Αφηρημένο

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί η κυτταροτοξική και αποπτωτικά αποτελέσματα της erythrocarpine Ε (CEB4), ένα λεμονοειδή που προέρχονται από

Chisocheton erythrocarpus

σε ανθρώπινο καρκίνωμα του στόματος πλακωδών κυττάρων. Με βάση τα προκαταρκτικά βρωμιούχο διμεθυλ-2-θειαζολυλ-2,5-διφαινυλο-2Η-τετραζολίου (ΜΤΤ) δοκιμασίες, κατεργάζεται CEB4 κύτταρα HSC-4 επέδειξε κυτταροτοξική δράση και τον πολλαπλασιασμό ανέστειλαν κυττάρου σε ένα χρόνο και εξαρτάται από τη δόση τρόπο με ένα IC

50 τιμή 4,0 ± 1,9 μΜ εντός 24 ωρών θεραπείας. CEB4 βρέθηκε επίσης να έχει ελάχιστες κυτταροτοξικές επιδράσεις στην κανονική κυτταρική γραμμή, ΝΗΒΕ με επίπεδα κυτταρικής βιωσιμότητας διατηρείται πάνω από το 80% κατά την κατεργασία. Annexin V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), πολυ-ΑϋΡ ριβόζης πολυμεράσης (PARP) τα αποτελέσματα του προσδιορισμού διάσπασης και του κατακερματισμού του DNA έδειξε ότι CEB4 επάγει απόπτωση κυτταρικού θανάτου. Western blotting αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η επαγωγή της απόπτωσης από CEB4 φάνηκε να διαμεσολαβείται μέσω της ρύθμισης της οδού σηματοδότησης ρ53 όπως υπήρχε μια αύξηση στα επίπεδα φωσφορυλίωσης ρ53. CEB4 βρέθηκε επίσης να ρυθμίζουν την προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bax, ενώ τα κάτω ρύθμιση της αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bcl-2, υποδηλώνοντας την εμπλοκή της εγγενούς μιτοχονδριακής οδού. Μειωμένα επίπεδα εκκινητή procaspase-9 και δήμιος κασπάσης-3 ζυμογόνο παρατηρήθηκαν επίσης μετά την έκθεση CEB4, ως εκ τούτου, που δείχνει την εμπλοκή του κυτοχρώματος c απόπτωση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν την κυτταροτοξική και την αποπτωτική ικανότητα των erythrocarpine Ε, και προτείνουν τις δυνατότητες ανάπτυξης του ως πράκτορα του καρκίνου chemopreventive

Παράθεση:. Nagoor ΝΗ, Shah Jehan Muttiah Ν Σύντομα Lim C, Σε LLA, Mohammad Κ, Αγουάνγκ K (2011) κανονισμός του αποπτωτικά αποτελέσματα από Erythrocarpine Ε, μία κυτταροτοξική λεμονοειδή από

Chisocheton erythrocarpus

στην HSC-4 ανθρώπινη στοματική καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (8): e23661. doi: 10.1371 /journal.pone.0023661

Επιμέλεια: Παύλος Γ Driscoll, MRC Εθνικό Ινστιτούτο Ιατρικής Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5η Μάη του 2011? Αποδεκτές: 22 Ιουλ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 του Αυγ 2011

Copyright: © 2011 Nagoor et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο της Malaya Μεταπτυχιακών Ερευνών Grant (ΣΔΙΤ) (PS166-2008B), το Υπουργείο Επιστημών, Τεχνολογίας και Καινοτομίας (Mosti) Ταμείο eScience (12-02-03-2022), το Πανεπιστήμιο της Malaya Research Grant (UMRG ) (RG0008 /09BIO), και το Κέντρο Έρευνας και Φαρμάκων Φυσικό Προϊόν Discovery (CENAR) Grant (4.911.274). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Διάφορες φυσικές phytocompounds έχουν ελεγχθεί και διερευνήθηκαν εκτενώς ως πιθανών αντικαρκινικών παραγόντων. Περίπου το 74% των φαρμάκων που εγκρίθηκαν για τη θεραπεία του καρκίνου έχουν εξαχθεί από φυσικές πηγές, είτε δημιουργούνται από δομική τροποποίηση ή συντίθενται και έχουν σχεδιαστεί με βάση το φυσικό ενώσεις ως μοντέλο [1]. Τα περισσότερα από τα φυσικά αντικαρκινικών παραγόντων που υπάρχουν σήμερα προέρχονται από φυτά, ζώα, θαλάσσιων οργανισμών και μικροοργανισμών. Μερικά παραδείγματα που χρησιμοποιούνται σήμερα από φυτικής προέλευσης ενώσεων με δυναμικό δραστηριότητες αντικαρκινικά είναι οξικό 1’S-1’acetoxyeugenol και οξικού 1’S-1′-acetoxychavicol [2], βινκριστίνη, ιρινοτεκάνη, ετοποσίδη και πακλιταξέλη, ενώ η βλεομυκίνη και η δοξορουβικίνη είναι μικροβιακά προερχόμενο ενώσεις και citarabine, που προέρχεται από θαλάσσιες πηγές [3].

