Αφηρημένο

Τα επίπεδα έκφρασης και ρυθμιστικούς ρόλους του miR-497 σε καρκίνο του παγκρέατος είναι ασαφείς. Η κλινική αξία της στο πλάσμα που μοιάζει με ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα 1 υποδοχέα (IGF-1 R) σε καρκίνους του παγκρέατος δεν έχει διερευνηθεί. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι miR-497 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς. Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497 σε AsPC-1 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές BxPC-3 και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, η ενισχυμένη απόπτωση, επανα-ευαισθητοποιημένα κύτταρα να γεμσιταβίνης και κατέστειλε IGF-1 R και ρ-ΑΚΤ έκφραση μέσω της άμεσης μειορρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης IGF-1 R. Αντίθετα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν μετά την προς τα κάτω ρύθμιση των miR-497. Τα επίπεδα πλάσματος IGF-1 R σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος αυξήθηκε σημαντικά, σε σύγκριση με εκείνη σε ασθενείς με χρόνια παγκρεατίτιδα, άλλες παγκρεατικών όγκων και νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος (

Ρ = 0,006

,

Ρ = 0.018 και

P = 0,004

, αντίστοιχα), και εμφανίζονται πιθανές τιμές για τη διάκριση του παγκρέατος βλάβες. Ωστόσο, τα επίπεδα σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος ήταν συγκρίσιμη με αυτή των υγιών εθελοντών (

Ρ = 0,095

). Το στάδιο θέσεις του όγκου και ΤΝΜ συσχετίστηκαν με τα επίπεδα IGF-1 R πλάσματος (

Ρ = 0,013

και

P = 0,01

, αντίστοιχα). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά της συνολικής επιβίωσης μεταξύ των υψηλών και χαμηλών ομάδες έκφραση του IGF-1R. Συμπερασματικά, αποδείξαμε ότι miR-497 εξασθένησε την κακοήθεια των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος και να προωθηθεί η ευαισθησία των κυττάρων σε γεμσιταβίνη με απευθείας προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του IGF-1R. Πλάσμα IGF-1 R εμφανίζεται μια δυνητική αξία για τη διάκριση του παγκρέατος βλάβες και θα μπορούσε να είναι ένα νέο βιοδείκτη για την καθοδήγηση στάδιο ΤΝΜ του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Xu JW, Wang TX, μπορείτε L, Zheng LF, Shu Η Ζανγκ TP, et al. 1 υποδοχέα του παράγοντα (2014) Ινσουλίνη-Like Growth (IGF-1 R) ως Target of Mir-497 και Plasma IGF-1R επίπεδα που σχετίζονται με το ΤΝΜ στάδιο του καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (3): e92847. doi: 10.1371 /journal.pone.0092847

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 του Αυγ, 2013? Αποδεκτές: 27, Φεβρουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 25 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81272484, 81141027), Ίδρυμα Πεκίνο Φυσικών Επιστημών (Νο 7132179), το Πεκίνο Δημοτική Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (7.100.003) και το Ειδικό Ταμείο Έρευνας για Κοινής Ωφέλειας Βιομηχανίας Υγείας ( 201202007). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDAC) είναι μια επιθετική και καταστροφική ασθένεια. PDAC έχει μια εξαιρετικά κακή πρόγνωση με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μικρότερη από 5% [1]. Αν και οι μηχανισμοί της παγκρεατικής καρκινογένεσης, οι νέες δείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση, και οι νέες θεραπευτικές στρατηγικές έχουν ευρέως διερευνηθεί [2], [3], [4], η συνολική επιβίωση δεν έχει βελτιωθεί κατά τα τελευταία 80 χρόνια [5] . Οι μοριακοί μηχανισμοί της εξέλιξης της PDAC, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, αντοχή φαρμάκου, παραμένουν ασαφείς.

miRNAs είναι μικρής μη-κωδικοποίησης RNAs, τα οποία μπορεί να αναστέλλουν τη μετάφραση του αγγελιοφόρου RNA (mRNA) σε πρωτεΐνη με δέσμευση σε ο 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR). MiRNAs μπορούν να δράσουν ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων στη ρύθμιση της καρκινογένεσης, μεταστατική ικανότητα και αντοχή φαρμάκου [6]. Προς τα κάτω ρύθμιση του miR-497 έχει παρατηρηθεί στο στήθος, του παχέος εντέρου και του τραχήλου της μήτρας [7], [8], [9]. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αναφορά σχετικά με τα επίπεδα έκφρασης miR-497 σε καρκίνο του παγκρέατος επί του παρόντος. Η ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα 1 υποδοχέα (IGF-1 R) ταυτοποιήθηκε ως στόχος του miR-497. Προς τα κάτω ρύθμιση του miR-497 συμβάλλει στην κακοήθεια του καρκίνου του παχέος εντέρου και του καρκίνου του τραχήλου με προς τα πάνω ρύθμιση IGF-1 R [8], [9]. Ωστόσο, οι ρυθμιστικούς ρόλους και τους μηχανισμούς του miR-497 σε καρκίνο του παγκρέατος είναι ακόμα ασαφής.

