Αφηρημένο

Καρκίνος στόχευση γονιδίων-Viro-Θεραπεία (CTGVT) κατασκευάζεται με την εισαγωγή ενός γονιδίου αντικαρκινική σε έναν ογκολυτικό ιό (OV). Είναι στην πραγματικότητα ένα OV-γονιδιακή θεραπεία, η οποία έχει πολύ καλύτερη αντικαρκινική δράση από είτε γονιδιακή θεραπεία μόνη της ή ιοθεραπείας μόνη της σε προηγουμένως δημοσιευθέντα έγγραφα μας. Η μελέτη αυτή είναι μια τροποποίηση της CTGVT με την εισαγωγή ενός ορθοκολικού καρκίνου (CRC) ειδικό γονίδιο καταστολέα, ST13, σε δεδομένη ογκολυτική ιό CRC, το Ad · CEA · Ε1Α (Δ24), για την κατασκευή του Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) για την αύξηση της τροπισμό στόχευση σε καρκίνο του παχέος εντέρου και ήταν εν συντομία ονομάζονται ως CTGVT-CRC. Αν και πολλές μελέτες για το γονίδιο υποκινητή και ST13 CEA έχουν αναφερθεί, αλλά δεν κατασκεύασμα έχει γίνει να συνδυάσει και τα δύο σαν μια νέα στρατηγική για καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) ειδική θεραπεία. Εκτός από την εξειδίκευση CRC, η αντικαρκινική δράση του Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) ήταν επίσης εξαιρετική και πήρε σχεδόν πλήρη αναστολή (όχι εκρίζωση) του CRC ξενομοσχεύματος αφού ST13 ήταν ένα αποτελεσματικό γονίδιο κατά του όγκου με μικρότερη τοξικότητα, και μια κινεζική πατέντα (Νο 201110319434,4) ήταν διαθέσιμο για αυτή τη μελέτη. Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) προκάλεσε την απόπτωση των κυττάρων μέσω της p38 MAPK (δηλαδή P38), η οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω την έκφραση CHOP και ATF2. Το μιτοχονδριακό φαρμακούχων μονοπάτι της απόπτωσης ενεργοποιήθηκε από την αύξηση της κασπάσης 9 και της κασπάσης 3 έκφραση

Παράθεση:. Zhou Χ, Xie G, Wang S, Wang Υ, Zhang K, Zheng S, et al. (2012) ισχυροί και ειδικοί Αντικαρκινική Δράση για τον καρκίνο του παχέος εντέρου από CEA και Rb διπλό Ρυθμιζόμενη Oncolytic αδενοϊό υπόθαλψη

ST13

Gene. PLoS ONE 7 (10): e47566. doi: 10.1371 /journal.pone.0047566

Επιμέλεια: Zhaozhong Χαν, του Πανεπιστημίου Vanderbilt, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 22, 2012? Αποδεκτές: 18η Σεπτεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 15 Οκτωβρίου 2012

Copyright: © Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα για την Επιστήμη της Zhejiang Sci-Tech University (ZSTU) κάτω από Grant Νο 1016834-Y, το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (973 Program) (Αρ 2010CB529901, Νο 2011CB510104), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών του Κίνα (81172449), το σημαντικό Εθνικό Επιστημονικό & amp? Τεχνολογία συγκεκριμένο έργο της ηπατίτιδας και Ηπατώματος σχετικό πρόγραμμα (2008ZX10002-023), και το νέο πρόγραμμα καινοτομίας (2009-ZX-09102 – 246). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια σημαντική παγκόσμια ανησυχία για τη δημόσια υγεία. Ένα σύνολο των 1.529.560 νέες περιπτώσεις καρκίνου και 569.490 θάνατοι από καρκίνο συνέβη στις Ηνωμένες Πολιτείες μόνο το 2010 [1]. Καρκίνο του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη μεγαλύτερη αιτία θανάτου στις ΗΠΑ και είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και η τρίτη πιο κοινός καρκίνος στις γυναίκες παγκοσμίως [2]. Έτσι, είναι σημαντικό για τους επιστήμονες και γιατροί να αναπτυχθούν νέες στρατηγικές για την θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Μια στρατηγική που ξεκίνησε από εμάς το 1999 έως το 2011, ονομάζεται Καρκίνος στόχευσης γονιδίων-Viro-Θεραπεία (CTGVT), περιλαμβάνει την εισαγωγή ενός αντικαρκινικού γονιδίου σε έναν ογκολυτικό ιό (OV) [3], [4]. Είναι στην πραγματικότητα ένα OV-γονιδιακή θεραπεία. Η CTGVT (OV-γονίδιο) έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση, η οποία είναι το αποτέλεσμα των εισηγμένων γονιδίων που πρόκειται να αναπαραχθεί αρκετές εκατοντάδες φορές-μαζί με την αντιγραφή του ιού ογκολυτικού σε καρκινικά κύτταρα [5]. Συνήθως, η σειρά των αντικαρκινική δράση είναι καλύτερη από CTGVT (OV-γονίδιο) σε σχέση με την επίδραση από OV και Ad-γονιδίου. Έχουμε αφιερωθεί για να μελετήσει τη στρατηγική CTGVT (OV-γονίδιο) για πάνω από 10 χρόνια και δημοσιεύθηκε περίπου 70 σχετικά έγγραφα, η οποία έδειξε πάντα πολύ υψηλότερη αντικαρκινική δράση από εκείνη του Ad-γονιδίου [6], [7], [8]. Η CTGVT (OV-γονίδιο) είναι επίκαιρη γίνει ένα καυτό θέμα από την Amgen καταβάλλονται 1 δισεκατομμύριο δολάρια για να αγοράσει το OncoHSV-GM-CSF (Ον από Herpes Simplex Virus) από BioVex [9] και η OncoPox-GM-CSF έχει δημοσιευθεί στην φύση, 2011 [10].

