Αφηρημένο

Ιστός υποξία επάγει τον επαναπρογραμματισμό του μεταβολισμού των κυττάρων και μπορεί να οδηγήσει σε κανονικό μετασχηματισμό των κυττάρων και εξέλιξης του καρκίνου. Υποξία παράγοντα 1-άλφα (HIF-1α), ο βασικός παράγοντας μεταγραφής, παίζει σημαντικό ρόλο στη γαστρική ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τη βασική κανονιστική οδό σηματοδότησης στο γαστρικό καρκίνο, χρησιμοποιώντας δείγματα γαστρικού καρκίνου ιστό. Η ενσωμάτωση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης και μεταγραφικής βάση δεδομένων ρυθμιστικό στοιχείο (TRED) συνεχίστηκε για τον εντοπισμό HIF-1α ↔ μονοπάτια γονίδιο NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 και οργανωμένη γονίδιά τους. Τα δεδομένα έδειξαν ότι υπήρχαν 82 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που θα μπορούσαν να ρυθμίζονται από αυτούς τους πέντε παράγοντες μεταγραφής στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς και τα γονίδια αυτά σχηματίζονται 95 τρόποι ρύθμισης, μεταξύ των οποίων επτά γονιδίων (ΜΜΡ1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS, και TFF3 ) ήσαν μόρια πλήμνη που ρυθμίζονται από τουλάχιστον δύο από αυτούς τους πέντε παράγοντες μεταγραφής ταυτοχρόνως και συνδέθηκαν με υποξία, φλεγμονή, και ανοσολογική διαταραχή. Real-Time PCR και κηλίδος western έδειξε αύξηση του HIF-1α σε mRNA και επίπεδα πρωτεΐνης, καθώς και TIMP1, TFF3 στα επίπεδα mRNA σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Τα δεδομένα είναι η πρώτη μελέτη που αποδεικνύει παράγοντες μεταγραφής HIF-1α-ρυθμιζόμενων και των αντίστοιχων γονιδίων του δικτύου τους σε γαστρικό καρκίνο. Περαιτέρω μελέτη με μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος και πιο λειτουργικά πειράματα για να επιβεβαιώσει αυτά τα στοιχεία και στη συνέχεια μετατρέπονται σε κλινικές ανακάλυψη βιοδεικτών και στρατηγική θεραπείας για καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Wang J, Ni Ζ, Duan Ζ, Wang G , Li F (2014) αλλαγμένη έκφραση του υποξία Factor-1α (HIF-1α) και ρυθμιστικά γονίδια του στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς. PLoS ONE 9 (6): e99835. doi: 10.1371 /journal.pone.0099835

