Αφηρημένο

Εξωσώματα είναι νανόμετρο μεγέθους εξωκυττάρια κυστίδια που πιστεύεται ότι λειτουργούν ως μεσοκυττάρια επικοινωνίας. Εδώ, αναφέρουμε ότι εξωσώματα είναι σε θέση να τροποποιήσει την απάντηση ακτινοβολία των καρκινικών κυτταρικών σειρών κεφαλής και του τραχήλου BHY και FaDu. Τα εξωσώματα απομονώθηκαν από το ρυθμισμένο μέσο ακτινοβολημένων καθώς και μη-ακτινοβολημένα καρκίνο κεφαλής και λαιμού κύτταρα με σειριακή φυγοκέντρηση. Ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας τεχνολογία NanoSight έδειξε μία αυξημένη απελευθέρωση εξωσωμάτων από ακτινοβολημένα σύγκριση με τα μη-ακτινοβολημένα κύτταρα 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Για να ελεγχθεί αν οι απελευθερώνονται εξωσώματα επηρεάζουν την ανταπόκριση ακτινοβολία άλλων κυττάρων τα εξωσώματα μεταφέρθηκαν σε μη ακτινοβολημένα και ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες. Βρήκαμε ενισχυμένη πρόσληψη εξωσωμάτων απομονωθεί τόσο από ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα με ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες σε σύγκριση με μη-ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες. Λειτουργικές αναλύσεις με μεταφορά εξωσωμάτων έδειξε ότι όλα τα εξωσώματα (από μη ακτινοβολημένα και ακτινοβολημένα κύτταρα δότη) αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό των μη-ακτινοβολημένων κυττάρων δεκτών και την επιβίωση των ακτινοβολημένων κυττάρων δεκτών. Οι επιδράσεις που προάγουν την επιβίωση είναι εντονότερες όταν εξωσώματα απομονώθηκαν από ακτινοβολημένα σε σύγκριση με τα μη-ακτινοβολημένα κύτταρα δότη μεταφέρθηκε. Ένας πιθανός μηχανισμός για την αυξημένη επιβίωση μετά από ακτινοβόληση θα μπορούσε να είναι η αύξηση του DNA διπλό σκέλος επισκευή διάλειμμα παρακολουθείται στα 6, 8 και 10 ώρες μετά τη μεταβίβαση εξωσωμάτων που απομονώνονται από ακτινοβολημένα κύτταρα. Αυτό καταργείται από την αποσταθεροποίηση των εξωσωμάτων. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι οι επιδράσεις της ακτινοβολίας τόσο η αφθονία και η δράση εξωσωμάτων σε κύτταρα δέκτες. Εξωσώματα μεταδίδουν prosurvival αποτελέσματα με την προώθηση της διάδοσης και ραδιοαντοχή του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Στο σύνολό τους, η μελέτη αυτή υποδεικνύει έναν λειτουργικό ρόλο εξωσωμάτων στην απόκριση των καρκινικών κυττάρων σε έκθεση σε ακτινοβολία μέσα σε ένα θεραπευτικό εύρος δόσεων και ενθαρρύνει ότι εξωσώματα είναι χρήσιμα αντικείμενα μελέτης για την καλύτερη κατανόηση της ανταπόκρισης ακτινοβολία του όγκου.

Citation : Mutschelknaus L, Peters C, Winkler Κ, Yentrapalli R, Heider Τ, Atkinson MJ, et al. (2016) Εξωσώματα Προέρχεται από πλακώδους καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου Προώθηση της επιβίωσης των κυττάρων μετά από ιονίζουσα ακτινοβολία. PLoS ONE 11 (3): e0152213. doi: 10.1371 /journal.pone.0152213

Επιμέλεια: Pierre Busson, Gustave Roussy, Γαλλία

Ελήφθη: 16, Νοέμ 2015? Αποδεκτές: 10, Μαρ του 2016? Δημοσιεύθηκε: 23 Μαρτίου 2016

Copyright: © 2016 Mutschelknaus et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Συντομογραφίες: ϋΜΕΜ, τροποποιημένο μέσο Eagle κατά Dulbecco? DSB, διπλό σκέλος διάλειμμα? ΕΞΩ, εξωσώματα? HNSCC, κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο

1 Εισαγωγή

Τα εξωσώματα είναι υποκατηγορία των εξωκυτταρικών μικροκυστιδίων που εκκρίνονται από τους περισσότερους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του όγκου. Είναι ενδοκυτταρική προέλευση και απελευθερώνονται στον εξωκυτταρικό περιβάλλον μέσω της σύντηξης του κυτοσολίου πολυκυψελιδωτών φορέων με τη μεμβράνη του πλάσματος. Εξωσωμάτων φορτίου περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα των πρωτεϊνών, mRNA, microRNAs και καιρό μη-κωδικοποίησης RNAs [1-4]. Λειτουργικές μελέτες αποκαλύπτουν ότι εξωσώματα δρουν ως εξωκυτταρικά επικοινωνίας με την παράδοση του περιεχομένου τους σε ένα κύτταρο στόχο μέσω σύντηξης μεμβρανών, ή εναλλακτικά με ενδοκυττάρωση [5]. Το 2007 Valadi et al. απέδειξε ότι εξωσώματα είναι σε θέση να λεωφορείο RNA μεταξύ των κυττάρων. Η μεταφορά εξωσωμάτων μαστοκυττάρων ποντικού στα ανθρώπινα μαστοκύτταρα αποτελέσματα στη μετάφραση του mRNA ποντικού, αποδεικνύοντας ότι οι παραδοθεί μόρια RNA είναι λειτουργικά στα κύτταρα δέκτες [3].

Απορροφώμενης εξωσώματα είναι σε θέση να τροποποιήσει βιολογικές λειτουργίες του τα κύτταρα δέκτες, όπου μπορεί να προσδώσει μία νέα φαινότυπο, όπως η μετάσταση [6], η αγγειογένεση [7] και της μετανάστευσης [8]. Η σύνθεση του exosomal εξωκυτταρικό περιβάλλον τροποποιείται με την κυτταρική στρεσογόνους παράγοντες, οδηγώντας σε αλλάξει, ως επί το πλείστον προστατευτικές επιδράσεις κατά κύτταρα δέκτες. Έτσι εξωσώματα που προέρχονται από κύτταρα που εκτέθηκαν σε οξειδωτικό στρες παρέχει αντίσταση κατά του οξειδωτικού στρες σε μη εκτεθειμένα κύτταρα δέκτες [9]. Σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του μαστού, η υποξία αυξάνει επίσης την απελευθέρωση εξωσωμάτων μεταφέρουν αυξημένες ποσότητες miR-210. Αυτό ενισχύει την επιβίωση και εισβολή των κυττάρων-δεκτών [10]. Στο πλαίσιο της ιονίζουσας ακτινοβολίας εξωσωμάτων προέρχονται από ακτινοβολημένα κύτταρα γλοιώματος ενισχύσει τη μετανάστευση των κυττάρων λήπτη γλοιώματος [11]. Εξωσώματα μπορούν έτσι να επηρεάσουν την επικοινωνία των επιπτώσεων της ακτινοβολίας μεταξύ των μη στοχευμένων και στοχευμένα κύτταρα (παρευρισκομένων-όπως σηματοδότηση), όπως γενωμική αστάθεια [12-14].

ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα είναι κοινές κακοήθειες στην περιοχή της κεφαλής και του τραχήλου . Ακτινοχημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία είναι η πιο κοινή θεραπεία για ασθενείς με τοπικά προχωρημένο και μη χειρουργήσιμο όγκους [15] HNSCC (κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων). Ωστόσο, η αντίσταση θεραπεία και την υποτροπή του όγκου αποτελέσει σημαντική πρόκληση και οι μηχανισμοί τους δεν είναι καλά κατανοητοί. Δεδομένου ότι τα εξωσώματα αναδυόμενες παίκτες της αντίστασης στα φάρμακα στόχος μας είναι να αξιολογηθεί κατά πόσον εξωσώματα θα μπορούσαν να επηρεάσουν την απόκριση της ακτινοβολίας του κεφαλιού και του λαιμού κυττάρων πλακώδους καρκινώματος [16-19]. Για το σκοπό αυτό έχουμε προσδιορίσει τις επιπτώσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας μέσα σε ένα μέτριο εύρος δόσης για την απελευθέρωση εξωσωμάτων και πρόσληψης στο HNSCC. Προκειμένου να αναλυθεί ένα υποθετικό λειτουργικό ρόλο εξωσωμάτων προσθέσαμε εξωσώματα απομονώθηκαν από διαφορικά ακτινοβολημένα κύτταρα του δότη, και αναλύθηκαν επιπτώσεις προκύπτουν για τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και την επιδιόρθωση του DNA του παραλήπτη HNSCC μετά από μια θεραπεία με ιοντίζουσα ακτινοβολία.

