Αφηρημένο

ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (H. pylori)

είναι ένα gram-αρνητικό, σπειροειδές βακτήριο που μολύνει περισσότερο από το ήμισυ του παγκόσμιου πληθυσμού και είναι μια σημαντική αιτία γαστρικού αδενοκαρκινώματος. Οι μηχανισμοί που συνδέουν

H. pylori

μόλυνση στα γαστρικά καρκινογένεση δεν είναι καλά κατανοητοί. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι η πρωτεΐνη αναστολέας Raf-κινάση (RKIP) έχει ένα ρόλο στην επαγωγή απόπτωσης από

H. pylori

σε γαστρικό επιθηλιακά κύτταρα. δοκιμασίες δημοσιογράφος κηλίδα και η μεταγραφή λουσιφεράσης Western αποδεικνύουν ότι η παθογένεια νησί της

H. pylori

φωσφορυλιώνει ταχέως RKIP, η οποία στη συνέχεια εντοπίζεται στον πυρήνα όπου ενεργοποιεί τη δική μεταγραφή του και επάγει την απόπτωση. Αναγκαστική υπερέκφραση του RKIP ενισχύει την απόπτωση σε

H. pylori

-μολυσμένα κύτταρα, ενώ η αναστολή RKIP RNA καταστέλλει την επαγωγή της απόπτωσης από

H. pylori

λοίμωξη. Ενώ επάγει την φωσφορυλίωση της RKIP,

H. pylori

στοχεύει ταυτόχρονα μη φωσφορυλιωμένη RKIP για την υποβάθμιση πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση. Η αύξηση της μεταγραφής RKIP και φωσφορυλίωση καταργείται από τη μετάλλαξή του RKIP σερίνη 153 σε βαλίνη, αποδεικνύοντας ότι η ρύθμιση της δραστηριότητας RKIP από

H. pylori

εξαρτάται από υπόλειμμα S153 RKIP του. Επιπλέον,

H. pylori

μόλυνση αυξάνει την έκφραση του σαλιγκαριού, ένας μεταγραφικός καταστολέας της RKIP. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι

H. πυλωρού

χρησιμοποιεί μια πρωτεΐνη καταστολέας των όγκων, RKIP, να προωθήσει την απόπτωση στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Moen EL, Wen S, Ανουάρ Τ, Cross-Knorr S, Brilliant Κ, Birnbaum F, et al . (2012) Κανονισμός Λειτουργίας RKIP από

Helicobacter pylori

σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10.1371 /journal.pone.0037819

Επιμέλεια: Yoshio Yamaoka, παλαιμάχων Ιατρικό Κέντρο Υποθέσεων (111d), Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Δεκ του 2011? Αποδεκτές: 24η Απριλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: May 25, 2012 |

Copyright: © 2012 Moen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Γενικών Ιατρικών Επιστημών του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας στο πλαίσιο Βραβείο Αριθμός P20GM103421 (DC)? το προηγούμενο τμήμα αυτού του έργου υποστηρίζεται από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων (NCRR) υπό P20 RR 017695 (DC), R01 CA111533 (SFM) και R21 CA133601 (JMS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικός καρκίνος είναι η τέταρτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται κακοήθεια στον κόσμο. Το 2007, περίπου ένα εκατομμύριο νέα κρούσματα καρκίνου του στομάχου που οδηγεί σε περίπου 800.000 θανάτους σε όλο τον κόσμο έχουν καταγραφεί, γεγονός που καθιστά τη δεύτερη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο [1]. Καρκίνο του στομάχου είναι σήμερα η έβδομη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο στις ΗΠΑ, με περίπου 21.500 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται το 2011 (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). Το gram-αρνητικό, σε σχήμα σπιράλ βακτήριο

ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (H. pylori)

προσβάλλει περισσότερο από το ήμισυ του παγκόσμιου πληθυσμού και έχει αναγνωριστεί ως ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για γαστρικό καρκινογένεση [2]. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας και ο Διεθνής Οργανισμός Ερευνών για τον Καρκίνο έχει ορίσει ως κατηγορίας Ι καρκινογόνο το 1994 [3]. τρέχουσα κατανόησή μας για

H. pylori

επαγόμενη καρκινογένεση είναι ότι το βακτήριο και η σχετική χρόνια φλεγμονώδη απόκριση προώθηση του γαστρικού επιθηλίου κυτταρικό θάνατο από απόπτωση [4], με επακόλουθη υπερ-πολλαπλασιασμό [5], και η παραγωγή ελεύθερων ριζών [6] τα οποία συμβάλλουν στην α αργή και προοδευτική ακολουθία των αλλαγών στο γαστρικό βλεννογόνο που τελικά ευνοεί την πρόοδο προς την κατεύθυνση του καρκίνου. Αυτό το μοντέλο είναι σύμφωνο με αναφορές ότι οι πολυμορφισμοί προ-φλεγμονώδης κυτοκίνη που γονίδιο αυξήσει την ένταση της φλεγμονώδους απόκρισης που σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του γαστρικού [7].

H. pylori

προσκολλάται στενά στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα και μπορεί να επάγει άμεσα απόπτωση [8]. Η παθογένεια νησί CAG (κυτταροτοξικά που σχετίζεται με το γονίδιο) (CAG PAI) του

H. pylori

είναι ένα 40 kB τμήμα DNA που περιέχει γονίδια που κωδικοποιούν για τα συστατικά ενός συστήματος βακτηριακής έκκρισης τύπου IV [9]. Εντός αυτής της περιοχής είναι το

CagA

γονίδιο το οποίο κωδικοποιεί CagA, ανοσοκυρίαρχο πρωτεΐνη 121 έως 145 kDa [9].