IGF-1 R είναι ένας υποδοχέας κινάσης τυροσίνης, η οποία περιλαμβάνει στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, διαφοροποίησης και κακοήθους μετασχηματισμού των καρκινικών κυττάρων [10]. Προς τα πάνω ρύθμιση του IGF-1 R σε ανθρώπινους ιστούς PDAC έχει αναφερθεί [11] και των συνεργατών με υψηλότερο βαθμό του όγκου και κακή επιβίωση [12]. Παρ ‘όλα αυτά, τα επίπεδα στο πλάσμα IGF-1 R σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος δεν ανιχνεύθηκαν σε προηγούμενες μελέτες. Οι κλινικές τιμές πλάσματος IGF-1 R σε καρκίνο του παγκρέατος είναι άγνωστες.

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι miR-497 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς. Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, αυξημένη απόπτωση και προωθείται ευαισθησία σε γεμσιταβίνη μέσω απ ‘ευθείας προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του IGF-1 R σε καρκινικά κύτταρα PDAC

in vitro

. Δείξαμε επίσης ότι τα επίπεδα του πλάσματος IGF-1 R σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος ήταν συγκρίσιμη με εκείνη σε υγιείς εθελοντές, αλλά υψηλότερη από ότι σε ασθενείς με χρόνια παγκρεατίτιδα, άλλες παγκρεατικών όγκων και νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος, και οι εμφανιζόμενες τιμές για τη διάκριση του παγκρέατος αλλοιώσεις. Το στάδιο θέσεις του όγκου και ΤΝΜ συσχετίστηκαν με τα επίπεδα IGF-1 R πλάσμα. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά του συνολικού χρόνου επιβίωσης μεταξύ υψηλών και χαμηλών ομάδες έκφραση του IGF-1R.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με την έγκριση ηθική από το Institutional Review Boards του Ιατρικού Νοσοκομείου Κολέγιο του Πεκίνου Ένωσης. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα μαθήματα.

Η ανίχνευση της έκφρασης του miR-497 με in situ υβριδισμού (ISH)

10 φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα καρκίνου του παγκρέατος και συμφωνημένα από όγκο παρακείμενους ιστούς ελήφθησαν και να γίνει σε μικροσυστοιχίες ιστό. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-497 σε ιστούς ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ανιχνευτή ανίχνευσης miRCURY LNA για miR-497 (Exiqon, Vedbaek, Denmark, αριθμός προϊόντος: 38256-15). ISH διεξήχθη όπως ακόλουθη περιγραφή. Εν συντομία, τα πλακίδια επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά, αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν με διαβαθμισμένη πλύσεις αλκοόλη. Στη συνέχεια, τα πλακίδια τοποθετήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη για 20 λεπτά σε έναν απαγωγό, και στη συνέχεια πλένονται με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) τρεις φορές. Οι πλάκες στη συνέχεια κατεργάζεται με 15 μg /ml πρωτεϊνάσης Κ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, πλύθηκε τις διαφάνειες με PBS και τους μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά μετά από αυτό. Μετά την έκπλυση, τα πλακίδια προ-υβριδοποιήθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης για 1 ώρα σε δωμάτιο 50 ° C και στη συνέχεια υβριδοποιήθηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C στο ρυθμιστικό υβριδισμού που περιέχει ανιχνευτή. Αυστηρές εκπλύσεις πραγματοποιήθηκαν στους 50 ° C για 20 λεπτά, και στη συνέχεια τα πλακίδια επωάστηκαν σε ένα διάλυμα μπλοκαρίσματος για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα πλακίδια επωάστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού με αλκαλική φωσφατάση συζευγμένη θραύσμα αντι-DIG Fab όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η αντίδραση ανίχνευσης χρωματομετρική διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ ΝΒΤ /ΒΟΙΡ (ThermoFisher Scientific) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα ISH καταγράφηκαν ως το ποσοστό των θετικών κυττάρων.

