Αφηρημένο

Ιστορικό

Καρκίνος /αντιγόνα όρχεις (CTA) ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά ως ανοσογόνους στόχους που εκφράζονται κανονικά σε βλαστική κύτταρα, αλλά διαφορικά εκφραζόμενο σε ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη προσέγγιση επιγενετικών διαλογής για τον εντοπισμό συντονισμένα εκφρασμένα γονίδια στο ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) του οποίου η μεταγραφή οδηγείται από απομεθυλίωση υποκινητή.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

προσέγγιση διαλογής μας βρίσκονται 290 σημαντικές γονίδια από τους πάνω από 47.000 μεταγραφές ενσωματωθεί στη συστοιχία έκφρασης 2.0 Affymetrix Human Genome U133 Plus. Από τους κορυφαίους 55 υποψηφίους, 10 έδειξε τόσο διαφορική υπερέκφραση και περιοχή του υποκινητή υπομεθυλίωση στην NSCLC. Παραδόξως, 6 από τα 10 γονίδια που ανακαλύφθηκαν από αυτή την προσέγγιση ήταν CTAs. Χρησιμοποιώντας μια ξεχωριστή ομάδα των πρωτογενών όγκων και φυσιολογικό ιστό, μπορούμε επικυρωμένη υπομεθυλίωση NSCLC προαγωγό και αυξημένη έκφραση με ποσοτική RT-PCR για όλους τους 10 γονίδια. Σημειώσαμε σημαντική, συντονισμένη συνέκφραση πολλαπλών γονιδίων στόχων, καθώς και συντονισμένες απομεθυλίωση υποκινητή, σε ένα μεγάλο σύνολο των επιμέρους όγκων που συνδέθηκε με τον υπότυπο του SCC NSCLC. Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει 2 γονίδια νέα στόχο που παρουσίασαν προαγωγής ανάπτυξης επιδράσεις σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Συντονισμένη απομεθυλίωση υποκινητή σε NSCLC σχετίζεται με παρεκκλίνουσα έκφραση του CTAs και δυνατότητες, μυθιστόρημα υποψήφιος πρωτο-ογκογονίδια που μπορούν να προσδιοριστούν χρησιμοποιώντας ενοποιητική τεχνικές ανακάλυψης. Τα ευρήματα αυτά έχουν σημαντικές επιπτώσεις για την ανακάλυψη νέων CTAs και CT αντιγόνου κατευθύνεται ανοσοθεραπεία

Παράθεση:. Glazer CA, Smith IM, Ochs MF, Begum S, Westra W, Chang SS, et al. (2009) Ολοκληρωμένη Discovery επιγενετικώς αποκαταστέλλεται Καρκίνος Όρχεων αντιγόνα σε NSCLC. PLoS ONE 4 (12): e8189. doi: 10.1371 /journal.pone.0008189

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 18 Σεπ του 2009? Αποδεκτές: 16 του Νοέμβρη, 2009? Δημοσιεύθηκε: 4 Δεκεμβρίου 2009

Copyright: © 2009 Glazer et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Δρ. Califano υποστηρίζεται από μια Clinical Award Innovator από το Flight Attendant Medical Research Institute, και το National Cancer Institute σπορίων (5P50CA096784-05) και EDRN U01CA084986. Ο Δρ Glazer χρηματοδοτείται εν μέρει από ένα ΝΙΗ Τ32 Research Training Grant. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

είναι γνωστό ότι CTAs υπερεκφράζονται σε διάφορους τύπους όγκων, με μικρή ή καθόλου έκφραση σε κανονικό ανθρώπινο ιστό? Ωστόσο, ο μηχανισμός αυτής της διαφορικής έκφρασης δεν είναι καλά κατανοητός. [1] Οι επιγενετικές μεταβολές καθώς και οι μεταβολές στη μεθυλίωση προαγωγού έχουν συσχετιστεί με διαφορές έκφραση ειδική για τον καρκίνο σε ανθρώπινες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Υποστηρικτής υπερμεθυλίωση έχει κατά κύριο λόγο θεωρείται ως μηχανισμός ογκοκατασταλτικό γονίδιο αδρανοποίηση? Ωστόσο, η παγκόσμια γονιδιωματικό υπομεθυλίωση έχει αναφερθεί σε όλες σχεδόν τις όγκους [2], [4], [8], [9]. Είναι επίσης γνωστό ότι CTAs, ειδικά εκείνοι που κωδικοποιείται από το χρωμόσωμα Χ (αντιγόνα ΟΤ-Χ), εκφράζονται σε συνδυασμό με απομεθυλίωση προαγωγό ή ολόκληρο γενωμικού υπομεθυλίωση [10], [11], [12].

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, με πάνω από 213.000 νέα κρούσματα και 160.000 θάνατοι αναφέρθηκαν το 2007? NSCLC αντιπροσωπεύει περίπου το 75% αυτών των περιπτώσεων [13]. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας σε NSCLC οφείλεται σε διάγνωση σε προχωρημένο στάδιο, ένα υψηλό ποσοστό υποτροπής, παρά την οριστική τοποπεριοχική διαχείρισης, καθώς και το γεγονός ότι δεν έχουν θεραπείες για υποτροπιάζοντα καρκίνο των πνευμόνων έχουν συσχετιστεί με τη βελτίωση της μακροπρόθεσμης επιβίωσης [6].