Η. Οι pylori

στελέχη που διαθέτουν και που εκφράζουν το CAG ΡΑΙ πιο συχνά συνδέεται με νόσο του πεπτικού έλκους και γαστρικού καρκίνου σε Δυτικούς πληθυσμούς από στελέχη τα οποία δεν [9]. Κατά την έγχυση του μέσω του συστήματος έκκρισης τύπου IV σε γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα ξενιστές, CagA μπορούν στη συνέχεια φωσφορυλιώνονται από κινάσες τυροσίνης Src-οικογένειας στο C-άκρο του [10], που οδηγεί CagA να δεσμεύουν και ενεργοποιούν SHP2 και σήματος μέσω ERK [11]. Σημαντικά, CagA είναι επίσης υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3)

in vitro

και

in vivo

[12], αν και αυτό μπορεί να μην είναι εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση CagA [11]

STAT πρωτεΐνες εκφράζονται συστατικά σε διάφορα νεοπλάσματα, συμπεριλαμβανομένων του στομάχου, του μαστού, της κεφαλής και του τραχήλου, και καρκίνων του προστάτη [13] – [16].. Μετά φωσφορυλίωση τυροσίνης 705 κατάλοιπο και ακετυλίωση στη λυσίνη 685, STAT3 διμερίζεται και εισέρχεται στον πυρήνα όπου λειτουργεί για να ρυθμίσει μεταγραφικά ένα ευρύ φάσμα των γονιδίων [17], [18]. Συστατική ενεργοποίηση STAT3 πρωτεΐνη έχει δειχθεί ότι αποτρέπει απόπτωση και να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετάσταση σε έναν αριθμό καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων γαστρικού καρκίνου [19], [20].

Ένα από τα χαρακτηριστικά του γαστρικού εξέλιξης του όγκου είναι η απόκτηση της πιο επεμβατικές και αποδημητικών φαινοτύπους κατά τη διάρκεια της επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT). Κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ, γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα υφίστανται φαινοτυπικές αλλαγές που χαρακτηρίζεται από την απώλεια των μορίων κυτταρικής προσκόλλησης, ιδίως η επιθηλιακή καντερίνη (Ε-καδερίνης) [21]. Το σαλιγκάρι μεταγραφικός παράγοντας, μία πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου, έχει χαρακτηριστεί προηγουμένως ως σημαντικός ρυθμιστής της ΕΜΤ οφείλεται στην ενεργοποίηση του μέσω Πυρηνικού Παράγοντα κάππα Beta (NF-kB) [22] και η επακόλουθη καταστολή της Ε-καδερίνης σε επιθηλιακά κύτταρα όγκου [ ,,,0],23], [24]. Επιπλέον, μελέτες που χρησιμοποιούν το κέρδος-of-λειτουργίας και απώλεια-του-λειτουργία προσεγγίσεις έχουν εντοπίσει σαλιγκάρι ως καταστολέας της μεταγραφής RKIP στο μεταστατικό καρκίνο του προστάτη κύτταρα [25].

RKIP είναι μέλος της πρωτεΐνης φωσφατιδυλαιθανολαμίνη δέσμευσης οικογένεια και ένας αρνητικός ρυθμιστής της ERK1 /2 (εξωκυτταρικό σήμα-Ρυθμιζόμενη κινάση) [26], NF-kB [27] και GRK (συζευγμένο με G πρωτεΐνη υποδοχέα κινάση) [28] οδούς. RKIP παίζει έτσι ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής επιβίωσης και απόπτωσης, εκτός από την ενδυνάμωση της αποτελεσματικότητας των χημειοθεραπευτικών παραγόντων [29]. RKIP έχει επίσης αναγνωριστεί ως μια πρωτεΐνη μετάσταση καταστολέα [30], και σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα στομάχου υπάρχει μια θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης RKIP και την επιβίωση των ασθενών και μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των RKIP και STAT3 [19]. RKIP έκφρασης και η λειτουργία μπορεί να ρυθμίζεται από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Για παράδειγμα, η φωσφορυλίωση του RKIP από πρωτεϊνική κινάση C σε σερίνη-153 παρεμποδίζει την ικανότητα RKIP να δεσμεύεται με μόριο-στόχο του, αδρανοποιώντας έτσι τη λειτουργία RKIP [31]. Περαιτέρω, RKIP καταστολή μέσω μεθυλίωσης προαγωγός μπορεί να ξεπεραστεί με μεθυλίωση και ιστόνης αναστολείς δεακετυλάσης [25].