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

BxPC-3 και AsPC-1 κυτταρικές σειρές PDAC ήταν ευγενική προσφορά από τον Καθηγητή Helmut Freiss (Πανεπιστήμιο Χαϊδελβέργης, Γερμανία ), ο οποίος ελήφθη από την American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) [13], [14], [15]. κύτταρα PDAC καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO2 στους 37 ° C σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο πλάσμα (FBS, Hyclone). Τα πρωτογενή αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology, συμπεριλαμβανομένων ΙΟΡ-Ι υποδοχέα β (D23H3) XP Rabbit mAb (# 9750), β-ακτίνη (13E5) Rabbit mAb (# 4970), Phospho-Ακί (Ser473) (D9E) XPRabbit mAb (# 4060), Akt (pan) (11E7) Κουνέλι mAb (# 4685), κασπάσης-3 αντισωμάτων (# 9662) και PARP αντισωμάτων (# 9542).

mirna επιμόλυνση

miR-497 μιμείται (5′-CAGCAGCACACUGUGGUUUGU-3 ‘, 5′-AAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3′), έλεγχος μιμείται (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′), αναστολέα miR-497 (5’- ACAAACCACAGUGUGCUGCUG-3 ‘) και έλεγχος αναστολέα (5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’) συντέθηκαν με Genepharma (Σαγκάη, Κίνα). MiRNAs στους 50-100 ηΜ επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Cellular εξαγωγή RNA και ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

τα κύτταρα διαμολύνθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων. Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για IGF-1 R ποσοτική δοκιμασία, ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το κιτ αντίστροφης μεταγραφής (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SYBR Green Master Mix (Takara, Ιαπωνία). GAPDH επιδόθηκαν όπως και η ενδογενής έλεγχος

IGF-1R Forward αστάρι:. 5′-TCTGGCTTGATTGGTCTGGC-3 ‘

Αντίστροφη έναυσμα: 5′-AACCATTGGCTGTGCAGTCA-3′

GAPDH πρόσθιο εκκινητή: 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 ‘,

Αντίστροφη έναυσμα: 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′

για miR-497 ποσοτική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκαν δοκιμασία TaqMan miRNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Applied Biosystems). U6 χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο. Διπλώστε αλλαγές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔCT μέθοδο.

Διάδοση ανάλυση

In vitro

πολλαπλασιασμός αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ του αριθμού των κυττάρων (CCK-8). BxPC-3 κύτταρα και κύτταρα AsPC-1 διαμολύνθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων (5 χ 10

5cells /φρεάτιο). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και επανακαλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων (1000 κύτταρα /φρεάτιο). 10 μl /φρεάτιο CCK-8 αντιδραστήριο προστέθηκε σε 0, 24, 48, 72 ώρες, αντίστοιχα, και επωάστηκαν για 2,5 ώρες στους 37 ° C. Οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε στα 450 nm και 630 nm από έναν αναγνώστη μικροπλάκας (Wellscan MK3, Θέρμο /Labsystems, Φινλανδία).

χημειοευαισθησία ανάλυση

BxPC-3 και AsPC-1 κύτταρα μορφομετατράπηκαν για 24 ώρες, τοποθετούνται σε πλάκες 96 φρεατίων (4000 κύτταρα /φρεάτιο), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σειριακά αραιωμένο γεμσιταβίνη (Eli Lilly and Company) εις τριπλούν. Μετά από 48 ώρες επώασης, 10 μΙ /φρεάτιο CCK-8 αντιδραστήριο προστέθηκε και επωάστηκε για 2,5 ώρες στους 37 ° C. Η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε στα 450 nm και 630 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός.

κηλίδωση Western

Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης σε 6-φρεατίων, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη και διάλυμα λύθηκαν με ρυθμιστικό ΚΙΡΑ (Applygen, Πεκίνο). Σύνολο πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση επί πηκτώματος δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μια διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Billerica, ΜΑ). Μετά τον αποκλεισμό με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα κρένου συζευγμένης με υπεροξειδάση (Applygen, Πεκίνο) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές με echochemiluminescence σύστημα ανίχνευσης (ECL) και τα επίπεδα έκφρασης αυτών των πρωτεϊνών αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus 6.0 λογισμικό (Media Cybernetics, USA).

δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης Dual-

Οι φορείς pmiR-RB-Έκθεση-IGF-1 R-3′-UTR που περιέχουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη αλληλουχία στόχο δομήθηκαν με RiboBio Co., Ltd. (Guangzhou, Κίνα). BxPC-3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 12 φρεατίων (1 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και συν-επιμολύνθηκαν με miR-497 μιμείται και φορείς που εκφράζουν μεταλλαγμένη αλληλουχία στόχο, ή συν-επιμολύνθηκαν με μιμείται και φορείς που εκφράζουν άγριου-στόχο τύπου αλληλουχία χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000. Μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες, η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας Dual-Luciferase Reporter (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ασθενείς και το πλάσμα IGF-1 R έκφραση