Μία υποομάδα των φυσικών ενώσεων που είναι γνωστές ως limonoids, είναι ιδιαίτερα οξυγονωμένα παράγωγα τετρακυκλικής τριτερπενίου και έχουν αναγνωριστεί ότι διαθέτει ενδιαφέρουσες βιολογικές δραστηριότητες. Μέχρι σήμερα, έχουν πολλές limonoids έχουν απομονωθεί με ένα ευρύ φάσμα βιολογικών επιπτώσεων συμπεριλαμβανομένων των εντόμων αντι-τροφοδοτική, αναστέλλοντας χαρακτηριστικά ανάπτυξης και αντι-φλεγμονώδεις παράγοντες [4]. Αρκετές αγλυκόνες εσπεριδοειδών σε λεμονοειδή όπως λιμονίνης, nomilin, obacunone, isoobacunoic οξύ και ichangin έχουν πρόσφατα υποβληθεί σε διαδικασίες διαλογής αντι-καρκίνου και βρέθηκαν να επάγουν σημαντική γλουταθειόνη-δ-τρανσφεράσης (GST) και κινίνη αναγωγάσης (QR) δραστηριότητα στην το ήπαρ και εντερικός βλεννογόνος των ποντικών και των αρουραίων αντίστοιχα [5] – [6]. Άλλες αναφορές περιλαμβάνουν ενδείξεις ότι μίγματα λεμονοειδή αγλυκόνες με γλυκοζίτες ήταν ισοδύναμης ισχύος με την ταμοξιφαίνη για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων ER θετικά μαστού, και μια ακόμη υψηλότερη δραστικότητα κατά οιστρογόνο ανεξάρτητος κύτταρα καρκίνου του μαστού [7]. Limonoids από το αιθανολικό εκχύλισμα του

Azadirachta indica

(φλοιός neem, φύλλα και σπορέλαιο) βρέθηκαν επίσης να προκαλούν κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων του προστάτη (PC-3) δι ‘επαγωγής της απόπτωσης μέσω της μείωσης στην έκφραση Bcl-2 επίπεδα που αντιστοιχούν με μια αύξηση στα επίπεδα Βαχ [8].

Επί του παρόντος, η διαδικασία της απόπτωσης και τη σημασία της στον καρκίνο ως ο προτιμώμενος τρόπος θανάτου λόγω της αποτελεσματικής κάθαρσης των αποπτωτικών κυττάρων χωρίς ενεργοποίηση φλεγμονή έχει γίνει ένα από οι τομείς προτεραιότητας στην έρευνα για τον καρκίνο [9]. Πρόσφατες μελέτες που διεξάγονται επί limonoids εξάγεται από

Citrus aurantifolia

έδειξαν ότι η εμφάνιση της απόπτωσης που προκαλείται μέσω της επαγωγής της κασπάσης-3, οδηγείται από την ενδογενή οδό και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος-c σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [10 ]. Η φυσική λεμονοειδή, erythrocarpine Ε (CEB4), το οποίο χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη, είναι Α, Β, D-σεκο heptacyclic λεμονοειδή με μια ομάδα κινναμοϋλο ως πλευρική αλυσίδα στο C-3 εξάγεται από τον φλοιό του

Chisocheton erythrocarpus

Hiern από την οικογένεια Meliaceae, κοινώς γνωστό ως «Rongga» στη Μαλαισία. Έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι επάγει CEB4 κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι Ρ-388 κύτταρα λευχαιμίας ποντικού κατά IC

50 16,0 μg /ml [11]. Σε αυτή τη μελέτη, CEB4 ερευνήθηκε για τη δυνατότητά της να επάγει απόπτωση σε HSC-4 καρκινώματος ανθρώπινου στόματος πλακωδών κυττάρων (SCC).