Λόγω των σημαντικών ρόλων της RKIP, STAT3 και

H. pylori

στην παθογένεση του καρκίνου του στομάχου, ερευνήσαμε αν

H. pylori

σήματα μέσω RKIP. Οι μελέτες μας δείχνουν ότι μια σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ

H. του πυλωρού του cagPAI

, RKIP, STAT3 και σαλιγκάρι ενεργεί για dysregulate γαστρικού επιθηλίου απόπτωση των κυττάρων από τη ρύθμιση της λειτουργίας RKIP, ένα μηχανισμό που καθορίζει έναν κεντρικό ρόλο για την RKIP στο

H. pylori

-associated γαστρική καρκινογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Όλα τα αντιδραστήρια και τα χημικά αγοράστηκαν από Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ), εκτός εάν αν σημειώνεται διαφορετικά. MG-132 αγοράστηκε από την Calbiochem (Gibbstown, NJ) διαλύθηκε σε DMSO και χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 10 mM. Η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) αγοράστηκε από την BD Biosciences (San Diego, CA). αντιδραστήρια ποσοτικού προσδιορισμού πρωτεΐνης λήφθηκαν από Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Ενισχυμένη αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας και δευτερογενή ποντικού και κουνελιού αρμορακίας συζευγμένη με υπεροξειδάση για ανάλυση κηλίδας Western ήταν από GE Healthcare (Piscataway, NJ). Η ακτίνη-HRP, φωσφορυλιωμένη-RKIP (pRKIP) και STAT3 αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA). Τα αντισώματα για STAT3 pS727 και pY705 και PARP αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ) και το αντίσωμα να RKIP από την Millipore, Billerica, ΜΑ. Το αντίσωμα προς σαλιγκάρι αγοράστηκε από Abcam (Cambridge, ΜΑ).

Cells και πλασμίδια

Η ανθρώπινη γαστρικού καρκινώματος κυτταρική γραμμή AGS (CRL-1739) αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (Manasas , VA). κύτταρα ΜΚΝ28 δωρήθηκαν από τον Δρ Ρίτσαρντ Peek, το Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Nashville, TN και είχαν αρχικά αγοραστεί από Riken Τράπεζας Κυττάρων, Ibaraki, Japan. Τα πλασμίδια έκφρασης για pcDNA3, c-myc STAT3, CMV-HA-RKIP (ΗΑ-RKIP) και CMV-HA κενό φορέα (EV) έχουν περιγραφεί [18], [26]. Το πλασμίδιο RKIP S153V παρασχέθηκε από τον Dr. Marsha Rosner, Πανεπιστήμιο του Σικάγου, Σικάγο, IL.

H. pylori

Στελέχη και συνθήκες καλλιέργειας

Άγρια τύπου

H. pylori

στελέχη ή ισογονιδιακές

H. pylori

μεταλλάκτες ήταν συν-καλλιεργήθηκαν με τα AGS ή γαστρικού κυτταρικές σειρές ΜΚΝ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32] σε πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 100:1 σε κάθε πείραμα εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Επιμόλυνση AGS κύτταρα

AGS κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης πλασμιδίου GenJet (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για μια μορφή πλάκας 6-φρεατίων. Συνολικές ποσότητες DNA μεταξύ 1 και 2 μg επιμολύνθηκαν ανά δείγμα. συνθήκες διαμολύνσεως αξιολογήθηκαν και βελτιστοποιημένη με ανάλυση κύτταρα επιμολυσμένα με μια πρωτεΐνη Πράσινη Φθορίζουσα (GFP) εκφράζοντα RKIP πλασμίδιο. Οι αποτελεσματικότητες επιμόλυνσης ήταν σταθερά στην περιοχή από 75-85%.

Protein Εκχύλιση και Ανάλυση Western Blot

Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα και υποκυτταρικές κλασματώσεις παρασκευάστηκαν και ανοσοστυπώθηκαν όπως περιγράφεται προηγούμενα [29], [32 ]. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το BCA Protein Assay (Thermo Scientific). Πυκνότητας των κηλίδων Western έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρατίθενται στην ακόλουθη ιστοσελίδα:. https://lukemiller.org/journal/2007/

Realtime PCR

Δύο μg του RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση 2 χ QIAgen QuantiFast SYBR Green Ι (Roche). Οι εκκινητές για σαλιγκάρι ήταν μπροστά: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, αντίστροφη: TGTGGCTTCGGATGTGCAT και βήτα-ακτίνη: προς τα εμπρός: CTGGCACCACACCTTCTACAA, αντίστροφη: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. Τα ακόλουθα τυπικοί χρόνοι προφίλ που χρησιμοποιήθηκαν ήταν για 40 κύκλους: ένα αρχικό στάδιο στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης υπολογίζεται με τη μέθοδο 2-ΔΔCT όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33].

STAT3 και RKIP λουσιφεράσης Αναλύσεις

Τα κύτταρα (2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 6 φρεατίων) διαμολύνθηκαν παροδικά με 0,1 μg (STAT3, RKIP) ή 0,05 μg (NF-kB) ενός πλασμιδίου ανταποκριτή που περιέχει είτε την πρόσδεση STAT3 SIE-θραύσμα της περιοχής προαγωγέα του γονιδίου IRF1 ποντικού (p2xSIE-Luc) ή η περιοχή προαγωγού RKIP συν τις ενδεικνυόμενες πλασμίδια όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Περίπου 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη φάρμακο ή μολυσμένα με

H. pylori

τη διάρκεια της νύχτας ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Η δραστικότητα λουσιφεράσης στο κυτοσολικό υπερκείμενο εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία λουσιφεράσης (Promega) και μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μετρητή φωταύγειας για την εκτίμηση μεταγραφική δραστηριότητα [18].

Η απόπτωση Δοκιμασίες

Η απόπτωση προσδιορίστηκε ποσοτικά σε ξεχωριστούς προσδιορισμούς με κυτταρομετρία ροής και κατάτμηση του DNA ELISA. Για κυτταρομετρία ροής, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (sub-G

O) προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ιωδιούχου προπιδίου χρωματισμένων κυττάρων [29]. Κυτταροπλασματικά ιστόνης σχετιζόμενη κατάτμηση του DNA μετρήθηκε με το κύτταρο Death Detection ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, ΙΝ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Κυτταροπλασματικά ιστόνης σχετίζεται με κατάτμηση του DNA μετρήθηκε με το κύτταρο Death Detection ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, ΙΝ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές και εκτελούνται εις διπλούν.