παχέος ογκογένεση είναι μια περίπλοκη διαδικασία που οδηγείται από πολλαπλά γονίδια και περιλαμβάνει πολλά βήματα. Προηγούμενη έρευνα έχει δείξει ότι

ras

γονιδιακές μεταλλάξεις? διαγραφές σε χρωμοσώματα 5q, 17q και 18q?

neu, c-myc,

ή

c-myb

ενισχύσεις? και αναδιατάξεις του

trk

ογκογονίδιο ενεπλάκησαν σε όγκους παχέος εντέρου [11]. Ωστόσο, αυτές οι μοριακές αλλαγές δεν θα μπορούσε να εξηγήσει πλήρως την όλη διαδικασία του παχέος ογκογένεσης. Το 1993, Zheng

et al

. εντόπισαν παχέος γονίδιο σχετίζονται με τον καρκίνο, η οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του παχέος εντέρου, που ονομάζεται καταστολή της ογκογονικότητας 13 (ST13) (GenBank αριθμός πρόσβασης Νο HSU17714), που κλωνοποιήθηκε με αφαιρετική διαλογή υβριδισμού μεταξύ του cDNA των φυσιολογικών βλεννογόνων ιστών και του mRNA του ορθοκολικού καρκινώματος ιστούς [12], [13], [14], [15]. Έτσι, ST13 ήταν ένα υποψήφιο γονίδιο καταστολής όγκων που εμπλέκονται στην ορθοκολικό καρκίνωμα [16], [17]. Η αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης ST13 θα μπορούσε να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση των ορθοκολικού κυτταρικές σειρές. Προηγούμενη έρευνα μας επαλήθευσε ότι η χρήση του ZD55-ST13 (α ογκολυτική αδενοϊός διαγραφή Ε1 Β 55kDa) οδήγησε σε μια 100-πλάσια ανασταλτική επίδραση για την ανάπτυξη των κυττάρων όγκου σε σύγκριση με Ad-ST13

in vitro,

και ZD55-ST13 επίσης εξασκείται μια ισχυρή αντικαρκινική δράση σε ένα SW620 ξενομοσχεύματος ζωικό μοντέλο ορθοκολικού καρκινώματος [18]. Η βελτιωμένη αντικαρκινική αποτελεσματικότητα του άλλου ογκολυτικού κατασκευή αδενοϊού SG500-ST13 πάνω SG500 ήταν εμφανής από πειράματα που χρησιμοποιούν τις κυτταρικές γραμμές SW620 HCT116 και

in vitro

, καθώς και την εφαρμογή του μοντέλου ξενομοσχεύματος HCT116

in vivo

[19]. Σε όλα τα παραπάνω έρευνα ST13, δεν υπάρχει εργασία χρησιμοποιώντας το τύπο του κυττάρου ειδικού προαγωγού CEA για να οδηγήσει την έκφραση Ε1Α (Δ24) για τον έλεγχο επιλεκτικού αναδιπλασιασμού του ιού για περαιτέρω ειδική θεραπεία CRC.

καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη όγκου, ειδικά στην επιτήρηση των ασθενών καρκίνου του παχέος εντέρου [20]. Πρόσφατα πειράματα έδειξαν ότι το CEA μπορεί να λειτουργεί ως μόριο προσκόλλησης κυττάρου που θα μπορούσε να παίξει έναν σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης και πιθανώς κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου [21]. Schrewe H

κ.ά.

., Βρήκαν ότι ένα κατασκεύασμα υποκινητή του γονιδίου CEA αποδειχθεί αντικαρκινική δραστηριότητα που ήταν εννέα φορές μεγαλύτερη έναντι του CEA που παράγει κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος SW403 από το μη-CEA-κυτταρική γραμμή που παράγει HeLa [20]. Ο προαγωγός CEA συζευγμένο με το κινάσης θυμιδίνης του ιού του απλού έρπητα (HSV-tk), φάνηκε να ρυθμίζουν προς τα πάνω επιλεκτικά την έκφραση του HSK-tk στο CEA που εκφράζει παγκρεατικού κυτταρική γραμμή καρκινώματος BxPC3, η οποία οδήγησε στην αντικαρκινική δράση [22]. AdCEAp /Rep, στα οποία η έκφραση Ε1Α οδηγήθηκε από τον προαγωγό CEA, ανέστειλαν αποτελεσματικά πολλαπλές μεταστάσεις ήπατος του CEA-θετικού καρκίνου του παχέος εντέρου M7609 σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος [23].