μία προσέγγιση για τη βελτίωση της θνησιμότητας NSCLC υπήρξε η ανάπτυξη των εμβολίων κατά του καρκίνου που αποσκοπούν να επάγουν μια ανοσοαπόκριση ξενιστή έναντι των κυττάρων όγκου. CTAs είναι ελκυστικοί στόχοι για ανοσοθεραπεία όγκου, λόγω της περιορισμένης σχήματα έκφρασης τους σε φυσιολογικό ανθρώπινο ιστό. Για παράδειγμα, NY-ESO-1 και MAGEA3 σήμερα υποβάλλεται σε κλινικές δοκιμές σε διάφορους ανθρώπινους κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου NSCLC. Οι ερευνητές έχουν προτείνει ότι η συνδυασμένη χρήση των εκφράζονται συντονισμένα CTAs και άλλα αντιγόνα που σχετίζονται θα μπορούσε να βοηθήσει στο σχεδιασμό των πιο αποτελεσματικών, πολυδύναμα ανοσοθεραπευτική πρωτόκολλα στον NSCLC και άλλους τύπους όγκων? Ωστόσο, υπάρχουν σήμερα πολύ λίγα γνωστά σχετικά με τα σχέδια συν-έκφραση των γονιδίων αυτών [14], [15], [16].

Μέχρι σήμερα, μια ολοκληρωμένη, γονιδίωμα-ευρεία προσέγγιση για τον εντοπισμό εκφράζονται συντονισμένα CTAs και άλλα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια ενεργοποιούνται από απομεθυλίωση υποκινητή σε NSCLC δεν έχει διεξαχθεί. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μία νέα, ολοκληρωμένη προσέγγιση επιγενετικές διαλογής που συνδυάζει 5-αζα-δεοξυκυτιδίνη και τριχοστατίνη Α (/TSA 5-αζα) θεραπεία των φυσιολογικών κυττάρων του πνεύμονα και ανάλυση έκφρασης μικροσυστοιχιών mRNA πρωτογενούς ιστού για την ταυτοποίηση γονιδίων που είναι τόσο ενεργοποιούνται από DNA υπομεθυλίωση και διαφορικά υπερεκφράζεται με συντονισμένο τρόπο σε NSCLC. Ήμασταν σε θέση να καθορίσει ένα σύνολο εκφράζονται συντονισμένα CTAs και τα νέα, τα γονίδια προώθηση της ανάπτυξης που ενεργοποιούνται σε συνδυασμό με τη συντονισμένη απομεθυλίωση υποκινητή. Τα δεδομένα αυτά έχουν επιπτώσεις για το μηχανισμό ενεργοποίησης του CTAs, σχεδιασμό ανοσοθεραπευτικών στρατηγικών, καθώς και τον εντοπισμό των πιθανών πρωτοογκογονιδίων και νέων βιολογικών στόχων για το γονίδιο που κατευθύνεται θεραπείες για NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

ιστοπαθολογία

Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν από το τμήμα παθολογίας στο Johns Hopkins Hospital. Οι ιστοί ελήφθησαν μέσω Johns Hopkins Διοικητικό κριτική Θεσμικών εγκριθεί NA_00001911 πρωτόκολλο. Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε υποκείμενο πριν από τη χρήση των ιστών τους για επιστημονική έρευνα. Όγκου και φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα από χειρουργικά δείγματα καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο αμέσως μετά από χειρουργική εκτομή και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Κανονική δείγματα μικροτομή και DNA παρασκευάστηκε από φυσιολογικό πνευμονικό παρέγχυμα. δείγματα όγκου επιβεβαιώθηκαν να είναι NSCLC και ακολούθως μικροδιατομή να αποδώσει τουλάχιστον 80% των κυττάρων του όγκου. Tissue DNA και RNA εκχυλίστηκε όπως περιγράφεται παρακάτω.

5Aza-DC και TSA Θεραπεία Κυττάρων

κατεργάζεται φυσιολογικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου πνεύμονα (ΝΗΒΕ και SAEC, Lonza, Walkersville, MD) εις τριπλούν με 5-αζα-δεοξυκυτιδίνη (ένα ανάλογο κυτοσίνης το οποίο δεν μπορεί να είναι μεθυλιωμένα) και τριχοστατίνης α (αναστολέας αποακετυλάσης ιστόνης) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, τα κύτταρα χωρίστηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (2,5 χ 10

5 κύτταρα και mm δίσκου 6 × 10

5/100 για SAEC και ΝΗΒΕ αντίστοιχα) 24 ώρες πριν τη θεραπεία. Αποθεματικά διαλύματα 5Aza-dC (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και TSA (Sigma) διαλύθηκαν σε 50% οξικό οξύ και 100% αιθανόλη, αντίστοιχα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 υΜ 5Aza-δεοξυκυτιδίνη για 72 ώρες και 300 nmol /L TSA για τις τελευταίες 24 ώρες. Baseline έκφραση ιδρύθηκε από ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα με τον ίδιο όγκο οξικό οξύ ή αιθανόλη εις τριπλούν.

RNA Εκχύλιση και Oligonucleotide Microarray Analysis

Το συνολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Life Technologies, Gaithersburg, MD) και το κιτ RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών ολιγονουκλεοτιδίων χρησιμοποιώντας το U133 GeneChip Plus 2.0 Affymetrix μικροσυστοιχίες έκφρασης (Affymetrix, Santa Clara, CA). Τα δείγματα μετατρέπονται σε σημασμένο, αποσπασματικές, cRNA ανά το πρωτόκολλο Affymetrix για χρήση στη μικροσυστοιχία έκφρασης. ένταση του σήματος και η στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε για κάθε μεταγραφή χρησιμοποιώντας dChip έκδοση 2005 για να αναλύσει αρχικά και ομαλοποίηση των δεδομένων πίνακα και στη συνέχεια Σημασία ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM) [18]. εξόδου SAM υπολογίστηκε σε d-αξίας 1.126 δίδοντας ένα ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη και δ-βαθμολογία αποκοπής των 5.065% και 1.885. Αυτό εντόπισε συνολικά 12.132 απορυθμίζεται υποψηφίων γονιδίων μετά από θεραπεία 5Aza-DC /TSA. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι MIAME συμβατό, και η πρώτη δεδομένα έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME, GEO, όπως περιγράφεται από τον MGED Κοινωνία.