δείγματα πλάσματος συλλέχθηκαν από 42 ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Πλάσμα δείγματα από ασθενείς με άλλες όγκους του παγκρέατος (29 ασθενείς, συμπεριλαμβανομένων ορώδες κυσταδένωμα (7 περιπτώσεις), βλεννώδες κυσταδένωμα (8 περιπτώσεις), στερεά pseudopapillary όγκου (10 περιπτώσεις) και ενδο-πόρου θηλώδες βλεννώδες νεόπλασμα (4 περιπτώσεις)), χρόνια παγκρεατίτιδα ( CP, 19 ασθενείς), παγκρεατικό νευροενδοκρινή όγκο (ΡΝΕΤ, 19 ασθενείς) και υγιείς εθελοντές (30 περιπτώσεις) συλλέχθηκαν ως έλεγχοι. Ο καρκίνος του παγκρέατος, ΡΝΕΤ και άλλους όγκους του παγκρέατος διαγνώστηκαν με παθολογική εξέταση. CP διαγνώστηκε σύμφωνα με τα κλινικά διαγνωστικά κριτήρια. Τα δείγματα αίματος φυγοκεντρήθηκαν σε 3000 στροφές ανά λεπτό (rpm) για 10 λεπτά. Πλάσμα συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C πριν από τη χρήση. Τα επίπεδα του IGF-1 R πλάσμα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ανθρώπινο IGF-1R ELISA Kit (Αριθμός καταλόγου: CSB-E13766h, CUSABIO, Κίνα). Ακολουθώντας το πρωτόκολλο των κατασκευαστών

Η στατιστική ανάλυση

SPSS v.13.0 λογισμικού (SPSS, Inc, Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε για στατιστικές αναλύσεις. Συνεχής δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) και συγκρίθηκαν με ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA),

t

δοκιμή Student ή το Mann-Whitney

U

δοκιμής. Κατηγορικά δεδομένα παρουσιάστηκαν ως ποσοστό και σε σύγκριση με τη χρήση ενός χ

2 τεστ Pearson ή την ακριβή δοκιμασία Fisher, όταν ο αριθμός των κυττάρων ήταν & lt? 5. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση επιβίωσης χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως

P & lt? 0.05

.

Αποτελέσματα

MiR-497 ήταν προς τα κάτω σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς

εντοπίστηκαν MiR-497 επίπεδα σε 10 παγκρεατικά καρκινικά δείγματα και να συνδυαστούν με όγκο γειτονικούς ιστούς χρησιμοποιώντας ISH. Το μέσο ποσοστό των θετικών κυττάρων σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς ήταν 30,0% ± 35,4%, η οποία ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε ιστούς όγκων-δίπλα (93.5.0% ± 2,4%) (

P = 0.000

). ( Σχήμα 1)

επίπεδα MiR-497 σε παγκρεατικά ιστούς ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ISH (200 ×). (Α) αρνητικό έλεγχο. (Β) ISH για miR-497 στον παγκρεατικό ιστό καρκίνου. (C) ISH για miR-497 σε όγκο παρακείμενο ιστό. (Δ) Το μέσο ποσοστό των θετικών κυττάρων σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς ήταν 30.0% ± 35.4%, η οποία ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε ιστούς όγκων-γειτονικά (93.5.0% ± 2,4%). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

MiR-497 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό

Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης με miR-497 μιμείται ή αναστολέα, τα επίπεδα του miR-497 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω ή μειωτικά (Σχήμα S1 Α, Β). Επιπλέον, miR-497 ανέστειλε σημαντικά την προς τα πάνω ρύθμιση πολλαπλασιασμό των κυττάρων PDAC (Σχήμα 2 Α, Β). Σε αντίθεση, miR-497 προς τα κάτω ρύθμιση προήγαγαν τον πολλαπλασιασμό (Σχήμα 2 C, D).

Ο πολλαπλασιασμός αναλύθηκε με CCK-8 δοκιμασίας. (Α, Β) Επιμόλυνση με miR-497 μιμείται κατέστειλε PDAC κύτταρα πολλαπλασιασμού σε AsPC-1 και κύτταρα BxPC-3, αντίστοιχα. (C, D) Η επιμόλυνση με αναστολέα miR-497 προωθείται PDAC πολλαπλασιασμό των κυττάρων. (*

P

& lt?

0.05

)

Η

MiR-497 προωθείται ευαισθησία σε γεμσιταβίνη

Μετά τη θεραπεία γεμσιταβίνης για 48 ώρες, η. ποσοστά αναστολής των κυττάρων PDAC επιμολυσμένα με miR-497 μιμείται ήταν σημαντικά υψηλότερες από κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο μιμείται (Σχήμα 3 Α, Β). Κύτταρα μετεμβολιασμένα με miR-497 αναστολέα ήταν πιο ανθεκτικά στην θεραπεία γεμσιταβίνης από ότι τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο αναστολέα. (Σχήμα 3 Α, C).