Σε αυτή τη μελέτη, εισήχθη γονίδιο ST13 σε έναν ογκολυτικού Ad φορέα ιικού · CEA · Ε1Α (Δ24), που εφαρμόζεται CEA υποκινητή για τον έλεγχο της έκφρασης Ε1Α με 24 bp διαγραφή στην περιοχή Ε1Α υπεύθυνη για τη δέσμευση ρετινοβλάστωμα πρωτεΐνη (Rb) και την αντιγραφή του και αυτό το κατασκεύασμα αναφέρεται ως Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) (το ST13 στην παρένθεση αντιπροσωπεύει μια κασέτα έκφρασης). Αυτό είναι μία τροποποίηση της CTGVT με CRC συγκεκριμένες Cancer Gene Στόχευση-Viro-Θεραπεία (εν συντομία CTGVT-CRC), η οποία αποτελεί μία νέα στρατηγική που δεν έχει προηγουμένως αναφερθεί. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η αντικαρκινική του Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) ήταν υψηλότερο από εκείνο του Ad · (EGFP) CEA · Ε1Α (Δ24), περαιτέρω υψηλότερη από εκείνη του ΟΝΥΧ-015

in vitro

και

in vivo

. Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) κατεργασία ανέστειλε σημαντικά αλλά δεν έχουν εξαλειφθεί πλήρως την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων SW620 καρκινωμάτων του παχέος σε γυμνά ποντίκια, και ο χρόνος επιβίωσης ήταν δραματικά βελτιωθεί χωρίς ένα γυμνό θάνατος ποντικούς στην Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) αντιμετωπίζονται ομάδα. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν μια νέα αντίληψη για την κλινική καρκίνο του παχέος εντέρου-ειδική θεραπεία και ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας έχει εφαρμοστεί [201,110,319,434.4].

Υλικά και Μέθοδοι

πλασμίδια, ιούς και Αντιδραστήρια

Η διάνυσμα pMD18-T αγοράστηκε από TaKaRa, Ltd., και το πλασμίδιο pBHGE3 αγοράστηκε από Microbix Biosystem Inc. (Toronto). Το μαξιλάρι · Ε1Α (Δ24), pMD18-T Απλή-HCMV-MCS-polyA (SV40) και pXC2-ΟΕΑ πλασμιδίων είχαν προηγουμένως κατασκευάστηκε από την ομάδα μας. Η pCA13-ST13, ΟΝΥΧ-015 και ιούς Ad-WT διατηρήθηκαν στο εργαστήριο μας.

Α. Σχηματική κατασκευή της διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) και διαφήμισης · ​​(EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24). Η μητρική

Ε1Α

προαγωγός αντικαταστάθηκε από τον προαγωγό CEA για τον έλεγχο της έκφρασης του

Ε1Α

γονίδιο με ένα 24-bp διαγραφή. Μια ST13 ή EGFP κασέτα έκφρασης υπό τον έλεγχο του υποκινητή hCMV εισήχθη μεταξύ της αλληλουχίας σήματος συσκευασίας ψ και το γονίδιο Ε1Α. B. Προσδιορισμός του γονιδίου CEA υποκινητή και ST13 σε pAd · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) με PCR. Λωρίδα Μ: DL2000 Marker? Διαδρομή 1: CEA προαγωγός? Διαδρομή 2: γονίδιο ST13. Γ Ανίχνευση Ε1Α (Δ24) και τα επίπεδα έκφρασης ST13 όταν τα κύτταρα SW620 μολύνθηκαν με Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) ή το τυπικό ογκολυτικού ιό ONYX- 015 σε ΜΟΙ 5 για 48 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη για την ανίχνευση Ε1Α (Δ24) και πρωτεΐνη ST13 επίπεδα.

Η

Αντισώματα έναντι της κασπάσης-3, κασπάσης-9, Fas, Bcl-XL, CHOP, Ε1Α, ρ38, Phospho-ρ38 ΜΑΡ κινάση, ATF-2 και φωσφο-ATF-2 αγοράσθηκαν από την Cell Signaling Technology, Inc. Οι ΡΑΚΡ-1/2 και β-ακτίνης αντισώματα ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), αντι-ST13 και αντι-Ηεχοη αντισώματα αγοράστηκαν από Epitomic, και ο αντι-ποντικού IgG και γαϊδάρου IRDye® 680 αντι-κουνελιού IgG IRDye® 680 γάιδαρος αγοράστηκαν από LI-COR.

η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων που έχουν μολυνθεί με διαφορετικά ΜΟΙ των διαφόρων ογκολυτικού αδενοϊούς. Τρεις CRC κυτταρικές γραμμές όγκου (SW620, HCT116 και ΗΤ29) και τρεις κυτταρικές γραμμές CEA-αρνητικό (Bcap37 καρκίνο του μαστού, καρκίνωμα CNE Nasopharynageal και HeLa αυχενικού καρκινώματος) και δύο φυσιολογικά κύτταρα (QSG7701 και WI38) μολύνθηκαν με είτε Ad · (ST13 ) · CEA · Ε1Α (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24), ή το τυπικό ογκολυτική ιός ΟΝΥΧ-015 σε μία περιοχή ΜΟΙ (0,1, 1, 5 ή 10 ΜΟΙ), 4 ημέρες, κύτταρο βιωσιμότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. Μη μολυσμένα κύτταρα θεωρήθηκαν ότι είναι 100% βιώσιμα. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD (η = 6). B. Η επίδραση της ιικής μόλυνσης επί της βιωσιμότητας των κυττάρων σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Τρεις θετικές κυτταρικές σειρές CEA (SW620, HCT116, και ΗΤ29) και τρεις CEA-αρνητικές κυτταρικές γραμμές (Bcap37, CNE και HeLa) και δύο φυσιολογικά κύτταρα (QSG7701 και WI38) μολύνθηκαν είτε με ΟΝΥΧ-015, Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24), ή Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) σε ΜΟΙ 10. Μετά από 24, 48, 72, και 96 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD πειραμάτων εις τριπλούν. C. Η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων που έχουν μολυνθεί με διαφορετικά ΜΟΙ του Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24). CEA-αρνητικό καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή (Colo-320) και CEA-θετικού μη κόλου κυτταρική σειρά καρκίνου (Α549, MCF-7) μολύνθηκαν με Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) σε ένα εύρος ΜΟΙ ( 0,1, 1, 5 ή 10 ΜΟΙ), 3 ημέρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό ΜΤΤ. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD (η = 6).

