Αφηρημένο

Γενική ενεργοποίηση του παράγοντα υποξία (HIF) πορείες κλασικά σχετίζεται με κακή πρόγνωση στον καρκίνο και έχει προταθεί να συμβάλει στην ογκογόνο οδηγώ. Σε σαφή κύτταρο νεφρικού καρκινώματος (CCRC) οδοί HIF απορυθμίζεται με απενεργοποίηση του καταστολέα όγκου νοη Hippel-Lindau-. Ωστόσο HIF-1α και HIF-2α έχουν αντικρουόμενες επιδράσεις σε πειραματικά εξέλιξης του όγκου. Για να κατανοήσουμε καλύτερα αυτό το παράδοξο εξετάσαμε παν-γονιδιωματικής πρότυπα του HIF DNA δεσμευτική και συνδέονται γονιδιακής έκφρασης σε απάντηση χειραγώγηση του HIF-1α και HIF-2α και σχετίζονται με τα ευρήματα για να CCRC πρόγνωση. Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν διακριτές παν-γονιδιωματική οργάνωση της δέσμευσης σε χιλιάδες ιστοσελίδες κανονικών και μη κανονικών HIF ισομορφή ειδικές DNA. Συνολικά συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ HIF-1α-ειδική δέσμευση, και τα γονίδια που σχετίζονται με ευνοϊκή πρόγνωση και μεταξύ HIF-2α-ειδική δέσμευση και τις δυσμενείς πρόγνωση. Ωστόσο, σε κάθε ισομορφή-συγκεκριμένο σύνολο, ατομικές ενώσεις γονιδίου ήταν ετερογενή στο πρόσημο και το μέγεθος, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση της κάθε ισομορφής HIF-α συνεισφέρει ένα εξαιρετικά σύνθετο μείγμα των προ- και αντι-ογκογόνο επιδράσεις

Παράθεση:. Salama R, Masson Ν, Simpson P, Sciesielski LK, Sun Μ, Tian ΥΜ, et al. (2015) Ετερογενή επιδράσεις των άμεσων υποξία μονοπάτι ενεργοποίησης στον Καρκίνο του νεφρού. PLoS ONE 10 (8): e0134645. doi: 10.1371 /journal.pone.0134645

Επιμέλεια: Jörn Karhausen, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: May 27, 2015? Αποδεκτές: 10 Ιουλ 2015? Δημοσιεύθηκε: 11 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Salama et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Τα δεδομένα έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων NCBI Gene Expression Omnibus (GSE67237, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE67237)

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από Cancer Research UK (αριθμός επιχορήγηση A16016) στην RS, NM και DRM, το Ludwig Institute for Cancer Research για PJR και MS, το Συμβούλιο χρηματοδότησης Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης για την Αγγλία στο DRM, η Wellcome Trust (αριθμοί επιχορήγηση 078.333 /Z /05 /Ζ, WT091857MA) να PJR, YMT και PS, και το γερμανικό Ίδρυμα Ερευνών (αριθμός επιχορήγηση SC132 /2-1) για να LKS. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η υποξία συνδέεται στενά με δυσμενή πρόγνωση σε συνήθως ενεργοποιούνται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου [1-4] καρκίνου και υποξία σηματοδότηση μονοπατιών. Αυτό επεξηγείται με σαφή κυττάρου καρκίνο του νεφρού (CCRC) στον οποίο αδρανοποίηση του καταστολέα όγκου νοη Hippel-Lindau (pVHL) είναι μια κοινή και πρώιμο συμβάν [5-7]. pVHL είναι το στοιχείο αναγνώρισης ενός συμπλόκου Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης που στοχεύει υποξία διεγέρσιμο παράγοντα (HIF) α-υπομονάδες για αποικοδόμηση από το μονοπάτι ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος, και αδρανοποίηση των αποτελεσμάτων pVHL σε συστατική ενεργοποίηση του μεταγραφικού οδού HIF [8]. HIF μεταγραφική στόχοι περιλαμβάνουν πολλά με τις λειτουργίες που συνδέουν με κοινά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του καρκίνου (π.χ. αυξημένη αγγειογένεση, απορυθμισμένη το μεταβολισμό της ενέργειας, αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων), και είναι κοινώς δεκτό ότι ογκογένεση οδηγείται σε μεγάλο βαθμό από το άθροισμα των θετικών επιδράσεων της ενεργοποίησης HIF σε τέτοιες διεργασίες.

η μεταγραφική ενεργοποίηση από HIF κατά κύριο λόγο μέσω μέσω δέσμευσης του HIF ετεροδιμερή α /β σε έναν πυρήνα συναινετική αλληλουχία (RCGTG) σε στοιχεία απόκρισης υποξίας (HREs) [9]. Αν και οι δύο καλύτερες χαρακτηρισμένο υπομονάδες HIF-α, HIF-1α και HIF-2α, δηλωτικό παρόμοια αρχιτεκτονική του τομέα, και να διακριθεί αλληλουχίες δέσμευσης DNA [10], μπορούν μετενεργοποιούν διακριτές στόχους και δείχνουν αντίθετες ογκογόνο ρόλους [11,12]. Παραδόξως, ισχυρή αυξητική ρύθμιση του HIF εξής αδρανοποίηση των VHL σε CCRC συνδέεται με μια ασυνήθιστη προκατάληψη στην έκφραση ισομορφή HIF, προς HIF-2α [13]. Αρκετές γραμμές έρευνας δείχνουν ότι αυτό είναι λειτουργικά σημαντική για την ανάπτυξη του CCRC. μελέτες συσχέτισης Genome κλίμακα εντοπίστηκαν πολυμορφικές παραλλαγές που επηρεάζουν την ευαισθησία στην CCRC στο HIF-2α, αλλά όχι HIF-1α, τόπο και σε τόπους εντός του HIF-2α μεταγραφικό μονοπάτι [14]. Αντιστρόφως, HIF-1α γονίδιο δόση συνήθως μειώνεται CCRC από την απώλεια του χρωμοσώματος 14q [15], και το γονίδιο HIF-1α, αλλά όχι το γονίδιο HIF-2α, υπόκειται σε μικρή αλλά σημαντική περίσσεια αδρανοποίησης μεταλλάξεων [16] . Επιπλέον, HIF-2α αλλά όχι HIF-1α, μπορεί να κατισχύει της δραστηριότητας καταστολέα όγκου των pVHL σε πειραματικά συστήματα όγκων [17,18]. Συγκεκριμένα, η εκ νέου έκφραση του HIF-1α σε γραμμές CCRC που στερούνται άγριου τύπου HIF-1α επιβραδύνει την ανάπτυξη, ενώ η υπερέκφραση του HIF-2α επιταχύνει την ανάπτυξη σε ξενομοσχεύματα όγκου [11,15].