(Α) κύτταρα AsPC-1 μορφομετατράπηκαν για 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 ηΜ γεμκιταβίνης για 48 ώρες. Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497 με επιμόλυνση μιμείται εκ νέου ευαισθητοποιημένα κύτταρα σε γεμσιταβίνη. Προς τα κάτω ρύθμιση του miR-497 με επιμόλυνση του αναστολέα μείωσε την ευαισθησία των κυττάρων σε γεμσιταβίνη. (Β) κύτταρα BxPC-3 μορφομετατράπηκαν για 24 ώρες, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σειριακά αραιωμένο γεμσιταβίνη (1 ηΜ, 10 ηΜ, 30 ηΜ, 100 ηΜ). Κύτταρα μετεμβολιασμένα με miR-497 μιμείται ήταν πιο ευαίσθητα σε γεμσιταβίνη. (Γ) Κύτταρα μετεμβολιασμένα με αναστολέα miR-497 ήταν πιο ανθεκτικά στην gemcitabine. (*

P

& lt?

0.05

).

Η

MiR-497 αυξημένη έκφραση της διασπασμένης κασπάσης-3 και PARP ενεργοποιείται με γεμσιταμπίνη

κασπάση-3 και Πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) είναι απαραίτητα για την απόπτωση. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη για 48 ώρες, και στη συνέχεια τα επίπεδα των διασπασμένη κασπάση-3 και PARP ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. Βρήκαμε ότι προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497 αύξησε τα επίπεδα της διασπασμένης κασπάσης-3 και διασπασμένη PARP (Σχήμα 4 Α, Β, Εικόνα S2). Αντιστρόφως, ρύθμιση προς τα κάτω του miR-497 μείωσε τα επίπεδα του διασπασμένη κασπάση-3 και διασπασμένη PARP. (Σχήμα 4 Α, Β, Εικόνα S2).

Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων. Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, AsPC-1 και BxPC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ και 10 ηΜ γεμκιταβίνης, αντίστοιχα. Μετά από επιπλέον 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται. (Α) Προς τα πάνω ρύθμιση miR-497 με επιμόλυνση μιμείται σε AsPC-1 κύτταρα αυξημένη έκφραση διασπασμένης κασπάσης-3 και PARP, ενώ η αναστολή του miR-497 με επιμόλυνση του αναστολέα μειωμένη έκφραση διασπασμένης κασπάσης-3 και PARP, χωρίς καμία επίδραση για τα επίπεδα των συνολικών κασπάσης-3 και PARP. (Β) ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε BxPC-3 κύτταρα.

Η

MiR-497 κατέστειλε την έκφραση της πρωτεΐνης IGF-1 R με σύνδεση στο 3′-UTR

Σύμφωνα με την πρόβλεψη της βάσεις δεδομένων ανοικτής πρόσβασης (TargetScan, στόχοι miRBase, PicTarget, microRNA.org), IGF-1R θεωρήθηκε ως υποψήφιος στόχος του miR-497. Για να επιβεβαιώσετε αυτήν την πρόβλεψη, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία λουσιφεράσης. Βρήκαμε δραστηριότητα λουσιφεράσης ήταν σημαντικά μειωμένη μετά από συν-διαμόλυνση του miR-497 μιμείται και φορείς που εκφράζουν άγριου αλληλουχία στόχο τύπου BxPC-3 κύτταρα, σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα συν-επιμολυσμένα με μιμείται και φορείς που εκφράζουν μεταλλαγμένη αλληλουχία στόχο (

P & lt ? 0,05

) (Σχήμα 5Α). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι IGF-1 R ήταν ένα άμεσο στόχο miR-497.

(Α) Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης μειώθηκε σημαντικά μετά συν-επιμόλυνση του miR-497 μιμείται και φορείς που εκφράζουν αλληλουχία άγριου τύπου-στόχου σε BxPC- 3 κύτταρα, σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα συν-επιμολυσμένα με μιμείται και φορείς που εκφράζουν μεταλλαγμένη αλληλουχία στόχο. (*

P

& lt?

0.05

). (Β) Τα επίπεδα mRNA του IGF-1 R ανιχνεύθηκαν με qRT-PCR. GAPDH επιδόθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η επιμόλυνση με μιμείται σε BxPC-3 κύτταρα δεν καταστέλλει την έκφραση του IGF-1 R mRNA. (Γ) Τα επίπεδα έκφρασης του IGF-1 R, ρ-ΑΚΤ και ΑΚΤ ανιχνεύθηκαν. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497 με επιμόλυνση μιμείται σε AsPC-1cells ανέστειλαν σημαντικά τα επίπεδα του IGF-1 R και ρ-ΑΚΤ, ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του miR-497 με επιμόλυνση του αναστολέα αύξησε τα επίπεδα του IGF-1 R και ρ-ΑΚΤ, χωρίς οποιαδήποτε επίδραση στα επίπεδα της ολικής ΑΚΤ. (Δ) Ίδια αποτελέσματα εμφανίζονται σε BxPC-3 κύτταρα.