2 Υλικά και μέθοδοι

2.1 κυτταρική καλλιέργεια και την ακτινοβόληση

κυτταρικές σειρές καρκίνου κεφαλής και τραχήλου BHY (DSMZ καμία .: ACC 404) και FaDu (ATCC

®HTB43

™) επωάστηκαν σε 37 ° C και μία σχετική υγρασία του αέρα 95%. κύτταρα BHY καλλιεργήθηκαν σε υψηλό μέσο καλλιέργειας γλυκόζης ϋΜΕΜ (Dulbecco τροποποιημένο μέσο του Eagle, Gibco) συν 10% ορό εμβρύου μόσχου (Bio & amp? ΠΩΛΗΣΗ), 2 mM L-γλουταμίνη και πυροσταφυλικό νάτριο σε 10% CO

2. κύτταρα FaDu διατηρήθηκαν σε χαμηλή γλυκόζη DMEM (GE Healthcare) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2 mM L-γλουταμίνη και 25 mM HEPES σε 5% CO

2. ταυτότητες γραμμή κυττάρων επικυρώθηκαν με προσδιορισμό της αλληλουχίας των εννέα διαφορετικούς τόπους: D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, VWA, TH01, AM, TPOX, CSF1PO (εκτελούνται από Eurofins Genomics, S1 και S2 πίνακες). Μια έλεγχο μυκόπλασμα αποκάλυψε αρνητικά αποτελέσματα.

Τα κύτταρα ακτινοβολούνται με ακτίνες γ που εκπέμπεται από ένα

137caesium πηγή στις εγκαταστάσεις ακτινοβόλησης HWM-D2000 (Wälischmiller Μηχανικών) με ποσοστό δόση 1 Gy ανά 2,04 λεπτά.

2.2 απομόνωση εξωσωμάτων

Για την απομόνωση εξωσωμάτων το πρωτόκολλο της Thery et al. προσαρμόστηκε [20] (Εικόνα 1Α). 5 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν ανά 10-cm τρυβλίου Petri, 72 ώρες αργότερα το μέσο αντικαταστάθηκε με 8 ml εξωσωμάτων μέσου ελεύθερου και τα κύτταρα ακτινοβολούνται σε μια μέτρια εύρος δόσεων από 0-9 Gy. Εξωσώματα απομονώθηκαν από μη-ακτινοβολημένα κύτταρα λάβει τη συντομογραφία ΕΞΩ 0 Gy, ενώ εξωσώματα από ακτινοβολημένα κύτταρα που ονομάζεται EXO 3 Gy, ΕΞΩ 6 και EXO 9 Gy. απομόνωση εξωσωμάτων διεξήχθη από το ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε 24 και 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Για την εξάλειψη αποσπασμένα κύτταρα, τα νεκρά κύτταρα καθώς και κυτταρική θραύσματα, το υπερκείμενο της κυτταρικής καλλιέργειας φυγοκεντρήθηκε με 10.000 g για 30 λεπτά και στη συνέχεια πέρασαν μέσα από ένα φίλτρο με μέγεθος πόρων 0,22 μm. Ένα βήμα υπερφυγοκέντρηση με 100.000 g επέτρεψε την καθίζηση των εξωσωμάτων (75 λεπτά, 4 ° C). Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το σφαιρίδιο exosomal επαναιωρήθηκε σε 2 ml PBS. Μετά από επανάληψη του άλλου σταδίου υπερφυγοκέντρηση (100.000 g), το υπερκείμενο απορρίφθηκε και τα εξωσώματα επαναιωρήθηκαν σε PBS. Exosomal παρασκευάσματα αποθηκεύθηκαν στους -20 ° C. Εξωσωμάτων κύτταρα δότη συλλέχθηκαν 24 και 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση χρησιμοποιώντας ένα ξέστρο κυττάρων. Μετά το πλύσιμο του κυτταρικού ιζήματος δύο φορές με PBS, το σφαιρίδιο καταψύχθηκε στους -20 ° C. Για την παρασκευή εξωσωμάτων μέσου άνευ, εξωσώματα βοοειδών απομακρύνθηκαν από τον ορό εμβρύου μόσχου με φυγοκέντρηση στα 100.000 g για 14 ώρες.