Υλικά και Μέθοδοι

Το φυτικό υλικό

Chisocheton erythrocarpus

Hiern συλλέχθηκε από Hutan Simpan Terenas, Kedah, Μαλαισία. Το δείγμα που προσδιορίζονται από τον κ Teoh Leng Eng από το Τμήμα Χημείας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο της Μαλαισίας. Ένα δείγμα κουπόνι (KL 4863) κατατέθηκε στο Τμήμα Χημείας Ερμπάριο, Πανεπιστήμιο της Μαλαισίας.

Αντιδραστήρια

Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) και Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI- 1640) με 4,5 g /L γλυκόζη, 300 mg /l L-γλουταμίνη, 2,5% (ν /ν) θρυψίνη σε ισορροπημένο διάλυμα άλατος τροποποιημένου Hank (HBSS) χωρίς ασβέστιο ή μαγνήσιο, ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και όλα τα αντιβιοτικά αγοράστηκαν από την Lonza Inc., USA. Διμεθυλ-2-θειαζολυλ-2,5-διφαινυλο-2Η-τετραζολίου (ΜΤΤ) αντιδραστήριο, αννεξίνη V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) κιτ ανίχνευσης απόπτωσης, ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), RNase και SuicideTrack ™ DNA κιτ Ladder Απομόνωση αγοράστηκαν από Calbiochem (CA, USA).

Εξαγωγή και Απομόνωση Φυσικών Ένωση

Αποξηραμένα φλοιός έδαφος (1,3 kg) του

Chisocheton erythrocarpus

εκχυλίζονται διαδοχικά με εξάνιο, διχλωρομεθάνιο και μεθανόλη. Κάθε εκχύλισμα ξηραίνεται στην συνέχεια

σε κενό

. Το ξηρό εκχύλισμα διχλωρομεθανίου (4,0 g) υποβλήθηκε σε κλασματοποίηση με χρωματογραφία στήλης σιλικαζέλ χρησιμοποιώντας ένα μίγμα διαλυτών εξανίου-οξικού αιθυλεστέρα. Η πολικότητα της κινητής φάσης αυξήθηκε βαθμιαία σε 100% οξικό αιθυλεστέρα. Το κλάσμα που εκλούεται από 30% οξικού αιθυλεστέρα, το οποίο περιείχε την ένωση στόχο, διαχωρίστηκε με παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) με εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (7: 3). Για να δώσει erythrocarpine Ε (4,7 mg)

γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

Ένα σύνολο πέντε κυτταρικές σειρές ανθρώπινου όγκου χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, η οποία περιλαμβάνει HSC-4, HSC-2 από το στόμα καρκινικών κυτταρικών σειρών και Ca σκι τραχήλου κυτταρική γραμμή όγκου που λαμβάνεται από την Research Cancer Πρωτοβουλία Foundation (CARIF, Μαλαισία), MCF-7 αδενοκαρκινώματος μαστού και HepG2 ηπατοκαρκινώματος τα οποία ελήφθησαν από το University of Malaya Medical Center (UMMC), και φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ΝΗΒΕ) (Lonza Inc., USA) που χρησιμοποιείται ως ένα κανονικό ελέγχου των κυττάρων. Για συντήρηση ρουτίνας HSC-4, HSC-2, κύτταρα Ca σκι και HepG2 καλλιεργήθηκαν σε κύτταρα ϋΜΕΜ και MCF-7 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640, με τους δύο τύπους μέσα συμπληρωμένα με 10% (ν /ν) FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. κύτταρα ΝΗΒΕ καλλιεργήθηκαν με βρογχικών επιθηλιακών βασικό μέσο (BEBM) με 10% (ν /ν) FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν ως μονοστοιβάδες στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με αέρα 5% CO

2/95%.

ΜΤΤ την Κυτταρική Βιωσιμότητα Δοκιμασία

Οι κυτταροτοξικές επιδράσεις της CEB4 σε όλες τις κυτταρικές σειρές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο προσδιορισμού ΜΤΤ. CEB4 διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε τελική συγκέντρωση 10 mM. Εν συντομία 1,0 × 10

4 κύτταρα ανά 100 μΙ μέσου σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων παρουσία ή απουσία CEB4 σε τελικές συγκεντρώσεις 5 μΜ έως 40 μΜ για έως και 24 ώρες. ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο (10 μΐ /φρεάτιο) και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες. Μετά την επώαση, το μέσο αντικαταστάθηκε με 200 μΐ DMSO και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm για κάθε πηγάδι χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Tecan Sunrise®, Ελβετία).