Η

Για την περαιτέρω επιβεβαίωση, western αποτύπωση πραγματοποιήθηκε. Βρήκαμε ότι προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497 κατέστειλε την έκφραση του IGF-1 R πρωτεΐνης χωρίς καμία αλλαγή στην έκφραση του IGF-1 R mRNA (Σχήμα 5 Β, C, D, Εικόνα S3). Αντίθετα, προς τα κάτω ρύθμιση του miR-497 αυξήθηκε IGF-1 R έκφραση της πρωτεΐνης (Σχήμα 5 C, D, Εικόνα S3). Επιπρόσθετα, ερευνήσαμε το επίπεδο της π-ΑΚΤ διαμεσολαβείται από IGF-1 R. Παρατηρήσαμε ότι το επίπεδο της p-ΑΚΤ μειώθηκε σημαντικά μετά την προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497. Αντιθέτως, η αναστολή της miR-497 αύξησε το επίπεδο του ρ-ΑΚΤ (

P & lt? 0,05

). (Εικόνα 5 C, D, Εικόνα S3)

Τα επίπεδα IGF-1 R πλάσμα σε ασθενείς με παγκρεατικό καρκίνο

τα επίπεδα πλάσματος IGF-1 R ανιχνεύθηκαν με ELISA. Τα επίπεδα πλάσματος του IGF-1 R σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, χρόνια παγκρεατίτιδα, άλλες παγκρεατικών όγκων, ΡΝΕΤ και υγιείς εθελοντές ήταν 0.823 ± 0,57 ng /ml, 0,472 ± 0,42 ng /ml, 0,562 ± 0,3 ng /ml, 0,460 ± 0,21 ng /ml, 1,004 ± 0,50 ng /ml, αντίστοιχα. Τα επίπεδα σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος αυξήθηκε σημαντικά, σε σύγκριση με εκείνη σε ασθενείς με χρόνια παγκρεατίτιδα, άλλες παγκρεατικών όγκων και ΡΝΕΤ (

Ρ = 0,006

,

Ρ = 0,018

, και

P = 0.004

, αντίστοιχα.). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά των επιπέδων IGF-1 R πλάσματος μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος και υγιείς εθελοντές (

Ρ = 0,095

). (Σχήμα 6).

Τα επίπεδα πλάσματος IGF-1 R ανιχνεύθηκαν με ELISA. Τα επίπεδα στο πλάσμα IGF-1 R σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος ήταν συγκρίσιμη με εκείνη σε υγιείς εθελοντές, αλλά υψηλότερη από ότι σε ασθενείς με χρόνια παγκρεατίτιδα, άλλες παγκρεατικών όγκων και ΡΝΕΤ. Άλλες όγκους του παγκρέατος περιλαμβάνονται ορώδες κυσταδένωμα, βλεννώδες κυσταδένωμα, στερεά pseudopapillary όγκου και ενδο-πορογενές θηλώδες νεόπλασμα βλεννώδες. ΡΝΕΤ, νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος.

Η

Η διαγνωστική αξία του πλάσματος IGF-1R

Η διαγνωστική αξία του πλάσματος IGF-1R αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την καμπύλη ROC. Δείξαμε ότι το πλάσμα IGF-1 R εμφανίζεται μια τιμή για τη διάκριση καρκίνου του παγκρέατος από χρόνια παγκρεατίτιδα και ΡΝΕΤ (AUC = 0.713, 95% CI: 0,564 έως 0,862,

Ρ = 0,008

? AUC = 0.711, 95% CI: 0,581 έως 0,840,

Ρ = 0,009

, αντίστοιχα). Όταν η τιμή αποκοπής ορίζεται σε 0,257 ng /ml, η ευαισθησία και η ειδικότητα για τη διάκριση καρκίνου του παγκρέατος από χρόνια παγκρεατίτιδα ήταν 95,2% και 47,3%. Όταν η τιμή αποκοπής ορίζεται σε 0,699 ng /ml, η ευαισθησία και η ειδικότητα για τη διάκριση καρκίνου του παγκρέατος από ΡΝΕΤ ήταν 47,6% και 89,5%. Plasma IGF-1 R μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τη διαφοροποίηση του καρκίνου του παγκρέατος από άλλες παγκρεατικών όγκων (AUC = 0.634, 95% CI: 0,504 έως 0,763,

Ρ = 0,057

). Όταν η τιμή αποκοπής ορίζεται στο 0,925 ng /ml, η ευαισθησία και η ειδικότητα για τη διαφοροποίηση του καρκίνου του παγκρέατος του παγκρέατος από καλοήθεις όγκοι ήταν 33,3% και 89,7%.