φακοϊό μεσολάβηση Νοκ ντάουν της RKIP

Lentivirus κατασκευάζει.

pLKO.1 puro-αντίσταση λεντοϊού κατασκευή RHS3979-97070798 και RHS3979-98492779 αγοράστηκαν από Open Biosystems (Huntsville, AL). Τα κατασκευάσματα περιείχαν πουρομυκίνης δείκτη επιλογής και αναπτύχθηκαν σε Luria Broth που περιέχει αμπικιλλίνη σε 37 ° C. Ο ζωμός φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 χ

g

για 10 λεπτά. και το υπερκείμενο απορρίφθηκε. DNA από τα σφαιρίδια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το Qiagen Plasmid Maxi Kit Plus.

Lentivirus παραγωγής.

κύτταρα συσκευασίας 293Τ σπάρθηκαν σε χαμηλή αντιβιοτικό μέσο ανάπτυξης (DMEM, 10% θερμοαπενεργοποιημένο FBS, 0,1 × πενικιλίνη /Strepomycin /γλουταμίνη). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες (37 ° C, 5% CO

2), ή έως ότου ήταν περίπου ~ 70% συρροή. Τα μέσα στα κύτταρα συσκευασίας 293Τ αντικαταστάθηκε με μέσο ανάπτυξης που περιέχει υψηλή DMEM. Ένα μίγμα των πλασμιδίων μορφομετατροπής παρασκευάστηκαν ως εξής:. Πλασμίδιο πακεταρίσματος (ΔVpr.89), το πλασμίδιο περιβλήματος (VSV-G), φουρκέτα-pLKO.1 και κενό φορέα

αντιδραστήριο Fugene διαμόλυνσης παρασκευάσθηκε σε DMEM σύμφωνα τις οδηγίες των κατασκευαστών. Εν συντομία, τα 3 πλασμίδια προστέθηκαν στάγδην στο FuGENE και DMEM και αναμίχθηκαν. Το μίγμα στη συνέχεια αφήνεται να επωαστεί για 20-30 λεπτά. σε θερμοκρασία δωματίου. Το μίγμα διαμόλυνσης στη συνέχεια προστέθηκε προσεκτικά στα κύτταρα συσκευασίας. Τα κύτταρα επωάστηκαν για περίπου 18 ώρες. Το μέσο διαμόλυνσης στη συνέχεια απορρίφθηκε το επόμενο πρωί και να αντικατασταθεί με μέσο υψηλής ανάπτυξης. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες. Λεντοϊού που περιέχει μέσα συλλέχθηκαν containingand πρόσθετων μέσων υψηλής ανάπτυξης, πρόσθεσε. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες και τα μέσα μαζικής ενημέρωσης συγκομιδή. Τυπικά συλλογή ήταν για 2-3 χρονικά σημεία. Όλες οι συγκομιδές ιικό συνενώθηκαν.

μόλυνση Lentivirus κυττάρων AGS.

AGS κύτταρα αναπτύχθηκαν σε περίπου 50% συρροή. Τα ιικά υπερκείμενα προστέθηκαν με πολυβρένιο. Δώδεκα ώρες μετά τη μόλυνση, το ιικό μέσο απορρίφθηκε και αντικαταστάθηκε με ιογενή μέσα ενημέρωσης και επωάστηκαν για επιπλέον 12 ώρες. Το μέσο απορρίφθηκε και αντικαταστάθηκε με μέσο F12 του Ham. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα χωρίστηκαν σε μέσο επιλογής που περιέχει πουρομυκίνης και αφέθηκαν να επωαστούν για 24 ώρες.

Στατιστικές Μέθοδοι

Όλα τα πειράματα καλλιέργειας κυττάρων επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά και αντιστοιχισμένο t- τεστ χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα.

Αποτελέσματα

H. pylori

Λοίμωξη Αυξάνει την φωσφορυλίωση της RKIP

RKIP αναστέλλει αρκετές οδούς κυτταρικής επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που προκαλούνται μέσω NF-kB και Jak /STAT [22]. Για να διερευνηθεί η επίδραση του

H. pylori

μόλυνσης στην RKIP στα γαστρικά κύτταρα, AGS κύτταρα μολύνθηκαν με το

H. pylori

και συλλέχθηκαν 2 ώρες και 6 ώρες αργότερα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης RKIP (pRKIP) ήταν αυξημένα μετά από 2 ώρες (3.126 φορές) και 6 ώρες (2.9 φορές) μετά

H. pylori

μόλυνση ενώ η έκφραση της συνολικής πρωτεΐνης RKIP αυξήθηκε 1,4 φορές μετά από 2 ώρες και 1,75 φορές μετά από 6 ώρες

H. pylori

λοίμωξη. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης με ΜΚΝ γαστρικά καρκινικά κύτταρα (βλέπε Σχήμα S1).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των κυττάρων AGS συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

(HP) σε ΜΟΙ 100:1 για 2 και 6 ώρες και εξετάζονται για pRKIP, RKIP, και την έκφραση ακτίνης. Πυκνομετρία πραγματοποιήθηκε σε τρία ανεξάρτητα πειράματα και εντάσεις ζωνών ομαλοποιήθηκαν σε σύγκριση με Actin για κάθε χρονικό σημείο. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν 3,126 φορές αύξηση (μέση ένταση 0,44 vs 1,376) του pRKIP μετά από 2 ώρες και 1,384 φορές αύξηση (μέση ένταση 0,6774 έναντι 0.938) του RKIP μετά από 2 ώρες από

H. pylori

λοίμωξη. (Β) AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν για 6 ώρες παρουσία ή απουσία του δισινδολυλομηλεϊμίδης PKC αναστολέα (Bis), εξετάστηκαν για την έκφραση της pRKIP, RKIP και actin.All θεραπείες διεξήχθησαν σε 1% DMSO ως μάρτυρα οχήματος ( δις).