Επιμέλεια: Pankaj Κ Singh, του Πανεπιστημίου της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10, Ιαν του 2014? Αποδεκτές: 19 Μαΐου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (# 81320108025 και # 81271897), Εξειδικευμένες Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης της Κίνας (# 20110061120093), η Κίνα Ίδρυμα Μεταδιδακτορικός Science (# 20110491311 και # 2012T50285), Ίδρυμα του Τμήματος Jilin Provincial Υγείας (# 2011Z049), Ίδρυμα της επαρχίας Jilin Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας (# 20130522013JH και # 20140414048GH) και το Norman Bethune Πρόγραμμα του Πανεπιστημίου Jilin (# 2012219). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τον κόσμο, η οποία επηρεάζει περίπου 800.000 άτομα και 65.000 θάνατοι σχετίζονται με τον καρκίνο κάθε χρόνο [1]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η παρεκκλίνουσα κυτταρικό μεταβολισμό είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και ο καρκίνος εξέλιξης [2], [3]. Ειδικά, επαναπρογραμματισμό του μεταβολισμού της ενέργειας έχει συμπεριληφθεί ως μια αναδυόμενη χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου του [4], και ανώμαλος μεταβολισμός ενέργειας είναι ανιχνεύσιμη σε διαφορετικό ανθρώπινο καρκίνο, δηλαδή, τα καρκινικά κύτταρα θα επαναπρογραμματίσει το μεταβολισμό τους από την αύξηση του γλυκόλυση αντί του μιτοχονδριακού οξειδωτική φωσφορυλίωση για να δημιουργηθεί κύτταρο ενέργειας [5]. Tissue υποξία είναι μια κρίσιμη κινητήρια δύναμη που οδηγεί σε μεταβολισμό των κυττάρων reprograming [6]. Κάτω από το περιβάλλον υποξίας, κύτταρο γλυκόλυση επάγεται και οδηγεί σε αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και με τη σειρά, σχηματίζοντας ένα φαύλο κύκλο υποξίας-πολλαπλασιασμού αυξανόμενο υποξία που προωθούν τον κυτταρικό μετασχηματισμό και την εξέλιξη του καρκίνου [7]. Στο επίπεδο του γονιδίου, υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) είναι η κύρια ευαίσθητα στο οξυγόνο μεταγραφικός ενεργοποιητής και βοηθά τα κύτταρα να προσαρμοστεί η χαμηλή τάση οξυγόνου (υποξία) [8]. HIF-1 αποτελείται από ένα ιδιοσυστατικά εκφραζόμενο β-υπομονάδα και μια υποξία α-υπομονάδας. Το τελευταίο (HIF-1α) σταθεροποιείται μόνο υπό συνθήκες υποξίας και ρυθμίζει HIF-1 μεταγραφικής δραστικότητας [9]. Μέχρι σήμερα, ο HIF-1α φαίνεται να ενεργοποιεί πολλαπλά γονίδια-στόχους που περιλαμβάνουν σε κρίσιμες πτυχές της βιολογίας του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της ερυθροποίησης, της αγγειογένεσης, του μεταβολισμού της γλυκόζης, κυτταρικού πολλαπλασιασμού /επιβίωσης και απόπτωσης [10]. HIF-1α μπορεί να αλληλεπιδράσει με διάφορα άλλα σχετικά με τον καρκίνο παράγοντες μεταγραφής (ΤΡ) και σχηματίζουν ένα σύμπλοκο ρυθμιστική δίκτυο TF-γονιδιακής μεταγραφής κατά την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Έτσι, μια σύλληψη δεν αποτελεί έκπληξη εγείρει ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν απόκλιση και παθολογικά πρότυπα μεταγραφική σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα [11]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης HIF-1α σε γαστρικό ιστών και κυττάρων [12], [13] του καρκίνου, ενώ οι υποκείμενες ακριβώς ρυθμιστικών μηχανισμών μένει να προσδιοριστεί. Έτσι, σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τις Affymatrix εξόνιο Arrays να προσδιορίσει το προφίλ διαφορική γονιδιακή έκφραση σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς, και εκτελείται σε πραγματικό χρόνο PCR και αναλύσεις στυπωμάτων western για την επικύρωση των δεδομένων. Κατασκευάσαμε περαιτέρω το αποκλίνον ρυθμιστικό δίκτυο TF-γονιδιακής μεταγραφής που σχετίζονται με την έκφραση του HIF-1α με ολοκλήρωση των μεταγραφικών ρυθμιστικών βάση δεδομένων στοιχείου (TRED) [14] και το προφίλ γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας λογισμικό Cytoscape. Η μελέτη αυτή θα μπορούσε να προσδιορίσει μια συστηματική έκθεση των σχετικών τρόπων ρύθμισης της μεταγραφής που σχετίζονται με υποξία και να παρέχει διορατική πληροφορίες για τη μελλοντική ανακάλυψη βιοδεικτών και τα νέα θεραπευτική στρατηγική για τον καρκίνο του στομάχου.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

προφίλ των διαφορικά εκφρασμένα γονίδια σε καρκίνο του στομάχου σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς

για τον προσδιορισμό των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε γαστρικό καρκίνο, χρησιμοποιήσαμε τις Affymatrix εξόνιο πίνακες που περιέχουν 17.800 ανθρώπινα γονίδια στο προφίλ πέντε ζεύγη του γαστρικού καρκίνου και φυσιολογικούς ιστούς (πληροφορίες ασθενών ήταν έδειξε στον πίνακα S1). Βρήκαμε συνολικά 2546 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, εκ των οποίων 2422 ρυθμίζονταν μέχρι-και 124 κάτω-ρυθμιζόμενη (Πίνακας S2). Συγκεκριμένα, ο HIF-1α ήταν σημαντικά εντόνως εκφρασμένο σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς (Ρ & lt? 0,01). Εμείς επικυρωμένα περαιτέρω τα δεδομένα μικροσυστοιχιών εκτελώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR και στύπωμα Western σε άλλα 10 ζεύγη γαστρικού καρκίνου εναντίον φυσιολογικών ιστών (πληροφορίες ασθενών είχαν έδειξε στον Πίνακα S1). Η έκφραση του mRNA του HIF-1α έδειξε 2,55 ± 0,56 φορές πάνω ρύθμιση σε ιστούς όγκων έναντι φυσιολογικών (p & lt? 0,01)? ανάλυση κηλίδας Western έδειξε μία σαφή διαχωρισμό μεταξύ της σχετικής πυκνότητας πρωτεΐνη του HIF-1α σε ιστούς καρκίνου (0,41 ± 0,24) έναντι φυσιολογικών (0,17 ± 0,15) με ρ & lt? 0,01, τα αποτελέσματα μπορεί να φανεί στο Σχήμα 1 και στο Σχήμα S1. Πράγματι, μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι HIF-1α ήταν πανταχού εκφράζεται σε ιστούς ανθρώπου και ποντικού υπό υποξία [15] και σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς [12], [13], η υπερέκφραση του που συνδέονται με την κακή πρόγνωση των ασθενών με γαστρικό καρκίνο [12 ], [13]. Έτσι, αναλύθηκαν περαιτέρω HIF-1α υπερέκφραση σχετιζόμενη TFs και πιθανά γονίδια που στοχεύουν τους στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς.