Η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του IGF-1 R πλάσμα και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων και την επιβίωση ανάλυση

οι ασθενείς χωρίστηκαν σε ομάδες έκφραση υψηλού και χαμηλού χρησιμοποιώντας το 75

εκατοστημόριο των επιπέδων IGF-1 R πλάσμα. τοποθεσίες όγκου και το στάδιο ΤΝΜ συσχετίστηκαν με τα επίπεδα IGF-1 R πλάσματος (

Ρ = 0,013

,

P = 0,01

, αντίστοιχα. Πίνακας 1). Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης ήταν 18 μήνες και η 1-, 3-χρόνος ποσοστά επιβίωσης ήταν 64% και 23,1%, αντίστοιχα. Οι διάμεσοι χρόνοι επιβίωσης στις ομάδες υψηλής και χαμηλής έκφρασης ήταν 11 και 18 μήνες, αντιστοίχως. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά του συνολικού χρόνου επιβίωσης μεταξύ των ομάδων υψηλής και χαμηλής έκφρασης παρατηρήθηκε (

P = 0,366

).

Η

Συζήτηση

Μειωμένη miR-497 έκφρασης έχει καταδεικνύεται στο στήθος, του παχέος εντέρου και του τραχήλου της μήτρας [7], [8], [9]. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αναφορά σχετικά με τα επίπεδα έκφρασης του miR-497 σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς. Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497 μπορεί να καταστείλει τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιασμό, την προώθηση της απόπτωσης, να μειώσει τη μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων και την αύξηση χημειοευαισθησία [16], [17], [9]. Ωστόσο, οι ρόλοι και οι μηχανισμοί του miR-497 σε καρκίνο του παγκρέατος παραμένουν άγνωστοι. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε miR-497 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς. Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497 ανέστειλε πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αυξημένη απόπτωση και προωθείται ευαισθησία σε γεμσιταβίνη με απευθείας ρύθμιση προς τα κάτω την έκφραση της πρωτεΐνης IGF-1R.

Η μελέτη μας προσδιόρισε το ρόλο του miR-497 στη ρύθμιση της κακοήθειας του καρκίνου του παγκρέατος. Τα αποτελέσματα υποστήριξαν ότι ο πολλαπλασιασμός miR-497 ανέστειλε καρκινικά κύτταρα, προώθησε την απόπτωση και αυξημένη χημειοευαισθησία, όπως αναφέρθηκε από την βιβλιογραφία [9], [16], [17].

Στη συνέχεια, μελετήσαμε τους μηχανισμούς του miR-497 στη ρύθμιση της εξέλιξης του καρκίνου του παγκρέατος. Βρήκαμε IGF-1 R ήταν ένα άμεσο στόχο miR-497 από λουσιφεράσης δοκιμασία ρεπόρτερ, το οποίο επίσης αναφερθεί σε ορθοκολικούς καρκίνους και καρκίνους του τραχήλου της μήτρας [8], [9]. Πραγματοποιήσαμε επίσης κηλίδωση Western για περαιτέρω επιβεβαίωση. Δείξαμε ότι προς τα πάνω ρύθμιση miR-497 μειωμένων επιπέδων πρωτεΐνης IGF-1 R χωρίς καμία αλλαγή στην έκφραση του mRNA. Προς τα κάτω ρύθμιση του miR-497 αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης IGF-1 R. Επιπλέον, μελετήθηκε η έκφραση του IGF-1 R με τη μεσολάβηση κατάντη μοριακή. Βρήκαμε το επίπεδο της p-ΑΚΤ μειώθηκε σημαντικά μετά την προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497. Αναστολή της miR-497 αύξησε την έκφραση του ρ-ΑΚΤ. Ως εκ τούτου, πιθανολογείται ότι το miR-497 εξασθενεί την κακοήθεια του καρκίνου του παγκρέατος από τη μερική καταστολή IGF-1R μονοπάτι /AKT.

IGF-1R μονοπάτι /AKT έχει αναγνωριστεί για τη συμμετοχή στη ρύθμιση των πολλών βιολογικών διεργασιών των καρκίνων [18], [19]. ΑΚΤ να ενεργοποιήσετε BAD με φωσφορυλίωση επί Ser136 [20] ή ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ μέσω ρύθμισης ΙκΒ κινάσης (ΙΚΚ) [21], έτσι έχει σαν αποτέλεσμα αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα. μονοπατιού AKT περιλαμβάνει επίσης χημειοαντίσταση. αναστολή ΑΚΤ2 καταργεί gemcitabine επαγόμενη ενεργοποίηση ΑΚΤ2 και NF-κΒ, και ενισχύει gemcitabine επαγόμενη PUMA (p53-απορυθμίζεται ρυθμιστής της απόπτωσης) ρύθμιση προς τα άνω, με αποτέλεσμα την χημειοευαισθητοποίηση καρκίνους του παγκρέατος στη γεμσιταβίνη [22]. Σε συμφωνία με αυτές τις μελέτες, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η αναστολή της IGF-1 R μονοπάτι /ΑΚΤ μπορούσε εν μέρει ευθύνονται για τις συνέπειες της miR-497 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, miR-497 μπορεί επίσης να μετριάσει την κακοήθεια των καρκίνων με τη ρύθμιση άλλους στόχους, όπως TARBP2, Dicer, BCL2, CCND1, CCNE1, cdc25A, CCND3, CDK4. [23], [24], [25].