Annexin V-FITC /ΡΙ Ανάλυση

ανίχνευση απόπτωσης διεξήχθη με χρήση του κιτ ανίχνευσης Annexin V-FITC /ΡΙ απόπτωσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, οι δύο CEB4 επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα HSC-4 και ΝΗΒΕ συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν σε 1χ PBS και βάφτηκαν με προϊόν σύζευξης αννεξίνη V-FITC και ΡΙ. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACSCalibur ™ BD, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας λογισμικό απόκτησης και ανάλυσης BD CellQuest.

Δοκιμασία κατακερματισμού του DNA

ολικό DNA εκχυλίστηκε από τα δύο μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα κύτταρα με CEB4 για 12 και 24 ώρες με τη χρήση του SuicideTrack ™ κιτ απομόνωσης DNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Απομονωμένα DNA αναλύθηκε σε 1% (v w /) ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Ο κατακερματισμός του DNA παρατηρήθηκε υπό φωτισμό υν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τεκμηρίωσης γέλης (Άλφα Inotech, USA).

Western Blotting

κατεργάζεται CEB4 κύτταρα HSC-4 αναπτύχθηκαν σε πυκνότητα κυττάρων 80-90 % συρροή, πλύθηκαν με παγωμένο PBS 1x και πρωτεΐνες εξάγεται χρησιμοποιώντας το NE-PER® Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Extraction Kit (Pierce, USA). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad DC (Bio-Rad Laboratories, USA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με εννέα πρωτεύοντα αντισώματα έναντι β-ακτίνης, το πολυ-ΑϋΡ ριβόζης πολυμεράσης (PARP), ρ53, φωσφο-ρ53, ποντικού διπλό λεπτά 2 (MDM2), Bax, Bcl-2, procaspase-3 και procaspase-9 . Μετά την πλύση σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween-20 (TBST) ρυθμιστικό διάλυμα, υπεροξειδάση κοχλιαρίας (HRP) προστέθηκαν δευτερογενή αντισώματα και οι δεσμευμένες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν μέσω ενισχυμένης χημειοφωταύγειας σημάτων χρησιμοποιώντας φιλμ ακτίνων-Χ. Σχετικές εντάσεις όλων των ζωνών ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης εικόνας (ΝΙΗ ImageJ v1.43, National Institutes of Health, USA).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± Τ.Α. των δεδομένων που ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ διαφόρων ομάδων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA. Σημαντικές διαφορές θεωρήθηκαν ως p ≤ 0,05.

Αποτελέσματα

Απομόνωση και Χαρακτηρισμός των Erythrocarpine Ε (CEB4)

CEB4 (erythrocarpin Ε) απομονώθηκε ως λευκή άμορφη σκόνη. Ο μοριακός τύπος ήταν C

36Η

40o

10, η οποία προσδιορίστηκε από το [Μ + Η]

+ κορυφή σε m /z 633,2703 στη φασματομετρία μάζας ταχέως ατομικού βομβαρδισμού υψηλής ανάλυσης (HRFABMS) . Οι υπέρυθρες ακτίνες απορροφήσεις στα 3413 εκατοστά

-1 και 1700-1730 cm

-1 έδειξε την παρουσία υδροξυλίου και διάφορες ομάδες καρβονυλίου. Σε

Φάσμα 1Η NMR, εντοπίστηκαν τυπικό κορυφές που συνδέονται με λεμονοειδή σκελετό. Η φουράνιο πλευρική αλυσίδα στο δ 7.64 (

s

), δ 6.29 (

br s

), και δ 7.30 (

d

, J = 1.5 Ηζ) αποδόθηκαν στην Η-21, Η-22 και Η-23, αντίστοιχα. Σήματα που προκύπτουν από οξυγονωμένο πρωτόνια μεθινίου του Η-3 σε δ 4.91 (

d

, J = 10,2 Hz) και Η-17 στο δ 5.46 (

s

) ήταν εύκολα διαφοροποιημένες και αποδίδεται με βάση την η πολλαπλότητα σήματος. Από την άλλη πλευρά, η εμφάνιση μιας γέφυρας οξυγόνου που συνδέει C-1 έως C-29 θεωρήθηκε σπάνια [11]. Τα απομονωμένα diasterotopic πρωτόνια μεθυλενίου του H