α και β, Ανίχνευση HIF-1α, TIMP1 και έκφραση TFF3 mRNA σε γαστρικό καρκίνο vs. φυσιολογικούς ιστούς χρησιμοποιώντας PCR και qRT-PCR. Επίπεδα του HIF-1α, TIMP1, TFF3 mRNA ήταν 2,55 ± 0,56, 1,58 ± 0,25, 2,16 ± 0,59 πτυχώσεις πάνω ρυθμισμένα σε ιστούς όγκων, αντίστοιχα σε σύγκριση με εκείνα των κανονικών αυτά. * P & lt? 0,01. c και d, ανάλυση στυπώματος Western των πρωτεϊνών HIF-1α. Ιστοί όγκου εκφράζεται υψηλότερο επίπεδο HIF-1α πρωτεΐνη σε σύγκριση με τις κανονικές [ρ & lt? 0,01 (d). Ν, φυσιολογικούς ιστούς? C, καρκινικούς ιστούς (c)].

Η

Προσδιορισμός του HIF-1α υπερέκφραση σχετιζόμενη TFs και πιθανά γονίδια που στοχεύουν τους στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς

Για την ταυτοποίηση HIF-1α υπερέκφραση σχετιζόμενη TFs και το δυναμικό των γονιδίων που στοχεύουν τους, μεταγραφική βάση δεδομένων ρυθμιστικό στοιχείο (TRED) παρέχει ένα μοναδικό εργαλείο για την ανάλυση τόσο

cis

– και

trans

– ρυθμιστικά στοιχεία στα θηλαστικά, η οποία βοηθά να κατανοήσουμε καλύτερα την ολοκληρωμένη κανονισμοί γονιδίου και ρυθμιστικά δίκτυα, ειδικά στο επίπεδο της μεταγραφικής κανονισμών. Έτσι, χρησιμοποιώντας το προφίλ γονιδιακής έκφρασης ολοκλήρωσης και ρυθμιστικές πληροφορίες από TRED, αναλύσαμε HIF-1α και άλλες τέσσερις HIF-1α που σχετίζονται με παράγοντες μεταγραφής (δηλαδή, NFκB1, BRCA1, STAT3, και STAT1), που ήταν όλα πάνω ρυθμισμένα σε γαστρικό καρκίνο ιστούς και διαπίστωσε ότι σχηματίζονται αυτά τα TF-γονιδίου ρυθμιστικά δίκτυα με 82 γονίδια, 79 από τα οποία ρυθμίζονται up-και 3 κάτω-ρυθμιζόμενη (Πίνακας S3). Το Σχήμα 2 έδειξε την ανάλυση δι-συστάδες αυτών των 82 διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς έναντι των φυσιολογικών ιστών.

