Abstract

Προηγουμένως, επιβεβαιώσαμε ότι ο υποδοχέας χημειοκίνης CC 7 (CCR7) προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (ERK) οδό, αλλά ο ρόλος του στην απόπτωση των μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ( NSCLC) κυτταρικές γραμμές παραμένει άγνωστη. Α549 και Η460 κύτταρα του NSCLC χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί το αποτέλεσμα CCL21 /CCR7 επί της απόπτωσης μέσω κυτταρομετρίας ροής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενεργοποίηση των CCR7 με ειδικό συνδετήρα του, συνδέτης εξωγενές χημειοκίνης 21 (CCL21), συνδέθηκε με μια σημαντική μείωση στο ποσοστό της απόπτωσης. κηλίδα Western και δοκιμασίες PCR σε πραγματικό χρόνο έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του CCR7 προκάλεσε σημαντικά προς τα πάνω ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών Bcl-2 και προς τα κάτω ρύθμιση των προ-αποπτωτικών bax και κασπάσης-3, αλλά όχι p53, τόσο σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA. CCR7 μικρό παρεμβαλλόμενο RNA εξασθενεί σημαντικά αυτά τα αποτελέσματα εξωγενών CCL21. Εκτός αυτού, PD98059, ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΜΕΚ που διαταράσσει την ενεργοποίηση των κατάντη ERK, κατάργησε σημαντικά αυτά τα αποτελέσματα του CCL21 /CCR7. Συνανοσοκατακρήμνιση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω ότι υπήρχε μια αλληλεπίδραση μεταξύ ρ-ERK και bcl-2, bax, ή κασπάσης-3, ιδιαίτερα με την παρουσία CCL21. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι CCL21 /CCR7 αποτρέπει την απόπτωση με προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης bcl-2 και με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης των Bax και κασπάσης-3 ενδεχομένως μέσω της οδού ERK σε Α549 και Η460 κύτταρα του NSCLC

Citation.: Xu Y, Liu L, Qiu Χ, Liu Ζ, Λι Η, Li Ζ, et al. (2012) CCL21 /CCR7 Αποτρέπει απόπτωση μέσω του μονοπατιού ERK στην Ανθρώπινη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 7 (3): e33262. doi: 10.1371 /journal.pone.0033262

Επιμέλεια: Δημήτριος Vavvas, Massachusetts Eye & amp? Ear Infirmary, Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3, Νοεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 6η Φεβρουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Μαρτίου, 2012

Copyright: © 2012 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

χημοκίνες, μια οικογένεια pro χαμηλού μοριακού βάρους -inflammatory κυτοκίνες, έχουν περιγραφεί ως σημαντικοί μεσολαβητές όχι μόνο στην κυτταρική διακίνηση, την ανάπτυξη οργάνων, αναδιαμόρφωση ιστού και μετάσταση όγκου [1] – [3], αλλά και σε άλλα βιολογικά γεγονότα, όπως η αγγειογένεση, λεμφοποίησης, πολλαπλασιασμούς, και την απόπτωση [ ,,,0],4], [5]. Οι βιολογικές τους δραστηριότητες που προκαλούνται από την αλληλεπίδραση με την οικογένεια υποδοχέα χημειοκίνης του G-πρωτεΐνη υποδοχέων (GPCRs) (δηλ C, υποδοχείς CC, CXC, και CX3C) [6]. C-C υποδοχέα χημειοκινών 7 (CCR7), ένας από τους υποδοχείς χημειοκίνης CC, εκφράζεται σε όλα τα αφελή Τ-κύτταρα, ένα μέρος της μνήμης Τ-κύτταρα, Β-κύτταρα, και ώριμα δενδριτικά κύτταρα [7]. CCR7 αλληλεπίδρασε με συνδέτες του, συνδέτη χημειοκίνης 19 (CCL19) και συνδέτη χημειοκίνης 21 (CCL21) [8], παίζει σημαντικό ρόλο στη διακίνηση λεμφοκυττάρων και επανακάμπτοντας σε λεμφαδένες κατά τη διάρκεια ανοσολογικές και φλεγμονώδεις αντιδράσεις [9] – [11].