2-29 ανιχνεύθηκαν ως ένα ζεύγος διπλών σε δ 3,46 και δ 3,88, με μια σταθερή σύζευξης των 9,3 Ηζ. Στο υποδομή αλλυλική αλκοόλη, το ολεφινικό σήμα βρέθηκε στο δ 5,53 (dd, J = 1,7, 7,1 Hz). Η cinnamate πλευρική αλυσίδα στο C-3 επιβεβαιώθηκε με την παρουσία πέντε αρωματικών πρωτονίων σε 7,10-δ 7.20 και η χαρακτηριστική σήματα διπλή της περιοχής δ του Η-2 ‘και Η-3’ στο δ 6.25 (

d

, J = 16,0 Hz) και δ 7.58 (

d

, J = 15,7 Hz). Η σχετική στερεοδομή της erythrocarpin Ε ιδρύθηκε μέσω φασματοσκοπίας πυρηνικού επίδραση Overhauser (NOESY). Η χημική δομή της CEB4 φαίνεται στο Σχήμα 1.

Η

CEB4 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των HSC-4 κύτταρα

προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν για την αξιολόγηση των κυτταροτοξικών ιδιοτήτων και ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) τιμές του CEB4 επί πέντε ανθρώπινων όγκων και φυσιολογικών κυτταρικών σειρών ΝΗΒΕ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι CEB4 επάγει κυτταροτοξικότητα σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο πάνω από ένα καθεστώς επεξεργασίας 40.0 μΜ και 24 ώρες έκθεσης (Σχ. 2Α και 2Β). Minimal κυτταροτοξικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα ΝΗΒΕ, όπου παρατηρήθηκε περίπου 20,0% θανάτωση υπό παρόμοιες συνθήκες επεξεργασίας, σε αντίθεση με το 95% θανάτωση σε HSC-4 κύτταρα με την χαμηλότερη IC

50 καταγράφεται η τιμή του 4,0 ± 1,9 μΜ μεταξύ όλων των κυτταρικών γραμμές που εξετάστηκαν (Πίνακας 1). Η βιωσιμότητα των κυττάρων σε επεξεργασία με DMSO χωρίς CEB4 επηρεάστηκαν σε ασήμαντο βαθμό ( Δύο κύριες οδοί του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου μπορούν να διακριθούν: το εξωγενή και ενδογενή μονοπάτια. Η δράση της p53 είναι έμμεσα συνδεδεμένα με την ενδογενή οδό κυτταρικού θανάτου, όπου διεγείρει ένα ευρύ δίκτυο των σημάτων που δρα εν μέρει μέσω της οικογένειας καταρράκτη σηματοδότησης Bcl-2 [16]. Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις στο ρ53 παίζουν ζωτικό ρόλο στην έναρξη του καρκίνου και είναι πολύ σημαντικό σε σχέση του με καρκίνους όπως του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, του οισοφάγου, του μαστού, του ήπατος, του εγκεφάλου, δικτυοενδοθηλιακού ιστούς και αιματοποιητικούς ιστούς [17].

Τα κηλίδωση Western αποτελέσματα καταδεικνύουν μια αύξηση στο επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ρ53 και μια μείωση του αναστολέα του, MDM2 υποδηλώνοντας ότι ο τρόπος της επαγωγής απόπτωσης από CEB4 προκαλείται μέσω της εσωτερικής οδού. Αυτό ενισχύεται περαιτέρω από παρατηρήσεις επί μιτοχονδριακών πρωτεϊνών, όπου μια αύξηση των προ-αποπτωτικών επίπεδα πρωτεΐνης, Βαχ και μείωση των αντι-αποπτωτικών επίπεδα πρωτεΐνης, Bcl-2 παρατηρήθηκε. Η αναλογία μεταξύ Bcl-2 και Bax ρυθμίζεται η επαγωγή απόπτωσης από διμερισμού με το άλλο, προκαλώντας έτσι την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια [18] – [19]. Εκτός CEB4, άλλες φυσικές ενώσεις που έχουν εμφανιστεί επιδράσεις στην επαγωγή ρ53-μεσολαβούμενη απόπτωση ήταν κουρκουμίνη, η ρεσβερατρόλη, ανθοκυάνες και καψαϊκίνη [20]. Προηγούμενες μελέτες σε λεμονοειδή με βάση ενώσεις από

Citrus aurantifolia

έχουν επίσης δειχθεί ότι επάγει απόπτωση μέσω ενεργοποίησης της p53 [10], [20].