Αυτές οι παρατηρήσεις αμφισβητήσει την παράδειγμα που γενική ενεργοποίηση του HIF δίσκων σηματοδότησης ογκογένεση μέσω της ενεργοποίησης ενός μικρού αριθμού διακεκριμένων στόχων μεταγραφικής και προτείνουν μια πιο σύνθετη διασύνδεση. Για παράδειγμα, παν-γονιδιωματική αναλύσεις αποκάλυψαν εκατοντάδες έως και χιλιάδες άμεσες HIF μεταγραφικών στόχων [10,19-22]. Από HIF-1α και HIF-2α μπορεί δυνητικά να ανταγωνίζονται για δέσμευση με HIF-1β ή για πληρότητας HREs, ή μπορεί να δεσμεύονται διακεκριμένα σύνολα μεταγραφικών στόχων, δεν είναι σαφές πώς η ισομορφή ειδικό χειρισμό των επιπτώσεων HIF-α για τα πρότυπα της μεταγραφής συνδέονται με CCRC.

Για τη μελέτη αυτή θα πραγματοποιηθεί λεπτομερής τσιπ επόμενα και RNA-επόμενα ανάλυση του HIF-α ισομορφή δέσμευσης κατάληψη θέσης και γονιδιακής έκφρασης στο pVHL-ελαττωματική κυτταρική σειρά CCRC 786-0, μετά επανέκφραση του HIF-1α ή υπερέκφραση του HIF-2α, και σχετίζονται με τα ευρήματα αυτά να προγνωστικά συνδεδεμένες πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε ανθρώπινους όγκους CCRC [6]. Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν μεγάλο αριθμό διακριτών θέσεων δέσμευσης ισομορφής ειδικά HIF-α που εκδηλώνονται μια ισομορφή-ειδικές γονιδιωματικές αρχιτεκτονική, ενεργοποιούν διαφορετικά πρότυπα της γονιδιακής έκφρασης και των συνδεδεμένων με αντιθέσεις προγνωστικούς μοτίβα γονιδιακής έκφρασης σε κλινικές CCRC. Ωστόσο, αν και παρατηρήθηκε σαφής συνολική συσχετίσεις μεταξύ γονιδίων HIF-1α που σχετίζονται και την καλή κλινική πρόγνωση και μεταξύ των γονιδίων HIF-2α-συνδέονται και φτωχή κλινική πρόγνωση, αυτή η διχοτόμηση ήταν ελλιπής. Στο επίπεδο των μεμονωμένων γονιδίων, τα αποτελέσματα ήταν ετερογενές τόσο πρόσημο και το μέγεθος της επίδρασης, γεγονός που υποδηλώνει ότι ακόμη και σε αυτό ορίζεται το πλαίσιο, κάθε ισομορφή HIF-α έχει δυνητικά τόσο προ- και αντι-ογκογόνο δράση.

Υλικά και μέθοδοι

οι εργαστηριακές μέθοδοι

Cell Culture.

786-O και ΗΕΚ293Τ κύτταρα αγοράστηκαν από την ATCC (https://www.lgcstandards-atcc.org) και μεγάλους σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2 mM L-γλουταμίνη, 100U πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη 50 U /ml (ν /ν) (Sigma-Aldrich).

Παραγωγή 786-0 HIF -1α /HIF-2α κύτταρα.

HIF-1α και cDNA αλληλουχίες HIF-2α [11] για πρώτη φορά κλωνοποιήθηκε σε pRRL.IRES.EGFP (είδος δώρο από Kamil Kranc, Glasgow) για να δημιουργήσει δισιστρονική φορείς. Αυτά στη συνέχεια συν-επιμολύνθηκαν με ρΟΜν-dR8.2 και ρΟΜΟ-VSVG σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ και τα προκύπτοντα ιικά σωματίδια απομονώνονται με φυγοκέντρηση και υπερδιήθηση. 786-0 κύτταρα (ATCC) στη συνέχεια σε μεταγωγή είτε με έλεγχο (pRRL), HIF-1α (pRRL-HIF-1α) ή HIF-2α (pRRL-HIF-2α) που εκφράζουν τον ιό.

τσιπ seq .

Single αναλύσεις τσιπ επόμενα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Χρωματίνης ανοσοκατακρημνίσθηκε με πολυκλωνικό κουνελιού αντιορούς προς HIF-1α (PM14), HIF-2α (PM9) [23], ο HIF-1β (ΝΒ-100-110, Novus Biologicals, UK) ή προ-άνοσο ορό ως μάρτυρα.

ΡοΙγΑ + επιλεγμένων RNA-seq

Ολικό RNA παρασκευάστηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το mirVana miRNA Απομόνωση Kit. (Ambion? Technologies Life Ltd, Paisley, UK) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DNaseI (TURBO DNA-free, Ambion ). ΡοΙγΑ + RNA βιβλιοθήκες στη συνέχεια παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ΚΝΑ-Seq kit της ScriptSeq v2 (Epicentre, Madison, WI, USA).

υψηλής απόδοσης αλληλούχηση.

Όλες οι βιβλιοθήκες παρασκευάσθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα και Illumina αλληλουχία στην πλατφόρμα HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, USA).

κώδικες προσχώρησης.

τσιπ επόμενα και RNA-επόμενα στοιχεία είναι διαθέσιμα από την έκφραση γονιδίων Omnibus (GSE67237).

βιοπληροφορική ανάλυση των τσιπ επόμενα δεδομένα

Αρχική ανάλυση.

