Αφηρημένο

Ιστορικό

Ενισχυμένη εμπορίας λυσοσωμικής συνδέεται με μεταστατικό καρκίνο. Σε μια προσπάθεια να ανακαλύψουν τον καρκίνο σχετικές λυσοσωματικών πρωτεϊνών μοτέρ, συγκρίναμε τις των πρωτεϊνών λυσοσωμικού από τη γονική MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού με εκείνα από εξαιρετικά μεταστατικών κυττάρων MCF-7 που εκφράζουν μια δραστική μορφή του ErbB2 (ΔΝ-ErbB2).

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

μάζης ανάλυση φασματομετρίας προσδιορίζονται κινεσίνης πρωτεΐνη KIF5B βαριάς αλυσίδας ως το μόνο κινητήρα μικροσωληνίσκων που συνδέονται με τα λυσοσώματα στα κύτταρα MCF-7, και έκτοπη ΔΝ-ErbB2 ενισχυμένη λυσοσωμική ένωσή του. KIF5B συνδέονται με λυσοσώματα επίσης σε κύτταρα καρκινώματος τραχήλου HeLa όπως αναλύεται με υποκυτταρική κλασμάτωση. Η εξάντληση των KIF5B προκάλεσε περιφερειακές ομαδοποιήσεις λυσοσώματα ακολουθείται από λυσοσωμικές αποσταθεροποίηση, και θάνατο των κυττάρων σε κύτταρα HeLa. Οι λυσοσωμικές εξωκύττωση σε απόκριση σε βλάβη της πλασματικής μεμβράνης καθώς και ενδοκυττάρωση ρευστό φάση λειτουργούσε, ωστόσο, συνήθως σε αυτά τα κύτταρα. Αμφότερα τα κύτταρα HeLa και MCF-7 φάνηκε να εκφράζουν παρόμοια επίπεδα της ισομορφής KIF5B αλλά ο φαινότυπος θάνατος ήταν ασθενέστερη σε κύτταρα KIF5B-εξαντλημένο MCF-7. Παραδόξως, η εξάντληση KIF5B ανέστειλε την ραπαμυκίνη επαγόμενη συσσώρευση αυτοφαγοσώματα σε κύτταρα MCF-7. Στα κύτταρα KIF5B-εξαντλούνται οι αυτοφαγοσώματα σχηματιστεί και συσσωρευτεί σε στενή γειτνίαση με την συσκευή Golgi, ενώ στα κύτταρα ελέγχου εμφανίστηκαν ομοιόμορφα κατανεμημένα στο κυτταρόπλασμα.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα στοιχεία μας προσδιορίσει KIF5B ως καρκίνο σχετική λυσοσωμικής πρωτεΐνης κινητήρα με πρόσθετες λειτουργίες σε σχηματισμό autophagosome

Παράθεση:. Cardoso CMP, Groth-Pedersen L, Høyer-Hansen Μ, Kirkegaard Τ, Corcelle Ε, Andersen JS, et al. (2009) Η εξάντληση των κινε 5Β Επηρεάζει Λυσοσωμική Διανομής και Σταθερότητας και προκαλεί Peri-πυρηνική συσσώρευση των αυτοφαγοσώματα στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 4 (2): e4424. doi: 10.1371 /journal.pone.0004424

Επιμέλεια: Ανδρέας Bergmann, UT MD Anderson Cancer Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 του Νοεμβρίου του 2008? Αποδεκτές: 18 Δεκ 2008? Δημοσιεύθηκε: 10 Φεβρουαρίου 2009

Copyright: © 2009 Cardoso et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. CMP Cardoso ήταν ο αποδέκτης της επιχορήγησης από την πορτογαλική Ίδρυμα για την Επιστήμη και την Τεχνολογία (SFRH /BPD /14448/2003). Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τη δανική Αντικαρκινική Εταιρεία (MJ), η δανική Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών και Μελετών (MJ), το Ιατρικό Ερευνητικό Συμβούλιο της Δανίας (JN και MJ), η Meyer Ίδρυμα (MJ), η Μ.Ι. Ja; ¸rgensen και Gunnar Hansens Ίδρυμα (MJ), το Ίδρυμα Novo (MJ και MHH), το Ίδρυμα Vilhelm Pedersen (JN και MJ), το Ίδρυμα Προώθησης Έρευνας της Δανίας Καρκίνο (MJ) και η κοινοπραξία Ευρωπαϊκή Επιτροπή FP7 APO-SYS (MJ και ΚΑΕ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα λυσοσώματα είναι δυναμικές οργανίδια είναι δεσμευμένη σε μεμβράνη, που αντιπροσωπεύουν τον τελικό προορισμό για ενδοκυτταρικά, εκκριτική και αυτοφαγικά οδούς [1]. Η φυσιολογική σημασία των λυσοσωμάτων τονίζεται από έναν αριθμό ασθενειών που προκύπτουν από ατέλειες στο βιογένεση λυσοσωμική και λειτουργία [2]. Αντιθέτως, η ενισχυμένη σύνθεση, της διακίνησης και εξωκυτταρικό απελευθέρωση λυσοσωματικών πρωτεασών (καθεψινών), είναι σημαντικά χαρακτηριστικά της κακοήθειας και να συνδεθούν με την επεμβατική και μεταστατικό ικανότητα των καρκινικών κυττάρων [3], [4]. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι μεταβολές που σχετίζονται με λυσοσωμική αθανατοποίηση και τον μετασχηματισμό των κυττάρων του καρκίνου ευαισθητοποιούν επίσης τα καρκινικά κύτταρα σε προγραμματισμένο οδούς κυτταρικού θανάτου που περιλαμβάνουν διαπερατοποίηση της λυσοσωμικής μεμβράνης [5], [6]. Μόλις ενεργοποιηθεί, διαπερατοποίηση της λυσοσωμικής μεμβράνης σαν αποτέλεσμα την απελευθέρωση των καθεψινών και άλλων λυσοσωμικών υδρολασών στο κυτοσόλιο, όπου μπορούν να ενεργοποιήσουν την μιτοχονδριακή διαπερατοποίηση εξωτερικής μεμβράνης που ακολουθείται από κασπάση απόπτωση που διαμεσολαβείται [7], [8] ή μεσολαβούν κασπάσης-ανεξάρτητο προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο [9]. Έτσι, η αναστολή της λυσοσωμικής διακίνησης /εξωκύττωση εμφανίζεται ως υποσχόμενο στόχο για θεραπεία του καρκίνου. Δεν θα μόνο αναστέλλουν την εισβολή καθεψίνης μεσολάβηση αλλά επίσης εμποδίζει τη γενική διακίνηση και ενδεχομένως να οδηγήσει σε συσσώρευση των λυσοσώματα που προορίζονται για έκκριση και ως εκ τούτου περαιτέρω ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα σε λυσοσωματική οδούς κυτταρικού θανάτου. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από τα δεδομένα που δείχνουν ότι η βινκριστίνη, ένα μικροσωληνίσκους αποσταθεροποιούν αντικαρκινικό φάρμακο, όχι αναστέλλει μόνο λυσόσωμα διακίνησης αλλά επίσης επάγει μια ταχεία αύξηση του όγκου του διαμερίσματος λυσοσωματικής ακολουθούμενη από διαρροή λυσοσωματικές και καθεψίνη εξαρτώμενη κυτταρικό θάνατο [10] .