προηγούμενη μελέτη μας δείχνει ότι CCR7 εκφράζεται έντονα σε ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κύτταρα, και ότι CCL21 /CCR7 προάγει τον πολλαπλασιασμό των Α549 και Η460 κύτταρα του NSCLC μέσω εξωκυτταρικών κινάση σήματος ρυθμιζόμενη (ΕΚΚ) οδού [ ,,,0],12], [13]. ERK, ένα μέλος της οικογένειας που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνικών κινασών (ΜΑΡΚ), σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική επιβίωση, και την απόπτωση [14] – [17]. Ωστόσο, ο ρόλος της CCR7 στην απόπτωση των ανθρώπινων κυττάρων NSCLC δεν έχει διευκρινιστεί.

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει την επίδραση και κανονιστικό μηχανισμό της αλληλεπίδρασης CCL21 /CCR7 στην απόπτωση των Α549 και Η460 ανθρώπινο NSCLC κύτταρα. Δείξαμε εδώ ότι CCL21 /CCR7 αποτρέπει κυτταρικής απόπτωσης με προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης της αντι-αποπτωτική bcl-2 και με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης των προ-αποπτωτικών bax και κασπάσης-3, αλλά όχι p53, η οποία είναι δυνητικά διαμεσολαβείται μέσω της οδού ERK στο NSCLC κύτταρα. Η μελέτη παρέχει νέα αποδεικτικά στοιχεία για τους μηχανισμούς επιβίωσης των CCR7 μεσολάβηση καρκινικά κύτταρα και μπορεί να είναι χρήσιμο για την εξερεύνηση στόχο τη θεραπεία του NSCLC.

Αποτελέσματα

CCL21 /CCR7 εμποδίζει την απόπτωση των Α549 και Η460 κύτταρα. Σε προηγούμενη μελέτη μας, εντοπίσαμε ένα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης CCR7 σε Α549 και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC Η460, και η ενεργοποίηση της προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [12], [13]. Για να καθοριστεί εάν η ενεργοποίηση του CCR7 επηρεάζει επίσης την απόπτωση των Α549 και Η460 κύτταρα, η ενεργοποίηση και αναστολή CCR7 προκλήθηκαν με εξωγενή CCL21 και με CCR7 μικρά RNA παρεμβολής (siRNA), αντίστοιχα [13]. δοκιμασία χρώσης V αννεξίνης διεξήχθη χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής για να προσδιοριστεί η επίδραση της CCL21 /CCR7 επί της απόπτωσης των Α549 και Η460 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, το ποσοστό των προ-αποπτωτικών κυττάρων στην ομάδα CCL21 σημαντικά μειωμένη, σε σύγκριση με τους άλλους (όλα

P

& lt? 0,01), ενώ δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των άλλων (όλα

P

& gt?. 0,05), εμπλέκοντας ότι η ενεργοποίηση των CCR7 μπορεί να αναστείλει την απόπτωση των Α549 και Η460 κύτταρα, ενώ η επίδραση του CCL21 μπορεί να καταργηθεί από την αναστολή της CCR7

Α549 (Α) και Η460 κύτταρα (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (100 ng /mL) για 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με CCR7 siRNA (siCCR7). Μετά τη θεραπεία, η απόπτωση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας χρώση αννεξίνης V, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. ** Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Α549 (Α) και τα κύτταρα Η460 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (100 ng /mL) για 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με CCR7 siRNA (siCCR7. ). Μετά την κατεργασία, η έκφραση του bcl-2, bax, κασπάσης-3 και ρ53 σε αμφότερα πρωτεΐνη (α) και mRNA (β) εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας κηλίδα western (α) και πραγματικού χρόνου PCR (β) όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0,05 ή ** ρ & lt?. 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Α549 (Α) και τα κύτταρα Η460 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (100 ng /mL) για 24 ώρες μετά από την έκθεση να PD98059, ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΜΕΚ που διαταράσσει την ενεργοποίηση του κατάντη ERK, για 1 ώρα. Μετά τη θεραπεία, η απόπτωση εκτιμήθηκε με τη χρήση της χρώσης αννεξίνης V. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Α549 (Α) και τα κύτταρα Η460 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (100 ng /mL) για 24 ώρες μετά από έκθεση σε PD98059, ένας εκλεκτικός αναστολέας. της ΜΕΚ που διαταράσσει την ενεργοποίηση του κατάντη ERK, για 1 ώρα. Μετά τη θεραπεία, τα επίπεδα έκφρασης αυτών των συστατικών εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδα western. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0,05 ή ** ρ & lt?. 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Α549 (Α) και Η460 (Β) κυττάρων απουσία ή παρουσία CCL21 (100 ng /mL) για 24 h υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με αντισώματα έναντι Bcl-2 ή IgG, ακολουθούμενη από κηλίδωση Western για bax και κασπάσης-3 (α). Η αμοιβαία ανοσοκαθίζηση με αντισώματα έναντι Βαχ ή IgG αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για bcl-2 και κασπάσης-3 (β). Η αμοιβαία ανοσοκαθίζηση με αντισώματα έναντι της κασπάσης-3 ή IgG αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για bcl-2 και bax (γ).