Η

Κατασκευή διαφορετικών ανασυνδυασμένων adenovirusesThe CEA υποκινητή από pXC2-CEA υποκλωνοποιήθηκε σε pAd · Ε1Α (Δ24) για να σχηματίσει pAd · CEA · Ε1Α (Δ24 ) που φέρει το γονίδιο αδενοϊό ορότυπο 5 Ε1Α με 24 bp διαγραφή από 923 bp έως 946 bp. Ολόκληρη η κασέτα έκφρασης ST13 περαιτέρω εισάγεται εντός pAd · CEA · Ε1Α (Δ24) για να σχηματίσει pAd · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24). Η μέθοδος κατασκευής για την παραγωγή των πελμάτων · (EGFP) CEA · Ε1Α (Δ24) ήταν παρόμοια με εκείνη για την PAD · (ST13) CEA · Ε1Α (Δ24)

. Η αλληλουχία εκάστου των κατασκευασμάτων πλασμιδίου επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας πέψη με περιοριστικά ένζυμα, PCR και DNA αλληλούχηση. Η ογκολυτικούς ιούς Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) και διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) δημιουργήθηκαν με ομόλογο ανασυνδυασμό του πέλματος · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) ή ένα μαξιλάρι · ( ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) με το πλασμίδιο πακεταρίσματος αδενοϊού pBHGE3 (Microbix Biosystem) σε κύτταρα ΗΕΚ293 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο μορφομετατροπής Effectene (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε ανασυνδυασμένος αδενοϊός επιλέχθηκε μετά από τρεις κύκλους καθαρισμού πλάκας σε κύτταρα ΗΕΚ293 και επισημαίνονται ξεχωριστά με PCR. Ο τελικός καθαρισμός του ιού διεξήχθη με φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας χλωριούχου καισίου.

Μορφολογικές παρατηρήσεις των καρκινικών κυττάρων και φυσιολογικών κυττάρων μολυσμένα με τις διάφορες ογκολυτική αδενοϊοί όπως ανιχνεύεται με μικροσκοπία. Τα κύτταρα μολύνθηκαν σε ένα ΜΟΙ των 10, και οι μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία μετά από 72 ώρες από την μόλυνση. B. Ανίχνευση απόπτωσης σε κύτταρα SW620 με FACS. κύτταρα SW620 μολύνθηκαν είτε με ΟΝΥΧ-015, Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) ή Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) σε ΜΟΙ 10. Στις 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίζονται με αννεξίνη V-FITC (για πρώιμου σταδίου απόπτωση) ή ΡΙ (για προχωρημένου σταδίου απόπτωση) και εξετάστηκαν με κυτταρομετρία ροής. C. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cell Quest. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως οι (ράβδοι σφάλματος) μέση τιμή ± SD πειραμάτων εις τριπλούν. (** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.001)

Η

Γραμμές Κυττάρων και Cell Culture

ΗΕΚ293 (ανθρώπινη εμβρυϊκή σειρά νεφρού) κύτταρα, Α549 (ανθρώπινου πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα. γραμμή), Colo-320 (ανθρώπινου κόλου κυτταρική σειρά καρκίνου), και MCF-7 (ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). HeLa (κυτταρική σειρά ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος), κύτταρα SW620, ΗΤ29 και HCT116 (ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές), WI38 (ανθρώπινη φυσιολογική κυτταρική σειρά εμβρυϊκών πνευμονικών ινοβλαστών), και QSG-7701 (ανθρώπινη φυσιολογική κυτταρική σειρά του ήπατος) αγοράστηκαν από το κύτταρο Τράπεζα στο Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). SW620 κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο κατά Dulbecco Eagle του Dulbecco (ϋΜΕΜ, GIBCO BRL, Grand Island, ΝΥ) που έχει συμπληρωθεί με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS), 4 mM γλουταμίνη, πενικιλλίνη (100 U /mL), και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL). Όλες οι άλλες κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλες οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή. Κύτταρα σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα.

SW620 κυττάρων με κηλίδα western. κύτταρα SW620 μολύνθηκαν είτε με ΟΝΥΧ-015, Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) ή Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) σε ΜΟΙ 5, για 48 ώρες, οι απόπτωση που σχετίζονται με πρωτεΐνες αναλύθηκαν με western blot.

