Αφηρημένο

Ιστορικό

Εισαγωγή χημειοθεραπείας είναι μια κοινή θεραπευτική επιλογή για τους ασθενείς με locoregionally-προχωρημένο καρκίνο κεφαλής και τραχήλου (ΕΘΕΓ), αλλά παραμένει ασαφές ποιοι ασθενείς θα ωφεληθούν. Σε αυτή τη μελέτη, ψάξαμε για βιοδείκτες την πρόβλεψη της ανταπόκρισης των ασθενών με locoregionally προηγμένες ΕΘΕΓ με χημειοθεραπεία εφόδου με την αξιολόγηση του προτύπου έκφρασης των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA.

Μέθοδοι

Η έκφραση ενός πάνελ του DNA -Επισκευή πρωτεΐνες σε φορμόλη σταθερό ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα από μια ομάδα των 37 ασθενών που υποβάλλονται σε ΕΘΕΓ με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία εφόδου πριν από την οριστική chemoradiation αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική ανοσοϊστοχημεία.

Αποτελέσματα

Βρήκαμε ότι XPF (ένας συνεργάτης σύνδεσης ERCC1) και φωσφο-ΜΑΡΚΑΡ κινάσης 2 (ρΜΚ2) είναι νέα βιοδείκτες για τους ασθενείς που υποβάλλονται σε HNSCC με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία εφόδου. Χαμηλή έκφραση XPF σε ασθενείς HNSCC σχετίζεται με καλύτερη απόκριση σε επαγωγή χημειοραδιοθεραπεία, ενώ η έκφραση υψηλής XPF συσχετίζεται με χειρότερη απόκριση (p = 0.02). Επιπλέον, η χαμηλή έκφραση ρΜΚ2 βρέθηκε να συσχετίζεται σημαντικά με τη συνολική επιβίωση μετά την επαγωγή συν θεραπεία chemoradiation (p = 0,01), γεγονός που υποδηλώνει ότι ρΜΚ2 μπορεί να σχετίζονται με τη θεραπεία chemoradiation.

Συμπεράσματα

Εντοπίσαμε XPF και ρΜΚ2 ως νέων βιοδεικτών επιδιόρθωσης DNA για τους ασθενείς ΕΘΕΓ locoregionally-προηγμένη που υποβάλλονται με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία εφόδου πριν από την οριστική chemoradiation. Η μελέτη μας παρέχει πληροφορίες για τη χρήση των βιοδεικτών επιδιόρθωσης του DNA σε εξατομικευμένες στρατηγικές διάγνωσης. Περαιτέρω επικύρωση σε μια μεγαλύτερη ομάδα υποδεικνύεται

Παράθεση:. Seiwert TY, Wang Χ, Heitmann J, Villegas-Bergazzi V, Sprott K, Finn S, et al. Επισκευή (2014) DNA Biomarkers XPF και φωσφο-ΜΑΡΚΑΡ κινάσης 2 συσχετίζει με την κλινική έκβαση σε προχωρημένους καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. PLoS ONE 9 (7): e102112. doi: 10.1371 /journal.pone.0102112

Επιμέλεια: Apar Kishor Ganti, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Μάρτη 2014? Αποδεκτές: 14 Ιούν του 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 του Ιουλίου, 2014

Copyright: © 2014 Seiwert et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ASCO Μεταγραφική Καθηγητής βραβείο του πλοίου (EEV), η Grant Achatz και ο Nick Κοκονά /Alinea καρκίνο κεφαλής και τραχήλου Ταμείο Έρευνας (EV, TYS), και μια πτήση Παρακολούθηση Ιατρικού Ερευνητικού Ινστιτούτου Νέων Κλινική βραβείο Επιστήμονας (FAMRI, YCSA) ( TYS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Χ Wang, V Villegas-Bergazzi, και η DT Weaver ήταν υπάλληλοι της On-Q -ity. Κ Sprott, S Finn, Ε O’Regan, DA Φάροου ήταν σύμβουλοι για On-Q-τητα. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι αυτό δεν μεταβάλλει τη συμμόρφωση με όλες PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

κεφαλής και τραχήλου ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC) είναι η 6η πιο συχνή κακοήθης νεοπλασία σε όλο τον κόσμο και ευθύνεται για 45.000 νέα κρούσματα στις ΗΠΑ κάθε χρόνο [1], [2]. Για πρακτικούς λόγους, καρκίνο κεφαλής και τραχήλου χωρίζεται σε τρία κλινικά στάδια: νωρίς, locoregionally προχωρημένο, μεταστατικό ή υποτροπιάζοντα. θεραπευτικές προσεγγίσεις μπορεί να ποικίλει ανάλογα με το στάδιο της νόσου. Η συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών (περίπου 60%) που παρουσιάζουν locoregionally-προχωρημένη νόσο απαιτούν επιθετική θεραπεία πολυτροπικότητα. Αναφέρθηκαν τα ποσοστά μακροχρόνιας επιβίωσης κυμαίνεται μεταξύ 50-70% [3], [4]. Επαγωγή ή εισαγωγική χημειοθεραπεία χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο πριν από την οριστική τοπική θεραπεία (δηλαδή η χειρουργική επέμβαση /χημειοραδιοθεραπεία /ακτινοβολία) και FDA ενέκρινε για τη συγκεκριμένη ένδειξη. Εισαγωγή χημειοθεραπείας σχετίζεται με υψηλά ποσοστά ανταπόκρισης, συμπτωματική ανακούφιση και μείωση σε μακρινές μεταστατικές βλάβες. Επιπλέον, αρκετές ομάδες, συμπεριλαμβανομένων δικό μας έχουν αναφέρει μια σαφή σχέση μεταξύ ανταπόκρισης στην αρχική χημειοθεραπεία και βελτίωσε τη συνολική επιβίωση [5] – [7]. Παρά το υψηλό βαθμό δραστηριότητας, μια πρόσφατη μελέτη φάσης ΙΙΙ, απέτυχε να δείξει όφελος προσθήκη χημειοθεραπείας εφόδου σε χημειοραδιοθεραπεία σε ένα μη επιλεγμένο πληθυσμό [8] του ασθενούς. ανάλυση των υποομάδων υποδηλώνουν πιθανό όφελος σε ορισμένους πληθυσμούς υψηλού κινδύνου, αλλά εν τη απουσία μιας κατάλληλης επικύρωση των βιοδεικτών των υποθέσεων θα είναι δύσκολη και δαπανηρή.