αλληλουχίες προσαρμογέα Illumina ήταν στολισμένα με χρήση Trimgalore (0.3.3) και διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με Genome αναφοράς Κοινοπραξία GRCh37 ( hg19) χρησιμοποιώντας BWA (0.7.5a-R405). χαρτογράφηση χαμηλής ποιότητας αφαιρέθηκε (MapQ & lt? 15) χρησιμοποιώντας SAMtools (0.1.19) [24] και διαβάζει χαρτογράφηση για Duke Κωδικοποίηση μαύρη λίστα περιοχές (https://hgwdev.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgFileUi?db = hg19 & amp? g = wgEncodeMapability) αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας BEDTools (2.17.0) [25]. Διπλότυπο διαβάζει σημαδεύτηκαν αποκλεισμού χρησιμοποιώντας τα εργαλεία Picard (1.106) (https://picard.sourceforge.net/). Διαβάστε πυκνότητες ομαλοποιήθηκαν και εκφράζονται ως διαβάζει ανά kilobase ανά εκατομμύριο διαβάζει (RPKM) [26]. Ένα εκατομμύριο τυχαία μη-επικαλυπτόμενες περιοχές που επιλέγονται από ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ Cluster DNase κορυφών ΙΙ (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeRegDnaseClustered/) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρας.

Peak Calling .

τσιπ επόμενα κορυφές ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας T-PIC (σχήμα Δέντρο Peak Αναγνώριση για τσιπ Seq) [27] και MACS (Model-based ανάλυση των τσιπ Seq) [28] στη λειτουργία ελέγχου. Κορυφές ανιχνεύονται από τα δύο καλούντες κορυφή διηθούνται ποσοτικά χρησιμοποιώντας την συνολική καταμέτρηση κάτω από την κορυφή να περιλαμβάνει μόνο κορυφές που ήταν πάνω από το 99.99th εκατοστημόριο των τυχαίων φόντο περιοχών που επιλέγονται από την ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ DNASE II σύμπλεγμα (τιμή-ρ & lt? 0,0001).

De-novo Μοτίβο Ανάλυση.

Ακολουθίες συνοδευτικά κάθε σύνοδο κορυφής κορυφής (± 150bp) ήταν επαναλαμβανόμενων καλυφθούν με τη χρήση RepeatMasker 4.0.3 (https://www.repeatmasker.org). De-novo μοτίβων ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Meme-chip (4.9.1) [29] και να συνδυαστούν, με τη χρήση της μονάδας TomTom, με τα γνωστά μοτίβα παράγοντα μεταγραφής στο 2009 JASPAR πυρήνα της βάσης δεδομένων [30].

Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA).

οι θέσεις σύνδεσης για όλες τις υπομονάδες που περιλαμβάνονται στο PCA συγχωνεύθηκαν σε ένα ενιαίο σύνολο δεσμευτική. PCA διεξήχθη χρησιμοποιώντας Singular αποσύνθεσης Αξία (Prcomp, R 3.1.1 -stats βιβλιοθήκη, https://cran.r-project.org) και για τα δύο επιμέρους θέσεις πρόσδεσης και για το σύνολο του τσιπ-seq σήματος για κάθε υπομονάδα. Biplots παρήχθησαν στο R.

χάρτες θερμότητας

θέση δέσμευσης χάρτες θερμότητας παρήχθησαν χρησιμοποιώντας Ngsplot (2.08) [31] με τις ακόλουθες παραμέτρους:. FL = 50, MW = 5, RZ = 1 , SC = 0-1, MQ = 15.

Motif Πιθανότητα.

Κάθε δεσμευτική HIF-α περιοχή (σύνοδος κορυφής ± 150bp) σαρώθηκε για την HRE (Jaspar /MA0259.1) και το AP-1 (Jaspar /MA0491.1) μοτίβα χρησιμοποιώντας μήτρες βάρους θέση (PWMs) ανακτώνται από τη βάση δεδομένων του 2009 JASPAR πυρήνα [30] δεσμευτική. Η αναλογία ομαλοποιημένη πιθανότητα (NLR) για κάθε μοτίβο υπολογίστηκε σύμφωνα με την εξίσωση 1. Η μέγιστη κανονικοποιημένη αναλογία πιθανότητας για κάθε περιοχή δέσμευσης αναφέρθηκε τόσο για την HRE και ΑΡ-1 μοτίβο όπως δίνεται από την εξίσωση 2.

Εξίσωση (1) η εξίσωση (2)

όπου

ι

είναι η θέση στην κορυφή,

i

είναι η θέση στο μοτίβο,

L

είναι το μήκος του μοτίβου,

PWM (β

,

i)

είναι η τιμή PWM σε

i

για την αντίστοιχη βάση

β

,

β (β)

είναι το βάρος υπόβαθρο για την αντίστοιχη βάση υπολογίζονται πάνω από ένα εκατομμύριο τυχαία DNAse sites και

W

είναι το πλάτος της κορυφής.

βιοπληροφορική ανάλυση του RNA-επόμενα δεδομένα

Αρχική ανάλυση.

ακολουθίες Adapter ήταν στολισμένα όπως παραπάνω. Διαβάζει στη συνέχεια ευθυγραμμίζονται με GRCh37 χρησιμοποιώντας ΤΟΡΗΑΤ C 2.0.8b (https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml) και παπιγιόν 1.0.0 (https://bowtie-bio.sourceforge.net/index. shtml) και μη μοναδικά χαρτογράφηση θραυσμάτων αποκλείονται χρησιμοποιώντας SAMtools (0.1.19) [24]. Σύνολο μετράει ανάγνωσης για κάθε καθορισμένο γονίδιο UCSC εξήχθησαν χρησιμοποιώντας HTSeq (0.5.4p3) [32] με «διασταύρωση-αυστηρό» τρόπο λειτουργίας και σημαντικά ρυθμίζονται τα γονίδια ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας DESeq2 (ref. [33]).

Gene Ορίστε εμπλουτισμός ανάλυση (GSEA).

ανάλυση εμπλουτισμό

GSEA χρησιμοποιηθεί 10000 μεταθέσεις, σταθμισμένη βαθμολογία εμπλουτισμό και προ-κατάταξης των γονιδίων [34]. Τόσο σημασία διαφορικής έκφρασης σύμφωνα με DESeq2 και διπλώστε-διαφορά μεταξύ των δύο όρων χρησιμοποιήθηκαν για να κατατάξουν τα γονίδια [35] (εξίσωση 3).

Εξίσωση 3

Όταν φ

i είναι η log2 πολλαπλή μεταβολή και

pv

i

είναι η τιμή p για γονιδιακή

i

.

ο Καρκίνος Γονιδιώματος Atlas (TCGA) GSEA.