η

Western blot Ανάλυση

για να διερευνήσουν περαιτέρω τις μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται για το θάνατο των κυττάρων που προκαλείται από τον ανασυνδυασμένο αδενοϊό, αναλύσεις κηλίδος Western εκτελέστηκαν. SW620 και HCT116 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

5 ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα, και μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς τον ιό επί 48 ώρες. Αμφότερα τα προσκολλημένα και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [62.5 mM Tris-HCl (ρΗ 6.8), 2% δωδεκυλο θειικό νάτριο (SDS), 10 mM γλυκερίνη, και 1,55% διθειοθρεϊτόλη]. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα δικινχονινικού οξέος (BCA) κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Thermo Scientific, Rockford, USA). Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη (NC) μεμβράνες. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα και τα κατάλληλα δευτερογενή φθορίζοντα αντισώματα. Ανοσοανίχνευση έγινε ορατή χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υπέρυθρης απεικόνισης Οδύσσεια (LI-COR Biosciences Inc, Αμερική).

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Τα κύτταρα διανεμήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και έλαβαν θεραπεία είτε με ΟΝΥΧ-015, διαφήμισης · ​​(EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24), ή ad (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) στις αναφερόμενες ΜΟΙ και χρονικά σημεία. Μία δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπεία με τις διάφορες αδενοϊούς. Τέσσερις ώρες πριν από το τέλος της επώασης, 20 μL του διαλύματος ΜΤΤ (5,0 mg /mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Οι προκύπτοντες κρύσταλλοι διαλύθηκαν με 150 μL DMSO /φρεάτιο με ανάδευση για 10 λεπτά. Η οπτική πυκνότητα (O.D.) μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας DNA (GENIOS μοντέλο? Tecan, Μάνερντορφ, Ελβετία). Το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:% επιβίωση των κυττάρων = (τιμή απορρόφησης των επεξεργασμένων κυττάρων /τιμή απορρόφησης των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου) χ 100%. Έξι όμοια δείγματα αξιολογήθηκαν για κάθε συγκέντρωση.

Οι όγκοι καθορίστηκαν με ένεση SW620 κύτταρα υποδορίως στην δεξιά πλευρά γυμνών ποντικών. Όταν οι όγκοι έφθασαν 100-130 mm

3, οι ποντικοί διαιρέθηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (η = 8) και υπέστησαν αγωγή ημερησίως με διαδοχικές ενέσεις εντός του όγκου τέσσερις φορές του ΟΝΥΧ-015, Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α ( Δ24) ή διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) σε 5 × 10

8 PFU /ημέρα και PBS. A. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: όγκος του όγκου (mm

3) = 0,5 × μήκος × πλάτος

2. B. Η καμπύλη επιβίωσης για τα ζώα κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD (ράβδοι σφάλματος). Μια δοκιμασία log-rank έχει χρησιμοποιηθεί για να αναλύσει τα ποσοστά επιβίωσης στις διαφορετικές ομάδες. Στατιστική σημαντικότητα: α, ρ & lt? 0.001, σε σύγκριση με το PBS? b, p & lt? 0,01, σε σύγκριση με ONYX015? c, p & lt? 0,05, σε σύγκριση με το Ad * (EGFP) * CEA * Ε1Α (Δ24). C. Ηεχοη και έκφραση ST13

in vivo.

Τομές όγκων που προέρχονται από PBS-ή διαφορετικών φαρμάκων αδενοϊό αγωγή 4 ημέρες αναλύθηκαν για Ηεχοη και έκφραση ST13 με ανοσοϊστοχημεία. Πρωτότυπη μεγέθυνση 400χ.

Η

Flow Cytometry Ανάλυση

Ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα SW620 σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

5 ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή. Μετά από ολονύκτια καλλιέργεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με ΟΝΥΧ-015 ή Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) σε ΜΟΙ 5. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την αγωγή. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ανεξίνη V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης, όπως περιγράφεται στην αννεξίνη V-FITC πρωτόκολλο κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (BioVision, Palo Alto, CA). Μετά τη χρώση, τα κύτταρα αναλύθηκαν για απόπτωση χρησιμοποίηση ενεργοποιημένης με φθορισμό κυτταρικής διαλογής. (FACS? Becton Dickinson)

Δήλωση Ηθικής και ζώων Πείραμα

Αρσενικά BALB /c γυμνά ποντίκια (4-εβδομάδα- παλιά) διατηρήθηκαν και χρησιμοποιείται σε ένα ελαφρύ και ελεγχόμενη θερμοκρασία δωματίου σε ένα AAALAC διαπιστευμένο εγκατάσταση, και με δεδομένο το νερό και εργαστηριακή τροφή

κατά βούληση.

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση της Σαγκάης Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας στο πλαίσιο του πρωτοκόλλου IBCB-SPF0029. Ξενομοσχεύτηκε ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπο σύστημα για τη μελέτη των κυτταροτοξικών επιδράσεων κυττάρων SW620 (Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα)

in vivo

. κύτταρα SW620 (5 × 10

6/100 μί) εγχύθηκαν υποδορίως στο δεξί πλευρό θηλυκών γυμνών ποντικών για τη δημιουργία του μοντέλου ξενομοσχεύματος όγκου χαμηλότερα. Ο όγκος του όγκου (V), η οποία βασίζεται σε μετρήσεις πάχους, υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο V (mm

3) = μήκος (mm) χ πλάτος (mm)

2/2. Αφού οι όγκοι έφτασαν 100 έως 130 mm

3 σε μέγεθος, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ελέγχου και θεραπείας (n = 8). Οι ομάδες θεραπείας χορηγήθηκαν εντός του όγκου στις διαδοχικές ημερήσιες δόσεις των 5 × 10