Κάθε σειρά αντιπροσωπεύει ένα γονίδιο και κάθε στήλη αντιπροσωπεύει ένα δείγμα, οι «C» στήλες στο κάτω μέρος αντιπροσωπεύουν καρκίνο ιστούς, «Ν» στήλες αντιπροσωπεύουν φυσιολογικούς ιστούς. & Gt? 1 Κόκκινο για υψηλή έκφραση σε καρκίνο σε σύγκριση με το φυσιολογικό και & lt? 1 πράσινο για χαμηλή έκφραση σε καρκίνο σε σύγκριση με το κανονικό αυτά

Η

Μετά από αυτό, η βάση δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (DAVID. ) [16] εφαρμόστηκε για τη λειτουργική σχολιασμό αυτών των 82 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Έχουμε απαριθμούνται τα κορυφαία τέσσερις τάξεις ασθένεια που σχετίζεται με αυτά τα 82 παρεκκλίνουσα γονίδια (Πίνακας 1) και βρέθηκε ότι η πιο σημαντική κατηγορία είναι Καρκίνος με 29 γονίδια που ακολουθείται από μόλυνση (18 γονίδια), Cardiovascular (25 γονίδια) και νόσο του ανοσοποιητικού (26 γονίδια) .

η

Αναγνώριση του γαστρικού καρκίνου που σχετίζονται με τον παράγοντα μεταγραφής του γονιδίου (TF-γονίδιο) δίκτυο

Με βάση την μεταγραφική ρυθμιστική βάση δεδομένων στοιχείου και το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης, κατασκευάσαμε σχετική η μεταγραφική ρυθμιστική δίκτυο να HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 με αυτά τα 82 γονίδια στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι αυτά τα 82 γονίδια που μπορούν να σχηματίσουν 95 διαφορετικές λειτουργίες ρύθμισης (Εικόνα 3Α) και η λεπτομερής TF-γονιδίου τρόποι ρύθμισης οι πληροφορίες που παρατίθενται στον πίνακα S4.

Κόκκινο κύκλους Α είναι up-ρυθμιζόμενα γονίδια, ενώ το πράσινο κύκλους κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια και τα κίτρινα τρίγωνα είναι αυτά τα πέντε βασικά ΤΡ. Β, Η σύντομη πλαίσιο αυτού του δικτύου. Οι κύκλοι είναι οι σύμπλεγμα γονιδίων και ο αριθμός των γονιδίων που εμφανίζεται στο εσωτερικό του. Η κατεύθυνση του βέλους είναι από την Πηγή στο Target.

Η

Για την καλύτερη κατανόηση του ρυθμιστικού δικτύου, χτίσαμε μια σύντομη πλαίσιο του δικτύου (Σχήμα 3Β). Μεταγραφικοί παράγοντες HIF-1α ↔ NFκB1 → BRCA1 → STAT3 ← STAT1 ήταν σε θέση να αποτελούν το πλαίσιο του κανονιστικού δικτύου με την οποία άμεσα ρυθμίζονται 21, 45, 2, 12, και 10 γονίδια, αντίστοιχα. NFκB1 άμεσα ρυθμίζεται από HIF-1α και ήταν αλήθεια ότι η πλειοψηφία του κανονιστικού δικτύου άμεσα ρυθμίζονται από HIF-1α (21/82) και NFκB1 (45/82), τις βασικές ρυθμιστικές αρχές που συνδέονται με υποξία και τη φλεγμονή σε καρκίνους [ ,,,0],17]. Γαστρικό καρκίνος χαρακτηρίζεται από υποξία των ιστών και τη χρόνια φλεγμονή (όπως

Helicobacter pylori

λοίμωξη). Στην τρέχουσα μελέτη μας, HIF-1α ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε γαστρικό καρκίνο σε σύγκριση με τα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς (Ρ & lt? 0,01). Επιπλέον, τα τρέχοντα δεδομένα μας έδειξαν ότι η έκφραση του πάνω από 20 γονίδια που συνδέονται άμεσα ρυθμίζονται από HIF-1α μεταβλήθηκε σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένου NFκB1, το κλειδί μόριο ρυθμιστή σε φλεγμονή και τον καρκίνο [18] και η στόχευση του ΝΡκΒ μπορεί να είναι χρήσιμη σε χημειοπροφύλαξη διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων [19].