Επειδή τα φάρμακα που διαταράσσουν το δίκτυο των μικροσωληνίσκων show υψηλής γενικής τοξικότητας, έχουμε σκεφτεί ότι μια πιο συγκεκριμένη παρέμβαση με λυσοσώματα διακίνησης θα μπορούσε να οδηγήσει σε στρατηγικές για την καταπολέμηση του καρκίνου με λιγότερες παρενέργειες. Ως εκ τούτου, θα θέλαμε να προσδιορίσει και να χαρακτηρίσει τις πρωτεΐνες του κινητήρα σημαντικό για τις μεταφορές λυσοσώματα στα καρκινικά κύτταρα. Οι Motor πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας τον κυτταρικό σκελετό ως υπόστρωμα για την κίνηση χωρίζεται σε κινητήρες μυοσίνης που κινούνται κατά μήκος μικρονηματίων ακτίνης και κινητήρες κινεσίνης /δυνεΐνης που χρησιμοποιούν μικροσωληνίσκους μέσω της αλληλεπίδρασης με τουμπουλίνης για τη μετακίνηση τους [11]. Οι πρωτεΐνες Motor τροφοδοτείται από την υδρόλυση του ΑΤΡ και μετατρέπει τη χημική ενέργεια σε μηχανικό έργο που τους επιτρέπει να κινούνται φορτίου (κυστίδια, πρωτεΐνες και λιπίδια) σε μεγάλες αποστάσεις. Μικροσωληνίσκων ειδικές κινητήρες αποτελούνται από δύο βασικούς τύπους κινητήρων μικροσωληνίσκων:. Συν-άκρο κινητήρες και μείον-άκρο κινητήρες, ανάλογα με την κατεύθυνση στην οποία κινούνται κατά μήκος των νημάτων στο εσωτερικό του κυττάρου [12]

Η κολοβωμένη μορφή του ο υποδοχέας ErbB2 απαντάται συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο του μαστού και η έκφραση και η δραστικότητα του συσχετίζεται με αυξημένη διεισδυτικότητα, κινητικότητα και φτωχή πρόγνωση [13]. Κατά συνέπεια, η έκτοπη έκφραση της ΔΝ-ErbB2 σε MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού τα καθιστά ιδιαίτερα κινητό και επεμβατικές [14] (μη δημοσιευμένα παρατήρηση μας). Με αφορμή τη διαπίστωση ότι η ΔΝ-ErbB2 που προκαλείται από επεμβατικές φαινότυπο συνδέθηκε με αλλοιωμένη διακίνηση λυσοσωμικές και αρκετές φορές αύξηση στην έκφραση και τη δραστηριότητα των πρωτεασών λυσοσωμικής, επιλέξαμε αυτό το μοντέλο του συστήματος για να ψάξετε καρκίνο σχετικές λυσοσωμικών πρωτεϊνών κινητήρα. Εφαρμόσαμε μια ποσοτική πρωτεομική ανάλυση σχετικά καθαρίζεται λυσοσώματα από κύτταρα ΔΝ-ErbB2 MCF-7 και ελέγχου δείχνει ότι ορισμένα επίπεδα της πρωτεΐνης κινητήρα ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα παρακάτω ΔΝ-ErbB2 επαγωγής. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι ΔΝ-ErbB2 αύξησε την έκφραση του κινεσίνης 5Β (KIF5B), μια πρωτεΐνη με κινητήρα εμπλέκεται στην λυσοσωμική και μιτοχονδριακή μεταφορά [15], [16]. Σύμφωνα με αυτό, KIF5B mRNA έχει αναφερθεί να είναι up-ρυθμίζονται σε διάφορους τύπους ιστών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (GDS1479 ρεκόρ), προχωρημένο γαστρικό καρκίνο (GDS1210 ρεκόρ), ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (GDS2200 ρεκόρ), σποραδικές βασική-όπως του μαστού καρκίνο και τον καρκίνο του BRCA1 που σχετίζονται με μαστού (GDS2250 ρεκόρ) (στοιχεία που ελήφθησαν από το NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez? Gene Expression Omnibus). KIF5B είναι μια Ν-κινεσίνη (Plus-end κινητήρα) που ανήκουν στην υπερ οικογένεια του κινεσίνης-1 πρωτεΐνες μοριακού κινητήρα που μαζί με κυτταροπλασματική δυνεΐνης είναι υπεύθυνη για μικροσωληνίσκων εξαρτώμενη μεταφορά φορτίου σε ευκαρυωτικά κύτταρα [17]. Για να διευκρινιστεί ο ρόλος του KIF5B σε καρκινικά κύτταρα εξετάσαμε τη λειτουργία του σε διάφορες λυσοσωματικής οδούς συμπεριλαμβανομένης της οδού θανάτου κυττάρου λυσοσωμικής, την απόκριση επανασφράγισης μετά τη βλάβη της μεμβράνης πλάσματος (εξωκυττάρωση) και μακροαυτοφαγία.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπείες

MCF-7, κύτταρα HeLa και U2OS προέρχονται από ανθρώπινο καρκίνωμα του μαστού, καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας και οστεοσάρκωμα, respectivly. MCF-7-eGFP-LC3 κυτταρική γραμμή είναι ένας απλός κυτταρικός κλώνος των κυττάρων MCF-7 που εκφράζουν μια πρωτεΐνη σύντηξης που αποτελείται από ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (eGFP) και LC3 αρουραίου [18]. MCF-7-ΔNErbB2 και κυτταρικές σειρές MCF-7-PTRE είναι μόνο κύτταρο κλώνοι των MCF-7 που εκφράζουν τον διενεργοποιητή τετρακυκλίνης επιμολυσμένα με PTRE-ΔNErbB2 και PTRE, αντίστοιχα [14]. κύτταρα HeLa-LIMP1 ΕΟΡΡ είναι κύτταρα HeLa που εκφράζουν eGFP-tagged λυσόσωμα ενσωματωμένη μεμβράνη πρωτεΐνη-1 (Ι_ΙΜΡ-1) [19] (ευγενώς από τον Dr. J. Ρ Luzio, University of Cambridge). Τα καρκινικά κύτταρα και επιμολυσμένα παραλλαγές τους πολλαπλασιάστηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) συμπληρωμένο με 6% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FCS? Biological Industries) και πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Το μέσο της MCF-7-ΔNErbB2 και MCF-7-PTRE συμπληρώθηκε περαιτέρω με 5 μg /ml τετρακυκλίνη. Για να προκληθεί το ΔΝ-ErbB2 έκφραση, τετρακυκλίνη (5 μg /ml) απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν 5 φορές σε PBS πριν από την επίστρωση. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα αέρα σε 5% CO

2.

Ανάλυση του λυσοσώματος πρωτεϊνών που σχετίζονται με φασματομετρία μάζας χρησιμοποιώντας σταθερές επισήμανσης ισοτόπων με αμινοξέα σε κυτταρική καλλιέργεια (SILAC)

MCF-7-ΔNErbB2 και MCF-7-PTRE αναπτύχθηκαν στην παραγγελία συντίθεται RPMI 1640 είτε με κανονική λυσίνη 12C614N2 (Lys0) ή ισότοπο επισημασμένα L-λυσίνη 13C615N2 (Lys8) (Sigma-Isotec, St . Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 10% διαλυμένο βόειο εμβρυϊκό ορό (Invitrogen) για τουλάχιστον 5 κυτταρικές διαιρέσεις να ενσωματώσει πλήρως τα επισημασμένα αμινοξέα. Τα λυσοσώματα καθαρίστηκαν με σιδήρου-δεξτράνης (Fedex) κλασματοποίηση σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που δημοσιεύθηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, τα κύτταρα (80-90 × 10

6 συνολικά) προεπωάζεται με Fedex (8 ώρες) λύθηκαν μηχανικά σε έναν ομογενοποιητή dounce και το ελαφρό κλάσμα μεμβράνης φορτώθηκε σε στήλη MiniMachs που συνδέεται με ένα μαγνήτη (σύστημα MACS διαχωριστικό, Miltenyi Biotec). Τα λυσοσώματα παγιδευμένοι στη στήλη εκλούστηκαν σε σακχαρόζη ρυθμιστικό εκχύλισης (250 mM σακχαρόζη, 20 mM Hepes, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, και 1 mM Pefabloc, ρΗ 7.5) με την αφαίρεση η στήλη από το μαγνήτη και να καθαρίσουμε τα λυσοσώματα από ένα έμβολο. Τα λυσοσώματα διαλύθηκαν και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα 4-12% κλίση NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) και χρωματίζονται με Comassie Blue. φέτες πηκτής κόπηκαν σε μικρά τεμάχια και επωάστηκαν με 12,5 ng /μl θρυψίνη στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Τα προκύπτοντα πεπτίδια αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία (Agilent ΗΡ1100) σε συνδυασμό με διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC MS /MS) χρησιμοποιώντας γραμμικό μετασχηματισμού Fourier φασματόμετρο μάζας συντονισμού ιόντος κυκλοτρονίου ιόντων παγίδα (LTQ-FT-ICR, Thermo-Finnigan). Peak λίστα εξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα in-house αναπτύξει σενάρια (DTA-Supercharge), σε συνδυασμό για κάθε διαφάνειες τζελ, και χρησιμοποιείται για αναζητήσεις σε βάσεις δεδομένων πρωτεϊνών. Αυστηρές κριτήρια που απαιτούνται για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών στη Διεθνή Protein βάση δεδομένων δείκτη χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Mascot (Matrix Science): τουλάχιστον δύο ταιριάζουν πεπτίδια ανά πρωτεΐνη, μια μάζα ακρίβεια μέσα σε 3 ppm, ένα σκορ Mascot για μεμονωμένα πεπτίδια καλύτερα από 20, και ένα βαθμολογία δέλτα του καλύτερα από ό, 5. MS-Quant (https://msquant.sourceforge.net/), ένα in-house ανέπτυξε το πρόγραμμα λογισμικού που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό δείκτη αφθονίας πεπτίδιο και να αξιολογήσουν την ασφάλεια στην ταυτοποίηση πεπτιδίων.

