Αφηρημένο

Ο αριθμός των καρκίνων εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του Νικοτιναμίδιο φωσφοριβοσυλ τρανσφεράσης (Nampt). Ωστόσο, ο μηχανισμός μέσω του οποίου ρυθμίζεται αυξητικά Nampt είναι ασαφής. Στη μελέτη μας, βρήκαμε ότι η FK866 Nampt-ειδικό χημικό αναστολέα ανέστειλε σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων και τα επίπεδα μειώνονται δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου-αδενίνης (NAD) σε κυτταρικές σειρές LoVo και SW480. αναλύσεις βιοπληροφορική πρότεινε ότι το miR-26β στοχεύει Nampt mRNA. Ταυτοποιήσαμε Nampt ως ένα νέο στόχο του miR-26b και απέδειξαν ότι miR-26b αναστέλλει την έκφραση Nampt στην πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA με σύνδεση προς το Nampt 3′-UTR. Επιπλέον, βρήκαμε ότι miR-26b ήταν κάτω ρυθμίζονται σε καρκινικούς ιστούς σε σχέση με εκείνη σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς σε 18 ασθενείς με καρκίνο του παχέος. Μια στατιστικά σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-26b και έκφραση Nampt παρατηρήθηκε σε δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και σε 5 ορθοκολικού κυτταρικές γραμμές (ΗΤ-29, SW480, SW1116, LoVo, και HCT116). Επιπλέον, πάνω από την έκφραση του miR-26b παρεμποδίζει ισχυρά την επιβίωση των κυττάρων LoVo και εισβολή, ένα αποτέλεσμα εν μέρει καταργηθεί με την προσθήκη NAD. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη απέδειξε ότι το NAD-ανάσυρση βιοσύνθεσης μονοπάτι που περιλαμβάνουν Nampt θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην επιβίωση του παχέος καρκινικών κυττάρων. MiR-26β μπορεί να χρησιμεύσει ως καταστολέας των όγκων με τη στόχευση Nampt

Παράθεση:. Zhang C, Tong J, Huang G (2013) Νικοτιναμίδιο φωσφοροριβοσυλ-τρανσφεράσης (Nampt) είναι ο στόχος του microRNA-26b σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (7): e69963. doi: 10.1371 /journal.pone.0069963

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27η του Φεβρουαρίου 2013? Αποδεκτές: 13 Ιούν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 του Ιούλη του 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθμούς 30830038, 30970842, 81071180, 81000929)? «973» του έργου (2012CB932604)? Έργο Νέα Drug Discovery (2012ZX09506-001-005)? Βασικό έργο της Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (αριθμός 10JC1410000)? και η κορυφαία ακαδημαϊκά Πειθαρχία σχέδιο της Σαγκάης (αριθμός S30203). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η πρωτεΐνη νικοτιναμίδη φωσφοριβοσυλ τρανσφεράσης (Nampt) έχει διάφορες λειτουργίες. Υπάρχει σε μεσοκυττάρια (iNAMPT) και εξωκυττάριο (eNAMPT) μορφές [1]. Σε κύτταρα, λειτουργεί ως ένα ένζυμο περιορισμού ρυθμού στην οδό διάσωσης για τη σύνθεση του δινουκλεοτιδίου νικοτιναμιδίου-αδενίνης (NAD), η οποία εμπλέκεται στο μεταβολισμό των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό. [2] Εξωκυτταρική Nampt αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως αποικία προ-Β-κυττάρων ενισχύοντας παράγοντα (PBEF), μιας κυτοκίνης που μοιάζει με πρωτεΐνη που διεγείρεται σχηματισμός νωρίς Β-κυττάρων [3]. Μετονομάστηκε πρόσφατα βισφατίνης από Fukuhara et al., Ο οποίος προσδιόρισε ως σπλαχνικού λίπους αδιποκίνης προερχόμενο που πιστεύεται ότι μιμείται τη δράση της ινσουλίνης [4]. Nampt έχει καταρτίσει σημαντικό ενδιαφέρον όχι μόνο στους τομείς του μεταβολισμού και της ανοσολογικής απάντησης, αλλά και στον τομέα του καρκίνου. Ένας αριθμός των καρκίνων εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του Nampt [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], και οι αναστολείς του Nampt προσφέρουν πολλά υποσχόμενες θεραπευτικές εφαρμογές στον καρκίνο [12] , [13], [14], [15]. Ωστόσο, ο μηχανισμός μέσω του οποίου Nampt απορυθμίζεται είναι ασαφής.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μία κατηγορία των μικρών μη-κωδικοποίησης RNAs. Αναγνωριστεί ως μια νέα κατηγορία των ρυθμιστών της γονιδιακής έκφρασης, που στοχεύουν mRNA για μεταγραφική καταστολή ή την υποβάθμιση [16]. Μια σειρά από μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι miRNAs μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση μιας ποικιλίας γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που είναι σημαντικές για τον πολλαπλασιασμό των όγκων, εισβολή ή μετάσταση [17], [18], [19]. Η χρησιμότητα των miRNAs στη θεραπεία του καρκίνου έχει αποδειχθεί [20], [21], [22].