Η κατάντη του κανονιστικού δικτύου οδός ρυθμίζεται κυρίως από STAT3 (12/82) και STAT1 (10/82), τα μέλη του μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της οικογένειας μεταγραφής ( stats). STATs σηματοδότησης με Jak είναι ένα κανονικό μονοπάτι για τη ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται σε πολλές φυσιολογικές διεργασίες με τη μεταφορά σημάτων από την κυτταρική μεμβράνη προς τον πυρήνα [20]. Για τη ρύθμιση παρακρινής σηματοδότηση κυτοκίνης και μεταβολές στην μεταστατικές θέσεις, STAT3 εξασκεί τόσο όγκο ενδογενείς και εξωγενείς επιδράσεις [21]. Στόχευση μονοπάτι σηματοδότησης Jak-STAT3 θεωρείται ως πιθανή θεραπευτική στρατηγική, ιδίως στο πλαίσιο της φλεγμονής και της ανοσίας του όγκου [21]. Συνεχής απορύθμιση των γονιδίων από επίμονα ενεργοποιηθεί NFκB και STAT3 στο μικροπεριβάλλον του όγκου είναι δύο κρίσιμες πτυχές για τη φλεγμονή και τα κακοήθη εξέλιξη [17]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε μια συνεργατική δράση της STAT3 και HIF-1α στην ενεργοποίηση των γονιδίων υπό περιβάλλον υποξίας σε κύτταρα νεφρικού καρκινώματος [22]. Ο ειδικός μηχανισμός ενεργοποίησης Jak-STAT, ειδικά STAT3 στο γαστρικό καρκίνο μένει να καθοριστεί, αν και τα τρέχοντα δεδομένα μας έδειξαν σημαντικά υψηλότερο επίπεδο της JAK1, STAT3 και έκφραση STAT1 σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς.

ανάλυση Λειτουργία του κέντρου -genes

ένας παράγοντας δίνεται μεταγραφής μπορούν να ρυθμίζουν δεκάδες, αν όχι εκατοντάδες, των γονιδίων στόχων, ενώ ένα γονίδιο μπορεί να ρυθμίζεται από πολλές διαφορετικές TFs στο δίκτυο ρύθμισης γονιδίων. Έτσι, θεωρείται ότι τα γονίδια πλήμνη ρυθμίζεται από διάφορους παράγοντες μεταγραφής ταυτόχρονα σε γαστρικό καρκίνο, που μπορεί να έχει συνεργιστική επιδράσεις στην ανθρώπινη καρκινογένεση. Στην παρούσα μελέτη, εντοπίστηκαν επτά γονίδια (συμπεριλαμβανομένων των ΜΜΡ1, TIMP1, TLR2, FCGR3A, IRF1, FAS, και TFF3) που μπορούν να ρυθμιστούν άμεσα από τουλάχιστον δύο βασικούς παράγοντες μεταγραφής, οι περισσότεροι από αυτούς είναι οι κόμβοι κόμβο που συνδέει με NFκB1 και STATs οδού (Εικόνα 4). Δεδομένου ότι οι παράγοντες μεταγραφής ρυθμίζουν τα γονίδια-στόχους μέσω ενός μεταγραφής εξαρτιόταν τρόπο να ρυθμίζουν την έκφραση του mRNA τους, εδώ πραγματοποιήσαμε qRT-PCR για να εξετάσει την έκφραση του TIMP1 και TFF3 mRNA, δύο γονίδια στόχους του HIF-α τη σχετική έκφραση TIMP1 και TFF3 mRNA ήταν 1.58 ± 0.25 και 2.16 ± 0.59 φορές πάνω ρυθμισμένα σε δέκα όγκων εναντίον φυσιολογικών ιστών, αντίστοιχα (Εικόνα 1).

Ελλείψεις είναι γονίδια κόμβο που ρυθμίζονται από παράγοντες μεταγραφής, τα τρίγωνα είναι οι πέντε αυτοί παράγοντες μεταγραφής σε το ρυθμιστικό δίκτυο TF-γονιδίου.

η

Επιπλέον, η οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) είναι ο κύριος εξωκυτταρική μήτρα αναδιαμόρφωση ένζυμα, δραστηριότητα των οποίων είναι το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης μεταξύ των κυττάρων του όγκου και μικροπεριβάλλον του όγκου και ελέγχεται αυστηρά από μεταγραφική ενεργοποίηση, συμπεριλαμβανομένου ενός σύνθετου καταρράκτη πρωτεολυτική ενεργοποίηση καθώς και ενδογενείς σύστημα αναστολέων μεταλλοπρωτεϊνασών ιστού (ΤΙΜΡ) [23]. ΜΜΡ1 έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται σε γαστρικού καρκίνου κυτταρική εισβολή [24]. Επιπλέον, TLR2 είναι μέλος της διοδίων-όπως υποδοχείς και παίζει θεμελιώδη ρόλο στην αναγνώριση παθογόνων και την ενεργοποίηση της έμφυτης ανοσίας από την ενεργοποίηση του ΝΡκΒ. TLR2 μπορεί να λειτουργεί ως εμπνευστής για την παροχή του μολυσμένου ή τραυματίες κύτταρα μια δεύτερη ευκαιρία να εξελιχθούν σε καρκινικά κύτταρα και ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων [25]. Εν τω μεταξύ, το θραύσμα Fc του IgG, χαμηλής συγγένειας υποδοχέα IIIa (FCGR3A, επίσης γνωστό ως CD16a) ανήκει στην οικογένεια υποδοχέα Fc γάμμα (FcgR).