Δημόσια Σύνολα

Οι δημόσιες βάσεις δεδομένων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν η σειρά αναφοράς Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας Σάντα Κρουζ (UCSC) Ανθρώπινο Γονιδίωμα και η βάση δεδομένων σχολιασμό από το πάγωμα Μαρτίου 2006 (hg18). Έχουμε λάβει 40 φυσιολογικού πνεύμονα και 111 NSCLC μικροσυστοιχίες έκφρασης από τα σύνολα δεδομένων Expo (όλα εκτελούνται στην πλατφόρμα έκφρασης του mRNA 2,0 Affymetrix U133 Plus) διαθέσιμα στο διαδίκτυο ως μέρος του Gene Expression Omnibus (GEO /NCBI). αριθμοί πρόσβασης για αυτές τις σειρές είναι GSE1643 και GSE3141 αντίστοιχα. Οι μικροσυστοιχίες από το φυσιολογικό ιστό και όγκου ήταν το πρώτο κανονικοποιούνται για ανάλυση COPA χρησιμοποιώντας dChip έκδοση 2005.

Καρκίνος ακραίων τιμών Προφίλ Ανάλυση (COPA)

Θα εφαρμοστεί COPA σε ομάδα μας των 151 ιστούς (111 όγκους, 40 φυσιολογικά), με κάθε σύνολο δεδομένων γονιδιακής έκφρασης που περιέχει 54.613 σετ καθετήρα από την πλατφόρμα έκφρασης mRNA 2,0 Affymetrix U133 Plus. Εν συντομία, οι τιμές γονιδιακής έκφρασης ήταν διάμεσος επικεντρωμένη, θέτοντας διάμεση τιμή έκφρασης του κάθε γονιδίου στο μηδέν. Η μέση απόλυτη απόκλιση (MAD) υπολογίστηκε και κλιμακώνεται έως 1 διαιρώντας κάθε τιμή της γονιδιακής έκφρασης από το MAD του. Της σημείωσης, μεσαίο και το MAD χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό σε αντίθεση με την μέση και τυπική απόκλιση έτσι ώστε οι τιμές έκφρασης ακραία τιμή δεν επηρεάζουν αδικαιολόγητα τις εκτιμήσεις της κατανομής, και έτσι διατηρείται μετά την εξομάλυνση. Τέλος, τα εκατοστημόρια 75η, 90η, 95η και των μεταμορφωμένων τιμές έκφραση υπολογίζεται για κάθε γονίδιο και στη συνέχεια γονίδια rank-διέταξε από εκατοστημόριο βαθμολογίες τους, παρέχοντας μια λίστα προτεραιότητας των ακραία προφίλ. Για τους σκοπούς της κατάταξης-list μας, το 90ο εκατοστημόριο για όγκους επιλέχθηκε με βάση την ανάλυση του δείγματος μεγέθους (111 όγκους, 40 φυσιολογικά). Φυσιολογικό ιστό που είχε ένα 95ο εκατοστημόριο & gt? 2 αποκλείστηκε από τη λίστα κατάταξης μας. Συνολικά 35.764 μεταγραφές πληρούνται τα παραπάνω κριτήρια και κατατάχθηκαν. Για λεπτομέρειες σχετικά με τη μέθοδο που αναφέρεται στο Tomlins et. al [19].

Ολοκληρωμένες Επιγενετική

Είμαστε κατατάσσονται τα γονίδια στόχου από την πλατφόρμα έκφρασης mRNA 2,0 Affymetrix U133 Plus από COPA ρύθμιση προς τα πάνω κατά τη 90

ο εκατοστημόριο (από 111 όγκους και 40 φυσιολογικά ιστούς). Η πλατφόρμα U133 Plus mRNA 2,0 έκφρασης (Affymetrix, Santa Clara στην Καλιφόρνια) έχει περίπου 55.000 σετ καθετήρα. Μια δεύτερη Κατάταξη παρήχθη από την κατάταξη των γονιδίων κατά φθίνουσα σειρά του d-βαθμολογία τους, όπως υπολογίζεται από SAM μετά από 5-αζα επεξεργασία /TSA του φυσιολογικού πνεύμονα κυτταρικών σειρών (ΝΗΒΕ και SAEC). Ένα τρίτο Κατάταξη υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας 111 NSCLC και ένα πρόσθετο Expo σύνολο δεδομένων με 79 επιπλέον ιστούς πρωτογενούς όγκου NSCLC τρέξει επίσης στην πλατφόρμα έκφρασης του mRNA 2,0 Affymetrix Human Genome U133 Plus. Σε αυτά τα 190 στοιχειώδη δείγματα NSCLC, εμείς συσχετίζεται πρότυπα έκφρασης BORIS σε κάθε όγκου με την έκφραση όλων των μεταγραφές που ενσωματώνονται στο U133 Plus πίνακα 2.0 μέσω υπολογισμού του συντελεστή συσχέτισης με τη χρήση του Excel. Όλα τα γονίδια στη συνέχεια κατετάγη με βάση τη δύναμη του συσχετισμού μεταξύ της έκφρασης τους και ότι η έκφραση του BORIS σε όλα τα 190 δείγματα. Αυτές οι τρεις πηγές πληροφόρησης (γονίδιο σύνολο αποδεικνύοντας ρύθμιση προς τα άνω με 5-αζα, το σκορ COPA και BORIS συσχέτιση) συνδυάστηκαν με τη χρήση ενός προϊόντος rank (x * y * z). Αυτές οι τρεις βαθμολογίες συνδυάστηκαν για να ταξινομήσει όλους τους στόχους και μετάθεση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία σημασία με κατώτατο όριο α = 0,005, αποδίδοντας 290 σημαντικά γονίδια. Γονιδιωματικές αλληλουχίες ελήφθησαν για 122 αυτών των γονιδίων, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης γονιδίωμα UCSC, και η παρουσία των CpG νησίδων σε υποκινητών ή πρώτο εσώνιο αυτών των γονιδίων προσδιορίστηκε με MethPrimer το οποίο βασίζεται σε GC περιεχόμενο του & gt? 50%, & gt? 100 bp, & gt? 0,6 παρατηρήθηκε να αναμένεται CG [20]