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι το NAD-ανάσυρση μονοπάτι βιοσύνθεσης αφορούν Nampt παίζει ρόλο σε ορθοκολικό καρκινικό κύτταρο επιβίωσης. Δείξαμε για πρώτη φορά ότι Nampt είναι ένας στόχος του miR-26b. Επιπλέον, η έκφραση του miR-26b και Nampt αναλύθηκε σε ανθρώπινα δείγματα ασθενών καρκίνου του παχέος εντέρου και του παχέος 5 καρκινικά κύτταρα. Οι ρόλοι του miR-26b και Nampt στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου συζητείται.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ρεν Τζι Νοσοκομείο, Σχολή της ιατρικής, της Σαγκάης Jiao Tong University. Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ανθρωπίνων Δείγματα από Ρεν Τζι Νοσοκομείο.

Γραμμές κυττάρων και δείγματα ιστών

Καρκίνος του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές SW480, SW1116 , ΗΤ-29, LoVo, και HCT116 χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή (που λαμβάνεται από τη Σαγκάη Ινστιτούτο γαστρεντερικές παθήσεις, Ρεν Τζι Νοσοκομείο, ιατρική Σχολή, Shanghai Jiao Tong University, Κίνα). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C.

Δείγματα ιστών από ανθρώπινο ορθοκολικό και παρακείμενο φυσιολογικό παχέος ιστούς ελήφθησαν από 18 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στη Ρεν Τζι Νοσοκομείο, ιατρική Σχολή, Shanghai Jiao Tong University (Σαγκάη, Κίνα). Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν την επέμβαση. Τα δείγματα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Οι ιστοπαθολογικές διαγνώσεις αξιολογήθηκαν από παθολόγο του νοσοκομείου, χρησιμοποιώντας και τα δύο μορφολογικά κριτήρια και ανοσοκυτταροχημεία. Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση τους (όπως περιγράφεται στο έντυπο συγκατάθεσης PLoS) πριν από τη συλλογή των ιστών και η μελέτη εγκρίθηκε από τις επιτροπές δεοντολογίας της Ρεν Τζι Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Jiao Tong της Σαγκάης.

CCK-8 Δοκιμασία

Το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας το κινητό Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) (Dojindo). Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων στα 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλήρες μέσο και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με RPMI-1640 που περιείχε 10% FBS, με ή χωρίς θεραπεία. Μετά την επώαση, 10 μL του CCK-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν περαιτέρω για 4 ώρες σε ένα επωαστή. Η απορρόφηση στα 490 nm αναγνώστηκε φασματοφωτομετρικώς χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακός.

Προσδιορισμός απόπτωσης

κυτταρικής απόπτωσης προσδιορίσθηκε με την δοκιμασία Vybrant απόπτωσης kit # 2 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής με μια ροή Coulter Epics XL κυτταρόμετρο (Beckman-Coulter). Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Expo 32 κυτταρόμετρο λογισμικού (Beckman-Coulter). Τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές εις διπλούν.

NAD + και NADH Ποσοτικοποίηση

Οι συγκεντρώσεις του NAD

+ και NADH σε κύτταρα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα NAD

+ /NADH Ποσοτικοποίηση Kit ( Bio Vision) σύμφωνα με το εγχειρίδιο. Το ποσό της NAD

+ σε κάθε δείγμα ομαλοποιήθηκε με την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες για κάθε δείγμα δοκιμής

Πρόβλεψη των miRNA Στόχοι

Computer-based TargetScan (http:. //www.targetscan .org /) χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη των miRNAs που στοχεύουν Nampt mRNA.

νοκ ντάουν ή υπερέκφραση του miR-26b

η έκφραση του miR-26b σε κύτταρα χτυπήθηκε κάτω από επιμόλυνση με miR-26b αναστολέα (GenePharma) ή να αυξηθεί από επιμόλυνση με μιμείται miR-26b (GenePharma). Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ή πλάκες 24-φρεατίων για 24 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με αναστολέα ή μιμείται χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) για 24 ώρες. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε περαιτέρω δοκιμασίες ή στο RNA εκχύλισης /πρωτεΐνη.

RNA Εκχύλιση και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα και τα παχέος δειγμάτων καρκίνου χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Τα επίπεδα του mRNA Nampt και miR-26b μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Για την ανίχνευση του mRNA Nampt, αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Μ-ΜυΙ_ν αντίστροφης System μεταγραφάσης και PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green (Takara) με το ΑΒΙ Prism 7700 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems). Γλυκεραλδεΰδη αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. Για τη μέτρηση των επιπέδων miR-26β, ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το TaqMan Reverse Transcription Kit και TaqMan microRNA Δοκιμασίες Kit (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Μια ανθρώπινη U6 μικρό πυρηνικό RNA TaqMan ανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση. Primer αλληλουχίες (εμπρός και πίσω) παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

Western Blotting

Ένας ίσος αριθμός σφαιροποιήθηκαν κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS), πάλι σε σφαιρίδια, και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν στους 95 ° C για 5 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν σε μικροφυγόκεντρο για 5 λεπτά. Ίσες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης φορτώθηκαν για ηλεκτροφόρηση σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλ θειικού νατρίου και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% ΤΒδ-Τ για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα σε ΤΒδ-Τ για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ή όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά από πλύση 4 φορές για 5 λεπτά το καθένα σε ΤΒδ-Τ, οι μεμβράνες επωάστηκαν με χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Kangchen Technology) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση 4 φορές για 5 λεπτά, πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές μέσω της αντίδρασης χημειοφωταύγειας και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ. Το πρωτογενές αντίσωμα, αντι-Nampt αντίσωμα (αριθμός καταλόγου AP9010c), ήταν από Abgent. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCT.