siRNAs και επιμολύνσεις

Τρεις siRNAs σχεδιάστηκαν να στοχεύσουν KIF5B mRNA: 5′-CCAUCAUCAUACAAUGAGUCUGAAA-3 ‘(KIF5B-1), 5′-CGGCGACAAGUACAUCGCCAAGUUU-3′ (KIF5B-2), και 5’- CAUCUACCAGAAGGGAUCAAGACAA-3 ‘(KIF5B-3). Όλα τα siRNAs αγοράσθηκαν από την Invitrogen. Σε κάθε siRNA πειραματιστεί ένα δείγμα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με τον παράγοντα μορφομετατροπής μόνο και /ή ένα KIF5B αναντιστοιχία ολίγο, 5’-CGGAACACAUGGCUAAACCGGCUUU-3 ‘(ΜΜ), συμπεριλήφθηκαν. MCF-7 και HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με 25 ηΜ siRNA εφαρμογής Oligofectamine (Invitrogen) ως παράγοντα διαμόλυνσης.

Μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων και μικροσκοπική ανάλυση

Τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με την ικανότητά τους να να μειώσει το άλας τετραζολίου βρωμιούχου 3- (4,5-διμεθυλοθειαζολο-2-γ) -2,5-diphenyltetrasodiumbromide (ΜΤΤ? Sigma) σε ένα χρωστικής φορμαζάνης ανιχνεύσιμο με φασματοφωτομετρική ανάλυση σε αναγνώστη μικροπλάκας VersaMax (Molecular Devices Ltd., Wokingham, Ηνωμένο Kingdom) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. εικόνες αντίθεσης φάσης των κυτταρικών σειρών ελήφθησαν με ένα ανεστραμμένο της Olympus ΙΧ-70 μικροσκόπιο συνδεδεμένο με ένα Olympus ψηφιακή φωτογραφική μηχανή DP70. μικροσκοπία χρονικού διαστήματος έγινε με ένα μικροσκόπιο φθορισμού Carl Zeiss Axiovert 200M χρησιμοποιώντας το λογισμικό MetaMorph.

Ανάλυση της GFP-LC3 μετατόπιση

Autophagy προκλήθηκε με επώαση των κυττάρων MCF-7-LC3-eGFP με 2,5 μΜ ραπαμυκίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) για 24 ώρες. Το ποσοστό των κυττάρων με eGFP-LC3 μετατόπιση σε κουκκίδες (τουλάχιστον 100 κύτταρα /δείγμα) μετρήθηκε σε eGFP-LC3 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά σε 3,7% φορμαλδεΰδη και 0,19% πικρικού οξέος (ο /ο) εφαρμογή Zeiss Axiovert 100 Μ Συνεστιακό Laser μικροσκόπιο σάρωσης. Κύτταρα με ≥5 πράσινο του κυτταροπλάσματος κυστίδια θεωρήθηκαν θετικά.

Μέτρηση των δραστηριοτήτων του ενζύμου

κασπάσης-3-όπως (DEVD-AFC, Enxzyme Σύστημα Προϊόντων), κυστεΐνη καθεψίνη (zFR-AFC, Enzyme Σύστημα Products), όξινη φωσφατάση και SS

Ν-ακετυλο-

γλυκοζαμινιδάση (NAG) δραστηριότητες προσδιορίστηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6], [9]. Εν συντομία, το κυτταροπλασματικό κλάσμα εκχυλίζεται με 20-35 μg /ml διγιτονίνη και το συνολικό κυτταρικό κλάσμα με 200 μg /ml διγιτονίνη και το ποσοστό του κατάλληλου υδρόλυσης υποστρώματος V

max μετρήθηκε επί 20 λεπτά στους 30 ° C επί μία Spectramax Gemini φθορισμού (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) δραστηριότητα του κυτοσολίου καθορίζεται από ένα κιτ ανίχνευσης κυτταροτοξικότητας (Roche) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο.

ανάλυση ανοσοστυπώματος και ανοσοκυτταροχημεία

Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Πρωτογενή αντισώματα που εγείρονται έναντι KIF5B (SUK4 από Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), Πανεπιστήμιο της Αϊόβα) και ab5629 (από Abcam), λυσόσωμα σχετιζόμενη μεμβράνη πρωτεΐνη-2 (LAMP-2? Κλώνος H4B4 από DSHB), GRP75 (SPA825 από StressGene ,), καθεψίνη Β (Ab1 από Oncogene), p70 S6 κινάση 1 (p70

S6K1? # 9202) και phospo-P70

S6K1 (# 9206) (από κινητό Σηματοδότηση Technology), και αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής (GAPDH, Biogenesis, Poole, UK) που ακολουθείται από κατάλληλη συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα από ϋΑΚΟ Α /δ (Glostrup, Δανία).

για ανοσοκυτταροχημεία, κύτταρα σε καλυπτρίδες στερεώθηκαν χρησιμοποιώντας παγωμένη μεθανόλη για 10 λεπτά ή 3,7% φορμαλδεΰδη για 30 λεπτά στους 25 ° C. Τα κύτταρα χρωματίσθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα συμπεριλαμβανομένων των αντι αχινού ποντικού KIF5B (1:20? SUK4), ποντικού αντι-ανθρώπινου κυτοχρώματος

γ

(κλώνος 556432 σε 1: 350, BD PharMingen, San Diego, CA) , κατσίκα αντι-ανθρώπινο γ-τουμπουλίνης (SC-7396, Santa Cruz Biotechnology) και ποντικού αντι-ανθρώπινο LAMP-2 (1:100). Μετά την πλύση, τα δείγματα επωάστηκαν με το κατάλληλο Alexa Fluor-488- και Alexa- Fluor-546/594-συζευγμένο δευτερεύον αντισώματα (Molecular Probes). Ομοεστιακή εικόνες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Axiovert 100 Μ Συνεστιακό Laser Scanning μικροσκόπιο εφοδιασμένο με LSM 510 σύστημα (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.).