Η

Η αναστολή της απόπτωσης εμπλέκεται στη ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών Bcl-2 και του προ-αποπτωτική bax και κασπάσης-3, αλλά όχι p53 σε Α549 και Η460 κύτταρα. Έχει αποδειχθεί ότι η απόπτωση εντός κυττάρων είναι κυρίως εμπλέκονται στην έκφραση του bcl-2, bax, κασπάσης-3, ή p53 [4], [18] – [20]. Για τον προσδιορισμό πιθανός μηχανισμός με τον οποίο η ενεργοποίηση των CCR7 ανέστειλε την απόπτωση των Α549 και Η460 κύτταρα, Western Blot και δοκιμασίες PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθησαν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, η έκφραση στα δύο επίπεδα πρωτεΐνης και mRNA των αντι-αποπτωτικών Bcl-2 και του προ-αποπτωτικών bax και κασπάσης-3 αντιστοίχως ρυθμίζεται αυξητικά και μειωτικά στην ομάδα CCL21, σε σύγκριση με τους άλλους (όλα

P

& lt? 0,01), ενώ δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των άλλων (όλα

P

& gt? 0,05). Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση των προ-αποπτωτικών ρ53 δεν έχει αλλοιωθεί (

P

& gt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η λειτουργία του CCR7 ως αναστολέας επί της απόπτωσης των κυττάρων NSCLC υλοποιείται κυρίως πιθανώς από τις οδούς του bcl-2, bax, και κασπάσης-3, αλλά όχι p53.

CCL21 /CCR7 ρυθμίζει το έκφραση του bcl-2, Βαχ και κασπάσης-3 μέσω της οδού ERK. προηγούμενη μελέτη μας επιβεβαίωσαν ότι η αλληλεπίδραση CCL21 /CCR7 ενισχύει τη φωσφορυλίωση της ERK (ρ-ΕΚΚ) σε Α549 και Η460 κύτταρα [13]. Για να καθοριστεί εάν η οδός ΕΚΚ συμμετέχει επίσης στην αντι-αποπτωτική δράση του CCL21 /CCR7, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PD98059, ένας επιλεκτικός αναστολέας της ΜΕΚ που διαταράσσει την ενεργοποίηση του κατάντη ERK, για 1 ώρα. Βρήκαμε ότι PD98059 καταργηθεί σημαντικά CCL21 /CCR7 μεσολάβηση αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα (Σχήμα 3) και οι μετατροπές στην έκφραση του bcl-2, Βαχ και κασπάσης-3 (Σχήμα 4). Είναι ενδιαφέρον, PD98059 μόνο (θεραπεία επί 1 ώρα) είχε σημαντική επίδραση στην έκφραση του bcl-2, αλλά όχι για την έκφραση του Bax και κασπάσης-3 και την απόπτωση. Όπως bax έχει δειχθεί ότι είναι ένας καθοδικός τελεστής του bcl-2-ρυθμιζόμενη μονοπάτι της απόπτωσης και της ενεργοποίησης του bcl-2 μπορεί να προάγει την απελευθέρωση του Βαχ, οδηγώντας σε ενεργοποίηση κασπασών [21], [22], επιδιώξαμε να να εξετάσει κατά πόσον υπάρχει μια αλληλεπίδραση μεταξύ bcl-2, bax, και capspase-3. αλληλεπιδράσεις τους επιβεβαιώθηκαν από τα αποτελέσματα Συνανοσοκατακρήμνιση (Σχήμα 5).