Μια μετα-ανάλυση επιβεβαίωσε επίσης ένα μικρό πλεονέκτημα επιβίωσης με χημειοθεραπεία εφόδου, παρά την ετερογένεια των θεραπειών που περιλαμβάνονται [9]. Δυστυχώς, δεν υπάρχει σήμερα καμία επικυρωμένη μέθοδο να προβλεφθεί ποιοι ασθενείς θα ωφεληθούν από αυτήν την θεραπεία και παραμένει ασαφές το πώς να επιλέξετε ασθενών για αυτό το δυνητικά ευεργετικά, καθώς και ενδεχομένως τοξικά θεραπεία. Βιοδείκτες θα μπορούσαν να βοηθήσουν να βελτιωθεί η επιλογή των ασθενών στο μέλλον.

πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στη διατήρηση της σταθερότητας γονιδιώματος και έχουν εμπλακεί σε ογκογένεση. Οι ασθενείς με σύνδρομα χρωμοσωμική αστάθεια, όπως της αναιμίας Fanconi (FA), αταξία τελαγγειεκτασία (ΑΤ), σύνδρομο ή σύνδρομο Werner δείχνουν ελαττώματα του Bloom στην επιδιόρθωση του DNA και ένα σχετικό αυξημένο κίνδυνο και κακή πρόγνωση για τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων της κεφαλής και του τραχήλου [10] – [17 ]. Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν γενετική αστάθεια και συχνά είναι ελαττωματικά σε ένα από τα έξι μεγάλα μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA και συγκεκριμένα: επισκευαστικής βάσης εκτομή (ΚΑΚ), την επισκευή νουκλεοτιδίων εκτομή (NER), επισκευή ασυμφωνία (MMR), ομόλογος ανασυνδυασμός (HR), μη ομόλογα endjoining (NHEJ) , και η σύνθεση translesion DNA (TLS). Η χημειοθεραπεία και η πιο χημειοθεραπευτικούς παράγοντες βλάψουν το DNA και η έλλειψη επαρκούς επισκευής προκαλεί καρκινικών κυττάρων θάνατο.

Ως εκ τούτου, είναι ζωτικής σημασίας να προσδιοριστούν βιοδείκτες επιδιόρθωσης του DNA που μπορεί να προβλέψει ποιοι ασθενείς ωφελούνται από χημειοθεραπεία εφόδου σε locoregionally-προχωρημένο καρκίνο κεφαλής και τραχήλου .

Οι προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι ERCC1 είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για θεραπεία με βάση την πλατίνα [18] – [20]. Η πρωτεΐνη ERCC1 δεσμεύεται με XPF για να σχηματίσουν ένα ετεροδιμερές, η οποία είναι μια ειδική δομή ενδονουκλεασών DNA που σταθεροποιεί το ένα το άλλο

in vivo

και είναι υπεύθυνη για την «τομή 5 κατά τη διάρκεια επισκευής νουκλεοτιδίων εκτομής [21]. Τα επίπεδα ERCC1 μειωθεί σημαντικά σε ανεπαρκή κύτταρα XPF και αντίστροφα [22]. Αυτό βιοδεικτών δεν έχει εγκριθεί για HNSCC εν μέρει οφείλεται σε διαμάχη γύρω από την ιδιαιτερότητα του απασχολούμενου αντισώματος [23], [24]. Άλλες μελέτες διαπιστώθηκε, ότι η αντίσταση προς την κατεύθυνση με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία συσχετίζεται με τα επίπεδα της πρωτεΐνης ή mRNA του ERCC1 και XPF [21], [25], [26].

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε ένα πάνελ επιδιόρθωσης του DNA πρωτεΐνες σε πέντε μεγάλες μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (IHC) και μια ψηφιακή πλατφόρμα παθολογίας να αξιολογηθεί κατά πόσο το πρότυπο έκφρασης των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA στο στάδιο της βιοψίας μπορεί να προβλέψει ανταπόκριση του όγκου σε ασθενείς με locoregionally προηγμένες HNSCC που υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία εφόδου πριν από την οριστική chemoradiation. Η μελέτη μας δείχνει ότι XPF είναι εξαιρετικά μεταβλητή μεταξύ των καρκίνων της κεφαλής και του τραχήλου με ένα ευρύ δυναμικό εύρος: Τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης του XPF συσχετίζονται με καλύτερη απόκριση σε επαγωγή χημειοραδιοθεραπεία, ενώ τα υψηλά επίπεδα έκφρασης XPF σχετίζεται με χειρότερη απάντηση. Επιπλέον, ρΜΚ2, μια κινάση που έχει αναφερθεί ότι είναι κρίσιμης σημασίας για την μετα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, ως μέρος της απάντησης βλάβης του DNA [27], συνδέεται σημαντικά με τη συνολική επιβίωση μετά τη θεραπεία επαγωγής συν chemoradiation. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ανάλυση της αλλαγής στα μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA μπορεί να είναι κλινικά πολύτιμες ΕΘΕΓ.