εκχύλιση RNA, σύνθεση cDNA και αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR)

το RNA συλλέχθηκε από καλλιέργεια κυττάρων με στήλες RNeasy (Qiagen) και cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε με την TaqMan RT Kit (Roche) χρησιμοποιώντας ολιγο- (dT)

16 εκκινητές. Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπες συνθήκες με τους ακόλουθους εκκινητές:

KIF1A-forw: GACACGCTGGTCTGAGATGA. KIF1A-rev: TGGCTTAGGCACTCCTCACT? KIF3A-forw: GACTATGCTGAGGCTGCAA. KIF3A-rev: TGTCTTTGGCCTTGCTTTC? KIF5A-forw: CAGCTTGACGACAAGGATGA. KIF5A-rev: GGTGTCCACTGACCTCCTGT? KIF5B-forw: GATGGATCGGAAGTGAGCAT. KIF5B-rev: ATCACGACCGTGTCTTCTCC? KIF5C-forw:. GCAACTGGAACAGGAGAAGC

KIF5C-rev: ACCTCACCCAAACACTCCAG. PBGD-forw: CATGTCTGGTAACGGCAATG? PBGD-rev: AGGGCATGTTCAAGCTCCTT. Πορφοχοληγενής απαμινάση (PBGD? Εισόδου PubMed BC000520) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος μαζί με το γονίδιο που μας ενδιαφέρει. Τα προϊόντα της PCR μεγέθους διαχωρισμένη σε -αγαρόζης γέλη 1,5% που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο, οπτικοποιήθηκε υπό υπεριώδες φως, φωτογραφήθηκε με τη χρήση φιλμ Polaroid.

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

Για τα κύτταρα κλασματοποίηση κλίσης πυκνότητας συγκεντρώθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό ομογενοποίησης (250 mM σακχαρόζη, 20 mM Hepes και 1 mM EDTA, ρΗ 7,4) και λύθηκαν σε έναν ομογενοποιητή dounce σε πάγο. Τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο στροβιλίστηκαν στα 3000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C και το σφαιρίδιο απορρίφθηκε. Το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε στα 17.000 g για 20 λεπτά στους 4 ° C. Iodixanol κλίσεις σχηματίστηκαν με διαδοχική προσθήκη 4, 10, 16 και 24% διαλύματα σε ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης στους 25 ° C για 1 ώρα, με αποτέλεσμα το σχηματισμό μιας συνεχούς κλίσης. Το τελικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης και φορτώθηκε σε μια συνεχή βαθμίδωση iodixanol 4-24% και φυγοκεντρήθηκε στις 20.000

g

σε ένα στροφέα SW41Ti (Beckman) για 17 ώρες στους 4 ° C. Κλίσεις διαχωρίστηκαν σε συνολικά είκοσι κλάσματα των 500 μΙ, που συλλέγεται από τον πυθμένα. Η πυκνότητα του κάθε κλάσματος προσδιορίστηκε μετρώντας OD στα 244 nm. Καθεψίνες Β /L,

N

-ακετυλγλυκοσαμινιδάση (NAG) και δραστηριότητες όξινη φωσφατάση μετρήθηκαν για κάθε κλάσμα μετά την προσθήκη του διγιτονίνης.

Ανάλυση της δραστηριότητας εξωκυττάρωση κατόπιν πλασματικής μεμβράνης τραυματισμό

τραυματισμό μεμβράνης με ηλεκτροδιάτρηση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε Hanks ισορροπημένο διάλυμα άλατος (HBSS) (Gibco, Invitrogen), υποβάλλονται σε ηλεκτροδιάτρηση στα 200 V με μεταβλητά επίπεδα της χωρητικότητας σε ένα 0,2-cm γονίδιο ηλεκτρόδιο Pulser κυψελίδα (Bio-Rad), και επωάστηκαν για 1 λεπτό στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-LAMP-1 (SC-20011, Santa Cruz Biotechnology) αντίσωμα σε πάγο για 30 λεπτά, πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με Alexa Fluor 488 δευτερογενή αντισώματα (Molecular Probes). Η κυτταρομετρία ροής επί 10.000 κύτταρα ανά δείγμα πραγματοποιήθηκε με FACS (Becton Dickinson) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson). Για τη μέτρηση ιονομυκίνη επαγόμενα κύτταρα δραστηριότητα εξωκύττωση επωάστηκαν σε HBSS που περιέχει 10 μΜ ιονομυκίνη (Sigma). Ένα καθεψίνης Β ειδικό ανιχνευτή, zfr-AMC (VWR International) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο σε μια τελική συγκέντρωση 100 μΜ σε χρόνο 0 και 10 λεπτά. Ο ρυθμός υδρόλυσης του υποστρώματος, όπως μετράται με την απελευθέρωση του AMC (μήκος κύματος διέγερσης, 400 nm? Μήκος κύματος εκπομπής, 489 nm). Στους 30 ° C σε ένα φθορόμετρο Spectramax Gemini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)