Η φωσφορυλίωση της ERK, που προκαλείται από CCL21 /CCR7, αλληλεπιδρά με bcl-2, bax, ή κασπάσης-3. Να προσδιορίσει περαιτέρω εάν υπάρχει μια αλληλεπίδραση μεταξύ του p-ERK και bcl-2, bax, ή κασπάσης-3, Συνανοσοκατακρήμνιση εκτελέστηκε. Α549 και Η460 κυττάρων απουσία ή παρουσία CCL21 για 24 ώρες υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση με αντισώματα εναντίον ρ-ERK ή IgG, ακολουθούμενη από κηλίδωση Western για bcl-2, Βαχ και κασπάσης-3. Μία έντονη, ειδική αλληλεπίδραση μεταξύ ρ-ERK και bcl-2, bax, ή κασπάσης-3 παρατηρήθηκε, ειδικά όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 για 24 h (Σχήμα 6α). Η αμοιβαία ανοσοκαθίζηση με αντισώματα έναντι Bcl-2, bax, κασπάσης-3, ή IgG εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western για ρ-ERK, και πάλι, η αλληλεπίδραση μεταξύ ρ-ERK και bcl-2, bax, ή κασπάσης-3 ήταν εμφανή, ειδικά με την παρουσία του CCL21 (Σχήμα 6β).

Α549 (Α) και τα κύτταρα Η460 (Β) απουσία ή παρουσία CCL21 (100 ng /mL) για 24 ώρες υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση με αντισώματα ενάντια ρ-ERK ή IgG, ακολουθούμενη από κηλίδωση Western για bcl-2, Βαχ και κασπάσης-3 (α). Αμοιβαίες ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα κατά του bcl-2, bax, κασπάσης-3 ή IgG αναλύθηκαν με western αποτύπωση για την p-ERK (β).

Η

Συζήτηση

προηγούμενο μας μελέτες έχουν τεκμηριώσει ότι η ενεργοποίηση του CCR7, που προκαλείται από CCL21 συνδέτη, μπορεί να προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και να μεσολαβήσει λεμφαδένα μετάστασης του στα κύτταρα NSCLC [12], [13]. Ωστόσο, ο ρόλος της CCL21 /CCR7 στην απόπτωση των NSCLC παραμένει ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι CCL21 /CCR7 αποτρέπει την απόπτωση στα Α549 και Η460 κύτταρα του NSCLC, η οποία ενδεχομένως διαμεσολαβείται μέσω της οδού ΕΡΚ.

Bcl-2 και bax είναι ρυθμιστές του κυτταρικού μονοπατιού εγγενή απόπτωση, η οποία ρυθμίζει την ακεραιότητα της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης [21], [23], [24]. Έχει αποδειχθεί ότι ορισμένοι bcl-2 μέλη της οικογένειας που βρίσκεται στην μιτοχονδριακή μεμβράνη (όπως bax, bcl-XL, Mcl-1, bcl-2, και Bid) μπορούν να μεταβάλλουν τη διαπερατότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης και ενεργοποιούν την ενεργοποίηση κασπασών , οδηγώντας σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [25] – [27]. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα από διαφορετικές κυτταρικές μοντέλα [4], [18], [20], [28] – [30], τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ενεργοποίηση των CCR7 εμπόδισε την απόπτωση, με αποτέλεσμα την αύξηση στην έκφραση των αντι-αποπτωτικών Bcl -2 και μια μείωση στην έκφραση των προ-αποπτωτικών bax και κασπάσης-3. Είναι ενδιαφέρον, αυτή η ανασταλτική επίδραση δεν προφανώς συνδέονται με την οδό της ρ53. Επίσης, p53 δεν έχει σημαντικές επιπτώσεις στην έκφραση των CCR7 [31].