Reporter Κατασκευάσματα

Οι υποθετικές στοιχεία miRNA26b αναγνώρισης από το γονίδιο Nampt και αντίστοιχες μεταλλάξεις κλωνοποιήθηκαν στον 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή (UTR) του το γονίδιο της λουσιφεράσης στον φορέα λουσιφεράσης pEZX-MT01 (GeneCopoeia Inc.). Αυτός ο κλώνος έκφρασης περιείχε την Nampt (Προσχώρησης: NM_005746.2) 3′-UTR αλληλουχία εισάγεται στον φορέα pEZX-MT01 κατάντη ενός γονίδιο λουσιφεράσης πυγολαμπίδας υπό τον έλεγχο ενός υποκινητή SV40. Ο φορέας pEZX-MT01 περιείχε επίσης το γονίδιο λουσιφεράσης Renilla κάτω από τον έλεγχο ενός προωθητή CMV. Firefly δραστηριότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης της Renilla. Τα μεταλλαγμένα κλώνοι για Nampt κατασκευάστηκαν. Η περιοχή πρόσδεσης σπόρος (5’-UACUUGAA-3 ‘) άλλαξε σε 5′-UACUUACA-3’ (2-bp αντικατάστασης). Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας DNA.

Luciferase Assay Reporter

SW480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με αρνητικό μιμούνται έλεγχο (NC) ή μιμείται miR-26b (30 ηΜ ή 60 ηΜ? GenePharma) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Μετά από μια δεύτερη επιμόλυνση με ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή miR-26b ή μεταλλαγμένων της (50 ng), SW480 κύτταρα επωάστηκε για 24 ώρες. Λουσιφεράσης δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Σύστημα Dual-Light συνδυασμένης Reporter Gene Assay (Promega) και Promega Turner TD-20 /το 20 λουμινόμετρο.

Transwell Δοκιμασία

κυτταρικής μετανάστευσης εκτελέστηκε με transwell δοκιμασίας (BD Biosciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Έλεγχος miRNA ή μιμητικά miR-26b επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Στη συνέχεια, 3,0 × 10

5 επιμολυσμένων κυττάρων ή μη κατεργασμένα κύτταρα σε μέσο άνευ ορού προστέθηκαν σε κάθε άνω ένθετο προ-επικαλυμμένα με μήτρα Matrigel. Για αντιστοιχισμένης κάτω θάλαμο, προστέθηκαν 500 μL του 10% μέσου FBS. Μετά την επώαση, μη επεμβατική κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια της μεμβράνης transwell με μια μπατονέτα, και οι επεμβατικές κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε μεθανόλη, βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες, φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν.

Στατιστική Ανάλυση

Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Για τη σύγκριση των 2 ομάδων, χρησιμοποιήθηκε ένα δίπλευρη ασύζευκτη δοκιμασία t. Μια τιμή του ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Στατιστική δοκιμές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση κρατικών Λογισμικό 12.0 (Stata Corp).

Αποτελέσματα

Nampt ειδικό χημικό αναστολέα FK866 Αναστέλλει NAD Σύνθεση και κυττάρων Επιβίωση

Η αυξημένη έκφραση Nampt έχει αναφερθεί στην πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο [5], [6], [7]. FK866 είναι ένα Nampt ειδικό χημικό αναστολέα που αναστέλλει την NAD-ανάσυρση μονοπάτι βιοσύνθεσης με την πρόσδεση στο νικοτιναμίδη-θέση δέσμευσης του Nampt, έτσι τα κύτταρα του NAD [23], [24] καταστρέφουν. Σύμφωνα με πληροφορίες, FK866 είναι καλά ανεκτή, και αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων σε μερικούς όγκους τύπου [13], [15]. Ωστόσο, η επίδραση της FK866 σε ορθοκολικό καρκίνο δεν έχει τεκμηριωθεί.

Αναλύσαμε την επίδραση της FK866 επί του ρυθμού επιβίωσης των κυττάρων του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου SW480 και LoVo κυττάρων με CCK-8 δοκιμασίας και κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι FK866 προώθησε σημαντικά την απόπτωση των κυττάρων SW480 και LoVo με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Το IC

50 του FK866 ήταν 14.3 ηΜ για SW480 κύτταρα και 32.7 ηΜ για τα κύτταρα LoVo, σύμφωνα με την δοκιμασία CCK-8 (Σχήμα 1Α). Κυτταρομετρία ροής μελέτες έδειξαν ότι η έκθεση των κυττάρων SW480 και LoVo να διαφορετική συγκέντρωση FK866 για 3 ημέρες αύξησε το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε πρώιμα στάδια από 3,37 ± 0,83% έως 27,27 ± 1,49% (SW480) και 3,00 ± 0,37% έως 21,53 ± 1,76% (LoVo) (Εικόνα 1Β).