Αποτελέσματα

ΔNErbB2 αυξάνει το επίπεδο της KIF5B σε λυσοσώματα

p> κύτταρα καρκινώματος μαστού

(Α) Ανοσοκηλίδωση με λυσόσωμα ειδικό αντίσωμα LAMP-1 σε κύτταρα ελέγχου ΔΝ-ErbB2 και. (Β) RT-PCR ανάλυση δείχνει τα επίπεδα έκφρασης του mRNA διαφόρων Ν-κινεσίνες συμπεριλαμβανομένων KIF5A (349 bp), KIF5B (337 bp), KIF5C (320 bp), KIF3A (393 bp) και KIF1A (364 bp) σε H: HeLa, M: MCF-7 και U: κύτταρα U2OS. Οι ζώνες ενίσχυσης KIF υποδεικνύονται με βέλη. Το σπίτι διατήρησης γονιδίων ΡΒϋΟ (257 bp) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Γ) κλάσματα Φως μεμβράνης των κυττάρων HeLa διαχωρίστηκαν με υπερφυγοκέντρηση βαθμίδωσης iodixanol και τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του KIF5B, LAMP-2 (λυσοσώματα) και GRP75 (μιτοχόνδρια) έγιναν ορατά με ανοσοκηλίδωση. Τα επίπεδα ενζυματικής δραστικότητας της καθεψίνης Β /L, όξινο φωσφατάση και NAG μετρήθηκε σε όλα τα κλάσματα και υπηρέτησε ως δείκτες λυσοσωμικής? η γραμμικότητα του προφίλ κλίσης iodixanol προσδιορίστηκε μετρώντας OD στα 244 nm (κάτω διάγραμμα).

Η

(Α) Τα επίπεδα πρωτεΐνης του KIF5B, 48 ώρες μετά την εξάντληση με διάφορες συγκεντρώσεις siRNA (KIF5B-1 siRNA ) για HeLa και MCF-7? β-τουμπουλίνης υπηρέτησε ως εσωτερικός έλεγχος. Oligof: κύτταρα ελέγχου έλαβαν μόνο Oligofectamine. (Β) εικόνες αντίθεσης Αντιπροσωπευτικά φάση HeLa, MCF-7 και MCF-7-ΔΝ-ErbB2 κύτταρα, 72 ώρες μετά την αγωγή με ενδεικνυόμενη siRNAs. κύτταρα (C) HeLa είχαν εξαντληθεί για KIF5B ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με τον έλεγχο MM siRNA και μεταβολική δραστηριότητα προσδιορίζεται με μία δοκιμασία ΜΤΤ και ο θάνατος εκτιμήθηκε με προσδιορισμό απελευθέρωσης LDH (D). ΜΤΤ και LDH τιμές παρουσιάζονται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων. (Ε) κασπάση-3, όπως δραστικότητα και (F) κυτοσολικό δραστικότητα καθεψίνης σε κύτταρα HeLa μετά την εξάντληση KIF5B (72 ώρες) που μετράται με DEVDase και προσδιορισμούς ενζύμου zFRase αντίστοιχα. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο τριπλών μετρήσεων ± SD. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με ουσιαστικά τα ίδια αποτελέσματα.

Η

KIF5B εκφράζεται έντονα σε διάφορα καρκινικά κύτταρα

Κατ ‘αρχάς, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της KIF5B σε τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές (MCF-7, HeLa και U2OS οστεοσάρκωμα) και βρέθηκε ότι είναι ιδιαίτερα εκφράζεται σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με άλλες Ν-κινεσίνες συμπεριλαμβανομένων KIF5A /KIF5C (Μετακίνηση κινε 1), KIF3A (Μετακίνηση κινε 2) και KIF1A (Μετακίνηση κινε 3) (Εικ. 1Β). Διαπιστώσαμε μόνο χαμηλά επίπεδα KIF3A λαμβάνοντας υπόψη ότι τόσο KIF5A και KIF5C mRNAs ήταν μη ανιχνεύσιμα σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση τους είναι περιορισμένη για τους νευρώνες [23] (Εικ. 1Β). Προκειμένου να αμφισβητήσει την λυσοσωμική εντόπιση των KIF5B ανιχνεύεται από πρωτεομική ανάλυση των κυττάρων MCF-7, θα υποβάλλεται το κλάσμα φως της μεμβράνης των κυττάρων HeLa σε κλασματοποίηση κλίσης πυκνότητας και αναλύθηκαν τα διάφορα κλάσματα με ανοσοαποτύπωση και ενζυματική δραστηριότητα λυσοσωματικής μετρήσεις. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1Γ, KIF5B ήταν αποκλειστικά παρούσα σε κλάσματα που περιέχουν υψηλά επίπεδα λυσοσωματικής πρωτεΐνης LAMP-2 και δείκτες ενζυματική δραστικότητα λυσοσωμική (καθεψίνες κυστεϊνης, όξινο φωσφατάση και SS

N-ακετυλο-

γλυκοζαμινιδάση). Θα πρέπει, ωστόσο, να σημειωθεί ότι τα κλάσματα που περιέχουν πρωτεΐνη δείκτη μιτοχονδριακού GRP75 ήταν εν μέρει επικαλυπτόμενες με κλάσματα λυσοσωμικές και KIF5B.

Η εξάντληση των KIF5B προκαλεί διαρροή λυσοσωμικές και θάνατο των κυττάρων σε κύτταρα HeLa

Για να διευκρινιστεί η ρόλος του KIF5B στην κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση, HeLa και κύτταρα MCF-7 εξαντλημένο για KIF5B με παρεμβολή RNA (Εικ. 2Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, KIF5B-εξαντλημένο κύτταρα HeLa αποκτήσει ένα επίμηκες κυτταρικό φαινότυπο που ακολουθείται από σημαντική αναστολή της ανάπτυξης και κυτταρικού θανάτου (Σχ. 2Β-D). εξάντληση KIF5B προκάλεσε παρόμοιες αλλά σαφώς ασθενέστερη κυτταροστατικά /κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε κύτταρα MCF-7 και ελαφρώς περισσότερο σε MCF-7-ΔΝ-ErbB2 κύτταρα όπως αναλύθηκε με μικροσκοπία φωτός (Σχ. 2Β). Παρά την επαγωγή σημαντικής κυτταρικού θανάτου, μόνο πολύ χαμηλή κασπάσης-3 σαν δραστικότητα ανιχνεύθηκε σε KIF5B-εξαντλημένο κύτταρα HeLa (Σχ. 2Ε). Αντ ‘αυτού, τα KIF5B εξαντληθεί κύτταρα εμφάνισαν μια σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα της καθεψίνης κυτοσολικό κυστεΐνη ενδεικτική διαπερατότητας μεμβράνης λυσοσωματικής (Σχ. 2F).