DNA Extraction

τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και πέψη σε ένα διάλυμα απορρυπαντικού (δωδεκυλοθειικό νάτριο) και πρωτεϊνάση Κ, για την απομάκρυνση των πρωτεϊνών δεσμεύεται στην. DNA. DNA καθαρίστηκε με εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου και καταβύθιση αιθανόλης. Το DNA ακολούθως επαναιωρήθηκε σε 500 μL του Lote (EDTA 2,5 mmol /L και Tris-HCl 10 mmol /L) και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

κατεργασία όξινου θειώδους και Sequencing

2 ug του DNA από 28 NSCLCs και 11 φυσιολογικούς ιστούς του πνεύμονα υποβλήθηκαν σε κατεργασία όξινου θειώδους χρησιμοποιώντας το EpiTect® Bisulfite Kit (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτό όξινο θειώδες τροποποιημένου DNA στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C. Στη συνέχεια, κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές σχεδιασμένους με MethPrimer να εκτείνονται σε περιοχές των CpG νησίδων στον υποκινητή ή πρώτου ιντρονίου [20]. Primer ακολουθίες σχεδιαστεί ώστε να μην περιέχουν δινουκλεοτίδια CG. Primer αλληλουχίες είναι διαθέσιμες στον Πίνακα S1. Αγγίξτε κάτω Διεξήχθη PCR και τα προϊόντα καθαρίστηκαν επί πηκτής χρησιμοποιώντας το QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα ενισχυμένου DNA εφαρμόστηκε με φωλιασμένους εκκινητές για τις Applied Biosystems 3700 αναλυτή DNA χρησιμοποιώντας βαφή τερματισμού BD (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε ως που περιγράφεται παραπάνω και η συγκέντρωση για κάθε δείγμα μετρήθηκε. 1 ug του RNA στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για σύνθεση cDNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ολιγο-άΤ με το κιτ SuperScript Πρώτη Εφαρμογή Strand Synthesis (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα τελικά προϊόντα cDNA χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρες για επακόλουθες RT-PCR με εκκινητές που σχεδιάστηκαν ειδικά για κάθε υποψήφιο γονίδιο. 18s rRNA εξετάστηκε για να εξασφαλίζεται η ακριβής σχετική ποσοτικοποίηση σε ποσοτική RT-PCR. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το TaqMan 7900 (ΑΒΙ) σε πραγματικό χρόνο PCR μηχανή και το QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Primer σειρές είναι διαθέσιμες στον πίνακα S1.

Ποσοτική Unmethylation-ειδική PCR (QUMSP)

Για να ενισχύσει επιλεκτικά περιοχές απομεθυλιωμένο υποστηρικτής στα γονίδια ενδιαφέροντος, εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας δεδομένα από όξινο θειώδες αλληλουχία των πρωτοπαθών όγκων οι οποίες είναι δωρεάν μόνο σε ακολουθίες με όξινο θειώδες μετατρέπεται γνωστό ότι απομεθυλιώνεται σε όγκους. Primer συνδυασμούς επικυρώθηκαν με τη χρήση

in vitro

μετουσιωμένο και απομεθυλιωθεί ελέγχους. Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το TaqMan 7900 (ΑΒΙ) σε πραγματικό χρόνο PCR μηχάνημα με πρότυπες καμπύλες και κανονικοποίηση προς Βήτα-ακτίνης εναρκτήρες που δεν περιέχουν CpG στην αλληλουχία για ποσοτικοποίηση. Primer αλληλουχίες είναι διαθέσιμες στον Πίνακα S1.

Επιμόλυνση Ανθρώπινων φορέων έκφρασης και Δοκιμασία AD Ανάπτυξης

Ένα πλήρους μήκους ORF cDNA του SBSN και ΝΥ-ΕδΟ-1 ελήφθησαν για παροδικές επιμολύνσεις από ΟηΟεηε σε ένα φορέα pCMV6-Entry (Rockville, Maryland). Οι κυτταρικές γραμμές επιστρώθηκαν σε 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο χρησιμοποιώντας πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν με είτε κενό φορέα ή φορέα που περιέχει το γονίδιο ενδιαφέροντος χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Fugene 6 Transfection (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) σύμφωνα με τον κατασκευαστή του πρωτόκολλο. Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8) (Dojindo? Rockville, Maryland) απορρόφηση μετρήθηκε με την 96-φρεατίων αναγνώστη πλακός φθορισμού Spectramax M2e Molecular Devices (Sunnyvale, California). Όλα τα πειράματα ανάπτυξης AD διεξήχθησαν εις τριπλούν για όλες τις κυτταρικές σειρές και φορείς.

Anchorage-Ανεξάρτητοι Δοκιμασία Ανάπτυξης

Soft δοκιμασίες άγαρ διεξήχθησαν μετά από επιμόλυνση των κυττάρων με φορείς έκφρασης θηλαστικών pCMV6-Entry που περιέχουν κασέτα αντίστασης G418 (ΟηΟεηε). Τα κύτταρα μετρήθηκαν και περίπου 5000 προστέθηκαν σε κάθε πλάκα 6 φρεατίων. Το κάτω στρώμα αποτελείται από άγαρ 0,5%, RPMI + 10% FBS, ενώ τα κύτταρα αιωρούνται σε ένα άνω στρώμα 0,35% άγαρ, RPMI + 10% FBS και G418 (300 μg /ml). Μαλακό δοκιμασίες άγαρ επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 12 ημέρες. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για όλες τις κυτταρικές σειρές και φορείς.