Υλικά και Μέθοδοι

ομάδες των ασθενών

Η βιοψία δειγμάτων (φορμόλη σταθερό, παραφίνη ενσωματωμένα δείγματα όγκων) από 37 ασθενείς με σταδίου IV locoregionally προηγμένο HNSCC αντιμετωπίζονται στο Πανεπιστήμιο του Σικάγο αξιολογήθηκαν από ολόκληρα τμήματα. Οι βιοψίες ασθενών HNSCC είχε ληφθεί από ένα πρωτογενές εκτομή ή βιοψία πριν από τη θεραπεία. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους χορηγούς ή τον πλησιέστερο συγγενή για τη χρήση αυτών των δειγμάτων στον τομέα της έρευνας έχουν εγκριθεί βάσει του πρωτοκόλλου του Πανεπιστημίου του Σικάγο IRB 8980 και 15410A. Όλοι οι ασθενείς είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με χημειοθεραπεία εφόδου που αποτελείται από δύο κύκλους πακλιταξέλης και καρβοπλατίνη για ένα σύνολο οκτώ εβδομάδες. Εμείς στη συνέχεια πραγματοποιείται μια ενδιάμεση αξιολόγηση, που ακολουθείται από πακλιταξέλη, 5-φθοριοουρακίλη, υδροξυουρία και σχήματα ακτινοθεραπείας-based (FHX) με βάση χημειοραδιοθεραπεία και τελικά αξιολογούνται για την απάντηση [28], [29]. Αναλύσαμε τα δείγματα ασθενών σχετικά με HPV-κατάστασή τους με χρώση για το p16 (Santa Cruz JC-8).

αξιολόγηση Θεραπεία

αξιολόγηση Response διεξήχθη στο διάστημα μεταξύ χημειοθεραπεία εφόδου και συνεχόμενες χημειοραδιοθεραπεία από εκτιμήθηκε αξονική τομογραφία ή /και κλινική εξέταση από έναν ειδικό ΩΡΛ και η καλύτερη απάντηση. κριτήρια ανταπόκριση ορίστηκαν ως πλήρης απόκριση (CR) [14], προοδευτική ανταπόκριση (PR) και σταθερή νόσο (SD) με βάση τα κριτήρια RECIST [6], [30].

Οι κυτταρικές σειρές

Τα ιού πιθήκου 40 μετασχηματισμένες ινοβλάστες GM08437 (XPF – /-, Coriell Institute) κύτταρα και κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FCS) σε υγροποιημένο 5% CO2 επωαστή στους 37 ° C.

η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

τα ολόκληρα τμήματα των δειγμάτων βάφτηκαν από την IHC χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι XPF (SPM228) /ERCC1 (8F1) (Abcam), FANCD2 (Santa Cruz ), PAR, γH2AX (Millipore), MLH1 (AbSerotec) και φωσφο-ΜΑΡΚΑΡ Kinase2 (ρΜΚ2) (Cell Signaling Technology). Τομές ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν /επανυδατώθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές. Heat-επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου διεξήχθη και οι ιστοί βάφτηκαν με αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Πρωτογενή αντισώματα είχαν παραλειφθεί για αρνητικούς ελέγχους. Αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε ως πυρηνική αντιχρωστική. Διπλάσιες σειρές αραίωσης αντισώματος καθορίστηκαν και τις συνθήκες ανάκτησης αντιγόνου τέθηκαν έτσι ώστε αντίσωμα ήταν σε περίσσεια και διακρίσεις μεταξύ ιστών τον έλεγχο του καρκίνου, καθώς και μεταξύ χαμηλών και υψηλών επιπέδων έκφρασης. Αναγέννηση TSATM (τυραμιδίου Ενίσχυση σήματος) Βιοτίνη System (Perkin Elmer) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των XPF και FANCD2. Σούπερ Ευαίσθητα TM IHC Σύστημα Ανίχνευσης (BioGenex) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των PAR, PARP1, MLH1, ρΜΚ2, γH2AX και ERCC1.