Η

H. pylori

Induced φωσφορυλίωση των RKIP είναι PKC-εξαρτώμενη

Η φωσφορυλίωση της σερίνης RKIP επί 153 από πρωτεϊνική κινάση C (PKC) καταργεί την ικανότητά του να δεσμεύεται με Raf και αναστέλλουν καθοδικά ΜΑΡ κινάσης σηματοδότησης [31]. Εξετάσαμε αν η φωσφορυλίωση της RKIP από

H. pylori

ήταν PKC-εξαρτώμενη. κύτταρα AGS μολύνθηκαν με

H. pylori

για 6 ώρες, με την παρουσία ή απουσία 40 μΜ δισινδολυλομηλεϊμίδης (Bis, ένας αναστολέας PKC). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης RKIP ανεστάλη 3.9-φορές και RKIP 1,36 φορές μετά την

H. pylori

μόλυνση με την παρουσία του αναστολέα PKC, υποδηλώνοντας ότι η φωσφορυλίωση από RKIP

H. pylori

περιλαμβάνει, αλλά δεν μπορεί να εξαρτάται αποκλειστικά από το PKC-ρυθμίζεται οδού (Εικ. 1Β).

IL-6 επάγει φωσφορυλίωση της RKIP και

H. pylori-

ενεργοποιεί STAT3

Δεδομένου ότι υπάρχει μια αντίστροφη σχέση μεταξύ RKIP και της έκφρασης STAT3 στο γαστρικό δείγματα καρκίνου [19], θα αξιολογηθεί κατά πόσο STAT3 και βασικό ρυθμιστή της IL-6 [17] επηρεάζει την έκφραση pRKIP. IL-6 θεραπεία σε δόση 25 ή 50 ng /ml αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης pRKIP 1,8 και 1,35 φορές αντίστοιχα και η συνολική έκφραση της πρωτεΐνης RKIP μειώθηκαν 0,8 και αυξήθηκε 1,05 φορές αντίστοιχα (Εικ. 2Α). Η φωσφορυλίωση του RKIP σε απόκριση στην IL-6 ήταν PKC-εξαρτώμενο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η IL-6 μπορεί επίσης να επάγει φωσφορυλίωση του RKIP στα γαστρικά κύτταρα που μπορεί να προκύψει, εν μέρει, σε ΡΚΟ-εξαρτώμενο μονοπάτι.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των κυττάρων AGS κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της IL-6 και για 6 ώρες. Πυκνομετρία πραγματοποιήθηκε και για την έκφραση pRKIP, τα αποτελέσματά μας δείχνουν μια 1.8 φορές incerase του pRKIP (μέση ένταση 0,59 vs 1,051) σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 25 ng /ml IL-6 και ένα 1,35 φορές αύξηση (μέση ένταση 0,59 vs 0,772) σε κύτταρα κατεργασμένα με 50 ng /ml IL-6. Για την έκφραση RKIP, τα αποτελέσματά μας δείχνουν μια 0.8 φορές incerase του pRKIP (μέση ένταση 0,69 vs 0,563) σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 25 ng /ml IL-6 και ένα 1,05 φορές αύξηση (μέση ένταση 0,69 vs 0,745) σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 50 ng /ml IL-6 όταν εξομαλύνεται σε ακτίνη σε κάθε χρονικό σημείο. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των AGS συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

και εξετάστηκαν για pY705 STAT3 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους? (Γ) STAT3 αναφοράς λουσιφεράσης μεταγραφική δοκιμασία των κυττάρων AGS συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

στο υποδεικνύεται ΜΟΙ? δοκιμασία ανταποκριτή (D) STAT3 λουσιφεράσης των κυττάρων AGS παροδικά επιμολυσμένα με STAT3 για 24 ώρες και συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

ή /και υποβάλλεται σε επεξεργασία με IL-6 για 6 ώρες. Μια paired t-test διεξήχθη για να αναλυθεί η αύξηση ή μείωση της STAT3 μεταγραφή των πειραματικών δειγμάτων σε σύγκριση με κενό φορέα (EV): * IL-6, ρ & lt? 0,0003? ** STAT3, σ & lt? 0,009? ***

H. pylori

p & lt? 0,0005? **** STAT3 και

H. pylori

p & lt?. 0.0000023

Η

Τα μακροφάγα κυτοκίνες απελευθέρωση, συμπεριλαμβανομένης της IL-6 κατά τη διάρκεια

H. pylori

μόλυνση [34] που οδηγούν στην ενεργοποίηση STAT3 [17]. Να διερευνήσει τις επιπτώσεις της

H. pylori

μόλυνση στην ενεργοποίηση των STAT3, AGS κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα κατασκεύασμα IRF-1 ρεπόρτερ [18] και συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