Στατιστική Ανάλυση

Αναζητήσαμε ομοιότητες στα πρότυπα μεθυλίωσης μεταξύ γονιδίων εκτελώντας μια ανάλυση συσχέτισης μεταξύ αναγνώσεων QUMSP τα γονίδια απέναντι όλα τα δείγματα. δοκιμών μετάθεση συσχέτιση Spearman χρησιμοποιήθηκε με 1.000 μεταθέσεις των δειγμάτων για τη δημιουργία σημασία, με α = 0,05. Για τα δεδομένα της έκφρασης, έχουμε log-μετασχηματιστεί των κανονικοποιημένων δεδομένων και εκτελείται ανάλυση συσχέτισης για όλα τα δείγματα μεταξύ έκαστου από τα γονίδια στη μελέτη. Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε με υποθέτοντας κανονική κατανομή στα επίπεδα έκφρασης log-μετασχηματισμένα και εφαρμόζοντας κατανομή t του Student με μία άλφα του 0.05. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Matlab.

Αποτελέσματα

Μια προσέγγιση Μυθιστόρημα Integrative Επιγενετική στην οθόνη για την CTAs και Συναφών επιγενετικώς γονιδίων που ρυθμίζονται

Έχουμε αναπτύξει μια ολοκληρωμένη, υψηλής απόδοσης προσέγγιση για την οθόνη για CTAs και άλλα εκφράζονται συντονισμένα γονιδίων βασίζεται σε τρεις βασικές προηγουμένως δημοσιευθέντα παράγοντες: (1) οι CTAs εκφράζονται σε βλαστικής σειράς κυττάρων και πολλούς όγκους, αλλά όχι σε φυσιολογικό σωματικό ιστό [1], [21], (2) CTAs έχουν προαγωγό CpG νησιά που μεθυλιώνονται και σιγήσει σε φυσιολογικό σωματικό ιστό, αλλά, πειραματικά, μπορεί να εκφραστεί με απομεθυλίωση υποκινητή [1], [10], [11], [12] και (3), ο παράγοντας μεταγραφής BORIS έχει δειχθεί ότι επάγει de -repression αρκετών CTAs σε NSCLC και άλλα όγκου /τύπους ιστού (Εικόνα 1Α) [22], [23], [24], [25].

(Α) Σχηματική περιγραφή της ολοκληρωμένη στρατηγική επιγενετικές διαλογής που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη που συνδύασε τη φαρμακολογική απομεθυλίωση της κανονικής κυτταρικές σειρές, συγκριτική ανάλυση στοιχείων COPA στην πρωτοβάθμια ιστού και η συσχέτιση της έκφρασης των γονιδίων με τη επιγενετικές ρυθμιστή BORIS στην πρωτοβάθμια ιστό. (Β) Εκπρόσωπος COPA γράφημα

MAGEA12

αποδεικνύουν την στατιστική προσέγγιση που χρησιμοποιείται για να βρει υποψήφιο υπερεκφράζεται CTAs και των σχετικών γονιδίων. Διαφορά σε όγκο έναντι φυσιολογική έκφραση ήταν σημαντική, τιμή ρ & lt? 0,00001 όπως μετράται με Mann-Whitney U test. (Γ) ρύθμιση Upfold της έκφρασης mRNA σε αγωγή φυσιολογικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα, ΝΗΒΕ και SAEC, όπως μετράται από την πλατφόρμα έκφρασης του mRNA 2,0 Affymetrix Human Genome U133 Plus.

Η

Ο πρώτος βραχίονας του προσέγγιση διαλογής μας συμμετέχει ο φαρμακολογική απομεθυλίωση 2 φυσιολογικό πνεύμονα κυτταρικές σειρές, Normal Human Βρογχικό Επιθηλιακά (ΝΗΒΕ) και Ανθρωπίνων μικρά επιθηλιακά (SAEC) κύτταρα (Lonza, Walkersville, MD), χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο θεραπείας /TSA 5-αζα που έχει ήδη επιτυχές στον καθορισμό υποψήφιος ογκοκατασταλτικά γονίδια από κυτταρικές σειρές απομεθυλίωσης όγκου. Με την κατανόηση ότι οι CTAs σιγήσει από μεθυλίωση σε φυσιολογικό ιστό, χρησιμοποιήσαμε φυσιολογικές κυτταρικές σειρές για την ταυτοποίηση γονιδίων που συνήθως καταστέλλεται σε φυσιολογικούς ιστούς, αλλά μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί εκφράζεται από φαρμακολογική χειρισμό. Δύο φυσιολογικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα, ΝΗΒΕ και SAEC, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ 5-αζα δεοξυκυτιδίνης για 72 ώρες και τριχοστατίνη Α για 24 ώρες πριν από τη συλλογή ολικού RNA για ανάλυση της σειράς έκφρασης χρησιμοποιώντας το Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 πλατφόρμα έκφρασης. Τα αποτελέσματα αυτά στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας dChip και Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM) [17], [18]. Γονίδια κατατάσσονται με βάση την βαθμολογία SAM τους (δ). SAM ανέφεραν επίσης την πτυχή αλλαγή στην μέση έκφραση των γονιδίων-στόχων στην ομάδα θεραπείας /TSA 5-αζα έναντι της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 1Β).