Α. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις FK866 για 72 ώρες και στη συνέχεια αξιολογείται χρησιμοποιώντας Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8. Το IC

50 τιμές υπολογίστηκαν. Κάθε δοκιμασία επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές. B. Η ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από FK866 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα περιεχόμενα υπο-G1 χαρακτηρίστηκαν αποπτωτικά κύτταρα. *: Έναντι αρνητικού ομάδα ελέγχου? **: Σε σύγκριση με 2 ομάδες θεραπείας. επίπεδα C. NAD σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα μετρήθηκαν μετά από έκθεση σε FK866. Κάθε κατακόρυφη γραμμή αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριπλών προσδιορισμών. Για τη σύγκριση των 2 ομάδων, χρησιμοποιήθηκε ένα δίπλευρη ασύζευκτη δοκιμασία t.

Η

επόμενο προσδιορίζεται η επίδραση της FK866 επί της βιοσύνθεσης NAD στα κύτταρα χρησιμοποιώντας το NAD

+ /NADH Ποσοτικοποίηση Kit . έκθεσης FK866 για 3 ημέρες μείωσε το επίπεδο NAD από 5,33 ± 0,96 έως 1,17 ± 0,31 nM /μα (SW480) και 6,63 ± 1,16 έως 2,33 ± 0,85 nM /μα (LoVo) (Εικόνα 1Γ). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι Nampt μεσολάβηση βιοσύνθεσης NAD-ανάσυρση διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση του παχέος καρκινικών κυττάρων και ότι FK866 έχει αντι-καρκινογόνες ιδιότητες σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

MiR-26β αναστέλλει την έκφραση Nampt μέσω δέσμευσης της 3′-UTR

με την ανάλυση της αλληλουχίας που βασίζονται σε υπολογιστή χρησιμοποιώντας TargetScans λογισμικό ανίχνευσης (https://www.targetscan.org/), Nampt είχε προβλεφθεί να είναι ένας πιθανός στόχος του miR-26b. Η αλληλουχία του ώριμου σπόρου miR-26β διατηρήθηκε μεταξύ των ανθρώπινων, χιμπαντζή, rhesus, και θαμνώδεις είδη μωρό, μεταξύ άλλων. Ως εκ τούτου, miR-26b επιλέχθηκε για περαιτέρω βιολογικό χαρακτηρισμό.

Με μιμείται miR-26β, η υπερέκφραση του miR-26b κατέστειλε Nampt mRNA (Σχήμα 2Α αριστερά) και πρωτεΐνης (Εικόνα 2Β) επίπεδα σε κύτταρα SW480, όπως ανιχνεύεται με RT-PCR και ανάλυση στυπώματος Western, αντιστοίχως. Εν τω μεταξύ, μιμείται miR-26β κατέστειλε επίσης το επίπεδο έκφρασης του NAD +, η οποία μετρήθηκε με την NAD

+ /NADH Ποσοτικοποίηση Kit (Εικόνα 2D αριστερά). Από την άλλη πλευρά, η επιμόλυνση με αναστολέα miR-26β αυξήθηκε Nampt mRNA (Σχήμα 2Α δεξιά) και τα επίπεδα πρωτεΐνης (Σχήμα 2C), και miR-26b αναστολέα αύξησε επίσης το επίπεδο έκφρασης του NAD + (Εικόνα 2D δεξιά).

Α. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου της Nampt σε κυτταρικές σειρές SW480 μετά την επιμόλυνση με διαφορετικές συγκεντρώσεις μιμείται miR-26b ή αναστολείς. Β και C. κηλίδωση Western των Nampt σε κυτταρικές σειρές SW480 μετά την επιμόλυνση με διαφορετικές συγκεντρώσεις μιμείται miR-26b ή αναστολείς. D. Τα σχετικά επίπεδα του NAD σε κυτταρικές σειρές SW480 μετά την επιμόλυνση με διαφορετικές συγκεντρώσεις μιμείται miR-26b ή αναστολείς. δοκιμασίες ρεπόρτερ Ε Λουσιφεράσης επικύρωση της άμεσης αλληλεπίδρασης του miR-26b με το 3′-UTR του Nampt. Nampt-3′-UTR-pEZX (ή Nampt-3′-UTR-mut-pEZX) συνεπιμολύνθηκε με miR-26b μιμούνται ή αρνητικό έλεγχο σε κύτταρα SW480. *: Έναντι αρνητικού ομάδα ελέγχου? **: Σε σύγκριση με 2 ομάδες θεραπείας. Κάθε κατακόρυφη γραμμή αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριπλών προσδιορισμών. Για τη σύγκριση των 2 ομάδων, χρησιμοποιήθηκε ένα δύο-tailed, unpaired t-test.