στην ενδεικνυόμενη περιοχή από πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) για 24 ώρες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι σε ΜΟΙ μεταξύ 10-200:1,

H. pylori

ήταν σε θέση να επάγει μεταγραφή STAT3 (Σχ. 2C) και φωσφορυλίωση STAT3 pY705 (Εικ. 2Β) μέσα σε 6 ώρες από τη μόλυνση. Είμαστε δίπλα προσδιοριστεί αν η IL-6 θα μπορούσε επίσης να διεγείρει τη μεταγραφή STAT3 στα κύτταρα AGS. κύτταρα AGS επιμολύνθηκαν παροδικά με IRF-1 και με EV και ή c-myc-tagged STAT3 και, στη συνέχεια, μετά από 24 ώρες τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με είτε IL-6 (50 ng /ml) ή συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

σε ΜΟΙ 100:1. Τα αποτελέσματα, που απεικονίζονται στο Σχ. 2D, αποδεικνύουν ότι η IL-6 (p & lt? 0.0003) και

H. pylori

(ρ & lt? 0,0005) ήταν το καθένα μπορεί να διεγείρει σημαντικά την μεταγραφή STAT3, μια επίδραση που ενισχύθηκε όταν τα κύτταρα AGS επιμολύνθηκαν με STAT3 και μολύνθηκαν με

H. pylori

(p & lt? 0,0000023). Η ενίσχυση της ενεργοποίησης STAT3 ήταν σημαντικά αυξημένη όταν τα κύτταρα AGS συν-επεξεργασία με IL-6 και

H. pylori

σε σύγκριση με τη θεραπεία με IL-6 (ρ & lt? 0,000028) ή

H. pylori

(p & lt? 0,0003). μόνη

φωσφορυλιωμένη RKIP επάγει το δικό της μεταγραφής του

Χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης RKIP να ερευνήσει τις επιπτώσεις της

H. pylori

μόλυνση στο RKIP μεταγραφική δραστηριότητα.

Η. pylori

σημαντικά αυξημένη μεταγραφή RKIP (ρ & lt? 0.002) με αύξηση μεγαλύτερη από 10-φορές συμβαίνουν με RKIP υπερέκφραση και μεγαλύτερη από 16-πλάσια αύξηση με τον συνδυασμό του

H. pylori

και RKIP (ρ & lt? 0,0003) (σχήμα 3Α.) όταν συγκρίνεται με τα μη επεξεργασμένα AGS κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα. Υπήρξε μια σημαντική αύξηση (p & lt? 0,0001) σε μεταγραφή RKIP με

H. pylori

μόλυνση και RKIP υπερέκφραση σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με RKIP χωρίς λοίμωξη (Εικ. 3Α). Επαναλάβαμε τα πειράματα αυτά με την παρουσία δις να αναστέλλουν δραστικότητα PKC για να προσδιοριστεί η αύξηση RKIP μεταγραφή οφειλόταν σε φωσφορυλίωση. Με την παρουσία του αναστολέα PKC,

H. pylori

αυξημένη μεταγραφή RKIP και RKIP υπερέκφραση είχε επίσης ως αποτέλεσμα την αύξηση της δραστηριότητας RKIP υποκινητή. Δις μειωμένη μεταγραφή RKIP προκαλείται από RKIP υπερέκφραση και

H. pylori

μόλυνση μεγαλύτερη από 4 φορές, σε σύγκριση με τα κύτταρα με υπερέκφραση RKIP και προτείνει ότι αυτές οι ενέργειες ήταν εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση RKIP (Εικ. 3Α). Εξετάσαμε τον εντοπισμό των RKIP μετά

H. pylori

λοίμωξη. Ανοσοκηλίδωση υποκυτταρικών κλασμάτων AGS κύτταρα έδειξαν ότι pRKIP είναι εντοπισμένη στον πυρήνα ενώ RKIP παραμένει κυρίως στο κυτταρόπλασμα μετά την μόλυνση, (Σχ. 3Β). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι

H. pylori

μπορεί να προάγει τη μετατόπιση του pRKIP μέσα στον πυρήνα όπου μπορεί να ενεργοποιήσει μεταγραφή RKIP.

(Α) μεταγραφή RKIP δοκιμασία ρεπόρτερ κυττάρων AGS παροδικά επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα λουσιφεράσης RKIP και ΗΑ-RKIP για 24 ώρες, τότε συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

για 12 ώρες με την παρουσία ή απουσία του αναστολέα PKC. Σε σύγκριση με τους ελέγχους κενών φορέα, σχετικής μεταγραφικής δραστικότητα ήταν σημαντικά αυξημένη για *

H. pylori

, σ & lt? 0,002? και **

H. pylori

+ RKIP, P & lt? 0,0003. Συγκρίνοντας την απώλεια της σχετικής δραστηριότητας λουσιφεράσης της

H. pylori

και RKIP σε σύγκριση με το

H. pylori

, RKIP και Bis, σ & lt? 0,0004. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσον +/- τυπική απόκλιση (SD) του πλάσια αύξηση σε σχέση με τα κενά στοιχεία ελέγχου του φορέα σε 2 ανεξάρτητα πειράματα εκτελέστηκαν εις διπλούν. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των πυρηνικών και κυτοσολικά κλάσματα των κυττάρων AGS συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

για 4 ώρες για την έκφραση του pRKIP και συνολικής RKIP. Ακτίνης και έλασμα παρέχουν επαλήθευση των επιτυχημένων κυτταροπλασματικών και πυρηνικών διαχωρισμό κλάσμα.