FCGR3A

πολυμορφισμού συσχετίστηκε με ευαισθησία σε ορισμένες αυτοάνοσες νόσους και FCGR3A έχει ένα σημαντικό ρόλο στην απομάκρυνση των ανοσοσυμπλόκων από το σώμα και συμμετέχει επίσης σε κυτταροτοξικά αποκρίσεις έναντι καρκινικών κυττάρων και μολυσματικών παραγόντων [26]. Ο ρυθμιστικός παράγοντας ιντερφερόνης (IRF) -1 είναι επίσης ένα ανοσοποιητικό δραστικό μόριο και φλεγμονωδών ρυθμιστής διαδικασία, η ενεργοποίηση του IRF-1 και NF-κΒ βρέθηκε να ενεργοποιείται ταυτόχρονα σε μελάνωμα [27]. Επιπλέον, πολυμορφισμοί του τριφυλλοειδούς παράγοντα 3 (

TFF3

) προαγωγό σχετίστηκαν με γαστρικό καρκίνο επιδεκτικότητα [28] και TFF3 ρυθμιζόταν τόσο από HIF-1 και ΝΡκΒ [29]. Η υπερέκφραση του TFF3 ήταν ανεξάρτητη δείκτης για τη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στομάχου [30]. Και πάλι, FAS (επίσης γνωστή ως TNFSF6 /CD95 /ΑΡΟ-1) ανήκει στην υπεροικογένεια υποδοχέα παράγοντα νέκρωσης όγκων (μέλος 6) και παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της εξωγενούς οδού απόπτωσης [31]. Μειωμένη έκφραση FAS συνδέθηκε με τον αυξημένο κίνδυνο καρκίνου με προς τα κάτω ρύθμιση της FAS-μεσολαβούμενη απόπτωση [32]. Ωστόσο, τα τρέχοντα δεδομένα μας έδειξαν αντιφατικά υψηλό επίπεδο έκφρασης του FAS στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς ad περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για να το επιβεβαιώσετε. Συνολικά, αλλαγμένη έκφραση αυτών των γονιδίων σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς χρειάζεται περαιτέρω επαλήθευση ως βιοδείκτες για γαστρικό τη διάγνωση του καρκίνου και την πρόγνωση. Αυτά τα γονίδια είναι ζωτικής σημασίας για την φλεγμονή και ανοσιακή ασθένεια, η οποία μπορεί να υποδεικνύει περαιτέρω τη σημασία της

Helicobacter pylori λοίμωξη

στο γαστρικό ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ιστός δείγματα

Ένα σύνολο από 15 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο είχαν προσληφθεί για τον καρκίνο και το μακρινό κανονική συλλογή ιστών από το πρώτο νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Jilin, Changchun, Κίνα. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ακαδημίας των Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Jilin, κάθε ασθενής είχε συναινέσει σε γραπτή έντυπο συγκατάθεσης. Τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα. Όλοι οι ιστοί ελήφθησαν από χειρουργείο και καταψύχθηκαν ταχέως και αποθηκεύεται σε υγρό άζωτο εντός 10 λεπτών μετά την εκτομή. Η TNM και ιστολογική ταξινόμηση διεξήχθησαν σύμφωνα με τα κριτήρια (WHO) Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας.

απομόνωση RNA και υβριδοποίησης μικροσυστοιχιών και σάρωση

Ο ιστός RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, CA, USA) και καθαρίζεται περαιτέρω με τη χρήση του RNeasy Mini kit (Qiagen, Düsseldorf, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας το UV2800 υπεριώδους φασματοφωτόμετρο (UNIC, ΝΥ, USA) με αναλογία A260 /A280 μεταξύ 1.8~2.0 και η συγκέντρωση του RNA κυμαίνεται από 100 ng /μl σε 1 μg /μl.