IHC Scoring

Τα IHC χρωματίζονται ιστοί στις διαφάνειες σαρώθηκαν σε μια ψηφιακή πλατφόρμα παθολογία (Aperio). Ποιότητα της χρώσης μοτίβο ήταν παθολογία αναθεωρηθεί. Ένταση της πυρηνικής χρώσης και /ή τον εντοπισμό του δείκτη στα δύο πυρηνικά και κυτταροπλασματικά τμήματα προσδιορίστηκε. Τρεις περιοχές του όγκου του ενδιαφέροντος σε ένα ολόκληρο τμήμα επιλέχθηκαν από παθολόγους, προκειμένου να ελαχιστοποιηθούν οι επιπτώσεις της IHC διακύμανση χρώση. Σαρωθεί πλάκες στη συνέχεια αξιολογούνται από παθολόγους και ανάλυση ψηφιακής εικόνας της μηχανής με βάση (Aperio). Το ποσοστό (0-100%) των καρκινικών κυττάρων με θετική χρώση Ποσότητα (Q) και την ένταση (Ι) για κάθε δείκτη σε ανεξάρτητο βαθμολογήθηκε από δύο εκπαιδευμένους παθολόγους (VVB, SF), οι οποίοι δεν γνώριζαν από το κλινικό ιστορικό. Ένα πυρηνικό βαθμολογία αναφέρθηκε για XPF, ERCC1, FANCD2, MLH1, PARP1, άρτιο και γH2AX. Τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά τμήματα βαθμολογήθηκαν ξεχωριστά για ρΜΚ2. Χρώση ποσότητα (Q) βαθμολογήθηκε 0-4: καμία πυρηνική χρώση = 0? 1-9% των κυττάρων με πυρηνική χρώση = 1? 10-39% = 2? 40-69% = 3? και 70-100% = 4. ένταση χρώσης (Ι) κατατάσσονται 0-3, με 0 = αρνητική, 1+ = αδύναμη, 2+ = ενδιάμεσο, 3+ = ισχυρή. Τελικές βαθμολογίες προκύπτουν από τον πολλαπλασιασμό των βαθμολογιών ποσότητα και την ένταση χρώσης (IxQ) [31]. αναλύσεις εικόνας της μηχανής με βάση ιδρύθηκαν με βάση την τροποποιημένη μακροεντολές του πυρηνικού αλγόριθμο Aperio IHC να σκοράρει την ένταση /ποσότητα των θετικών πυρήνων όγκου. εξόδους δείκτη σε 0, 1+, 2+ και 3+ κάδους συνενώθηκαν σε έναν αλγόριθμο στάθμιση για να δημιουργήσει μια σχετική βαθμολογία ένταση (H-score) 0-300 [32].

Ανοσοαποτύπωσης

Ανοσοκηλίδωση για XPF, ERCC1, και β-ακτίνης έγινε χρησιμοποιώντας πρότυπη μεθοδολογία όπως περιγράφεται προηγουμένως [33] – [37]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκηλίδωση ήταν αντι-XPF (SPM228, Abcam), αντι-ERCC1 (8F1, Abcam /Santa Cruz), και αντι-β-ακτίνης (Η-170, Santa Cruz). Εννέα κυτταρικές σειρές καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου (SCC58, SCC61, SCC35, SCC28, SQ20B, SCC9, ΗΝ5, SCC68, SCC25), παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Ralph Weichselbaum και ο Δρ Μαρκ Lingen, χρησιμοποιήθηκαν.

Στατιστικές ανάλυση

βιοδεικτών βαθμολόγησης συσχετίστηκε με κλινικά δεδομένα για την εκτίμηση για τη συσχέτιση με την έκβαση. Ένα σύνολο αξιών βέλτιστο όριο δείκτη προσδιορίστηκε με μονοπαραγοντική ανάλυση για κάθε δείκτη που απέδωσε την υψηλότερη διάκριση για το διαχωρισμό Πλήρης ανταπόκριση (CR), μερική ανταπόκριση (PR), σταθερή νόσο (SD) ομάδες για την επαγωγή χημειοθεραπεία και η συνολική επιβίωση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση δεν ήταν εφικτό λόγω του μικρού αριθμού του δείγματος. Μονοπαραγοντική αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλα κατασκευάστηκαν για καθένα από τους δείκτες (μοντέλα ενιαίο δείκτη) για να εξετάσει το δυναμικό πρόβλεψης των αρμοδιοτήτων τους. διακριτική ανάλυση και τη διχοτόμηση πραγματοποιήθηκε επίσης να διαχωριστούν σε μέγιστο βαθμό τα δείγματα του συνόλου δεδομένων σε ομάδες.

Στατιστική εξόδους για το p-value (θετική προγνωστική αξία), Φαινομενική Error Rate (AER), Χαρακτηριστικά Δέκτης Χειριστή (ROC) και το εμβαδόν κάτω καμπύλη (AUC). ROC είναι μια γραφική πλοκή του εναντίον ευαισθησίας (1-εξειδίκευση) για ένα δυαδικό σύστημα ταξινομητή ως διάκριση της πραγματικής θετικά, σε αυτή την περίπτωση, είναι 1-ειδικότητα (κλάσμα CR /PR ονομάζεται SD /PD) έναντι ευαισθησίας ( κλάσμα SD /PD ονομάζεται SD /PD). AUC είναι ένα μέτρο του πόσο καλά δύο κατηγορίες των δεδομένων που διαχωρίζουν κάτω από ένα πρόγραμμα δοκιμών. Ευαισθησία, ειδικότητα, θετική προγνωστική ισχύς, Αρνητική προφητική δύναμη, σχετικός κίνδυνος (RR) και Λόγος Αποδόσεις υπολογίστηκαν στα εναλλακτικά μοντέλα.

Για να εκτιμηθεί η συσχέτιση των βαθμολογιών βιοδείκτη για τη συνολική επιβίωση των ασθενών, τα κατώφλια για κάθε βιοδείκτη προσδιορίστηκαν, το οποίο διαχωρίζεται ασθενείς σε δύο ομάδες. Τα όρια αυτά επιλέχθηκαν με την επιλογή της αξίας των βιοδεικτών που παράγεται την ελάχιστη τιμή p καμπύλη επιβίωσης όταν οι ασθενείς με βαθμολογίες πάνω από το όριο συγκρίθηκαν με ασθενείς κάτω από το όριο. Κατώτατα όρια που δημιούργησε ένα ελάχιστο μέγεθος της ομάδας κάτω από το 10% όλων των δειγμάτων δεν θεωρήθηκαν αξιόπιστες και αποκλείονται από την ανάλυση.