8 μονάδες σχηματισμού πλάκας (PFU) /100 μL είτε ΟΝΥΧ-015, διαφήμισης · ​​(EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24), Ad ( ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) για τέσσερις ημέρες. Η ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαδοχικές εντός του όγκου εγχύσεις τέσσερις φορές με τον ίδιο όγκο του PBS

τμήματα όγκου HCT116 CRC αναλύθηκαν για νέκρωση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η &? Ε). Κηλίδωση, για απόπτωση με TdT μεσολάβηση dUTP nick-βιοτίνη-άκρο επισήμανση (TUNEL), και για μορφολογική παρατηρήσεις ηλεκτρονικό μικροσκόπιο ανάλυση (ΤΕΜ). (Β1), απόπτωση σε κύτταρα όγκου. (Β2), Για λόγους σαφήνειας, ένα ενιαίο όγκου παρατηρήθηκε για την απόπτωση.

Η

Ανοσοϊστοχημική και ιστοπαθολογική Πειράματα

Για την ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση, δύο ποντίκια ανά ομάδα επιλέχθηκαν τυχαία 4 ημέρες μετά την ιική διαχείριση. Υπό άσηπτες συνθήκες, οι ιστοί του όγκου συλλέχθηκαν και κόπηκαν σε τεμάχια περίπου 1 κυβικό χιλιοστό σε μέγεθος. Το φρέσκο ​​ιστός αμέσως εμβαπτίζεται σε 4% παραφορμαλδεΰδη, όπου κρατήθηκε για 48 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια ενσωματώνονται σε παραφίνη. Στη συνέχεια, τα δείγματα κόπηκαν σε 4-μm πάχους τομές. Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε με ένα αντι-αδενοϊικό hexon ή αντι-ST13 αντίσωμα (Biodesign International, Saco, ΜΕ) χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανοσοϊστοχημείας σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Επιπλέον, παθολογικές μεταβολές στον ιστό του όγκου εξετάστηκαν μετά αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε). Χρώση και χρώση TUNEL καθώς και δια μεταδόσεως ηλεκτρικής μικροσκοπία (ΤΕΜ)

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD και υπέστησαν επεξεργασία χρησιμοποιώντας το στατιστικό λογισμικό SPSS 10.1. Κάθε ποσοτική πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον τρεις φορές, και η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε για p ≤0.05.

Μετά διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) λοίμωξη, από τη μία πλευρά, η φωσφορυλιωμένη Ρ38, ATF2 και προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης CHOP ανιχνεύθηκαν. Από την άλλη πλευρά, δήμιος της κασπάσης-3 ενεργοποιήθηκε.

Η

Αποτελέσματα

Κατασκευή και Χαρακτηρισμός της διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24)

το Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) φορέας επιτυχώς κατασκευάστηκε με αντικατάσταση του φυσικού προαγωγού Ε1Α με τον καρκίνο του παχέος εντέρου-ειδικό προαγωγό CEA, διαγραφή 24 bp σε Ad · Ε1Α (923-946 bp) και φιλοξενούν την αντικαρκινική ST13 γονίδιο, όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α. Η ταυτοποίηση των ST13 και έκφραση CEA με PCR δείχθηκε στο Σχ. 1Β. Για τον προσδιορισμό της Ε1Α (Δ24) και έκφραση ST13 των διαφόρων ιών, η κυτταρική γραμμή CRC SW620 μολύνθηκε με είτε Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24), Ad · (EGFP) CEA · Ε1Α (Δ24), ή το τυπικό ογκολυτική ιός ΟΝΥΧ-015 σε ΜΟΙ 5. αναλύσεις κηλίδος Western χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση Ε1Α (Δ24) και πρωτεΐνη ST13. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) επάγεται φορέα ειδική έκφραση ST13 και η έκφραση μεγαλύτερη Ε1Α (Δ24) (Εικ. 1 C) σε ανιχνεύσιμες κύτταρα CRC.

CRC-ειδική κατά του όγκου επίδραση της διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24)

in vitro

Η

CEA-θετικές κυτταρικές σειρές CRC (SW620, HCT116, και ΗΤ29), και τρεις ΟΕΑ-αρνητικών καρκινικών κυττάρων γραμμές (μαστού καρκινική κυτταρική γραμμή Bcap37, Nasopharynageal καρκίνωμα CNE κυτταρική γραμμή και τραχηλικού καρκινώματος κυτταρική γραμμή HeLa) και δύο φυσιολογικές κυτταρικές σειρές (QSG7701 και WI38) μολύνθηκαν με είτε Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24), Ad · ( EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24), ή ΟΝΥΧ-015 στο υποδεικνυόμενο ΜΟΙ (0,1, 1, 5, ή 10). Μετά από 96 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η ογκολυτική επίδραση του Ad (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) αγωγή επέδειξε ανώτερη αντικαρκινική δράση από ό, τι η επεξεργασία με Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) ή ΟΝΥΧ-015 σε ΜΟΙ 5 ή 10. Επιπλέον, η αναστολή ήταν δοσοεξαρτώμενη. Η Bcap37, CNE και HeLa κύτταρα έδειξαν ένα χαμηλότερο επίπεδο αναστολής από τις τρεις κυτταρικές σειρές CRC, και δεν υπήρχε αναστολή στην QSG7701 ή WI38 κανονικές κυτταρικές γραμμές.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, μία χρονική πορεία για την θεραπεία με τους ανασυνδυασμένους ιούς ελέγχθηκε επίσης. Τα κύτταρα μολύνθηκαν είτε με Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) ή ΟΝΥΧ-015 σε ΜΟΙ 10 για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (24, 48, 72 , ή 96 h), και η κυτταρική βιωσιμότητα μετά τη μόλυνση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κυτταρική αναστολή ήταν εξαρτώμενη από το χρόνο. Η αντικαρκινική επίδραση παρακάτω αγγελία (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) της θεραπείας ήταν ανώτερη από εκείνη ακόλουθη διαφήμιση · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) και ΟΝΥΧ-015 θεραπείας σε κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν (Εικ. 2Β) . Μετά από 96 ώρες, η βιωσιμότητα της διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) μολυνθέντα κύτταρα μειώθηκε σημαντικά. Και πάλι η κυτταροτοξικότητα της Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) σε τρεις παχέος εντέρου έδειξε μεγαλύτερη αντικαρκινική δράση από ότι τριών CEA-αρνητικό καρκίνο, ενώ καμία κυτταροτοξικότητα σε δύο φυσιολογικά κύτταρα.