Η

Για να επιβεβαιώσετε ότι Nampt είναι ο στόχος του miR-26b, το αποτέλεσμα της επιμόλυνσης με μιμείται miR-26b για το εξετάστηκε δραστηριότητα δημοσιογράφος της ευρείας τύπου και των μεταλλαγμένων pEZX-Nampt. pEZX-Nampt είναι ένα κατασκεύασμα διπλής λουσιφεράσης ανταποκριτή που περιέχει ένα ευρύ τύπου ή μεταλλαγμένο τμήμα του Nampt 3′-UTR με την αλληλουχία αναγνώρισης miR-26b αμέσως προς τα κάτω της πυγολαμπίδας αναφοράς λουσιφεράσης (Εικόνα S1A). Ένα διάγραμμα του Nampt με άγριου τύπου ή μεταλλαγμένες αλληλουχίες στην πιθανή θέση πρόσδεσης miR-26β δείχνεται στο Σχήμα S1B. Οι χάρτες αλληλουχία του άγριου τύπου και μεταλλαγμένων Nampt που λαμβάνεται με προσδιορισμό αλληλουχίας του γονιδίου φαίνεται στην Εικόνα S1c. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, επιμόλυνση με διαφορετική συγκέντρωση του μιμείται miR-26β μείωσε την πυγολαμπίδα δραστηριότητα ανταποκριτή λουσιφεράσης του άγριου τύπου pEZX-Nampt κατά περίπου 51,7% ± 3,2% και 64,3% ± 4,0%, αντίστοιχα. Η επαγωγή της δραστικότητας ανταποκριτή από υπερέκφραση του miR-26b με μιμείται miR-26b, ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκε όταν η αλληλουχία αναγνώρισης miR-26b στην 3′-UTR του mRNA Nampt μεταλλάχθηκε (Σχήμα 2Ε). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα από τα Σχήματα 2 επιβεβαιώνουν ότι Nampt είναι ο στόχος του miR-26b

Τα επίπεδα έκφρασης του miR-26b και Nampt στον καρκίνο του παχέος εντέρου ιστούς και κυτταρικές γραμμές

Τα βασικά επίπεδα έκφρασης. του miR-26b και Nampt mRNA μετρήθηκαν με qRT-PCR σε ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (ΗΤ-29, SW480, SW1116, LoVo, και HCT116), και τα βασικά επίπεδα έκφρασης του NAD + επίσης μετρήθηκαν με NAD

+ /NADH ποσοτικοποίηση Kit σε κυτταρικές σειρές. κύτταρα SW480 είχε τη χαμηλότερη έκφραση Nampt και το επίπεδο NAD +, και το υψηλότερο επίπεδο miR-26b, που ακολουθείται από ΗΤ-29, HCT116, LoVo, και τα κύτταρα SW116 (Σχήμα 3Α αριστερά). Μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-26b και Nampt mRNA παρατηρήθηκε και σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ του NAD + και Nampt mRNA παρατηρήθηκε επίσης (Σχήμα 3Α δεξιά).

Α. miR-26b, Nampt mRNA και NAD + τα επίπεδα προσδιορίστηκαν σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές. Η έκφραση του miR-26b ήταν αντιστρόφως ανάλογη με Nampt έκφραση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές? η έκφραση του NAD + ήταν θετική συσχετίζεται με την έκφραση Nampt σε ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (Α δεξιά). Β miR-26b και Nampt mRNA επίπεδα προσδιορίστηκαν σε 18 χειρουργικά δείγματα ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου και ιστών γειτονικό φυσιολογικό ορθοκολικό ιστούς. Τα σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω επίπεδα Nampt σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς φαίνεται σε σχέση με τα επίπεδα Nampt σε γειτονικό φυσιολογικό ορθοκολικό ιστούς (πολλαπλές μεταβολές & gt? 6)? Τα σημαντικά μειωτικά επίπεδα miR-26b σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς παρουσιάζεται σε σχέση με τα επίπεδα του miR-26b σε γειτονικό φυσιολογικό παχέος ιστούς (πάσο αλλαγών & gt? 2). C. Η έκφραση του miR-26b ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση Nampt σε ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς (C αριστερά), και παρακείμενο φυσιολογικό ορθοκολικό ιστούς (C δεξιά). επίπεδα Nampt mRNA προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH. Τα επίπεδα miR-26β προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς U6. Κάθε κατακόρυφη γραμμή αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριπλών προσδιορισμών. Για τη σύγκριση των 2 ομάδων, χρησιμοποιήθηκε ένα δίπλευρη ασύζευκτη δοκιμασία t.

Η

Επιπλέον, επεκτείναμε την έρευνά μας σε δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του παχέος. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση Nampt ήταν σημαντικά αυξημένη σε καρκινικούς ιστούς (6,3 φορές) σε σύγκριση με ότι στα ζεύγη παρακείμενων φυσιολογικών ιστών στον πίνακα 18 ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο (Σχήμα 3Β δεξιά), η οποία ήταν σύμφωνη με τα ευρήματα άλλων [5 ], [6], [7]. Επιπλέον, βρήκαμε το καρκινικό ιστό έδειξε μια αξιοσημείωτη απώλεια miR-26b (~45.45%) σε σύγκριση με τα γειτονικά φυσιολογικό ορθοκολικό καρκίνο ιστούς στον πίνακα του 18 ασθενείς ορθοκολικό καρκίνο (Σχήμα 3Β αριστερά), η οποία δεν έχει αναφερθεί πριν . Παρατηρήσαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-26b και έκφραση Nampt σε καρκινικούς ιστούς (Εικόνα 3C αριστερά) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (Σχήμα 3C δεξιά).