Η επιβίωση καμπύλες για τις χαμηλού και υψηλού κινδύνου ομάδες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας μοντέλα Kaplan-Meier και η p-value αναφερθεί. Επιπλέον, η ΣΠΕ, AUC, καμπύλη ROC, ευαισθησία, ειδικότητα, θετική προγνωστική αξία, αρνητική προγνωστική αξία, καθώς και του σχετικού κινδύνου που αναφέρθηκαν.

Αποτελέσματα

Σημαντικές διακυμάνσεις των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA έκφρασης σε πολλαπλά οδούς επιδιόρθωσης του DNA σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου

οδούς επιδιόρθωσης του DNA είναι σημαντικές για την κυτταρική απόκριση σε χημειοθεραπεία και ακτινοβολία. Οκτώ επιλεγμένων πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA σε πέντε μεγάλες οδούς επιδιόρθωσης του DNA αξιολογήθηκαν από IHC σε μια ομάδα 37 ασθενείς? ένα IHC χρώση παράδειγμα για κάθε βιοδείκτη δείχνεται στο Σχήμα 1Α. βαθμολογίες Παθολόγοι ‘και μηχανή που βασίζεται εκτίμηση του IHC εντάσεις χρώσης σε σχολιασμένα ζώνες όγκου χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των διαφορών έκφρασης πρωτεΐνης μεταξύ δειγμάτων ασθενών. Η έκφραση των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA διαφέρει μεταξύ των δειγμάτων όγκου όπως παρουσιάζεται διαγραμματικά στην κατανομή ασθενή για τους δείκτες (Σχήμα 1Β). Υποκυτταρικός εντοπισμός της ρΜΚ2 ποικίλλει μεταξύ των πυρηνικών μόνο, ή πυρηνική + κυτταροπλασματική εντόπιση ανάλογα με τον όγκο του ασθενούς. Αρκετές βιοδείκτες όπως πρωτεΐνες FANCD2 και γH2AX έχουν ένα ξεχωριστό πρότυπο στον πυρήνα ενδεικτικό της ενεργοποίησης του FA /Ο ομόλογος ανασυνδυασμός (HR) ή Response Βλάβη DNA (DDR) οδού (Σχήμα 1Α) σε αυτούς τους όγκους HNSCC. Βιοδεικτών σε διαφορετικά μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA, όπως XPF (NER), MLH1 (MMR), PAR (ΚΑΚ), FANCD2 (FA /ΥΕ), ρΜΚ2 και γH2AX (DDR) βρέθηκαν να έχουν διαφορές όσον αφορά την πυρηνική ενέργεια ή κυτταροπλασματική ένταση και την κατανομή χρώσης μεταξύ παραβασικών (Pb) και μη παραβασικών (μη-PB) στρώμα κυττάρων για ορισμένα δείγματα, ενδεικτικά μιας μεταβλητής έκφρασης αυτών των βιολογικών δεικτών επιδιόρθωσης του DNA (Σχήμα 1 C). Ένα παράδειγμα που παρουσιάζεται εδώ είναι το μοτίβο πυρηνική χρώση των NER βιοδείκτη XPF σε δύο αντιπροσωπευτικά καρκίνους από την IHC. Χαμηλή ή αρνητική ένταση της πυρηνικής χρώσης XPF υποδεικνύει ότι μονοπάτι NER είναι απενεργοποιημένη, και η υψηλή ένταση της χρώσης XPF δείχνει ότι μονοπάτι NER είναι ενεργοποιημένη (Σχήμα 2). Για να ελέγξετε τις συσχετίσεις μεταξύ των βαθμολογιών παθολόγος, μηχανή καθοδηγούμενη και εικόνας ανάλυση, σε σύγκριση IHC βάφονται XPF, τα οποία αναλύθηκαν από δύο παθολόγους, οι οποίοι δεν γνώριζαν σε δείγματα όγκων, και ο αλγόριθμος μηχανή που βασίζεται σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 2) με την τιμή R2 από 0,79.

Α. Οι FFPE ολόκληρα τμήματα από δείγματα ασθενών 37 HNSCC χρωματίστηκαν με IHC χρησιμοποιώντας τα αντισώματα έναντι βιοδείκτες επιδιόρθωσης του DNA (XPF, ERCC1, FANCD2, MLH1, ρΜΚ2, PAR, PARP1) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Το χρωματισμένο ιστού στη διαφάνεια σαρώθηκε σε μια πλατφόρμα ψηφιακής παθολογίας (Aperio) και οι εικόνες είχαν δει ψηφιακά, μεγέθυνση 10Χ. Όπως σημειώνεται, υποκυτταρική εντόπιση του ρΜΚ2 είναι είτε Nuclear (Ν), ή Nuclear (Ν) + Cytoplasmic (C), τα πρότυπα χρώσης των ρΜΚ2 σε αυτούς τους καρκινικούς ιστούς εμφανίζεται ως υποδεικνύεται, μεγέθυνση 20Χ. Πυρηνική εστίες σε καρκινικά κύτταρα του αυχένα της κεφαλής δείχθηκαν για γH2AX και FANCD2 στο κάτω πάνελ όπως υποδεικνύεται, μεγέθυνση 40Χ. Τα B. Παραδείγματα ποικίλης έκφρασης βιοδεικτών σε δείγματα καρκινικού ιστού της κεφαλής και του τραχήλου βάφονται με XPF, FANCD2, MLH1 δείξει. κατανομή των ασθενών της XPF, FANCD2, MLH1 βαθμολογίες σχεδιάζονται. Γ διαφορές στην ένταση και τη διανομή των XPF (NER), MLH1 (MMR), PAR (ΚΑΚ), FANCD2 (FA /ΥΕ), ρΜΚ2 και γH2AX (DDR) σε παραβασικών (Pb) και nonparabasal χρώση (μη-PB) στρώμα κυττάρων από δείγματα από έναν εκπρόσωπο των ασθενών HNSCC παρουσιάστηκαν όπως υποδεικνύεται.