Κλινικές και RNA-επόμενα δεδομένα V2 για Νεφρού Νεφρική Clear Καρκίνωμα (KIRC) ασθενείς (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [6] έχουν συγκεντρωθεί. Ασθενείς με ελλείποντα κλινικά δεδομένα ή πολλαπλές σειρές δεδομένων RNA-επόμενα αποκλείστηκαν. Κανονικοποιημένη μετρήσεις mRNA χρησιμοποιήθηκαν ως παρέχονται. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες χρησιμοποιώντας ένα προγνωστικό σκορ, προσθέτοντας 1 για κάθε ένα από? ηλικίας άνω των 60 ετών, παθολογικό στάδιο 3 ή 4, η παρουσία της μετάστασης, ή ασθενής απεβίωσε. ασθενείς καλής πρόγνωσης σημείωσε 0 ή 1 και κακή πρόγνωση των ασθενών σκόραρε 2, 3 ή 4. Η διαφορική έκφραση κάθε γονιδίου μεταξύ των ομάδων των ασθενών εκτιμήθηκε από τον Test Λόγος Κίνδυνος για την αρνητική διωνυμική εξοπλισμένα μοντέλα που χρησιμοποιούν glm.nb στο R (3.1.1 ). Γονίδια κατατάχθηκαν για GSEA βασίζεται σε συνδυασμό σημασία και διπλώστε αλλαγής όπως παραπάνω.

Ασθένεια σχολιασμού.

βιβλιοδεσίας εμπλουτισμό ιστοσελίδα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας -λογ10 της διωνυμικό τεστ FDR (Q-value) από ΜΕΓΑΛΗ (περιοχές του γονιδιώματος Εμπλουτισμός σχολιασμοί εργαλείου [36]) 2.0.2. υποτύπων του καρκίνου χωρίς εμπλουτισμό είτε σε τσιπ επόμενα σύνολο δεδομένων αφαιρέθηκαν.

Βιβλιοδεσία Gene Predictor.

Τα γονίδια μέσα σε 10 kb των sites με τουλάχιστον 3-πλάσια διαφορά μεταξύ των HIF-1α και HIF -2α δεσμευτική επιλέχθηκαν για να σχεδιάσει ένα προγνωστικό γονίδιο χρησιμοποιώντας Ανάλυση Στοιχείο Εποπτευόμενοι Αρχή (SPCA) [37,38]. Κατ ‘αρχάς, τα γονίδια HIF-δεσμευτική επίδειξη μονοπαραγοντική σημασία? Επιλέχθηκαν στην πρόβλεψη πρόγνωση του ασθενούς (Cox αναλογικό μοντέλο κινδύνου) (p & lt 0,05). Για κάθε σετ γονιδίων (εκείνων δεσμευτική εκ νέου εισήγαγε HIF-1α ή υπερεκφράζεται HIF-2α) Singular Value Decomposition (SVD) σε όλες τις ασθενείς TCGA χρησιμοποιήθηκε για να εκχωρήσετε τα βάρη γονίδιο [37,38]. Κάθε προγνωστικός γονίδιο ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας «άδεια-one-out» διασταυρωμένης επικύρωσης, χρησιμοποιώντας 414 ασθενείς σε μια στιγμή για να δημιουργηθεί το γονίδιο προγνωστικός και, στη συνέχεια, να προβλέψει την επιβίωση της κάθε αριστερά-out ασθενή. Η τελική αναλογία σημασία και την επικινδυνότητα του προγνωστικό παράγοντα κινδύνου του ασθενούς αξιολογήθηκε παρόμοια με μονοπαραγοντική ανάλυση.

Αποτελέσματα

Πρώτον, να καθορίσει τις συγκεκριμένες δραστηριότητες HIF ισομορφή που συνδέονται με αντικρουόμενες επιδράσεις στην ανάπτυξη των CCRC προερχόμενο VHL ελαττωματικού 786-0 κύτταρα, αίμα ή τα κύτταρα μολύνθηκαν με ιούς που εκφράζουν κενό φορέα (VA), άγριου τύπου HIF-1α, ή άγριου τύπου HIF-2α, και παν-γονιδιωματική μοτίβα του HIF-δεσμευτικών και γονίδιο έκφραση αναλύθηκαν με τσιπ seq και RNA-seq. HIF-1α και HIF-2α λοιμώξεις επιτευχθεί σχεδόν ίσα επίπεδα mRNA που ήταν περίπου 10 φορές υψηλότερη από το ενδογενές επίπεδο mRNA HIF-2α (S1A Εικ). Ομοίως, τα επίπεδα της πρωτεΐνης HIF-2α ήταν περίπου 8 φορές υψηλότερη στον HIF-2α μολυσμένα κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, ενώ HIF-1α επίπεδα πρωτεΐνης 15-20-φορές υψηλότερη σε HIF-1α μολυσμένα κύτταρα σε σχέση με ένα άλλο κύτταρο CCRC γραμμή (RCC4), η οποία εκφράζει την πλήρη μήκους HIF-1α (S1B σχήμα). Στα κύτταρα ελέγχου, εντοπίστηκαν συνολικά 1719 κορυφών σύνδεση ενδογενούς HIF-2α. Όπως ήταν αναμενόμενο, αυτές οι περιοχές παρουσιάζουν υψηλό επίπεδο αντιστοιχίας με το σήμα HIF-1β, σύμφωνα με δέσμευση ενός HIF-2α /1β ετεροδιμερές (S2 σχήμα).

RNA-επόμενα ανάλυσή μας επιβεβαιώνει προηγούμενα ευρήματα [15] ότι, ενώ 786-0 κύτταρα δεν εκφράζουν άγριου τύπου HIF-1α, αυτοί εκφράζουν αρκετές κολοβωμένη και /ή σύντηξη μεταγραφές περιλαμβάνει HIF-1α εξόνια 1-9, αλλά όχι περισσότερο απομακρυσμένο αλληλουχίες (S3 Εικ), και προβλέπεται να είναι ανίκανη να κωδικοποιεί ένα μεταγραφικά ενεργή HIF-1α. Re-έκφραση της πλήρους μήκους άγριου τύπου HIF-1α σε 786-0 κύτταρα έχει αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη ως ξενομοσχεύματα όγκου σε ποντίκια. Ως εκ τούτου, άρχισε με την εξέταση παν-γονιδιωματική μοτίβα δέσμευσης DNA για HIF-1α, HIF-1β και HIF-2α σε τέτοια κύτταρα, και σε σύγκριση με αυτά του ελέγχου 786-0 κύτταρα.