GeneChip Human το εξόνιο 1.0 ST (Affymetrix, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε στο προφίλ διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς vs. τα κανονικά σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από Affymetrix (P /N 900223). Εν συντομία, χρησιμοποιήθηκε 1 μg ΚΝΑ-πρότυπο για να αντίστροφα μεταγραφή σε cDNA και δείγματα cDNA υπέστησαν πέψη σε θραύσματα cDNA με ενδονουκλεάσες και στη συνέχεια επισημαίνονται με το αντιδραστήριο σήμανσης DNA που παρέχονται από Affymetrix. Μετά από αυτό, τα επισημασμένα δείγματα cDNA χρησιμοποιήθηκαν ως ανιχνευτές για να υβριδοποιούνται προς τις μάρκες συστοιχία με επώαση στους 45 ° C και περιστράφηκε στις 60 rpm για 17 ώρες. Μετά πλένονται και βάφονται τα τσιπ μετά την υβριδοποίηση, τα τσιπ σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας GeneChip Scanner3000 με GeneChip Λογισμικό Λειτουργικό (GCOS). Όλα τα όργανα, τα τσιπ, και τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από όλα Affymetrix.

Ανάλυση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε καρκίνο έναντι φυσιολογικών ιστών

GeneChip Λογισμικό Λειτουργικό εφαρμόστηκε για την ανάλυση των τσιπ και εκχυλίστε οι πρώτες εικόνες σηματοδοτούν δεδομένα. Οι DataSets GEO του NCBI αριθμό προσχώρησης της μελέτης μας είναι: GSE56807. Δεδομένα πρωτογενών σήμα στη συνέχεια εισάγονται και αναλύονται με αλγόριθμο Limma για τον εντοπισμό των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Τα γραμμικά μοντέλα και εμπειρικές μεθόδους Bayes ήταν να αναλύσει τα δεδομένα. Αυτό εμπόδισε ένα γονίδιο με ένα πολύ μικρό φορές αλλαγή από το να κριθεί ως διαφορικά εκφρασμένων μόνο και μόνο επειδή μια λάθος μικρό υπόλοιπο SD. Οι προκύπτουσες τιμές Ρ προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο BH FDR. Γονίδια θεωρήθηκαν ότι είναι σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο εάν και οι δύο οι τιμές FDR ήταν & lt? 0,05 (ελέγχει την αναμενόμενη FDR σε όχι περισσότερο από 5%) και την έκφραση του γονιδίου έδειξαν τουλάχιστον 2-φορές αλλαγές μεταξύ του καρκίνου και αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί τους με Log2FC & gt? 1 ή log2FC & lt? -1, P-value & lt? 0.05.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

Για ανάλυση qRT-PCR, λιγότερο από 5 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA με 1

st κλώνου cDNA Synthsis Kit (Takara , Dalian, Κίνα)? η έκφραση του mRNA για την ανθρώπινη HIF-1α, TIMP1 και TFF3 εξετάστηκαν από qRT-PCR με SYBR πρόμιγμα Ex Taq (Takara, Dalian, Κίνα) και Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR System. Η σχετική έκφραση του mRNA ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη έκφραση με συγκριτική μέθοδο Ct (2

-ΔΔCt, ΔCt = Ct

στόχου-Ct

β-ακτίνης, ΔΔCt = ΔCt

όγκο ΔCt

κανονικό). Όλοι οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με Primer Premier 6 Software, αλληλουχίες εναρκτήρα για την ενίσχυση εισήχθησαν στον Πίνακα 2. Τα δεδομένα από qRT-PCR αναλύθηκαν με GraphPad Prism Version 5.0, οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν στατιστικά με δείγμα μονόπλευρο t-test του Student με ρ τιμή & lt?. 0.05 θεωρούνται σημαντικές

η

ανάλυση Western blot

Περίπου 1 mm

3 δείγματα ιστού γυαλισμένο με υγρό άζωτο και στη συνέχεια ομογενοποιούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρου (Beyotime, Κίνα) σε 4 ° C για 30 λεπτά, απομακρύνθηκαν τα κυτταρικά υπολείμματα με φυγοκέντρηση στα 10.000 rpm για 20 λεπτά σε 4 ° C. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης αναλύθηκε με προσδιορισμό πρωτεΐνης Bradford (Bio-Rad, USA). Το σύνολο πρωτεΐνη διαχωρίστηκε με 10% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (0,45 μm) για 2 ώρες. Μετά από 2 ώρες η απόφραξη από 5% γάλα σε TBST, επωάστηκαν της μεμβράνης με αντι-HIF-1α (Santa Cruz, CA, USA) σε αραίωση 1:200 και αντι-β-ακτίνης ποντικού (Proteintech, USA) σε 1: 2000 αραίωση σε 4 ° C για 12 ώρες και ακολουθήθηκε από 2 ώρες επώαση με γίδινη αντι-ποντικού IgG (Proteintech, USA) σε αραίωση 1:2000. Μετά το πλύσιμο με TBST, ανιχνεύονται τα σήματα μεμβράνη με τη χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας ECL (Beyotime, Κίνα). Η Εικόνα J λογισμικό εφαρμόστηκε για την ποσοτική ανάλυση του HIF-1α εντάσεις σήματος με κανονικοποιημένη με β-ακτίνη επίπεδα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με GraphPad Prism Version 5.0, οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν στατιστικά με δείγμα μονόπλευρο t-test του Student με την τιμή Ρ & lt? 0,05 θεωρείται ως σημαντική