Η αυξημένη έκφραση του IGF-1R έχει βρεθεί σε πολλούς καρκίνους [26] και εμφανίζει προγνωστικές αξίες [27]. Υψηλή έκφραση του IGF-1 R σε ανθρώπινους ιστούς PDAC έχει επίσης αναφερθεί [11] και των συνεργατών με υψηλότερο βαθμό του όγκου και κακή επιβίωση [12]. Ωστόσο, τα επίπεδα στο πλάσμα IGF-1 R σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος δεν έχουν ανιχνευθεί. Η μελέτη μας έδειξε ότι τα επίπεδα στο πλάσμα IGF-1 R σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος αυξήθηκε σημαντικά, σε σύγκριση με εκείνη σε ασθενείς με χρόνια παγκρεατίτιδα, άλλες παγκρεατικών όγκων και ΡΝΕΤ. Αλλά δεν υπήρχε σημαντική διαφορά των επιπέδων στο πλάσμα IGF-1 R μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος και υγιείς εθελοντές, που θα μπορούσε να επεξηγηθεί εν μέρει από το εν λόγω IGF-1R ήταν γενικά εκφράζεται σε φυσιολογικούς ιστούς, όπως το ήπαρ, του ενδομητρίου και νευρικά κύτταρα [28]. Η αξία των πλάσμα IGF-1 R κατά τη διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος αξιολογήθηκε στην παρούσα μελέτη. Υπήρξε μια δυνητική αξία για τη διάκριση καρκίνου του παγκρέατος από χρόνια παγκρεατίτιδα, ΡΝΕΤ και άλλους όγκους του παγκρέατος. Όμως, η διαγνωστική ευαισθησία ή ειδικότητα δεν ήταν τέλεια, μεγάλο ανιχνεύσεις δείγματος που απαιτείται για τον εντοπισμό περαιτέρω τη διαγνωστική αξία του IGF-1 R πλάσμα.

στάδιο TNM συνδέθηκε με το πλάσμα επίπεδα IGF-1 R στη μελέτη μας. Οι ασθενείς με προχωρημένους όγκους στάδιο είχαν υψηλά επίπεδα στο πλάσμα IGF-1R. Plasma IGF-1 R μπορεί να είναι μια νέα βιοδείκτης για την καθοδήγηση στάδιο ΤΝΜ του καρκίνου του παγκρέατος. Παραδόξως, υψηλή έκφραση του πλάσματος IGF-1 R δεν ήταν δυσμενή προγνωστικό παράγοντα στην παρούσα μελέτη.

Συμπέρασμα

MiR-497 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς. Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-497 κατέστειλε την κακοήθεια του καρκίνου του παγκρέατος και επανα-ευαισθητοποιημένα κύτταρα PDAC να gemcitabine με απευθείας ρύθμιση προς τα κάτω την έκφραση της πρωτεΐνης IGF-1 R. Τα επίπεδα πλάσματος IGF-1 R σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος αυξημένη, και εμφανίζονται πιθανές τιμές για τη διάκριση του παγκρέατος αλλοιώσεις. IGF-1R θα μπορούσε να είναι, επίσης, ένα νέο βιοδείκτη πλάσματος για την καθοδήγηση στάδιο ΤΝΜ του καρκίνου του παγκρέατος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Το επίπεδο έκφρασης του miR-497 μετά επιμόλυνση μιμείται ή αναστολέα. έκφραση MiR-497 ανιχνεύθηκε με qRT-PCR. U6 επιδόθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Α) BxPC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-497 μιμείται έδειξαν αύξηση στην miR-497 έκφρασης. (Β) Κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολέα miR-497 έδειξε μια μείωση στην έκφραση miR-497. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. (*

P & lt? 0,05

)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0092847.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Σχετικά επίπεδα έκφρασης της διασπασμένης κασπάσης-3 και PARP. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. (Α) Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών σε κύτταρα AsPC-1. (Β) Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών σε BxPC-3 κύτταρα. (*

P & lt? 0,05

)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0092847.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Σχετικά επίπεδα έκφρασης του IGF-1 R και ρ-ΑΚΤ. Σχετικά επίπεδα έκφρασης δείχνονται ως μέση τιμή ± SD. (Α) Τα σχετικά επίπεδα του IGF-1 R και ρ-ΑΚΤ σε κύτταρα AsPC-1. (Β) Τα σχετικά επίπεδα των πρωτεϊνών σε BxPC-3 κύτταρα. (*

P & lt? 0,05

)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0092847.s003

(ΔΕΘ)