επανέκφραση του HIF- 1α δεν ανταγωνίζεται την σύνδεση του HIF-2α

Από HIF-1α και HIF-2α και τα δύο διμερή με τον HIF-1β, και να αναγνωρίσουμε μια παρόμοια συναινετική αλληλουχία DNA, αλλά έχει αντίθετα αποτελέσματα στην ανάπτυξη ξενομοσχεύματος όγκου σε 786-0, θεωρήσαμε πρώτα τη δυνατότητα που εκ νέου εξέφρασε HIF-1α μπορεί να ανταγωνίζεται HIF-2α DNA-δέσμευσης, είτε μέσω άμεσης ανταγωνισμός για θέσεις σύνδεσης ή μέσω του ανταγωνισμού για HIF-1β. Κάπως εκπληκτικά, η ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο αποκάλυψε ότι η δέσμευση HIF-2α επηρεάστηκε ελάχιστα από την εκ νέου έκφραση του HIF-1α (Εικόνα 1Α, συγκρίνετε Ι και III). Σε συμφωνία με αυτό, ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) της πρόσδεσης σε κύτταρα εκ νέου εκφράζουν HIF-1α HIF-2α επέδειξε ισχυρή συν-διακύμανση με δεσμευτικές HIF-2α σε κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 1Β, σύγκριση διανύσματα HIF-2α (VA) και HIF -2α (1αRE)). Αυτές οι αναλύσεις δείχνουν ότι η σύνδεση HIF-2α είναι σε μεγάλο βαθμό ανεπηρέαστη από HIF-1α επανέκφραση. Για να ελεγχθεί αυτό περισσότερο ποσοτικά, συγκρίναμε την σχετική ισχύ του HIF-2 σήματα δεσμευτικός νέου εκφράζουν, έναντι κύτταρα ελέγχου HIF-1α, κατά μήκος των θέσεων σύνδεσης 1719 ενδογενούς HIF-2α προσδιορίζονται στα κύτταρα ελέγχου. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ένα σφιχτό συσχέτιση με επίκεντρο μετοχών σύνδεσης στις δύο κυτταρικές σειρές, τόσο για δέσμευση και για δέσμευση HIF-1β (S4 Εικ) HIF-2α. Έτσι, κάτω από αυτές τις συνθήκες, ο HIF-1α επανέκφραση δεν φαίνεται να παγκόσμιο ανταγωνίζεται HIF-2α διαταράσσοντας δεσμευτική HIF-2α, είτε μέσω άμεσης ανταγωνισμός για τόπους, ή με ανταγωνιστικές HIF-1β μακριά από HIF-2α δεσμευτική.

πρόσδεσης (Α) HIF-1α στα κύτταρα που εκφράζουν εκ νέου HIF-1α ταυτοποιήθηκαν με αιχμή καλούντος και κατατάσσονται στον κατακόρυφο άξονα ανάλογα με το σήμα έντασης. χάρτες θερμότητας από αυτές τις περιοχές (± 5kb στον οριζόντιο άξονα) που δείχνει τσιπ seq πυκνότητα ανάγνωσης για τις υποδεικνυόμενες υπομονάδες HIF δημιουργήθηκαν τόσο για τα κύτταρα ελέγχου (i, ii) και οι HIF-1α νέου κυττάρων που εκφράζουν με HIF-1α επαν εισήχθη (III-V). Το πρότυπο της πρόσδεσης HIF-2α επηρεάζεται ελάχιστα από την εκ νέου έκφραση του πλήρους μήκους ΗΙΡ-1α (σύγκρινε Ι και III). Θέσεις πρόσδεσης εκ νέου εκφράζεται HIF-1α είναι σε μεγάλο βαθμό συν-καταλαμβάνεται από HIF-1β (σύγκρινε IV και V). (Β) Biplot δείχνει Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA) των τσιπ επόμενα ένταση του σήματος (τιμές RPKM) και για τις δύο ατομικές θέσεις πρόσδεσης (τελείες) και HIF-υπομονάδες (φορείς) σε όλες τις περιοχές του HIF-δεσμευτική εντοπίζονται στα κύτταρα ελέγχου και HIF- 1α εκ νέου εκφράζοντα κύτταρα. Οι θέσεις πρόσδεσης ενδογενούς HIF-2α σε κύτταρα ελέγχου που απεικονίζεται στο μπλε, ενώ οι θέσεις πρόσδεσης εκ νέου εκφράζεται HIF-1α σε κόκκινο χρώμα, οι θέσεις σύνδεσης τόσο χρωματισμένα μωβ και οι υπόλοιπες θέσεις δεικνύονται με γκρι χρώμα. PCA για κάθε υπομονάδα παρουσιάζει υψηλή συν-διακύμανση μεταξύ HIF-2α δεσμευτικός ως προς όλα τα κύτταρα ελέγχου και στα κύτταρα εκ νέου εκφράζουν HIF-1α (συγκρίνετε HIF2α (VA) και (HIF2α (1αRE)). Αυτό δείχνει μόνο την ελάχιστη αλλαγή στην HIF -2α δεσμευτικός ως συνέπεια της HIF-1α επανέκφραση. Αντιστρόφως, ο HIF-1β αλλαγές διάνυσμα δραματικά με HIF-1α επανέκφραση (σύγκρινε HIF1β (VA) με HIF1β (1αRE)) και ευθυγραμμίζει στενά με τον φορέα για εκ νέου εξέφρασε HIF-1α (HIF1α (1αRE)). Η επιμέρους τόπους στα κύτταρα εκ νέου εκφράζουν ελέγχου και HIF-1α (μπλε και κόκκινες κουκκίδες) ευθυγραμμίζονται στενά με τις αντίστοιχες των φορέων τους PCA δεσμευτική. (Γ) Ιστόγραμμα της απόστασης πλησιέστερο σημείο έναρξης της μεταγραφής (TSS) για HIF-1α sites στα κύτταρα δέσμευσης εκ νέου την έκφραση του HIF-1α. (Δ) HIF-1α sites στα κύτταρα εκ νέου εκφράζουν δέσμευσης κατηγοριοποιούνται ανάλογα με την κατηγορία (Ensemble) του πλησιέστερου γονιδίου. η σχετική συχνότητα της κάθε κατηγορίας είναι παράσταση από γράφημα πίτας. (Ε) ανάλυση Gene σύνολο εμπλουτισμού (GSEA) για το σύνολο των γονιδίων πλησιέστερο προς HIF-1α θέσεις δέσμευσης όταν τα γονίδια κατατάσσονται σύμφωνα με πάσο-αλλαγής και η σημασία στην έκφραση mRNA μετά την εκ νέου -έκφραση HIF-1α (οριζόντιος άξονας).