Κατασκευή δικτύου γονιδίου παράγοντα μεταγραφής με βάση την έκφραση του γονιδίου. προφίλ και δικτύου (TF) γονίδιο μεταγραφικό ρυθμιστικό στοιχείο βάσης δεδομένων

παράγοντας μεταγραφή κατασκευάστηκε με βάση το προφίλ γονιδιακής έκφρασης και μεταγραφικές βάση δεδομένων ρυθμιστικό στοιχείο (TRED) με τη χρήση του λογισμικού Cytoscape σύμφωνα με το κανονιστικό αλληλεπίδραση και τις αξίες διαφορική έκφραση κάθε TF και γονιδίου. Ο πίνακας γειτνίασης της TFs και γονίδια που έγινε από τις σχέσεις χαρακτηριστικό μεταξύ όλων των γονιδίων και ΤΡ. Η έλλειψη σε δίκτυο TF-γονίδιο που αντιπροσωπεύεται γονίδια με κόκκινο (up-ρυθμιζόμενες) και πράσινο (κάτω-ρυθμιζόμενες), τα τρίγωνα αντιπροσωπεύει παράγοντες μεταγραφής. Η σχέση μεταξύ TF και τους στόχους τους εκπροσωπήθηκαν από τα βέλη, την κατεύθυνση του βέλους ήταν από τις πηγές έως το Target.

Η ανάλυση των γονιδίων που σχετίζονται νόσου και το γονίδιο της οδού σχολιασμό

Βάση δεδομένων για σχολιασμού, Οπτικοποίηση και Ολοκληρωμένη Discovery (David), το λογισμικό λειτουργικού σχολιασμό εφαρμόστηκε για την ανάλυση της λειτουργικής εμπλουτισμό της ανώμαλης γονιδίων. «GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS» επιλογή παρείχε τις πληροφορίες για την ασθένεια εμπλουτισμό ένωση των συστάδων γονιδίων. Έχουμε επιλέξει «GENETIC_ASSOCIATION_DB_DISEASE_CLASS» για τον προσδιορισμό της κατηγορίας νόσο εμπλουτισμού και «KEGG_PATHWAY» για τον εμπλουτισμό της οδού με τη μέθοδο Benjamini τον προσδιορισμό της σημαντικής score≥1.3 εμπλουτισμό.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

ανάλυση Western blot του HIF-1α σε 10 ζεύγη του γαστρικού καρκίνου και κανονικούς ιστούς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099835.s001

(DOC)

Πίνακα S1. δεδομένων

Ασθενείς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099835.s002

(DOC)

Πίνακας S2.

Περίληψη του 2546 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τους μακρινούς φυσιολογικούς ιστούς. τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς εναντίον τους μακρινούς φυσιολογικούς ιστούς ήταν τουλάχιστον 2 φορές διαφορετικά, με τιμή p & lt? 0,05

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099835.s003

(XLSX)

Πίνακας S3.

Περίληψη της these82 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων στο δίκτυο TF-κανονιστικό στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099835.s004

(XLSX)

Πίνακας S4.

Οι 95 τρόποι ρύθμισης που σχηματίζεται από 82 διαφορική γονίδια σε ρυθμιστικό δίκτυο TF-γονιδίου. Όλες οι πληροφορίες κανονισμός αυτός προέρχεται από μεταγραφικές βάση δεδομένων ρυθμιστικό στοιχείο (TRED)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099835.s005

(XLSX)

Ευχαριστίες

Επίσης, ευχαριστώ η Medjaden Bioscience Limited (Χονγκ Κονγκ, Κίνα) για την επεξεργασία και επιμέλεια αυτό το χειρόγραφο.