Η

H. pylori

επαγόμενη RKIP φωσφορυλίωση Εξαρτάται από το

H. CAG του πυλωρού του

Παθογένεια νησί και RKIP Σερίνη 153

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος των συγκεκριμένων

H. pylori

παράγοντες στην φωσφορυλίωση της RKIP, άγριου τύπου

H. pylori

και ισογονικούς μεταλλάξεις στερούνται ολόκληρου του CAG

PAI ή

το

oipA

γονίδιο συν-καλλιεργήθηκαν με AGS κύτταρα για 6 ώρες. Η

H. pylori

μεταλλαγμένο λείπει το CAG

ΡΑΙ

δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει φωσφορυλίωση RKIP, ενώ το άγριου τύπου λεκέ και το

oipA

μεταλλαγμένο έντονα προκαλείται από RKIP φωσφορυλίωση (Εικ. 4Α). Η ίδια τάση παρατηρήθηκε στις STAT3 pY705. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα γονίδια μέσα στο

H.

cagPAI του πυλωρού είναι αναγκαία για την επαγωγή της φωσφορυλίωσης RKIP και STAT3.

ανάλυση Western blot (Α) AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

στελεχών για 6 ώρες και εξετάζονται για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. C = ελέγχου (μη μολυσμένα), WT = AGS κύτταρα μολυσμένα με άγριου τύπου

H. pylori

για 6 ώρες,

PAI κατασκευαστής – και

oipA

– αντιπροσωπεύουν ισογονιδιακές μεταλλάξεις που δεν έχουν αυτά τα γονίδια. (Β) AGS κύτταρα παροδικά διαμολυσμένα για 24 ώρες με RKIP S153 cDNA ή 24 ώρες και συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

για 6 ώρες. δοκιμασία ανταποκριτή (C) RKIP λουσιφεράσης των κυττάρων AGS παροδικά επιμολυσμένα με S153V RKIP παρουσία ή απουσία του

H. pylori

λοίμωξη. Σε σύγκριση με άδειο ελέγχους φορέα, η σχετική δραστηριότητα της μεταγραφής RKIP αυξήθηκε κατά: *

H. pylori

, σ & lt? 0,002? ** RKIP, σ & lt? 0,002? *** S153V, σ & lt? 0,03, ****

H. pylori

και RKIP, σ & lt? 0,0005? *****

H. pylori

και S153V, σ & lt? 0.003. **, RKIP μεταγραφική δραστηριότητα μειώθηκε σημαντικά από το S153V σε σύγκριση με τον άγριο τύπο RKIP κατασκευάσει σε απάντηση

H. του πυλωρού, #

, σ & lt? 0,0003. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή +/- SD από 2 ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν.

Η

Για να διερευνηθεί αν η μετάλλαξη σερίνης 153 επηρεάζει

H. pylori

μεσολάβηση φωσφορυλίωση RKIP και μεταγραφική ενεργοποίηση, AGS κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα RKIP κατασκεύασμα στο οποίο η σερίνη υποκαταστάθηκε με βαλίνη στη θέση 153 (S153V) και στη συνέχεια συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

. Για άλλη μια φορά παρατηρήσαμε μια μεγαλύτερη συνέχεια 16-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα προαγωγέα RKIP σε κύτταρα με υπερέκφραση RKIP και

H. πυλωρού

λοίμωξη (p & lt? 0.0005). Ωστόσο, σε κύτταρα επιμολυσμένα με RKIP S153V πριν

H. pylori

μόλυνση, υπήρξε μια 2.5-πλάσια μείωση στην μεταγραφική δραστικότητα (ρ & lt? 0,0003) σε σύγκριση με την

H. pylori

λοίμωξη σε άγριου τύπου RKIP υπερεκφράζουν κύτταρα (Εικ. 4C). Επιπλέον, η υπερέκφραση του S153V RKIP ανέστειλε

H. pylori

μεσολάβηση RKIP φωσφορυλίωση (Εικ. 4Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση φωσφορυλίωσης και μεταγραφικές του RKIP εξαρτάται από

H.

του πυλωρού του cagPAI και επίσης από φωσφορυλίωση της RKIP στο S153.

H. pylori

λοίμωξη αποτελέσματα σε RKIP Υποβάθμιση και η επαγωγή της σαλιγκάρι

Επειδή αυξημένη μεταγραφή RKIP προκαλείται από

H. pylori

μόλυνση δεν συσχετίστηκε με αυξημένο σταθερή κατάσταση έκφραση της πρωτεΐνης συνολικό RKIP, εξετάσαμε αν η

H. pylori

μπορούσε ταυτόχρονα να αυξήσει τον ρυθμό αποικοδόμησης πρωτεΐνης RKIP μέσω αποικοδόμησης πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση, όπως προτείνεται προηγουμένως [35]. MG132 αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης RKIP παρουσία ή απουσία του

H. pylori

μόλυνση, σύμφωνα με το

H. pylori

αυξανόμενη αποικοδόμηση του πρωτεασώματος RKIP (Εικ. 5Α).