Η εξάντληση των KIF5B σε κύτταρα HeLa επάγει περιφερική ομαδοποιήσεις λυσοσώματα σε κύτταρα HeLa

από KIF5B extraembryonic κύτταρα ανεπαρκή ποντίκι εμφανίζει περιπυρηνικά ομαδοποίηση των μιτοχονδρίων και μειωμένη οξύ-ενεργοποιούνται διακίνησης λυσοσώματα προς την περιφέρεια του κυττάρου [16], μελετήσαμε την επόμενη την κατανομή αυτών των οργανιδίων, μετά την εξάντληση KIF5B. Προκειμένου να διερευνηθεί η κατανομή λυσοσωμικού, επωφεληθήκαμε από κύτταρα HeLa που εκφράζουν ένα eGFP-LIMP1 ως δείκτη λυσοσωματικής [19]. Σε κύτταρα HeLa-eGFP-LIMP1 KIF5B-εξαντλημένο η κατανομή των eGFP-LIMP1-postive λυσοσώματα μεταβλήθηκε δραματικά από μια διάχυτη περιπυρηνικών μοτίβο σε μεγάλες περιφερειακές αδρανών υλικών (Εικ. 3Α). Αυτά τα λυσοσώματα εμφανίστηκε σε ομίλους και έγιναν ενεργά μεταφέρονται προς και από τα μακροοικονομικά μεγέθη όπως παρατηρείται από βίντεο time-lapse μικροσκοπία (Βίντεο S1 και S2). Σε αντίθεση με τα λυσοσώματα, το μιτοχονδριακό διανομή δεν επηρεάστηκε από εξάντληση KIF5B σε κύτταρα HeLa (Εικ. 3Α).

(Α) Αντιπροσωπευτική εικόνες συνεστιακού είτε κύτταρα HeLa ή HeLa που εκφράζουν σταθερά Ι_ΙΜΡ-1-EGFP επιμολυσμένα με KIF5B ή ΜΜ siRNA, και χρωματίστηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) κύτταρα HeLa σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες (80% συρροή) έχουν μεμβράνη τραυματίστηκαν με ένα νυστέρι και αμέσως μετά χρωματίστηκαν για επιφάνεια LAMP-1? κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιείται και χρωματίστηκαν για KIF5B. κύτταρα (C) HeLa επιμολυσμένα με ενδεικνυόμενη siRNAs ήταν (μετά από 48 ώρες) διέγειρε να exocytose με 10 μΜ ιονομυκίνη. Εξωκυτταρική έκκριση των καθεψινών λυσοσωματικής μετρήθηκε με δοκιμασία ένζυμο zFR-AMC και τιμές (μέσα τριπλών μετρήσεων ± SD) εκφράστηκαν ως ποσοστό της συνολικής περιεκτικότητας κυτταρικής LDH. (Δ) Ποσοτικοποίηση της επιφάνειας LAMP-1 σε ηλεκτροδιάτρηση κύτταρα HeLa με κυτταρομετρία ροής. Κόκκινο και πράσινο δείχνει κύτταρα σε δύο διαφορετικές πύλες. Το ποσοστό των κυττάρων στην κόκκινη πύλη χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η ποσότητα του επιφανειακά-εκτεθειμένα LAMP-1 +/- ηλεκτροδιάτρηση. FL1-Η: ένταση φθορισμού. FSC-Η:. Εμπρός πλευρά διασποράς

Η

Από KIF5B λειτουργεί ως

συν

-Τέλος κινητήρα, δηλαδή έναν κινητήρα που μεταφέρει φορτίο από το κεντρόσωμα στην περιφέρεια του κυττάρου [24], η συσσώρευση των λυσοσωμάτων στην περιφέρεια του κυττάρου σε κύτταρα KIF5B-εξαντλημένο μπορούσε να οφείλεται σε μια περιφερειακή εντόπιση του κεντροσώματος ή αποτυχία των λυσοσώματα να συντήκονται με την μεμβράνη του πλάσματος. Για να δοκιμαστεί η πρώτη δυνατότητα, μπορούμε χρωματισμένα κύτταρα HeLa-eGFP-LIMP1 με ένα αντίσωμα έναντι γ-τουμπουλίνης για να επισημάνετε τις κεντροσωμάτια. Ωστόσο, οι συστάδες λυσοσωμική δεν συσσωρεύονται γύρω από τις κεντροσωμάτια (Εικ. 3Α). Για να εξεταστεί εάν KIF5B είναι απαραίτητη για λυσοσωμική εξωκυττάρωση, εφαρμόσαμε τρεις διαφορετικές μέθοδοι (μηχανική ξύσιμο, ηλεκτροπόρωση και ιονομυκίνη) για να προκληθεί βλάβες μεμβράνης πλάσματος που ενεργοποιούν Ca