Αυτά τα αποτελέσματα ανέφερε ότι η διαφήμιση · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) που ασκείται μεγαλύτερη ειδική αντικαρκινική δράση σε τρεις ΟΕΑ-θετικού καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα από εκείνη των τριών CEA-αρνητικό καρκίνο.

για την περαιτέρω επιβεβαίωση αν η αντικαρκινική δράση της διαφήμισης (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) ήταν CEA-ειδικό ή του παχέος εντέρου-ειδικά, συγκρίναμε επίδρασή του στην CEA-αρνητικό καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά (Colo-320) και CEA-θετικό μη-καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά (Α549 , MCF-7), όπως φαίνεται στο Σχ. 3C. Τα ευρήματά μας πρότεινε ότι Ad (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) ήταν πιο συγκεκριμένος σε CEA-θετικών καρκινικών κυττάρων.

Μορφολογικές αλλαγές και απόπτωση που επάγεται από τη θεραπεία του ιού και δοκιμάστηκαν αλλαγές eytometryMorphological ροής στα κύτταρα όγκου και φυσιολογικών κύτταρα κατεργασμένα με διάφορους ιούς σε ΜΟΙ 10 μετά από 72 ώρες παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, ένα κυτταροπαθολογικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε στις ΟΕΑ-θετικού καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα μολυσμένα με είτε Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) ή ΟΝΥΧ-015 σε σύγκριση με το CEA-αρνητικά κύτταρα HeLa. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχαν περισσότερες σημαντικές μορφολογικές αλλαγές στο διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) καρκίνο-μολυσμένα κύτταρα από ό, τι στο διαφήμισης · ​​(EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) μολυνθέντα ή ΟΝΥΧ-015-μολυσμένα κύτταρα , όπως συρρίκνωση κυττάρου και της εμφάνισης των μικρών κυτταρικών θραυσμάτων. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκαν μορφολογικές αλλαγές στην κανονική QSG7701 ηπατική κυτταρική γραμμή. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω από τα αποτελέσματα των αναλύσεων ΜΤΤ.

Για να προσδιορίσετε αν η απόπτωση εμπλέκονται στη διαφήμιση · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) επαγόμενη κυτταρικό θάνατο, απόπτωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας. κύτταρα SW620 μολύνθηκαν είτε με ΟΝΥΧ-015 ή Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) σε ΜΟΙ 5 για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε χρώση αννεξίνης V για τον εντοπισμό και την απόπτωση ΡΙ χρώση πρώιμου σταδίου για τον προσδιορισμό τελικού σταδίου απόπτωσης με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, τα ποσοστά της διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) μολυνθέντα καρκινικά κύτταρα σε πρώιμο στάδιο και τελευταίο στάδιο της απόπτωσης ήταν 7,13% και 22,22%, αντίστοιχα. Τα ποσά των ποσοστών των κυττάρων για την πρώϊμη και όψιμη φάση απόπτωσης, τα οποία παρουσιάζονται στο Σχ. 3C, ήταν 29,35% για τη διαφήμισή · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24), 8,85% για το ΟΝΥΧ-015 και 3,9% για το mock-μολυσμένα κύτταρα. Τα στοιχεία αυτά αποκάλυψαν ότι διαφήμισης (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) της θεραπείας θα μπορούσε να προκαλέσει αποτελεσματικά τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων από ειδικά επαγωγή της απόπτωσης.

Η απόπτωση Εντοπίστηκε από κασπάσης Σχετικές Enzyms

Η απόπτωση είναι συνήθως συνοδεύεται από δραματικές αλλαγές στα επίπεδα των ενζύμων και πρωτεϊνών κασπάσης σχετίζονται. Προηγούμενη έρευνα είχε δείξει ότι η θεραπεία ZD55-ST13 απόπτωση που επάγεται μέσω της μιτοχονδριακής οδού [18]. Ως εκ τούτου, πολλές απόπτωση που σχετίζονται με πρωτεΐνες από τα κύτταρα SW620 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας στύπωμα Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, το επίπεδο του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-XL μειώθηκε, πράγμα που θα υποστηρίζουν τον ρόλο για μιτοχονδριακή απόπτωση. Επιπλέον, διασπασμένη κασπάση 9, διασπασμένη κασπάση-3 και η διάσπαση της PARP, ήταν όλα σημαντικά αυξημένη σε Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) μολυνθέντα κύτταρα. Ήταν σαφές ότι η διαφήμιση · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) της θεραπείας που προκαλείται απόπτωση πιο αποτελεσματικά από ότι η θεραπεία με είτε διαφήμισης · ​​(EGFP) CEA · Ε1Α (Δ24) ή ΟΝΥΧ-015.