ταυτόχρονα ανέλυσε στοιχεία από 40 φυσιολογικού πνεύμονα και 111 έκφρασης NSCLC μικροσυστοιχίες από σύνολα δεδομένων Expo (όλα τρέχουν στην πλατφόρμα έκφρασης του mRNA 2,0 Affymetrix Human Genome U133 Plus) στη διάθεση του κοινού στο διαδίκτυο ως μέρος του Gene Expression Omnibus (GEO /NCBI). Για την ανάλυση μας από αυτά τα 151 σύνολα δεδομένων συστοιχίας έκφραση πρωτογενούς ιστού, χρησιμοποιήσαμε μια τεχνική γνωστή ως Cancer ακραίων τιμών Προφίλ Ανάλυση (COPA). COPA είναι μια μέθοδος για να ψάξετε σημαντική υπερέκφραση συγκεκριμένων γονιδίων που εμφανίζονται μόνο σε ένα υποσύνολο των περιπτώσεων, ενώ παραδοσιακές αναλυτικές μεθόδους που βασίζονται σε τακτικές στατιστικές μετρήσεις αδυνατούν να βρουν τα γονίδια με αυτό το είδος του προφίλ έκφρασης [19]. COPA ήταν μια ιδιαίτερα χρήσιμη μέθοδος για μας για να ψάξετε CTAs και γονίδια με παρόμοιο προφίλ έκφρασης με βάση προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι CTAs τα ετερογενή εκφράζεται τόσο σε ένα ευρύ πληθυσμό των ασθενών και εντός των μεμονωμένων δειγμάτων όγκου [26], [27], [28] . Γονίδια με μια κανονική έκφραση COPA ιστού κλίμακα βαθμολογίας & gt? 2 στο 95ο εκατοστημόριο, αφαιρέθηκαν από τη λίστα κατάταξης. Όλα τα υπόλοιπα γονίδια στη συνέχεια κατετάγη βάση την βαθμολογία COPA τους στο 90

ου εκατοστημόριο? στατιστική σημασία των διαφορών έκφρασης στα διαγράμματα COPA μετρήθηκαν με Mann-Whitney U test (Σχήμα 1 C).

Για την τελική του βραχίονα προσέγγιση διαλογής μας, χρησιμοποιήσαμε τα προηγούμενα δεδομένα που με 111 NSCLC και μια πρόσθετη Expo σύνολο δεδομένων με 79 επιπλέον ιστούς πρωτογενούς όγκου NSCLC τρέξει επίσης στην πλατφόρμα έκφρασης του mRNA 2,0 Affymetrix Human Genome U133 Plus. Σε αυτά τα 190 στοιχειώδη δείγματα NSCLC, εμείς συσχετίζεται πρότυπα έκφρασης BORIS σε κάθε όγκου με την έκφραση όλων των μεταγραφές που ενσωματώνονται στο U133 Plus πίνακα 2.0 μέσω υπολογισμού του συντελεστή συσχέτισης με τη χρήση του Excel. Όλα τα γονίδια στη συνέχεια κατετάγη με βάση τη δύναμη του συσχετισμού μεταξύ της έκφρασης τους και εκείνη της έκφρασης BORIS σε όλα τα 190 δείγματα.

Τρεις λίστες κατάταξης παρήχθησαν από την κατάταξη των γονιδίων με βάση τη βαθμολογία SAM (δ) μετά από 5-αζα /επεξεργασία TSA σε κανονικό πνεύμονα κυτταρικές σειρές, το σκορ COPA στην πρωτοβάθμια ιστό, και BORIS αντιστοιχίας του πρωτογενούς ιστού. Αυτές οι 3 πίνακες κατάταξης συνδυάστηκαν με τη χρήση ενός προϊόντος rank (x * y * z). Χρησιμοποιώντας ένα όριο σημαντικότητας (α = 0,005) και την επακόλουθη τυχαία μεταθέσεων της κατάταξης-λίστες μας, εντοπίσαμε 290 γονίδια που ήταν σημαντικά διαφορικά απορυθμίζεται με βάση την επιγενετική εξέταση και πρότυπα έκφρασης μικροσυστοιχιών ιστού (Πίνακας S2) [29].

Αρχικά, ένα

in silico

προσέγγιση αξιοποιώντας MethPrimer χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την παρουσία των CpG νησίδων στις περιοχές υποκινητή των κορυφαίων υποψηφίων μας [20]. Η κορυφή 100 από τις 290 σημαντικές γονίδια, καθώς και 22 γονίδια που επιλέχθηκαν με βάση την βιολογική σημασία στη σχετίζονται με τον καρκίνο μονοπάτια επιλέχθηκαν να προβληθεί μέσω αυτής της προσέγγισης, και 101 βρέθηκαν να περιέχουν 1 ή περισσότερα υποστηρικτής CpG νησίδων.

στη συνέχεια χρησιμοποιείται μια ξεχωριστή ομάδα από 11 φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων από ασθενείς χωρίς διάγνωση του καρκίνου για να επιβεβαιώσετε επιγενετική αποσιώπηση μέσω μεθυλίωσης προαγωγό σε κανονικό πνεύμονα βλεννογόνο από ασθενείς χωρίς νεόπλασμα του πνεύμονα. Bisulfite αλληλούχιση των CpG νησίδων στις περιοχές υποκινητή των 55 επιλεγμένων στόχων γονίδιο με CpG νησίδων χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η κατάσταση μεθυλίωσης. Μόνο 17/55 περιοχές υποκινητή κατέδειξε πλήρη μεθυλίωση σε όλα αλληλουχία CpG θέσεις σε όλες ή σχεδόν όλες από τους φυσιολογικούς ιστούς (Πίνακας S2). Οι στόχοι αυτοί στη συνέχεια όξινο θειώδες αλληλουχία σε μια ξεχωριστή ομάδα από 28 πρωτοβάθμια NSCLC για να αναζητήσετε την παρουσία της υπομεθυλίωσης υποκινητή. Από αυτά τα υπόλοιπα στόχους, 10/17 έδειξε απομεθυλίωση προαγωγό σε κάποιο κλάσμα των όγκων, συμπεριλαμβανομένων:

MAGEA3

(13/28, p = 0,0067),

MAGEA12

(19/28, p = 0,0001 ),

MAGEA4

(9/27, p = 0,0378),

MAGEA1

(21/27, p = 0,0001),

SBSN

(13/28, p = 0.0067),

TKTL1

(5/27, p = 0,2949),

MAGEA5

(9/23, p = 0,0172),

ZNF711

(21/24, σ = 0,0001),

NY-ESO-1

(14/20, p = 0,0002),

G6PD

(17/18, p = 0,0014), (ακριβής δοκιμασία του Fisher, δύο όψεων ) (Πίνακας 1 και Σχήμα 2)

Παρουσιάζονται οι διθειώδες αποτελέσματα αλληλούχισης μαζί με τις σχετικές τιμές ρ σε 28 δείγματα όγκου NSCLC και 11 κανονικούς ιστούς των πνευμόνων για:.

