέργειες σφαίρα σε σχέση με καλλιέργειες μονοστιβάδας. δραστικότητα κασπάσης-όπως μειώθηκε σε περίπου 20%, ενώ η παρόμοια με θρυψίνη δραστικότητα δεν ήταν σημαντικά διαφορετική (Σχ. 5D). Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι οι πολιτισμοί σφαίρα όγκου πνεύμονα έχουν χαμηλότερα 26S πρωτεασώματος δράση από μονοστρωματικές καλλιέργειες.

Α. κασπάση-όπως, Β τύπου χυμοθρυψίνης, και C. παρόμοια με θρυψίνη ενεργότητα του μονοστρωματική καλλιέργεια και σφαίρες όγκου από Α549 και κύτταρα Η1299 ήταν measued επί τους υποδεικνυόμενους χρόνους. ανάλυση σημείο Δ End (120 λεπτά) του 26S πρωτεασώματος δραστηριοτήτων σε καλλιέργειες μονοστιβάδας και σφαίρες όγκου. Μέση ± SD σχεδιάζεται και προέρχεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Μαθητή ζεύγη, και δύο-tailed t-τεστ έγιναν, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 και *** ρ & lt? 0.001 (τρεις επαναλήψεις ανά πείραμα)

Η

πνεύμονα σφαίρες όγκου. είναι εμπλουτισμένα με κύτταρα με χαμηλή ενεργότητα του πρωτεασώματος

υποβάθμιση του πρωτεασώματος των περισσότερων πρωτεϊνών πρέπει πρώτα να περάσουν από την πανταχού παρόντες δρόμους πριν υποβαθμίζονται από την πρωτεασώματος. Ωστόσο, αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης (ODC) είναι ένα καλά-χαρακτηριζόμενη κυτταρική πρωτεΐνη που υπόκεινται σε ουβικιτίνης ανεξάρτητα αποικοδόμηση του πρωτεασώματος, και μία φορά αναγνωρίζεται από 26S πρωτεασώματος, οδηγεί σε άμεση αποικοδόμηση των πρωτεϊνών που [21] περιέχει. Ρετροϊού που εκφράζουν ZsGreen-cODC (δηλ σύντηξη μιας φθορίζουσας πρωτεΐνης ZsGreen, και το Ο-άκρο του ποντικού αποκαρβοξυλάσης ορνιθίνης (cODC) degron) επιτρέπει την επισήμανση των κυττάρων με μειωμένη δραστηριότητα του πρωτεασώματος 26S λόγω του φθορισμού ZsGreen. Αυτό έχει προηγουμένως αναφερθεί για την παρακολούθηση CICs σε γλοίωμα και του μαστού

in vitro

με βάση την ικανότητά του για την επισήμανση ζώντα κύτταρα με χαμηλή δραστηριότητα του πρωτεασώματος 26S [21]. Για να επιβεβαιωθεί ότι η σφαίρα καρκινικά κύτταρα εμπλουτίζονται για τα ΚΕΠ του πνεύμονα, έχουμε μολυνθεί Α549 και Η1299 κυττάρων με τα εκφράζουν ρετροϊό ZsGreen-cODC. Παρατηρήσαμε ότι οι καλλιέργειες μονοστοιβάδας Α549 και Η1299 παρουσίασαν χαμηλό φθορισμό φόντου σε περισσότερο από το 98% των κυττάρων, και μόνο πολύ λίγα κύτταρα (2%) έδειξαν υψηλά επίπεδα ZsGreen (Σχ. 6Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον, σφαίρες όγκου του πνεύμονα προέρχεται από ZsGreen-cODC μολυνθεί Α549 και κύτταρα Η1299 είχαν σημαντικά εμπλουτισμένη για ZsGreen-θετικών κυττάρων, υποδεικνύοντας χαμηλή ενεργότητα του πρωτεασώματος και έτσι μια πολύ εμπλουτισμένη πηγή για ΚΕΠ (Εικ. 6Β). Για την περαιτέρω επιβεβαιώνουν ότι οι ΚΕΠ εμπλουτίζονται στον πληθυσμό με χαμηλή δραστηριότητα πρωτεασώματος, ZsGreen-θετικά και -αρνητικοί κύτταρα επίσης ταξινομούνται σε πλάκα 96 φρεατίων, και ο αριθμός των σφαιρών που σχηματίζεται από 100 ταξινομημένα κύτταρα μετρήθηκαν, ZsGreen-θετικά κύτταρα από τόσο Α549 και κυτταρικές σειρές Η1299 είχαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη ικανότητα σχηματισμού σφαίρας σε σχέση με τις ZsGreen-αρνητικά κύτταρα (Fig.6C).