Το p38 σήμα μεταγωγής μονοπάτι, μια που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της φλεγμονής, κυτταρική διαφοροποίηση, την κυτταρική ανάπτυξη και το θάνατο. Επιπλέον, ρ38 μετατρέπει επίσης σήματα προς άλλα κυτταρικά συστατικά για την εκτέλεση διαφόρων κυτταρικών αποκρίσεων. ΑΤΡ2, ένα υπόστρωμα για ρ38, μπορούν να σχηματίσουν ετεροδιμερή με τα μέλη της οικογένειας Ιούνιο παραγόντων μεταγραφής και μπορεί έτσι να συνδέσει απευθείας με τη θέση σύνδεσης του ΑΡ-1 [24]. CHOP, ένα μέλος της οικογένειας Ο /ΕΒΡ των παραγόντων μεταγραφής, επίσης αναφέρεται ως διακοπή αύξησης και βλάβη του DNA που επάγεται γονίδιο 153 (GADD153) και εμπλέκεται στην ρύθμιση της ανάπτυξης και διαφοροποίησης [25] κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, η έκφραση του φωσφορυλιωμένη ρ38 ήταν σημαντικά αυξημένη μετά Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α θεραπεία (Δ24). Εν τω μεταξύ, ενεργοποιημένη ρ38 αύξησε το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ATF2 και την έκφραση του CHOP. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ρ38 μπορεί να εμπλέκεται σε αποπτωτική παθολογική οδό που προκλήθηκε από την CRC ειδικό ογκολυτική αδενοϊό που φέρει ST13 (CTGVT-CRC). Τα παρόμοια αποτελέσματα σχετικά με πρωτεΐνες που σχετίζονται με την απόπτωση ανιχνεύθηκαν σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές HCT116. (Εικ. S1).

αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) σε γυμνούς ποντικούς

Το μοντέλο ξενομοσχεύματος SW620 για ανθρώπινη ορθοκολικούς όγκους ιδρύθηκε σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς να αξιολογήσει το δυναμικό αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24)

in vivo.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, οι όγκοι αναπτύχθηκαν ταχέως στην ομάδα αγωγής με PBS, ενώ παρατηρήθηκαν διάφορους βαθμούς καταστολής ανάπτυξης όγκου στο ΟΝΥΧ-015-, Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) – και Ad (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) κατεργασμένους ομάδες. Ο μέσος όγκος της διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) κατεργασμένους SW620 όγκοι ήταν περίπου 170 mm

3 σε 30 ημέρες μετά τη θεραπεία, που αντιστοιχεί σε αύξηση μόλις 40-70 mm

3 σε σύγκριση με τον αρχικό όγκο του όγκου του 100-130 mm

3. Ο τελικός όγκος του όγκου της ομάδας αγωγής με PBS ήταν περίπου 2500 mm

3, υποδεικνύοντας ότι υπήρχε περίπου μια ρυθμός αναστολής ανάπτυξης όγκου 98% σε αυτά τα ζώα, γεγονός που υποδηλώνει ότι μια σχεδόν πλήρης αναστολή παρατηρήθηκε στα ζώα πειραματικά αγωγή . Αυτή η ισχυρή και ειδική αναστολή του CRC, χρησιμοποιώντας τη στρατηγική CTGVT-CRC δεν είχε προηγουμένως αναφερθεί.

Επιπλέον, η επιβίωση των ζώων παρακολουθήθηκε μέχρι 54 ημέρες μετά τη θεραπεία, καθώς και όλα τα ποντίκια επέζησαν στο διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α ομάδα (Δ24). Στις άλλες ομάδες, τα ποσοστά επιβίωσης μειώθηκαν σημαντικά σε διαφορετικούς βαθμούς, όπως το Ad · (EGFP) · CEA · Ε1Α (Δ24) της ομάδας ήταν 50% επιβίωση, η ομάδα ΟΝΥΧ-015 ήταν 37,5% την επιβίωση, και η αγωγή με PBS ομάδα είχε μόνο ένα ποσοστό επιβίωσης 12,5% (Σχ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η στρατηγική CTGVT-CRC χρησιμοποιώντας διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) θα μπορούσε αποτελεσματικά να βελτιώσει τα ποσοστά επιβίωσης των ποντικών.

Για τη μελέτη του μηχανισμού της διαφήμισης · ​​(ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) της δράσης, η ανοσοϊστοχημική μελέτη για hexon έκφραση του αδενοϊού και το επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης ST13

in vivo

πραγματοποιήθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5C, στο Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α (Δ24) κατεργασμένα ομάδα, το επίπεδο της πρωτεΐνης hexon ήταν μεγαλύτερη από ό, τι στις ομάδες ιό επεξεργασμένο άγριου τύπου, και ST13 παρομοίως εντόνως εκφρασμένα. Όπως φαίνεται στο Σχ.