MAGEA3

(13/28, σελ = 0.0067),

MAGEA12

(19/28, p = 0,0001),

MAGEA4

(9/27, p = 0,0378),

MAGEA1

(21/27, p = 0,0001),

SBSN

(13/28, p = 0,0067),

TKTL1

(5/27, p = 0,2949),

MAGEA5

(9/23 , p = 0,0172),

ZNF711

(21/24, p = 0,0001),

NY-ESO-1

(14/20, p = 0,0002),

G6PD

(17/18, p = 0,0014). Στις παρενθέσεις είναι ο λόγος του απομεθυλιωμένου υποκινητών σε όγκους και τις τιμές ρ όπως υπολογίζεται από το ακριβές τεστ του Fisher συγκρίνοντας απομεθυλίωση σε όγκους έναντι φυσιολογικά. Σκιασμένο κουτιά αντιπροσωπεύουν μεθυλιωμένο υποστηρικτές, ND = κατάσταση μεθυλίωσης δεν καθορίζεται από το όξινο θειώδες αλληλουχίας.

Η

Η μεταγραφική ρύθμιση προς τα άνω των γονιδίων-στόχων μετά από 5-αζα επεξεργασία /TSA στο σύστημά μας γραμμή κυττάρων επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική RT -PCR στις 5-αζα /TSA-αγωγή φυσιολογικά κύτταρα σε σύγκριση με ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα για αυτά τα 10 γονίδια (Σχήμα S1). Κάθε γονίδιο με εξαίρεση

MAGEA12

παρουσίασαν σημαντική αυξητική ρύθμιση από 5-αζα επεξεργασία /TSA σε τουλάχιστον μία κυτταρική γραμμή που υποστηρίζει λειτουργικό ρύθμιση των γονιδίων με υπομεθυλίωση του υποκινητή.

CTAs και των συνδεδεμένων γονίδια είναι συντονισμένη απομεθυλιωθεί και έκφραση συσχετίζεται με Διοργανωτή απομεθυλίωση

για να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα θειώδους αλληλουχίας σε γονίδια-στόχους μας και να παρέχει ένα σύνολο δεδομένων των συνεχών μεταβλητών για να εκφράσει την κατάσταση της απομεθυλίωση υποκινητή, έχουμε επινοήσει μια ταχεία, ποσοτική δοκιμασία για ειδικά μέτρησης μη-μεθυλιωμένα προαγωγούς, την οποία ονομάζονται ποσοτικοί Unmethylation-ειδική PCR (QUMSP). Εμείς δοκιμάστηκαν DNA που εξάγεται από κοόρτη μας της 28ης πρωτογενούς δείγματα όγκου NSCLC και 11 φυσιολογικά δείγματα πνεύμονα από ασθενείς μη-καρκίνου (Σχήμα 3Α). Σημαντικές όγκου-ειδική απομεθυλίωση βρέθηκε σε

MAGEA3

(p & lt? 0.005),

MAGEA12

(p & lt? 0.025),

MAGEA4

(p & lt? 0.018),

MAGEA1

(p & lt? 0.001),

TKTL1

(p & lt? 0.025) και

MAGEA5

(p & lt? 0.007). Δύο επιπλέον στόχοι ελαφρώς έχασε σημαντικότητας στο α & lt? 0,05,

SBSN

(p & lt? 0,07) και

NY-ESO-1

(p & lt? 0,09) (2 tailed t-test του Student υποθέτοντας άνισες διακύμανσης ).

(Α) QUMSP διεξήχθη στην ομάδα μας των 28 NSCLC και 11 φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, οι μέσες τιμές δείχνονται αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των μη μεθυλιωμένων υποκινητών σε λογαριθμική κλίμακα. Στατιστικά σημαντική όγκου-ειδική απομεθυλίωση βρέθηκε σε

MAGEA3

,

MAGEA12

(p & lt? 0.025),

MAGEA4

(p & lt? 0.018),

MAGEA1

(p & lt? 0.001),

TKTL1

(p & lt? 0.025) και

MAGEA5

(p & lt? 0.007). Δύο επιπλέον στόχοι ελαφρώς έχασε σημαντικότητας στο α & lt? 0,05,

SBSN

(p & lt? 0,07) και

NY-ESO-1

(p & lt? 0,09) (2 tailed t-test του Student υποθέτοντας άνισες διακυμάνσεις ). (Β) Ανάδοχος υπομεθυλίωσης (QUMSP) μήτρας ρ-τιμή συσχέτισης για NSCLC (n = 28? Δοκιμή μετάθεση συσχέτισης Spearman του). Σκιασμένα πεδία παριστάνουν σημαντικές π-αξίες.

Η

Δεδομένου του όγκου συγκεκριμένο μοτίβο απομεθυλίωση δει για τα γονίδια στόχους μας, είμαστε δίπλα θέλησε να προσδιορίσει αν απομεθυλίωση των περιοχών προαγωγού αυτών των γονιδίων συνέβη με συντονισμένο τρόπο μέσα δείγματα όγκων. Χρησιμοποιήσαμε δοκιμές μετάθεση συσχέτιση του Spearman για να προσδιοριστούν σημαντικές συντονισμένη απομεθυλίωση χρησιμοποιώντας τα QUMSP αποτελέσματα από κοόρτη μας της 28ης NSCLC (Σχήμα 3Β). Η μήτρα ρ-τιμή συντελεστή συσχέτισης του Spearman δείχνει ότι για οποιοδήποτε από τα γονίδια στόχου, απομεθυλίωση έτεινε να συμβεί συντονισμένα με ένα ελάχιστο 6 από τα άλλα γονίδια. Σκιασμένα πεδία παριστάνουν σημαντικές π-αξίες. Αυτό προσφέρει ενδείξεις ότι η μεθυλίωση σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με τη συντονισμένη ρύθμιση αυτών των CTAs και των σχετικών γονιδίων-στόχων σε NSCLC, και υποδηλώνει σαφώς μια επιγενετική μηχανισμός ενεργοποίησης.