Ο μηχανισμός δράσης των κυτταροτοξικών φαρμάκων δεν μόνο περιλαμβάνουν χαρακτηριστικά όπως συρρίκνωση κυττάρου και κατάτμηση του DNA, αλλά και η ενεργοποίηση της ρ53 μόρια σηματοδοτήσεως που οδηγούν στην ενεργοποίηση ενός καταρράκτη δράση κασπάσης [21]. καταρράκτες κασπάσης μπορεί να ενεργοποιηθεί μέσω δύο κύριους κλάδους, είτε μέσω κυτταρικής επιφάνειας υποδοχείς θανάτου TNF-υπεροικογένεια και βασική πρωτεΐνη προσαρμογέα Fas ενεργοποιημένου πεδίου θανάτου (FADD) που οδηγεί σε ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και τελικά κασπάσης-3, ή μέσω της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος γ (Cytc) από τα μιτοχόνδρια με αποτέλεσμα την δράση της κασπάσης-9 και μετέπειτα δράση της κασπάσης-3. Κασπάσης-3, αντιπροσωπεύει ένα σημείο σύγκλισης μεταξύ των δύο διαδρομές, και με τη σειρά του προκαλεί διάσπαση PARP, χρωμοσωμικό DNA διαλείμματα και, τέλος, την κατανομή του κυττάρου σε αποπτωτικά σώματα [22]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CEB4 εξασκεί αποπτωτικά αποτελέσματα του δρώντας επί κασπάσες-9 και -3, όπου το επίπεδο της πλήρους μήκους procaspase-9 και κασπάσης-3 ζυμογόνο μειώνεται κατά την έκθεση CEB4, με αποτέλεσμα διασπασμένο, ενεργοποιημένες μορφές της κασπάσης-9 ( 37 kDa και 10 kDa) της κασπάσης-3 (17 kDa και 12 kDa). Ωστόσο, αποπτωτικό μεταγωγή σήματος περιλαμβάνουν σηματοδότηση του υποδοχέα θανάτου που προκύπτει σε ενεργοποιημένα εκκινητή κασπάσης-8, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί ζυμογόνου κασπάσης-3 δεν μπορεί να αποκλειστεί. Η μεσολάβηση του κυτταρικού θανάτου μέσω αυτής της οδού θα μπορούσε να εξηγήσει την παρατήρηση μιας πρώιμης μείωση (& lt? 6 ώρες) σε procaspase-3 επίπεδα πριν από αλλαγές στην Bcl-2 και Bax που συμβαίνουν σε 12 ώρες (Σχήμα 5Β και 5C.). Αυτό θα μπορούσε επίσης να σημαίνει ότι η συμμετοχή της ενδογενούς οδού χρησιμεύει ως βήμα ενίσχυσης προς την αρχική θάνατο σηματοδότησης μέσω της εξωγενούς οδού κατά την έκθεση CEB4.

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι CEB4 προκαλεί κυτταροτοξικότητα μέσω αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε HSC-4 καρκίνο του στόματος κύτταρα, και ότι η επαγωγή της απόπτωσης επιφέρεται με την ενεργοποίηση του ρ53, η οποία ενεργοποιεί την ενδογενή οδό μέσω Bcl-2 και Bax, και τέλος μέσω της κασπάσης-9 και -3 ενεργοποίηση. Τα δεδομένα μας δείχνουν το δυναμικό για την ανάπτυξη CEB4 ως νέου δυναμικού αντικαρκινικό φάρμακο κατά του ανθρώπινου καρκίνου του στόματος, αν και περαιτέρω εργασίες για

in vivo

επιπτώσεις στην ασφάλεια και τη φαρμακοκινητική απαιτείται πριν CEB4 μπορεί να αξιολογηθεί πλήρως σε ένα κλινικό ρύθμιση.

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να αναγνωρίσουμε Datuk Prof. Dr. A. Χαμίντ Α Hadi από το Κέντρο Φυσικών Ερευνών προϊόντων και Φαρμάκων Discovery, του Πανεπιστημίου της Μαλαισίας για την προσφορά του προς την κατεύθυνση της ανακάλυψη της ένωσης CEB4. Επίσης, η κα Norahayu Othman και η κα Yap Seow Hui από το Ινστιτούτο Βιολογικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο της Μαλαισίας για τη συμβολή τους κατά τη διάρκεια της ανάλυσης διαλογής κυτταροτοξικότητα και πορεία αυτής της έρευνας.