η

οι συγκρίσεις γίνονται μεταξύ των εναλλακτικών στρατηγικών βαθμολόγησης για ανοσοϊστοχημεία με την XPF για κάθε ασθενή με καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου. Μηχάνημα υποβοηθούμενης βαθμολόγησης για XPF καθορίστηκε με βάση το ποσοστό των πυρήνων με 1+ (ασθενής), 2+ (μέτρια), 3+ βαθμολογίες Παθολόγος (υψηλή) ένταση ήταν Ένταση (Ι). οι καμπύλες συσχετισμού όπως φαίνεται υπολογίζεται για ομοιότητα με ένα R-αξία των 0,79.

Η

Εξαιρετικά μεταβλητή έκφραση XPF με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου

Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ιδιαιτερότητα του XPF (SPM228) και ERCC1 (8F1) αντισώματα από την IHC χρησιμοποιώντας φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη μπλοκ των HeLa (θετικός μάρτυρας) και τα σφαιρίδια ανεπάρκεια των κυττάρων XPF. Άλλες XPF και ERCC1 αντισώματα αξιολογήθηκαν (τα δεδομένα δεν δείχνονται /ιδιόκτητα). SPM228 επελέγη λόγω της υψηλής βαθμό ειδικότητας, και 8F1 επιλεγεί καθώς είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο αντίσωμα ERCC1. αποτέλεσμα μας έδειξαν ότι οι ειδικές πυρηνική χρώση με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι XPF (SPM228) ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HeLa, αλλά όχι σε κύτταρα με ανεπαρκές XPF, αντίθετα, πυρηνική χρώση από το αντίσωμα ERCC1 8F1 βρέθηκε σε δύο ελλειμματικά κύτταρα HeLa και XPF, υποδεικνύοντας ότι αυτό SPM228 αντίσωμα είναι XPF ειδική και κατάλληλη για την ανίχνευση των XPF με IHC και ERCC1 8F1 αναγνωρίζει επιπλέον μη-ειδικών πυρηνικών πρωτεϊνών και είναι σε θέση να ανιχνεύουν ειδικά ERCC1 σε δείγματα (Σχήμα 3Α).

Α. FFPE μπλοκ HeLa και GM08437 (XPF ανεπάρκεια κυττάρων) σφαιρίδια χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες, XPF (SPM228) και ERCC1 (8F1) αντισώματα στη συνέχεια εφαρμόζεται στα τμήματα με ανοσοϊστοχημεία σύμφωνα με τη μέθοδο IHC για όγκο, και τα πρότυπα πυρηνική χρώση των XPF και ERCC1 είχαν δείξει. κυτταρικές γραμμές καρκίνου κεφαλής και τραχήλου Β Εννέα αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση ως προς την έκφραση του XPF. πρωτεΐνες κατανομή XPF και XPF ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-XPF (SPM228) με κυτταρικές γραμμές 5 και 6 που δείχνουν χαμηλή έκφραση. β-ακτίνης (Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. Τα ονόματα των κυτταρικών σειρών που αναφέρονται

Η

Εμείς αξιολογούνται έκφραση XPF τόσο, p16 (+) και p16. (-) δείγματα και δεν ανίχνευσε μια σημαντική διαφορά (178 έναντι 165, NS).

στη συνέχεια μετρήθηκε το επίπεδο της έκφρασης XPF σε κυτταρολύματα εννέα HNSCC κυτταρικών σειρών με ανοσοστύπωμα. Δύο λωρίδες XPF σε 110 kD και 75 kD βρέθηκαν σταθερά, με την kD ζώνη 75 αναγνωρίζοντας πλήρους μήκους XPF και η άλλη ζώνη που αντιπροσωπεύει ένα προϊόν διάσπασης του XPF (κατανομή XPF) (Σχήμα 3Β). Βρήκαμε επίσης ότι τα επίπεδα έκφρασης του XPF διαφέρουν δραματικά μεταξύ των εννέα HNSCC κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Β). Ένα μεγάλο δυναμικό εύρος της έκφρασης XPF στην κοόρτη στη μελέτη μας παρουσιάζεται επίσης σε ένα οικόπεδο διανομή ασθενή (Σχήμα 1Β). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα της έκφρασης XPF ανιχνεύεται από το αντίσωμα SPM228 διαφέρουν σημαντικά στις γραμμές κεφάλι και κυτταρικές λαιμό και δείγματα ασθενών, και ότι το μονοκλωνικό αντίσωμα SPM228 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση ειδικώς XPF έκφραση με κηλίδα Western και IHC.