(Α) Διάγραμμα της ανάλυσης εξωσωμάτων. μικρογραφία (Β) μετάδοσης ηλεκτρονίου που δείχνει εξωσώματα απομονώθηκε από το υπερκείμενο κυτταρικής καλλιέργειας από 3 Gy-ακτινοβολημένα κύτταρα BHY [κλίμακα bar: 100 nm]. (C) Αντιπροσωπευτική ανοσοκηλίδα HSP70, ακτίνη, CD63 και καλνεξίνη πραγματοποιήθηκαν με προϊόντα λύσης εξωσωμάτων (εξω) και κυτταρολύματα (CP) που συλλέγονται 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση. ϋΜΕΜ μέσο, ​​DMEM μέσο συμπληρωμένο με εξωσωμάτων-εξαντλημένο ορό εμβρύου μόσχου καθώς και υπερκείμενο μετά υπερφυγοκέντρηση φορτώθηκαν ως έλεγχοι. διανομής (D) Μέγεθος εξωσωμάτων από κύτταρα μη-ακτινοβολημένα BHY μετρήθηκε με την τεχνολογία NanoSight. (Ε) Σχετική εξωσωμάτων αφθονία BHY εξωσωμάτων απομονώθηκαν 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με 0, 3, 6 και 9 Gy [n = 6, p-value & lt? 0.05].

Η

2.3 Ηλεκτρονική μικροσκοπία εξωσωμάτων

μη αραιωμένου δείγματος (απομονωθεί από 3 ml ρυθμισμένο μέσο) απορροφήθηκε σε λάμψη εξιτήριο επικαλυμμένα με άνθρακα πλέγματα (G2400C από Plano) για 2 λεπτά. Το διάλυμα στυπώθηκε και αρνητικά χρωματίστηκαν με διάλυμα 4% μολυβδαινικού αμμωνίου (Sigma-Aldrich) για 30 δευτερόλεπτα. Μικρογραφίες καταγράφηκαν με ένα Jeol JEM 100CX ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σε 100 kV σε φιλμ Kodak SO163. Αρνητικά ήταν ψηφιοποιημένο με ένα X5 σαρωτή Hasselblad Flextight στα 3000 dpi, με αποτέλεσμα ένα μέγεθος pixel 0,25 nm /px. Για εικόνες οπτικοποίηση ήταν ομαδοποιημένων σε 1 nm /px.

2.4 εξωσωμάτων ποσοτικοποίηση και τον προσδιορισμό των exosomal

μεγέθους διανομής

εξωσωμάτων ποσό και κατανομή μεγέθους αναλύθηκε με τη χρήση του NanoSight LM10 (Malvern) μικροσκόπιο. παρασκευάσματα εξωσωμάτων (που απομονώνεται από 5 ml ρυθμισμένου μέσου) αραιώθηκαν 1: 100 έως 1: 2000 με H

2O να επιτευχθεί 15 έως 50 σωματίδια ανά πλαίσιο για την παρακολούθηση. Τα δείγματα αναλύθηκαν κάθε τρεις φορές για 30 δευτερόλεπτα.

2.5 εξωσωμάτων πρόσληψη

Τα εξωσώματα (που απομονώθηκε από 15 ml ρυθμισμένο μέσο) βάφτηκαν με την πράσινη φθορίζουσα χρωστική ΡΚΗ67 (MINI67-1KT, Sigma-Aldrich Chemie). Για το σκοπό αυτό 50 μΐ διαλύματος εξωσωμάτων επαναιωρήθηκαν σε 250 μΙ του αραιωτικού C συν 1.5 μΙ χρωστικής (1 mM). Μετά από 10 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου υπερβολική βαφή απομακρύνθηκε με τη χρήση στηλών Spin εξωσωμάτων (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Που ελέγχουν μια ίση ποσότητα βαφής σε αραιωτικό C συν 50 μλ PBS υποβλήθηκε σε επεξεργασία παρόμοια με εξωσώματα (εξωσωμάτων αρνητικός έλεγχος, εξω).