2+ εισροή και επαγωγή της απόκρισης επανασφράγισης που περιλαμβάνει εξωκυττάρωση λυσοσώματα [25 ]. Ένα νυστέρι χρησιμοποιήθηκε για να το μηδέν σε μια ημι-συρρέουσα στιβάδα κυττάρων HeLa να επάγει μηχανικά βλάβη της μεμβράνης του πλάσματος, και λυσοσωμική εξωκύττωση αμέσως αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ανίχνευσης ενός αυλού επίτοπο λυσοσωμικής LAMP-1 στην κυτταρική επιφάνεια. Η επιφάνεια φθορισμός του LAMP-1 αυξήθηκε σημαντικά στη θέση βλάβης ενδεικτική της επανασφράγισης λυσοσωματικής μεμβράνης, και ένα επιπλέον συν-εντοπισμό και τη συσσώρευση του KIF5B στη θέση βλάβης παρατηρήθηκε υποδεικνύοντας ότι KIF5B εμπλέκεται σε αυτήν την απόκριση (Σχ. 3Β). Δεδομένου ότι αυτή η μέθοδος δεν είναι κατάλληλη για ποσοτικές μελέτες, χρησιμοποιήσαμε ηλεκτροδιάτρηση για να επάγει μικρές υδρόφιλες πόρων στη μεμβράνη πλάσματος να ερευνήσει εάν KIF5B ήταν απαραίτητη για τη διαδικασία μεταφοράς των λυσοσωμάτων στους χώρους βλάβη. Η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως για να εισαγάγει πρωτεϊνών και του DNA σε κύτταρα και εξαρτάται από την ικανότητα των κυττάρων να επανασφράγιση μεμβράνη πλάσματος τους μετά την ηλεκτροδιάτρηση [26]. κύτταρα HeLa ηλεκτροδιατρήθηκαν με την αύξηση της χωρητικότητας και αμέσως μετά χρωματίστηκαν για επιφάνεια LAMP-1 (Σχ. 3D). Ποσοτικοποίηση της LAMP-1 που εκτίθεται στην μεμβράνη του πλάσματος με κυτταρομετρία ροής αποκάλυψε ένα ανιχνεύσιμο επίπεδο του LAMP-1 επί 3,3% των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Σε αντίθεση, όταν τα κύτταρα ηλεκτροδιατρήθηκαν σε 125 και 250 μΡ, LAMP-1 ανιχνεύθηκε στην επιφάνεια σε 11,4 και το 21% των κυττάρων, αντίστοιχα. Κύτταρα εξαντλημένο για KIF5B και εκτέθηκαν σε 125 μF δεν εμφανίζει καμία σημαντική αλλαγή στην επιφάνεια LAMP-1, σε σύγκριση προς κύτταρα που κατεργάζονται ελέγχου εκτέθηκαν σε 125 μF (Σχ. 3D). Ομοίως, η ιονομυκίνη επαγόμενη λυσοσωμική εξωκυττάρωση του αυλού πρωτεασών δεν επηρεάστηκε από εξάντληση KIF5B (Σχήμα 3C). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι KIF5B δεν είναι κρίσιμη για την εξωκύττωση λυσοσωμικής και επανασφράγιση μεμβράνη του πλάσματος. Επιπλέον, η πρόσληψη της Alexa Flour 488-Dextran (10 kDa) δεν επηρεάστηκε από την εξάντληση KIF5B υποδεικνύοντας ότι KIF5B δεν απαιτείται για ενδοκύτωση ρευστό φάση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η εξάντληση των KIF5B επάγει συσσώρευση περι-πυρηνική της αυτοφαγοσώματα

στη συνέχεια, εξετάσαμε αν KIF5B παίζει ρόλο στην αυτοφαγία, η κύρια οδός υποβάθμισης λυσοσωμικής. Για το σκοπό αυτό, μπορούμε κατεργασμένα κύτταρα MCF-7 τα οποία εκφράζουν σταθερά την autophagosome-πρωτεΐνης που συνδέεται LC3 συντηγμένη με την ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (MCF-7-LC3 ΕΟΡΡ) είτε με ραπαμυκίνη που επάγει autophagy αδρανοποιώντας τον στόχο των θηλαστικών του συμπλόκου ραπαμυκίνης 1 ( mTORC1) ή κονκαναμυκίνης Α που αναστέλλει την δραστικότητα V-ΑΤΡάση κενοτοπικής σε λυσοσώματα αποτέλεσμα μειωμένη κύκλο εργασιών αυτοφαγοσώματα καθώς και επαγωγή του σχηματισμού autophagosome μέσω αναστολής της mTORC1 [27]. Είναι ενδιαφέρον ότι η εξάντληση των KIF5B από τρεις μη-επικαλυπτόμενα siRNAs μείωσε σημαντικά την ικανότητα της ραπαμυκίνης να προκαλέσει το σχηματισμό LC3-postive κυστίδια αυτοφαγικά (Σχ. 4Α). Η επίδραση αυτή δεν επέφερε αλλαγές στην ικανότητα της ραπαμυκίνης να αναστέλλει mTORC1, δεδομένου ότι η εξάντληση των KIF5B δεν είχε καμία επίδραση στη δραστηριότητα mTORC1 όπως αναλύθηκε από την κατάσταση φωσφορυλίωσης της κινάσης p70 S6 1 (p70

S6K1) (Εικ. 4Β). Για να διερευνηθεί περαιτέρω το φαινόμενο, ακολουθήσαμε το σχηματισμό autophagosome σε MCF-7-LC3 ΕΟΡΡ κύτταρο υποβάλλεται σε επεξεργασία με ραπαμυκίνη (δεν φαίνεται) ή κονκαναμυκίνης Α με χρόνο μικροσκοπία lapse βίντεο για 45 λεπτά. Παραδόξως, η κατανομή των αυτοφαγοσώματα άλλαξε δραματικά με την εξάντληση KIF5B. Σε KIF5B απεμπλουτισμένο κύτταρα τα αυτοφαγοσώματα εμφανίστηκαν και συσσωρευμένη κυρίως γύρω από τον πυρήνα (Σχήμα 4C-E?. Βίντεο S3) ενώ σε κύτταρα επεξεργασμένα με siRNA ελέγχου είχαν διανεμηθεί διάχυτα σε όλο το κυτταρόπλασμα (Εικόνα 4C?. Βίντεο S4). Οι περιπυρηνική αυτοφαγοσώματα σε KIF5B εξαντλημένα κύτταρα που βρίσκονται σε άμεση γειτνίαση με την συσκευή Golgi όπως οπτικοποιούνται με χρώση με ένα αντίσωμα κατά α

trans

πρωτεΐνη μεμβράνης -Golgi δίκτυο Golgin-97 (Σχ. 4F και βίντεο S5).