Για να επιβεβαιώσετε όγκου ειδική έκφραση των γονιδίων στόχων μας, χρησιμοποιήσαμε ποσοτική RT-PCR για να προσδιοριστεί η έκφραση του mRNA σε ομάδα μας του NSCLC και του φυσιολογικού ιστού του πνεύμονα (Σχήμα S2A-J). Έξι γονίδια είχαν σημαντικά αυξημένη έκφραση σε όγκους

MAGEA12

(p & lt? 0.02),

SBSN

(p & lt? 0.002),

TKTL1

(p & lt? 0.02),

ZNF711

(p & lt? 0.008),

NY-ESO-1

(p & lt? 0.001),

G6PD

(p & lt? 0.006). Τρία γονίδια χάσει ελαφρώς σημαντικότητα σε α & lt? 0.05 επίπεδο:

MAGEA3

(p & lt? 0,09),

MAGEA4

(p & lt? 0,06) και

MAGEA1

(p & lt? 0,08) (2 tailed t-test του Student υποθέτοντας άνισες διακύμανσης).

Είμαστε δίπλα θέλησε να προσδιορίσει αν απομεθυλίωση ήταν υπεύθυνη για την αποκαταστολή του CTAs και των σχετικών γονιδίων σε NSCLC. Τέσσερα γονίδια στόχους έδειξαν μια σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του mRNA (ποσοτική RT-PCR) και υπομεθυλίωση υποκινητή (QUMSP):

MAGEA12

(p = 0,024),

MAGEA4

(p & lt? 0.004),

SBSN

(p = 0,004) και

NY-ESO-1

(p & lt? 0,004) (Εικόνα S3A-D) (δοκιμή μετάθεση συσχέτισης Spearman του).

TKTL1

(p = 0,1),

MAGEA5

(p = 0,104) και

MAGEA3

(p = 0,2) παρουσίασαν επίσης θετική συσχέτιση μεταξύ απομεθυλίωση και της έκφρασης, αλλά έχασε σημασίας (Πίνακας S3). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν απομεθυλίωση των περιοχών υποκινητή είναι εν μέρει υπεύθυνη για τη ρύθμιση της πλειονότητας των γονιδίων-στόχων μας.

CTAs και των συνδεδεμένων Target γονίδια εκφράζονται συντονισμένα

Με βάση τα συμπεράσματα στις προηγούμενες αναλύσεις μας κοόρτη πρωτογενούς ιστού που δείχνουν ότι αυτά τα γονίδια στόχους εκφράζονται διαφορικά σε όγκους, περιοχές προαγωγέα τους συντονισμένα απομεθυλιωθεί εντός των όγκων και η έκφραση συσχετίζεται με απομεθυλίωση, εξετάσαμε την αρχική μας ομάδα των 111 όγκων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα έκφρασης mRNA 2,0 Affymetrix Human Genome U133 Plus για να καθοριστεί εάν τα γονίδια στόχος μας ήταν συντονισμένα εκφράζονται σε δείγματα όγκων σε αυτό το μεγάλο σύνολο του δείγματος. Το Σχήμα 4Α δείχνει ένα χάρτη θερμότητας της έκφρασης μεταγράφου όπως μετράται από το U133 Plus 2.0 συστοιχίας για 40 δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα από ασθενείς μη καρκινικά δείγματα και 111 πρωτογενούς ιστού NSCLC. Αυτό το σχήμα απεικονίζει τη σχέση της έκφρασης μεταξύ των γονιδίων-στόχων 10 σε φυσιολογικά και καρκινικά δείγματα. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν πρώτα ρυθμίζοντας την μέση και τυπική απόκλιση του κάθε γονιδίου σε 0 και 1 αντίστοιχα σε όλες 151 δείγματα. Τα δεδομένα στη συνέχεια συγκεντρώνονται στην περιοχή του δείγματος με τη χρήση ιεραρχικής ομαδοποίησης με μέσο σύνδεσης και Ευκλείδεια μετρική απόστασης. Αυτό έδωσε τρεις συστάδες: 1) όλα τα 40 δείγματα φυσιολογικού, 2) 43 από τα δείγματα όγκου 111 παρουσιάζει υψηλή έκφραση στα περισσότερα από τα γονίδια και την ισχυρή συσχέτιση μεταξύ τους (Tumor 1), και 3) 52 από 111 δείγματα όγκων που δείχνουν χαμηλότερη έκφραση αλλά με την έκφραση ακόμη πάνω από φυσιολογικά (Tumor 2). Τα υπόλοιπα 16 από 111 δείγματα όγκων δεν σύμπλεγμα μαζί ή σε αυτές τις ομάδες. Αυτή η ανάλυση δεν είναι μόνο υπό την προϋπόθεση επιβεβαίωση ότι η έκφραση των γονιδίων στόχων μας περιορίζεται σε ένα υποσύνολο των όγκων με μικρή ή καθόλου έκφραση στον φυσιολογικό ιστό, αλλά επίσης, ότι οι στόχοι αυτοί φαίνεται να εκφράζονται συντονισμένα σε ένα μεγάλο υποσύνολο, 38,7%, από αυτά όγκων.

(Α) Heat χάρτης της έκφρασης μεταγράφου όπως μετράται από την πλατφόρμα έκφρασης του mRNA 2,0 Affymetrix Human Genome U133 Plus.