Α. Συχνότητα των κυττάρων ZsGreen στο Α549 και καλλιέργειες μονοστοιβάδας Η1299. B. Η συχνότητα των κυττάρων ZsGreen στο Α549 και H12199 που προέρχονται από τις σφαίρες του όγκου με τη συσσώρευση των ZsGreen-cODC, και ως εκ τούτου χαμηλή δραστηριότητα του πρωτεασώματος ενδείκνυται. C. Αριθμός σφαιρών που σχηματίζεται από το ZsGreen θετικά και τα αρνητικά κύτταρα ZsGreen μετά τη διαλογή με κυτταρομετρία ροής σε πλάκες 96 φρεατίων. ZsGree-θετικά και -αρνητικοί κύτταρα ταξινομήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων (100 κύτταρα /φρεάτιο), μετά καλλιεργήθηκαν σε μέσα σφαίρα όγκου για 2 εβδομάδες? μετρήθηκε αριθμός των σχηματίζονται σφαίρες. Μαθητή ζεύγη, και πραγματοποιήθηκαν δύο-tailed t-tests, *** p & lt? 0.001 (τρεις επαναλήψεις ανά πείραμα)

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε. ότι: 1) σε συμφωνία με προηγούμενες αποδείξεις [11], CSC κύτταρα που μοιάζουν υπάρχουν στον καρκίνο του πνεύμονα? 2) τόσο SP και κύτταρα NSP σχηματίζουν σφαίρες όγκου με την ίδια συχνότητα που υποδεικνύει την ύπαρξη της αυτο-ανανέωσης CSC-όπως τα κύτταρα σε δύο πληθυσμούς? 3) των πνευμόνων CSC-όπως τα κύτταρα μπορούν να πολλαπλασιάζονται σε μέσα ελεύθερα ορού? και 4) χαμηλή ενεργότητα του πρωτεασώματος 26S συνδέεται με πνευμονική CSC-όπως τα κύτταρα. Η υπόθεση του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων προβλέπει ότι το κλάσμα SP θα πρέπει να είναι σε θέση να αναγεννηθούν τόσο το SP και κλάσματα NSP ενώ το κλάσμα NSP θα πρέπει να είναι σε θέση να αναγεννά το ίδιο [28] μόνο. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ καταδεικνύουν ότι τόσο η SP και τα κλάσματα NSP έχουν την ικανότητα να αναγεννηθούν πλήρως και τις δύο κλάσματα. Η ίδια διαπίστωση έχει επίσης παρατηρηθεί σε κυτταρικές σειρές γλοιώματος και ϋΑΟΥ μυελοβλάστωμα C6 όπου και οι δύο κλάσματα ήταν ικανά επανασύστασης του γονικού κυτταρικού πληθυσμού [16], [33]. Στην παρούσα μελέτη, τα κύτταρα SP εμφανίζεται όγκου σφαίρα-όπως ανάπτυξη, την κλασική

in vitro

προσδιορισμό του δυναμικού αυτο-ανανέωση, επιβεβαιώνοντας έτσι προηγούμενα ευρήματα ότι τα κύτταρα SP εμφανίζουν δραστηριότητα στελέχους-όπως [34]. Ωστόσο, τα κύτταρα NSP ήταν επίσης σε θέση να σχηματίσουν σφαίρες όγκου σε μία συχνότητα συγκρίσιμη με εκείνη των κυττάρων SP.

CD133 (ανθρώπινο προμινίνη-1), ένα πέντε διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη τομέα, ταυτοποιήθηκε αρχικά ως παρόν αντιγόνο κυτταρικής επιφάνειας για CD34

+ αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Πρόσφατα, CD133 δείχθηκε ως υποθετικό δείκτη επιφάνεια των καρκινικών βλαστικών κυττάρων σε πολλούς συμπαγείς όγκους, όπως εγκεφαλικού όγκου [35], του καρκίνου του προστάτη [36], ο καρκίνος του παχέος εντέρου [8], τον καρκίνο των ωοθηκών [37] και τον καρκίνο του πνεύμονα [11] . Η εξαιρετικά χαμηλή αφθονία CD133

+ ή Oct3 /4

+ κυττάρων σε όγκους, καθιστά δύσκολη την απομόνωση αυτών των πληθυσμών. Στη μελέτη μας δείχνει ότι ο εμπλουτισμός των CD133

+ /Οκτώβριος 3/4

+ κύτταρα από

in vitro

καλλιέργειας χωρίς ορό είναι δυνατόν.

Είναι γνωστό εδώ και καιρό ότι δεν είναι κάθε καρκινικό κύτταρο είναι ένα καρκινικό κύτταρο-κίνηση, και έτσι τα εκατομμύρια των καρκινικών κυττάρων είναι συχνά υποχρεωμένοι να μεταμοσχεύσει ένα νέο όγκου από ένα υπάρχον. Στην παρούσα μελέτη, ξενομοσχεύματος ανάπτυξη όγκου σε γυμνά ποντίκια εμφανίστηκαν με ένεση των κυττάρων του όγκου σφαίρας 10000, αλλά όχι από την έγχυση ίσο αριθμό κυττάρων μονοστοιβάδας. Αυτοί οι όγκοι είχαν μεγάλους πυρήνες με εξέχοντα πυρήνια και πυρηνική χρώση των β-κατενίνης, υποδεικνύοντας πιθανή ενεργοποίηση της Wnt μονοπατιού. Πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης [38] έχει αποδειχθεί ότι παίζουν ένα ρόλο στον έλεγχο των βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση [31], [39].

χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως η σισπλατίνη και ιφοσφαμίδη [19], είναι είναι γνωστό ότι σκοτώνουν το μεγαλύτερο μέρος των όγκων με τα κάτω ρύθμιση ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος εξαρτώμενη πρωτεόλυση [20]. Ωστόσο, έχουν επίσης οδηγήσει σε εξάπλωση των ΚΕΠ [18].