MiR-26b αναστέλλει τον κυτταρικό Επιβίωση και εισβολή, και αυτό μπορεί να είναι εν μέρει καταργήθηκε με την προσθήκη του NAD

η Nampt είναι γνωστό ότι ρυθμίζει μια ποικιλία βιολογικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της επιβίωσης των κυττάρων και εισβολή. Από το miR-26b πιστεύεται ότι στοχεύουν Nampt, το αποτέλεσμα των miR-26b στην επιβίωση των κυττάρων και εισβολής ερευνήθηκε. Επιπλέον, είμαστε συν-επιμολυσμένα κύτταρα με miR-26b μιμούνται, στη συνέχεια, 1,0 mM /L NAD + (μέγιστη αποτελεσματική) προστέθηκε για να προσδιοριστεί κατά πόσον οι επιπτώσεις των miR-26b διαμεσολαβείται από Nampt μεσολάβηση βιοσύνθεσης NAD.

Χρήση η δοκιμασία CKK-8, κύτταρα κατεργασμένα με αναστολέα miR-26β είχε το υψηλότερο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, που ακολουθείται από κύτταρα κατεργασμένα με αρνητικό έλεγχο, μιμείται miR-26β συν NAD, και μιμείται miR-26b μόνο του (Σχήμα 4Α). Μια αύξηση 21,1% στην ανάπτυξη των κυττάρων παρατηρήθηκε σε κύτταρα LoVo 4 ημέρες μετά την επιμόλυνση με τον αναστολέα miR-26β, σε σύγκριση με αύξηση στον αρνητικό έλεγχο. Ωστόσο, η επιμόλυνση με μιμείται miR-26β κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων LoVo με 31,48% σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα. Η επιμόλυνση με μιμείται miR-26β συν NAD αύξησε την ανάπτυξη των κυττάρων LoVo με 26,85% σε σύγκριση με την ομάδα επιμολυσμένα με μόνο miR-26b μιμείται.

A. κύτταρα LoVo υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μιμείται miR-26b et al., και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8. B. Η ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από μιμείται miR-26b (με και χωρίς NAD) ή αναστολέα miR-26b επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα περιεχόμενα υπο-G1 χαρακτηρίστηκαν αποπτωτικά κύτταρα. Γ Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα των προσδιορισμούς κυτταρικής εισβολής (αριστερά) και τον ποσοτικό προσδιορισμό (δεξιά) από διαφορετικές θεραπείες (* ρ & lt? 0,01). Τα βαμμένα επεμβατική κύτταρα φωτογραφήθηκαν υπό ανεστραμμένο μικροσκόπιο φωτός (100 × μεγέθυνση). *: Έναντι αρνητικού ομάδα ελέγχου? **: Σε σύγκριση με 2 ομάδες θεραπείας. Κάθε κατακόρυφη γραμμή αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριπλών προσδιορισμών. Για τη σύγκριση των 2 ομάδων, χρησιμοποιήθηκε ένα δίπλευρη ασύζευκτη δοκιμασία t.

Η

Η κυτταρομετρία ροής αποτελέσματα της δοκιμασίας δείχνονται στην Εικόνα 4Β. Έκθεση των κυττάρων LoVo σε αναστολείς miR-26b για 4 ημέρες μείωσε σημαντικά το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε πρώιμα στάδια (3,03 ± 0,72% σε σύγκριση με το 7,33 ± 0,60% στην ομάδα αρνητικού ελέγχου). Η επιμόλυνση με μιμείται miR-26b και NAD μειωθεί αξιοσημείωτα την αποπτωτική ποσοστό πρώιμου σταδίου (12,23 ± 0,35% σε σύγκριση με 24,2 ± 0,79% στην ομάδα επιμολυσμένα μόνο με μιμείται miR-26b).

Ενδιαφέρον, ΜΙΚ καταστολή 26β επηρεάζεται όχι μόνο κυτταρική επιβίωση, αλλά και την εισβολή (Σχήμα 4C). Η επιμόλυνση με αναστολέα miR-26β αύξησε σημαντικά την αποδοτικότητα εισβολή των κυττάρων LoVo (1,7 φορές) σύμφωνα με την δοκιμασία Transwell. Η επιμόλυνση με μιμείται miR-26b, ωστόσο, μείωσε την αποδοτικότητα εισβολή των κυττάρων LoVo να 34,53%, και αυτό εν μέρει διασώθηκε με την προσθήκη NAD (αυξήθηκε στο 66,10%). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα από το Σχήμα 4 δείχνουν ότι το miR-26b ανέστειλε την κυτταρική επιβίωση και την εισβολή στα κύτταρα LoVo. Η προσθήκη του NAD κατήργησε μερικώς αυτό το αποτέλεσμα.