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η ενεργοποίηση των CCR7 μπορεί να ενισχύσει τη φωσφορυλίωση της ERK στα Α549 και Η460 κύτταρα [13], το οποίο είναι σύμφωνο με αρκετές μελέτες χρησιμοποιώντας άλλους τύπους κυττάρων [20], [28], [32] – [43]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε το ρόλο της φωσφορυλίωσης του ΕΚΚ CCL21 /CCR7 μεσολάβηση αντι-απόπτωση Α549 και Η460 κύτταρα. Βρήκαμε ότι η CCL21 /CCR7 μεσολάβηση δράση αντι-απόπτωση που σχετίζονται με την έκφραση του bcl-2, Βαχ και κασπάσης-3 θα μπορούσαν να καταργηθούν με κατεργασία με PD98059. PD98059 μόνο (θεραπεία επί 1 ώρα) είχε σημαντική επίδραση στην έκφραση του bcl-2, αλλά όχι για την έκφραση του Bax και κασπάσης-3 και την απόπτωση. Εκτός αυτού, τα αποτελέσματα Συνανοσοκατακρήμνιση επιβεβαίωσε ότι υπάρχει μία αλληλεπίδραση μεταξύ bcl-2, bax, και κασπάσης-3. Ο λόγος για την έλλειψη μεταβολή στην έκφραση του Βαχ και κασπάσης-3 είναι πιθανώς λόγω του περιορισμού του παρατηρηθέντα χρόνο επειδή bax και κασπάσης-3 έχει δειχθεί ότι είναι προς τα κάτω τελεστών του bcl-2-ρυθμιζόμενη μονοπάτι της απόπτωσης [21] , [22].

Όπως CCL21 /CCR7 ήταν ικανή να ρυθμίζει την έκφραση του bcl-2, bax, και της κασπάσης-3, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί εάν υπάρχει μια αλληλεπίδραση μεταξύ ρ-ERK και bcl-2 , bax, ή κασπάσης-3. Συνανοσοκατακρήμνιση και αμοιβαία ανοσοκαταβύθιση αποτελέσματα υποδηλώνουν έντονα ότι υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ του p-ERK και bcl-2, bax, ή κασπάσης-3, ειδικά με την παρουσία του CCL21. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η επίδραση της CCL21 /CCR7 στην απόπτωση των κυττάρων που εμπλέκονται στην έκφραση του bcl-2, Βαχ και κασπάσης-3 μπορεί να προκύψει μέσω της οδού ERK σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC.

Αυτή η μελέτη προτείνει ότι η ενεργοποίηση του CCR7, που προκαλείται από CCL21, μπορεί να αποτρέψει σημαντικά την απόπτωση των κυττάρων NSCLC, η οποία είναι δυνητικά διαμεσολαβείται μέσω της οδού ERK. Αυτή η πληροφορία μπορεί να βοηθήσει στην αποσαφήνιση των μηχανισμών της επιβίωσης των κυττάρων του καρκίνου και τον εντοπισμό πιθανών στόχων για τη θεραπεία του NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

Α549 και Η460 κυτταρικές σειρές από την προηγούμενη δημοσιευμένη εργασία μας [12], [13] καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 ή DMEM-F12 συμπληρωμένου με 10% ορό HyClone εμβρύου βοός (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, USA) σε μια ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 75 cm

2 φιάλες καλλιέργειας και συλλέχθηκαν σε ένα διάλυμα τρυψίνης-ΕϋΤΑ στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης.

Bcl-2, bax, κασπάσης-3, ρ-ΕΚΚ, IgG, και β ακτίνης αντισώματα ποντικού ή μονοκλωνικά κουνελιού αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Ανασυνδυασμένη ανθρώπινη CCL21 ήταν από ΡβρίΌ Tech (Rocky Hill, NJ, USA). Lipofectamine 2000 ήταν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Οι αλληλουχίες των siCCR7 και ελέγχου siRNA και τη μέθοδο της διαμόλυνσης έχουν αναφερθεί σε άλλο έγγραφο [13]. PD98059 ελήφθη από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA) και χρησιμοποιήθηκε σε 50 μΜ (τελικές συγκεντρώσεις), σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [13], [41], [44], [45]. Protein /G σφαιρίδια Α ήταν από Beyotime (Haimen, Κίνα).