XPF συνδέεται με την απάντηση σε αρχική χημειοθεραπεία για καρκίνο κεφαλής και τραχήλου ασθενείς

Οκτώ βιοδείκτες επιδιόρθωση του DNA χρωματίζονται σε 37 δείγματα ασθενών με IHC αναλύθηκαν για την ικανότητά τους να προβλέψουν την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία εφόδου. Από τους 37 ασθενείς HNC αγωγή με επαγωγή χημειοθεραπείας στη μελέτη, πλήρης απόκριση (CR) [14] παρατηρήθηκε σε 11 ασθενείς (29,7%), 19 ασθενείς (51,4%) που λαμβάνεται μία μερική απόκριση (PR), και επτά ασθενείς (18,9 %) είχαν σταθερή νόσο (SD). Βρήκαμε ότι τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης XPF σε ασθενείς HNC συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με την καλύτερη απόκριση σε επαγωγή χημειοθεραπεία (p = 0.02) (Σχήμα 4). Επιπλέον, όλες επτά ασθενείς οι οποίοι είχαν SD είχαν υψηλά επίπεδα έκφρασης XPF (Σχήμα 3, Πίνακας 1). Σε αντίθεση, ERCC1 ανιχνεύεται από το χρησιμοποιούνται συνήθως αντίσωμα (κλώνος 8F1) στο σύνολο ομάδα μας δεν συσχετίζονται με την απάντηση, και άλλους δείκτες, όπως PARP1, PAR, MLH1, ρΜΚ2, γH2AX, FANCD2, απέτυχε επίσης να συσχετιστούν (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι XPF είναι η προτιμώμενη NER βιοδείκτη για να προβλέψουν την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία εφόδου σε ασθενείς HNSCC.

Το διάγραμμα δείχνει ότι η μονοπαραγοντική ανάλυση των βαθμολογιών XPF βιοδείκτη σε σχέση με τη διάκριση μεταξύ των υποομάδων ανταπόκρισης. Η πρωταρχική μέτρηση έκβασης ήταν η απάντηση σε αρχική χημειοθεραπεία.

Η

ρΜΚ2 συσχετίζεται με τη συνολική επιβίωση στη θεραπεία chemoradiation

Στη συνέχεια αξιολογούνται σύνδεση των βιοδεικτών επιδιόρθωσης του DNA με τη συνολική επιβίωση για αυτό ομάδα ασθενών. ρΜΚ2 δεν συσχετίστηκε με απόκριση σε επαγωγή χημειοθεραπεία (Πίνακας 1), αλλά συσχετίζεται έντονα με τη συνολική επιβίωση: χαμηλή έκφραση ρΜΚ2 συσχετίστηκε με καλύτερη συνολική επιβίωση (ρ = 0,01) (Σχήμα 5)? ρΜΚ2 διαφοροποιούνται μια υποομάδα με βελτιωμένη επιβίωση πιθανώς σχετίζονται με τη θεραπεία chemoradiation, γεγονός που υποδηλώνει ότι ρΜΚ2 μπορεί να σχετίζονται με τη θεραπεία chemoradiation. Σε αντίθεση, XPF βρέθηκε να μην συσχετίζονται με τη συνολική επιβίωση (p = 0.08). Για αρκετές άλλοι δείκτες στην επιδιόρθωση του DNA, όπως PARP1, PAR, MLH1, γH2AX, ERCC1, FANCD2, η ίδια ανάλυση απέτυχε να φθάσει στατιστική σημασία (Πίνακας 2). Η περαιτέρω μελέτη των ρΜΚ2 απαιτείται.

Η συνολική επιβίωση εκτιμάται από καλύτερη απάντηση σε αρχική χημειοθεραπεία χρησιμοποιώντας καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier με βάση την ένταση πυρηνική χρώση και ποσοτικοποίηση των ρΜΚ2 καθορίζεται από τα αποτελέσματα παθολόγους ως NQ (Nuclear Ποσότητα).

Η

Συζήτηση

Η χημειοθεραπεία προκαλεί βλάβη του DNA στα καρκινικά κύτταρα. Συνεπώς, η ικανότητα για την επισκευή τέτοιων ζημιών χρησιμοποιώντας ειδικούς οδούς επιδιόρθωσης του DNA είναι πιθανό προβλεπτική της ευαισθησίας φαρμάκου /αντίσταση, και την έκβαση της θεραπείας. Έτσι, διαγνωστικά βιοδείκτες επιδιόρθωση του DNA κρατήσει δυνάμει να αλλάξει σημαντικά διαγνωστικά στρατηγικές και να επηρεάσει τη θεραπευτική διαδικασία λήψης αποφάσεων και τον σχεδιασμό της θεραπείας για τους ασθενείς με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Στη μελέτη μας, αξιολογήσαμε οκτώ βιοδείκτες επιδιόρθωση του DNA σε πέντε διαφορετικά μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA με ανοσοϊστοχημεία σε locoregionally-προχωρημένο καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Σημαντικές διακυμάνσεις πολλαπλές οδούς επιδιόρθωσης του DNA παρατηρήθηκαν σε όγκους HNSCC υποδηλώνοντας ότι κλινικές αποφάσεις μπορεί να επηρεαστεί από ένα προφίλ επιδιόρθωσης του DNA βιοδεικτών (Σχήματα 1, 2). Μεταξύ όλων των βιοδεικτών επιδιόρθωσης του DNA που αναλύσαμε, XPF ήταν το ενιαίο καλύτερο δείκτη για να προβλέψουν την ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία εφόδου με μονοπαραγοντική ανάλυση? χαμηλά επίπεδα έκφρασης του XPF σε ασθενείς με καρκίνο κεφαλής και λαιμού σχετίστηκαν με καλύτερη απόκριση σε επαγωγή χημειοθεραπεία. Υψηλά επίπεδα έκφρασης XPF σε ασθενείς κεφαλής και του τραχήλου συσχετίζεται με χειρότερα απόκριση σε χημειοθεραπεία βασισμένη στο λευκόχρυσο συνεπές με προηγούμενες αναφορές [38]. Αντίθετα ERCC1 (8F1), ανιχνεύονται από το κοινώς χρησιμοποιείται αντίσωμα (κλώνος 8F1), στο σύνολο ομάδα μας δεν συσχετίζονται με την απάντηση, η οποία μπορεί να σχετίζεται με φτωχότερη την ειδικότητα του (Σχήματα 3 και 4, Πίνακας 1). ERCC1 (8F1) απόδοση δεν ήταν επαρκής στη μελέτη μας και υποθέτουμε ότι η μειωμένη ειδικότητα μπορεί να αντισταθμιστεί με μεγαλύτερα μεγέθη δειγμάτων, όπως φαίνεται και σε άλλες μελέτες [18] – [20]. Επιπλέον, είναι πιθανό ότι η ERCC1 8F1 μετρά κάτι διαφορετικό από ό, τι ERCC1, η οποία συσχετίζεται με την επιβίωση.