Η

εκτεταμένη δέσμευση του νέου εξέφρασε HIF-1α σε νέες λειτουργικές περιοχές

σε αντίθεση με περιορισμένες επιπτώσεις στις υπάρχουσες HIF-2 δέσμευσης , η εκ νέου έκφραση του HIF-1α οδήγησε σε εκτεταμένη νέων δεσμευτικών απέναντι στο γονιδίωμα, με ειδικό σήμα HIF-1α εντοπιστεί σε 5.147 θέσεις. Marked συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ HIF-1α και δεσμευτική σε αυτά τα κύτταρα που εκφράζουν εκ νέου HIF-1α-1β HIF (Σχήμα 1Α, συγκρίνετε IV και V). Σύμφωνα με αυτό, η PCA επιβεβαίωσε την έντονη συσχέτιση ανάμεσα HIF-1α και HIF-1β στα κύτταρα εκ νέου εκφράζουν HIF-1α που δείχνει ότι αυτές οι περιοχές είναι σε μεγάλο βαθμό διαφορετικές από εκείνες που δεσμεύουν την ενδογενή HIF-2α (Σχήμα 1Β, συγκρίνετε φορείς HIF-1α ( 1αRE) και HIF-1β (1αRE) και την αντίθεση με HIF-2α (VA) και HIF-1β (VA)). Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι μετά την εκ νέου έκφραση του HIF-1α του δεσμεύεται σε ένα μεγάλο αριθμό θέσεων διακριτή από ενδογενών θέσεων HIF-2α, πιθανότατα ως HIF-1α /HIF-1β ετεροδιμερές. Επιπλέον, οι συνολικές HIF-1β χρωματίνης σήματος ανοσοκαταβύθιση (αριθμός διαβάζει χαρτογράφησης σε περιοχές αιχμής) αυξήθηκε περίπου 2-3 ​​φορές μετά επανέκφραση του HIF-1α (βλέπε επίσης Εικ S5). Αυτό υποδηλώνει ότι HIF-1β πρωτεΐνη αφθονία δεν είναι περιοριστικό για την ενδογενή HIF δεσμευτικός ως προς όλα 786-0 κύτταρα VHL-ελαττωματικό, και ότι επιπλέον HIF-1β μπορούν να προσληφθούν σε θέσεις δέσμευσης του DNA μετά από αυξημένη έκφραση του συντρόφου διμερισμού.

Ανάλυση της σύνδεσης HIF-1α έδειξε ότι παν-γονιδιωματική διανομή της ήταν εντυπωσιακά μη-τυχαία, είναι ισχυρά εμπλουτισμένο κοντά σε συγκεκριμένες κατηγορίες γονιδίου προαγωγό (Σχήμα 1 C και 1 D) και σημαντική ομοιότητα HIF-1α-συγκεκριμένα μοτίβα της πρόσδεσης σε άλλες τύπους κυττάρων [10,20,22,39]. Σχολιασμός των υποκινητών των HIF-1α «πλησιέστερου γείτονα», σύμφωνα με την κατηγορία μεταγραφής, έδειξε ότι το 68% συνδέονται με γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, με το υπόλοιπο να σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με το μεγάλο μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs) και αντινόημα RNAs (εικ 1D )? αναλογίες που είναι παρόμοιες με αυτές που αναφέρθηκαν για HIF-1α σε MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού [39].

επόμενο επεδίωξε να καθορίσει τις λειτουργικές επιδράσεις της νέας αυτής δεσμεύει έκφραση γονιδίου HIF-1α. γονιδιακή έκφραση Pan-γονιδιωματικής είχε περίγραμμα σε κύτταρα εκ νέου εκφράζουν ελέγχου και HIF-1α από την RNA-seq. Γονίδια κατατάχθηκαν σύμφωνα με έναν συνδυασμό φορές, αλλαγή στο επίπεδο της μεταγραφής μετά από την εκ νέου έκφραση του HIF-1α και η σημασία της αλλαγής αυτής [35]. Χρησιμοποιώντας αυτή την κατάταξη, η γονιδιακή ανάλυση σετ εμπλουτισμού (GSEA) [34] του πλησιέστερου γονιδίου σε κάθε θέση δέσμευσης του HIF-1α αποδειχθεί μια ιδιαίτερα σημαντική (p & lt? 0.001) συσχέτιση μεταξύ της HIF-1α δέσμευσης και θετική, αλλά όχι αρνητική, ρύθμιση αυτών των μεταγραφές (Σχήμα 1 Ε). Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενα ευρήματα που HIF δρα κυρίως ως ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής [10,19]. Αναφέρει, επίσης, ότι η νέα δεσμευτική HIF-1α είναι λειτουργικό, και έχει άμεση και σε μεγάλο βαθμό θετικά αποτελέσματα για την έκφραση σε όλη μεγάλο αριθμό γονιδίων.

Σε αντίθεση, παρατηρήσαμε λίγες επιδράσεις του HIF-1α επανέκφραση σε μεταγραφή επίπεδα (πλησιέστερου γείτονα) γονίδια δέσμευσης του HIF-2α. GSEA επέδειξε μια θετική, αλλά μη σημαντική (ρ = 0,15) επίδραση του HIF-1α επανέκφραση στην έκφραση των γονιδίων HIF-2α δέσμευσης (S6 Σχήμα), πιθανώς ως άμεσο αποτέλεσμα του HIF-1α σύνδεσης προς ορισμένα από αυτά τοποθεσίες (Σχήμα 3C). Σημαντικά, δεν υπήρξε ένδειξη της μεγάλης κλίμακας κάτω ρύθμιση των γονιδίων δέσμευσης HIF-2α (δηλαδή χωρίς τον εμπλουτισμό των γονιδίων μεταξύ των μειωτικά γονίδια δεσμευτικός HIF-2α) ως συνέπεια της HIF-1α επανέκφραση σε 786-O κύτταρα. Αυτό επιβεβαιώνει τη διαπίστωση ότι εκ νέου εξέφρασε HIF-1α δεν ανταγωνίζεται σημαντικά HIF-2α δραστηριότητα σε ολόκληρη την γονιδιώματος.