Συζήτηση

Οι μελέτες έχουν δείξει ότι Nampt είναι σημαντικά αυξημένη σε πρωτογενείς καρκίνο του παχέος εντέρου [5], [6], [7] και άλλων καρκίνων [8 ], [9], [10], [11]. Έτσι, Nampt μπορεί να είναι ένας καλός βιοδείκτης του κακοήθους δυναμικού και το στάδιο εξέλιξης [1], [8], [25], [26]. βιοσύνθεση NAD Nampt μεσολάβηση διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στο μεταβολισμό των κυττάρων, τις λειτουργίες επιβίωσης, και αντοχή στο στρες μέσω sirtuins και άλλες ρυθμιστικές NAD καταναλώνουν [1]. Η Nampt-ειδικό χημικό αναστολέα FK866 εξαντλεί τα κύτταρα της ενδοκυτταρικής NAD μέσω δέσμευσης στη θέση νικοτιναμιδίου πρόσδεσης Nampt και αναστολή της απόπλυσης NAD μονοπάτι [23], [24]. Στα καρκινικά κύτταρα, FK866 εμφανίζει κατά του όγκου [27], αντι-μεταστατική [15], και αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα [28] και χημειο-ευαισθητοποίηση των επίδραση [27]. Αντίθετα, ορισμένες μελέτες έδειξαν μη ογκογόνα κύτταρα δεν επηρεάστηκαν από τη FK866 [29], [30]. Αυτά μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι τα καρκινικά κύτταρα απαιτούν υψηλότερα επίπεδα NAD + για να φιλοξενήσει με υψηλό μεταβολικό ρυθμό από ό, τι τα φυσιολογικά κύτταρα. Κατά συνέπεια, υπάρχει μια διαφορά στο δόσης-απόκρισης μεταξύ κακοηθών και φυσιολογικών κυττάρων και για τα επίπεδα της κυτταρικής NAD + περιεχόμενο. Ως εκ τούτου, FK866 είναι καλά ανεκτή, και αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου in vitro και in vivo. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζονται από πολλές έρευνες [12], [13], [14], [15]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι πρώτα FK866 ανέστειλε σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων και μειωμένα επίπεδα NAD σε SW480 και LoVo κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η Nampt μεσολάβηση NAD βιοσυνθετική μηχανισμός είναι δραστική σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Ενδιαφέρουσες, υπήρξε μικρή συσχέτιση μεταξύ της μείωσης του NAD + και την αύξηση της απόπτωσης χρησιμοποιώντας FK866 σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας (r = -0,8544,

σ

= 0,3479). Μπορεί να υπάρχουν δύο διαφορετικές εικασίες ως προς το αποτέλεσμα. Πρώτον, μπορεί να υπάρχει ένα φαινόμενο όριο, λόγω της υψηλής συγκέντρωσης του FK866. Δεύτερον, Thakur, Β Κ αναφερόμενη FK866 είναι ικανό να επάγει απόπτωση σε λευχαιμικά κύτταρα με έμμεσα ενεργοποιώντας την πρωτεΐνη p53 ογκοκατασταλτικού [13], και αυτή η οδός μπορεί επίσης να λειτουργήσει σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Αν και υπήρξε μικρή συσχέτιση μεταξύ του NAD + και της απόπτωσης, σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, αυτό δεν θα επηρεάσει το γεγονός ότι FK866 μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο μέσο για παχέος εντέρου. Και οι μοριακοί μηχανισμοί ευθύνονται για την υψηλή έκφραση του Nampt σε ορθοκολικό καρκίνο δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι ακατάλληλη έκφραση του miRNAs συμβάλλει στην παθογένεση του καρκίνου. Οι Μειωμένα επίπεδα miR-26b που παρατηρείται σε ένα ευρύ φάσμα όγκων [17], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]. Στις μελέτες μας, αποδείξαμε ότι η έκφραση του miR-26b ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε 18 καρκινικά δείγματα από ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο. Σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο, miR-26b ήταν 2,2 φορές υψηλότερη σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς σε σχέση με καρκινικούς ιστούς (ρ & lt? 0,0001). Εμείς αρχικά αναγνωρίζονται Nampt ως στόχο του miR-26b από βιοπληροφορική ανάλυση, λουσιφεράσης δημοσιογράφος, και ο ποσοτικός προσδιορισμός φατρία με επιμόλυνση του miR-26 μιμείται ή αναστολείς. Η υπερέκφραση του miR-26b με επιμόλυνση του miR-26 μιμείται μειώθηκε σημαντικά Nampt mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης in vitro. Η μελέτη μας διαπίστωσε ότι μιμείται miR-26b είναι πιο αποτελεσματικά από ό, τι στην απόπτωση στις δοκιμασίες πολλαπλασιασμού. Τα αποτελέσματα συμφωνούν με άλλες μελέτες ότι η αναστολή της Nampt προκαλείται γενική κυτταροτοξικότητα [13]. Knockdown του miR-26b με επιμόλυνση των αναστολέων miR-26β αυξήθηκε σημαντικά Nampt mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Αυτό δείχνει ότι το miR-26b ρυθμίζει Nampt κυρίως μέσω μεταγραφική καταστολή. Εν τω μεταξύ, στα αποτελέσματά μας τα ρυθμιστικά μονοπάτια του miR-26b συνδέθηκαν με διεισδυτικότητα και τη μετάσταση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Ma et al. έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-26β ανέστειλε in vivo την ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα LoVo [38]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η αναστολή της κυτταρικής επιβίωσης και εισβολής από υπερέκφραση του miR-26b θα μπορούσαν να διασωθούν εν μέρει από την προσθήκη του NAD. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η αναστολή miR-26b της επιβίωσης των κυττάρων του όγκου και την εισβολή περιλαμβάνει βιοσύνθεση NAD Nampt μεσολάβηση. Ως εκ τούτου, τα ευρήματά μας παρέχουν πληροφορίες για τη λειτουργία των miR-26b στη ρύθμιση του παχέος ογκογένεση. Επιπλέον, δεδομένου ότι Nampt λειτουργίες στο μεταβολισμό και ανοσολογικές αποκρίσεις, miR-26b μπορεί επίσης να επηρεάσει τις διαδικασίες αυτές με την εξασθένηση της μετάφρασης Nampt. Αυτό υποδηλώνει μια μηχανιστική εξήγηση για την ρύθμιση προς τα κάτω του miR-26b σε διαβητικούς ποντικούς [39].

Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο miR-26b και Nampt ρυθμίζουν ογκογένεση μπορεί να μην είναι τόσο απλό. Όταν η συγκέντρωση του NAD + ήταν μέγιστη αποτελεσματική, η διάσωση δεν ήταν πλήρως ανακτηθεί. Η εναλλακτική οδός θα μπορούσε να είναι δυνατή η συμμετοχή. Κατ ‘αρχάς, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι το miR-26b έχει πολλούς άλλους άμεσους στόχους, όπως η EphA2 [40], SLC7A11 [32], Λεφ-1 [41], pRb πρωτεΐνη [42], και COX-2 [36]. Δεύτερον, miRNAs εκτός από miR-26b θα μπορούσε να στοχεύσει την έκφραση Nampt. Για παράδειγμα, miR-182 κατιούσα ρύθμιση της έκφρασης Nampt σε Tat-επαγόμενη HIV-1 μακρά τερματική επανάληψη (LTR) διαενεργοποίησης [43]. Τρίτον, αν και αναφέρεται ότι η ρύθμιση της γλυκόζης προκαλούμενη έκκριση ινσουλίνης και mTORC1 και ERK1 /2 σηματοδοτικό μονοπάτι εμπλέκονται στη σύνθεση απόπλυσης NAD Nampt-media [12], [44], άλλες οδούς σηματοδότησης που περιλαμβάνουν Nampt, όπως ΡΙ3Κ /Akt [45] και STAT3 [46], [47], συμμετέχουν επίσης στο σχηματισμό όγκων, το μετασχηματισμό και την αγγειογένεση. Στο σύνολό τους, το σηματοδοτικό μονοπάτι miR-26b-Nampt-NAD συμβάλλει στην παχέος την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή, αλλά δεν είναι η μόνη οδός.

Συμπέρασμα

Εν ολίγοις, παρούσα μελέτη μας υποδηλώνει ότι miR-26β ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση Nampt στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο δια συνδέσεως με 3′-UTR της. Επιπλέον, miR-26b ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και την εισβολή, και το αποτέλεσμα αυτό εν μέρει καταργήθηκε με την προσθήκη NAD. Βρήκαμε επίσης ότι τα επίπεδα του miR-26b σε ασθενή παχέος ιστούς όγκου ήταν πολύ χαμηλότερα από ό, τι στις παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς, και ότι η έκφραση miR-26b αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση του mRNA Nampt σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος 5 και δείγματα ασθενών. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα αποτελέσματά μας είναι κλινικά σημαντική: miR-26b υπερέκφραση και η αναστολή του μονοπατιού σηματοδότησης Nampt-NAD μπορεί να είναι μια λογική για θεραπευτικές παρεμβάσεις σε καρκίνο του παχέος εντέρου στο μέλλον

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. .

δοκιμασίες λουσιφεράσης δημοσιογράφος επικύρωση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των miR-26b και Nampt. Α Η κατασκευή της λουσιφεράσης pEZX-MT01 (Luc-Nampt 3′-UTR). hLuc, λουσιφεράση πυγολαμπίδας γονίδιο ρεπόρτερ? hRLuc, λουσιφεράση της Renilla γονιδίου αναφοράς. έκφραση λουσιφεράσης Firefly ρυθμίζεται με πρόσδεση του miRNA στην αλληλουχία στόχο 3′-UTR. Firefly δραστηριότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης της Renilla. Β Διάγραμμα Nampt με άγριου τύπου και μεταλλαγμένων αλληλουχιών στη θέση δέσμευσης του miR-26b. χάρτες Γ Ακολουθία του άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων αλληλουχιών Nampt ιδρύθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδίου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069963.s001

(ΔΕΘ)