Ενώ η ανταπόκριση του ασθενούς σε χημειοθεραπεία εφόδου είναι ένας πιθανός προγνωστικός παράγοντας της καλής συνολικό αποτέλεσμα, όπως αναφέρθηκε από αρκετές ομάδες [4], [5 ], [39] – [41], η συνολική επιβίωση παραμένει κλινικά πιο ουσιαστικό. ρΜΚ2 βρέθηκε να συσχετίζεται σημαντικά (ρ = 0,01) με συνολική επιβίωση. Από ρΜΚ2 δεν φαίνεται να σχετίζεται με επαγωγή απάντηση μπορεί να είναι ένας πιθανός δείκτης της επιτυχίας της θεραπείας για ταυτόχρονη chemoradiation (Σχήμα 5, Πίνακας 2) συνάδει με προκλινικά δεδομένα [42].

Με δεδομένη την ετερογένεια της κεφαλής και του τραχήλου καρκίνο, και η περίπλοκα συνδεδεμένο δίκτυο των έξι κυριότερων οδών επιδιόρθωσης του DNA, δεν είναι λογικό να αναμένει κανείς ότι έχει νόημα διαγνωστικές εξετάσεις μπορούν να βασίζονται σε ένα ενιαίο, ειδικό δείκτη. Όπως υποδηλώνει η μελέτη μας, δείκτες για την επαγωγή και chemoradiation είναι πιθανό διαφορετικά. Επιπλέον, η αποζημίωση της επιδιόρθωσης του DNA με την απουσία ενός μονοπατιού επισκευής από άλλο μονοπάτι υποδηλώνει την πιθανότητα ότι μπορεί να είναι απαραίτητη πολλαπλές δείκτες για την αξιολόγηση βέλτιστο τρόπο ανταπόκρισης. Μια τέτοια επιδιόρθωση του DNA υπογραφή απάντηση θα πρέπει να αξιολογηθούν από την ομάδα μας, χρησιμοποιώντας μια μεγαλύτερη ομάδα και μπορεί να επιτρέψει τη βελτίωση της αξιολόγησης της ΕΘΕΓ ετερογένεια και πολυπλοκότητα των δικτύων επιδιόρθωσης του DNA.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας παρέχει μια καθιερωμένη μέθοδο για να μέτρηση βιοδεικτών επιδιόρθωση του DNA και άλλων βιολογικών δεικτών με τη χρήση ποσοτικών ανοσοϊστοχημείας για τον εντοπισμό και την αξιολόγηση λειτουργικές αλλαγές στην επιδιόρθωση του DNA και ζημιές σηματοδότηση μονοπατιών ως ένα πολύτιμο εργαλείο για την εξατομικευμένη διάγνωση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν τη χρησιμότητα της XPF ως βιοδείκτη για να προβλέψει ποιοι ασθενείς ωφελούνται από ποιες θεραπείες με χημειοθεραπεία εφόδου. Συγκεκριμένα XPF αποδείχθηκε ανώτερη από ERCC1 δοκιμές (8F1). XPF μπορεί επίσης να έχει αξία να προβλέψουμε τη συνολική επιτυχία της θεραπείας, η οποία σχετίζεται ενδεχομένως με το ρόλο της για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης επαγωγής [25]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ρΜΚ2 είναι ένας πιθανός δείκτης για chemoradiation καθώς δεν συσχετίζονται με την απάντηση επαγωγής, αλλά δεν συσχετίζεται έντονα με τη συνολική επιβίωση. Περαιτέρω επικύρωση αυτών των δεικτών σε μια μεγαλύτερη ομάδα από ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο κεφαλής και τραχήλου είναι επιτακτική και οι παρατηρήσεις μας είναι σε μεγάλο βαθμό την υπόθεση σχηματισμού σε αυτό το σημείο, αλλά είναι σύμφωνες με άλλη βιβλιογραφία [38]. Τελικά, πολλαπλές δείκτες μπορεί να είναι αναγκαία για την αξιολόγηση άριστα δείγματα όγκων, και να παρέχει τις περισσότερες πληροφορίες για θεράποντες ιατρούς.

Ευχαριστίες

Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI) YCSA (TYS), Cancer Research Ίδρυμα ΓΙΑ (TYS), ASCO βραβείο μεταγραφική Καθηγητή (EEV). Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ Brian E. Ward για τη συνεχή υποστήριξή του.