Η υπερέκφραση του HIF-2α περαιτέρω ενεργοποιεί ενδογενείς στόχους της

Από την υπερέκφραση του HIF- 2α σε 786-O κύτταρα έχει το αντίθετο αποτέλεσμα επί της ανάπτυξης όγκου ξενομοσχεύματος για την εκ νέου έκφραση του άγριου-τύπου HIF-1α [11], εξετάσαμε έπειτα ως αποτέλεσμα την αύξηση HIF-2α επίπεδα επί HIF δεσμευτικές και γονιδιακή έκφραση. Επιδιώξαμε πρώτα να διακρίνει αν η σύνδεση του HIF-2α σε ελαττωματικά 786-Ο κύτταρα VHL είναι κορεσμένη ή αν η υπερέκφραση του HIF-2α θα αυξήσει δεσμευτική σε περιοχές που έχουν ήδη καταληφθεί στα κύτταρα ελέγχου. Για να ελεγχθεί αυτό, συσχετίζεται τη δύναμη των σημάτων πρόσδεσης HIF-2α σε κύτταρα που υπερεκφράζουν επιμολυσμένα HIF-2α με ότι στα κύτταρα ελέγχου. Αυτό αποκάλυψε μια αύξηση στις δύο σήματα HIF-2α και τα σήματα HIF-1β στην πλειονότητα των θέσεων σύνδεσης ενδογενούς HIF-2α εξής HIF-2α υπερέκφραση (S7 Σχήμα) υποδεικνύοντας ότι τα ενδογενή επίπεδα του HIF-2α σε 786-0 κύτταρα δεν είναι επαρκείς να φορτώσει πλήρως αυτές HIF-2α θέσεις δέσμευσης.

Εκτεταμένη μη κανονική σύνδεση του υπερεκφράζεται HIF-2α

Αξίζει να σημειωθεί, ωστόσο, παν-γονιδιωματική ανάλυση αποκάλυψε συνολικά θέσεις πρόσδεσης 5283 διακριτών HIF-2α στα κύτταρα 786-0 που υπερεκφράζουν HIF-2α. Αυτές οι περιοχές περιλαμβάνουν πολλές από εκείνους που καταλαμβάνεται από ενδογενή HIF-2α. Σε αντίθεση με τα πορίσματα που προκύπτουν μετά την εκ νέου έκφραση του HIF-1α, ανάλυση χάρτη θερμότητα του HIF-2α και δεσμευτική HIF-1β έδειξε ότι πολλές από αυτές τις περιοχές καταλαμβάνονται αποκλειστικά από HIF-2α, χωρίς HIF-1β (Σχήμα 2Α, συγκρίνετε iii και iv). Σύμφωνη με αυτό, η ανάλυση PCA αποκάλυψε ότι διαμολυσμένα HIF-2α και HIF-1β δέσμευσης συν-ποικίλουν λιγότερο εκτεταμένα σε κύτταρα που υπερεκφράζουν επιμολυσμένα HIF-2α σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2Β).

(Α) HIF- θέσεις πρόσδεσης 2α στην HIF-2α κύτταρα που υπερεκφράζουν ταυτοποιήθηκαν με αιχμή καλούντος και κατατάσσονται στον κατακόρυφο άξονα ανάλογα με το σήμα έντασης. χάρτες θερμότητας από αυτές τις περιοχές (± 5kb στον οριζόντιο άξονα) που δείχνει τσιπ seq πυκνότητα ανάγνωσης για τις υποδεικνυόμενες υπομονάδες HIF δημιουργήθηκαν τόσο για τα κύτταρα ελέγχου (I, II) και τα κύτταρα με HIF-2α υπερεκφράζεται (III, IV). Σε αντίθεση με την εκ νέου εκφράζεται HIF-1α, υπερεκφράζεται HIF-2α προσδένεται σε ένα μεγάλο αριθμό θέσεων (σύγκρινε Ι και III), χωρίς HIF-1β (σύγκρινε III και IV) και έχει μικρή επίδραση στην κατανομή του HIF-1β ( συγκρίνουν II και IV). (Β) Biplot δείχνει Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA) των τσιπ επόμενα ένταση του σήματος (τιμές RPKM) και για τις δύο ατομικές θέσεις πρόσδεσης (τελείες) και HIF-υπομονάδες (φορείς) σε όλες τις περιοχές του HIF-δεσμευτική εντοπίζονται στα κύτταρα ελέγχου και HIF- 2α υπερεκφράζουν κύτταρα. Οι θέσεις πρόσδεσης ενδογενούς HIF-2α σε κύτταρα ελέγχου που απεικονίζεται στο μπλε Ενώ οι τόποι πρόσδεσης εκ νέου εκφράζονται HIF-1α σε κόκκινο χρώμα, θέσεις δέσμευσης και οι δύο είναι χρωματισμένα μωβ και τα υπόλοιπες θέσεις χρωματισμένα γκρι. PCA για υπομονάδες HIF δείχνει ότι HIF-2α και HIF-1β συν-ποικίλουν πιο στενά στα κύτταρα ελέγχου (συγκρίνετε HIF2α (VA) και HIF1β (VA)) από ό, τι στα κύτταρα που υπερεκφράζουν (συγκρίνετε HIF2α (2αOE) και HIF1β (2αOE) ). (Γ) Ιστόγραμμα της απόστασης από το πλησιέστερο σημείο έναρξης της μεταγραφής (TSS) για τις περιοχές σε κύτταρα που υπερεκφράζουν HIF-2α δεσμευτική HIF-2α. (D) HIF-2α sites στα κύτταρα που υπερεκφράζουν HIF-2α δέσμευσης κατηγοριοποιούνται ανάλογα με την κατηγορία (Ensemble) του πλησιέστερου γονιδίου. Η σχετική συχνότητα κάθε κατηγορίας παρουσιάζεται με γράφημα πίτας. ανάλυση Gene σετ εμπλουτισμού (GSEA) για το σύνολο των γονιδίων πλησιέστερο στο (Ε) θέσεις πρόσδεσης HIF-2α στα κύτταρα ελέγχου και (F) που χαρακτηρίστηκαν πρόσφατα θέσεις στα κύτταρα που υπερεκφράζουν δεσμευτικός HIF-2α, όταν τα γονίδια κατατάσσονται σύμφωνα με fold- αλλαγή και σημασία στην έκφραση mRNA μετά υπερέκφραση του HIF-2α (οριζόντιος άξονας).