AGS κύτταρα ήταν (Α) υποβάλλεται σε επεξεργασία με MG132 και εξετάστηκαν για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες μέσω ανάλυσης στυπώματος Western. V παριστά όχημα (DMSO) ελέγχου. (B, C) Τα κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και εξετάστηκαν για την έκφραση του σαλιγκαριού ή (D) μετράται για Σαλιγκάρι mRNA με πραγματικού χρόνου PCR στους αναγραφόμενους χρόνους μετά

H. pylori

λοίμωξη.

Η

Ένας άλλος μηχανισμός που θα μπορούσε να εξηγήσει την έλλειψη αλλαγής στην πρωτεΐνη RKIP ή την έκφραση του mRNA θα είναι μεταγραφική καταστολή των RKIP μετά

H. pylori

λοίμωξη. Σαλιγκάρι είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που παίζει σημαντικό ρόλο στην ΕΜΤ [23] καθώς επίσης και όντας ένα γνωστό μεταγραφικό καταστολέα του RKIP σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [25]. Να διερευνήσει τις επιπτώσεις της

H. pylori

μόλυνση στην έκφραση των σαλιγκαριών και RKIP, AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με

H. pylori

σε ΜΟΙ 100. Snail mRNA έκφραση ήταν έντονα επάγεται μετά από 2-4 ώρες από την μόλυνση (Σχ. 5D) ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι

H. pylori

μόλυνση προκάλεσε έναν χρόνο και εξαρτάται από τη δόση αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης Σαλιγκάρι (Εικ. 5Β /C). Το αποτέλεσμα αυτό δεν είναι σύμφωνο με τα δεδομένα μας για τη μεταγραφή RKIP μετά

H. πυλωρού

λοίμωξη (Εικ. 3) και υποδηλώνει ότι

H. pylori

μόλυνση μπορεί στην επαγωγή της πρωτεΐνης (ων) που θα καταργήσει την επίδραση του Σαλιγκάρι σε μεταγραφή RKIP. Είμαστε διερευνά επί του παρόντος τη δυνατότητα αυτή με ανάλυση φασματομετρίας μάζας με τη χρήση γονικής και RKIP νοκ ντάουν κύτταρα (Εικ. 6).

(Α) ανάλυση Western blot της AGS παροδικά επιμολυσμένων με RKIP για 24 ώρες και στη συνέχεια μολύνονται με

Η . pylori

για 6 ώρες. πυκνομετρική ανάλυση για το μέσο όρο των 2 ανεξάρτητων πειραμάτων έδειξαν 1,53 φορές αύξηση στην απόπτωση (μέση ένταση 0,19 vs 0,295) σε

H. pylori

μολυσμένα κύτταρα? 2,1 φορές αύξηση (μέση ένταση 0,19 vs 0,403) σε κύτταρα επιμολυσμένα με RKIP? μια 2,6 φορές αύξηση (μέση ένταση 0,19 vs 0,495) σε κύτταρα μολυσμένα με

H. pylori

και παροδικά επιμολυσμένα με RKIP όταν εξομαλύνεται σε ακτίνη. Παράλληλα η απόπτωση μετρήθηκε με (Β) κυτταρομετρία ροής. δοκιμασία κατακερματισμού του DNA βασίζεται C) Μια ELISA χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της απόπτωσης. Σε σύγκριση με το κενό φορέα ελέγχου στο (Β) απόπτωση αυξήθηκε από

* H. pylori

, σ & lt? 0,0008? ** RKIP, σ & lt? 0,003? ***

H. pylori

και RKIP, σ & lt? 0,0005. Στο (C) σε σύγκριση με τους ελέγχους κενών φορέα, η απόπτωση αυξήθηκε σημαντικά με: *

H. pylori

, σ & lt? 0.000063? ** RKIP, σ & lt? 0,006?

*** H. pylori

και RKIP, σ & lt? 0,0007. Τα στοιχεία για το Β και C αντιπροσωπεύει το μέσο όρο +/- δϋ 2 ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν. (Δ) ανάλυση Western blot των κυττάρων AGS μολυνθεί με Lentivirus να γκρεμίσουμε έκφραση RKIP πριν από 6 ώρες μόλυνσης με

H. pylori

. CTR = μη μολυσμένα κύτταρα AGS, HP = AGS κύτταρα μολυσμένα με

H. pylori

, KD = AGS κύτταρα μολυσμένα με ιό lenti με νοκ ντάουν RKIP, κύτταρα KD + RKIP AGS μολυνθεί με τον ιό lenti με νοκ ντάουν RKIP και μολύνθηκαν με

H. pylori

για 16 ώρες. (Ε) απόπτωση (από το DNA του κατακερματισμού ELISA) μετρήθηκε μετά από 16 ώρες από

H. pylori

λοίμωξη. Η απόπτωση ήταν σημαντικά αυξημένη από το

H. pylori

στα AGS κύτταρα * p & lt? 0,0007? και AGS κύτταρα με RKIP νοκ ντάουν, ** p & lt? 0.003 και μειώθηκε σύγκριση

H. pylori

-μολυσμένα RKIP νοκ ντάουν κύτταρα AGS με

H. pylori

-μολυσμένα γονική AGS κύτταρα, # p & lt? 0,0006. Τα δεδομένα που δείχνονται αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή +/- SD 2 πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν.

Η

RKIP Βελτιώνει

H. pylori

μεσολάβηση απόπτωση

H. pylori

επάγει απόπτωση γαστρικού επιθηλίου κυττάρου [8]. Από RKIP μπορεί να προωθήσει την απόπτωση [29], εξετάσαμε αν η επαγωγή της pRKIP μετά

H. Όπως φαίνεται στο Σχ.