αννεξίνης V χρώση

Μετά την επεξεργασία με CCL21 για 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS με ήπια ανακίνηση. Επαναιωρήστε τα κύτταρα προστέθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης (1 χ) και ρυθμίστηκε η κυτταρική πυκνότητα 2-5 χ 10

5 /mL. Στο σκοτάδι, 5 μL αννεξίνης V-FITC (50 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1% BSA, 0.02% αζίδιο νατρίου, ρΗ 7.4) προστέθηκε στο κυτταρικό εναιώρημα Mix 195 μL και επωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την προσθήκη 190 μί ρυθμιστικού διαλύματος Δέσμευσης (1 χ) και 10 μL ΡΙ. Δέκα χιλιάδες γεγονότα ανά δείγμα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας FACS-scan κυτταρόμετρο ροής (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) και το ποσοστό των κυτταρικής απόπτωσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης CellQuest (Becton-Dickinson).

Western

ανάλυση κηλίδος

Μετά την επεξεργασία με CCL21 για 24 ώρες, τα κύτταρα εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.1% SDS, 2 μg /mL απροτινίνη και 1 mM PMSF) για 30 min στους 4 ° C. Τα εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000 χ

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C. Υπερκείμενα που περιέχουν ολική πρωτεΐνη στη συνέχεια συλλέχθηκαν. Κλάσματα, που το καθένα περιέχει 50 μg πρωτεϊνών, διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF στα 40 V για 2 ώρες σε χαμηλή θερμοκρασία. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες, και οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά 1:200 αραίωση επί μία νύκτα στους 4 ° C. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) σε 1:6000 (κασπάση-3, ρ53, bax) ή 1:8000 (οι άλλοι) αραίωσης για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, αντίστοιχα . Συγκροτήματα απεικονίστηκαν με Σύστημα EC3 Imaging (UVP LLC, Upland, CA, USA), και η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ (ΝΙΗ, Bethesda, MD, USA). Η διαφορά μεταξύ OD δοκιμαστεί πρωτεϊνών και β-ακτίνης του ίδιου δείγματος υπολογίστηκε ως σχετική περιεκτικότητα και εκφράζεται γραφικά.

Real-time PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ Prism 7900HT γρήγορο σύστημα (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) χρησιμοποιώντας SYBR Προμίγματα Ex Taq II (Takara, Dalian, Κίνα). Πολλαπλασιασμοί διεξήχθηκαν σε ένα συνολικό όγκο 20 μL και ανακυκλώθηκε 40 φορές μετά την αρχική αποδιάταξη (95 ° C για 30 s) με τις ακόλουθες παραμέτρους: 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 30 s. Οι εκκινητές οι αλληλουχίες που παρατίθενται στον Πίνακα 1 και β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος [13], [46]. Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων PCR υποστηρίχθηκε από την ανάλυση της καμπύλης διαχωρισμού. Σε πραγματικό χρόνο τα δεδομένα PCR υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCT μέθοδο για το πακέτο λογισμικού SDS 2.4 (Applied Biosystems) [47].

Συνανοσοκατακρήμνιση

Μετά τη θεραπεία με CCL21 για 24 ώρες , τα κύτταρα εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό λύσης (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2, 10 mM HEPES [ρΗ 7,9], 1 mM PMSF, 1 mM DTT) και ομογενοποιείται για 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000 χ

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C, και τα υπερκείμενα που περιέχουν συνολικής πρωτεΐνης συλλέχθηκαν. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης εξετέθησαν σε αντισώματα έναντι π-ΕΚΚ, bcl-2, Βαχ και κασπάσης-3, τα οποία ακινητοποιήθηκαν επί /G σφαιρίδια πρωτεΐνης Α. Μετά 3 ωρών επώαση στους 4 ° C με ήπια περιστροφή, χάντρες πλύθηκαν εκτεταμένα πέντε φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, βραστά, και μικροφυγοκεντρήθηκαν. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα εναντίον ρ-ΕΚΚ, bcl-2, Βαχ και κασπάσης-3 με κηλίδα western.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago , IL, USA). Μία μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις διαφορές μεταξύ των ομάδων με τις διάφορες αγωγές, και η δοκιμή ελάχιστη σημαντική διαφορά (LSD) ή δοκιμή Dunnett Τ3 χρησιμοποιήθηκε για post hoc ανάλυση υποομάδας. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές για την P & lt? 0,05. Ν-πλάσια τιμές για την έκφραση του γονιδίου αλλάξουν μέχρι και 0,5 και κάτω από 2 ελήφθησαν ως μη σημαντική, σύμφωνα με τις τιμές που λαμβάνονται από αρνητικό γονίδια ελέγχου [47], [48].