η

Όπως με δέσμευση στα κύτταρα του νέου εκφράζουν ΗΙΡ-1α, η κατανομή των θέσεων σύνδεσης επιμολύνθηκαν HIF-2α ήταν εντυπωσιακά μη Ομοιόμορφοι απέναντι του γονιδιώματος (Σχ 2C και 2D). Είναι ενδιαφέρον ότι, παρά τη μεγάλη αύξηση του αριθμού των τόπων που προσαρμόζονται σε μοτίβο παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε για ενδογενή HIF-2α και στις δύο αυτές (S8 Σχήμα) και μη CCRC κύτταρα (MCF7) [10,39], αλλά διακριτή από εκείνη για HIF-1α. Σε αντίθεση με HIF-1α, η κατανομή ήταν περισσότερο υποκινητή-άπω (Εικ 2C). Επιπλέον, όπως με τα ενδογενή μοτίβα πρόσδεσης HIF-2α, το σχολιασμό των γονιδίων «πλησιέστερου γείτονα» αποκάλυψε ότι ένα σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό ήταν στο μη-κωδικοποίησης γονιδιακούς τόπους, από ό, τι παρατηρήθηκε για την εκ νέου εισάγονται ή ενδογενή HIF-1α (Εικόνα 2D). Αυτές οι διαφορές μεταξύ των ισομορφών HIF-α, οι οποίες παρατηρήθηκαν ανεξάρτητα από το επίπεδο έκφρασης κυτταρικού τύπου ή του αριθμού των τόπων δεσμεύεται, υποδηλώνουν ότι η ικανότητα να αναγνωρίζει ενισχυτές προαγωγού-μακρινό στο μη-κωδικοποίησης γονιδιακούς τόπους έναντι sites εγγύς υποκινητής είναι μια έμφυτη ιδιότητα του HIF- α ισομορφών.

Τέλος, επιδιώξαμε να προσδιορίσει εάν η αυξημένη φόρτωση των υπαρχόντων θέσεων πρόσδεσης HIF-2α, ή σύνδεση του HIF-2α σε πρόσφατα ανιχνεύθηκε θέσεις, ή και τα δύο, σχετίζεται με λειτουργικές επιδράσεις στην γονιδιακή έκφραση. Χρησιμοποιήσαμε GSEA να δοκιμαστεί εμπλουτισμό των τόπων HIF-δέσμευσης (γονίδια πλησιέστερου γείτονα) μεταξύ των γονιδίων των οποίων η έκφραση άλλαξε με HIF-2α υπερέκφραση (όπως μετράται από την RNA-seq). Πραγματοποιήσαμε αυτή την ανάλυση και για τις δύο θέσεις δέσμευσης που καταλαμβάνεται από ενδογενή HIF-2α, και αυτές που πρόσφατα παρατηρήθηκε μετά από HIF-2α υπερέκφραση. Μια ένωση με θετική, αλλά όχι αρνητικά, παρατηρήθηκε επιδράσεις στην γονιδιακή έκφραση και για τις δύο ομάδες δέσμευσης loci (Σχ 2Ε και 2F). Έτσι, συστατική ενεργοποίηση του HIF-2α σε 786-0 κύτταρα είναι υπομέγιστη και την αύξηση της HIF-2α οδηγεί σε δύο ποσοτικές και ποιοτικές επιπτώσεις στην έκφραση του γονιδίου στόχου HIF.

Είναι ενδιαφέρον, στενή επιθεώρηση των φαινομενικά νέων θέσεων πρόσδεσης συχνά αποκάλυψε χαμηλά επίπεδα των HIF δέσμευσης σε αυτές τις θέσεις στα κύτταρα ελέγχου, τα οποία ήταν κάτω από τα όρια για τον προσδιορισμό των σημαντικών δεσμευτικές, αλλά πάνω απ ‘αυτές που παρατηρούνται σε μια σειρά από περιοχές ελέγχου (S9A σχήμα). Αυτό υποδηλώνει ότι τα σήματα αυτά είναι στην πραγματικότητα «πραγματική» και αντικατοπτρίζουν ανομοιόμορφη φόρτωση των πιθανών θέσεων δέσμευσης του HIF (S9B σχήμα).

Ανάλυση του HIF-2α και HIF-1α μοτίβα πρόσδεσης

Από HIF -1 και HIF-2 αναφέρεται ότι αναγνωρίζουν μια αλληλουχία πρόσδεσης πανομοιότυπη πυρήνα του DNA [10], δεν είναι σαφές γιατί σύνδεση του HIF-1α και HIF-2α κατανέμεται τόσο διαφορετικά. Για να αντιμετωπιστεί αυτό ξεκινήσαμε με την ανάλυση των ανοσοκαταβυθίζονται ακολουθίες για τον παράγοντα μεταγραφής μοτίβα χρησιμοποιώντας MEME-chip δεσμευτική. Όπως ήταν αναμενόμενο, η κανονική HRE μοτίβο (Jaspar /MA0259.1) [40] εμπλουτίστηκε σε όλα τα σύνολα των θέσεων σύνδεσης? εκείνοι που καταλαμβάνεται από ενδογενή HIF-2α, υπερεκφράζεται HIF-2α και επανα-εκφράζεται HIF-1α και εμπλουτισμός συσχετίστηκε θετικά με τη δύναμη του HIF-1β σήματος (σχήμα 3Α και 3Β και Σχ S8C, μπλε γραμμή). Το δεύτερο πιο εμπλουτισμένο μοτίβο ήταν ένα AP-1 (TRE) μοτίβο σύνδεσης (Jaspar /MA0491.1) [40]. Είναι ενδιαφέρον, αυτό εμπλουτισμός ήταν αρκετά διαφορετικά κατανεμημένα μεταξύ HIF-1α και τόποι δέσμευσης του HIF-2α. Ισχυρή εμπλουτισμός παρατηρήθηκε σε αλληλουχίες πρόσδεσης υπερεκφράζεται HIF-2α (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, σε έντονη αντίθεση με το μοτίβο HRE, στο σύνολο δέσμευσης για υπερεκφράζεται HIF-2α, ο εμπλουτισμός του ΑΡ-1 μοτίβο ήταν αντιστρόφως συσχετίζεται με τη δύναμη της δέσμευσης HIF-1β (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, το σύνολο των τόπων πρόσδεσης HIF-1α, το μοτίβο δέσμευσης ΑΡ-1 ήταν σημαντικά εξαντληθεί (Σχήμα 3Α). Συνολικά, η διαφορική κατανομή αυτού του ΑΡ-1 μοτίβο μεταξύ HIF-1α και τόπων πρόσδεσης HIF-2α ήταν πολύ σημαντική (ρ & lt? 10

-16).