Για να μετρηθεί η πρόσληψη εξωσωμάτων 50.000 κύτταρα σε 200 μλ μέσου σπάρθηκαν σε 48 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες ίσες ποσότητες ΡΚΗ67-βάφονται εξωσώματα προστέθηκαν σε ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες. Μετά από επιπλέον 3, 6, 8, 10 και 24 ώρες τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε επεξεργασία με θρυψίνη σε 500 μΙ PBS. Η πρόσληψη μετρήθηκε σε ένα FACScan LSRII (Becton-Dickinson, διέγερση = 490 nm, εκπομπή = 502 nm). Για φθορισμού κύτταρα μικροσκοπία πλύθηκαν τρεις φορές με PBS μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη πλύθηκαν και πάλι με PBS και καλύφθηκαν με Vectashield

® συμπεριλαμβανομένων Hoechst 33342 για χρώση πυρήνες. Ελήφθησαν εικόνες με το μικροσκόπιο φθορισμού ΒΖ-9000 από Keyence.

2.6 Επώαση των κυττάρων δεκτών με εξωσώματα

Για να προσδιοριστεί η βιολογική δραστικότητα του εξωσωμάτων (πολλαπλασιασμός, επιβίωση και επισκευή DSB) επωάσαμε το κύτταρα δέκτες με εξωσώματα απομονώθηκαν από ταυτόσημους αριθμούς κυττάρων δότη. Τα εξωσώματα ανακτήθηκαν σε όγκους για να δώσει μια τριπλάσια συγκέντρωση εξωσωμάτων σε σχέση με τις φυσικές συνθήκες.

2.7 Διάδοση και κλωνογονική επιβίωση μετά τη μεταφορά εξωσωμάτων

Η επίδραση εξωσωμάτων στον πολλαπλασιασμό ήταν καθορίζεται με την Presto Μπλε

™ τηλέφωνα Βιωσιμότητας πρωτόκολλο αντιδραστηρίου (Life Technologies). 500 ή 1500 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 100 μλ εξωσωμάτων μέσο ελεύθερο. Μετά από 24 ώρες εξωσώματα (που απομονώνεται από 300 μΐ ρυθμισμένο μέσο) προστέθηκαν και τα κύτταρα επωάστηκαν για άλλες 72 ώρες. Για τη μέτρηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων 10 μΐ Presto Μπλε αντιδραστήριο προστέθηκαν ανά φρεάτιο, επωάστηκαν για 40 λεπτά στους 37 ° C και ο φθορισμός προσδιορίστηκε (διέγερση 560 nm? Εκπομπή: 590 nm). Σε μία συσκευή ανάγνωσης πλάκας (Tecan)

Για τον προσδιορισμό της επιβίωσης, μία δοκιμασία κλωνογόνο επιβίωση διεξήχθη. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων και ψευδο-αγωγή ή ακτινοβοληθεί με 1, 2, 3, 6 και 10 Gy. Αμέσως μετά, εξωσώματα (από 2,5 ml ρυθμισμένου μέσου) μεταφέρθηκαν επί των κυττάρων τα οποία στη συνέχεια επωάστηκαν για 5 ημέρες για να επιτραπεί ο σχηματισμός αποικιών από απλά κύτταρα. κύτταρα συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS, σταθεροποιήθηκαν με 100% αιθανόλη (30 λεπτά) και, τέλος, χρωματίστηκαν με διάλυμα Giemsa (Boehringer Ingelheim, 1:20 σε PBS, 30 λεπτά). Υπερβολική βαφή απομακρύνθηκε και μετρήθηκαν οι αποικίες με περισσότερα από 30 κύτταρα.

2.8 Ανίχνευση DNA δίκλωνα σπασίματα μετά τη μεταφορά εξωσωμάτων

1.000 έως 6.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά την επίτευξη ενός συρροή 50-70% το μέσο αντικαταστάθηκε με 100 μΙ εξωσωμάτων μέσου άνευ, τα κύτταρα αμέσως ακτινοβοληθεί με 2 Gy και εξωσώματα απομονώθηκαν από 300 μΙ προστέθηκαν ρυθμισμένο μέσο. Μετά από επώαση 1, 6, 8 ή 10 ώρες στους 37 ° C, ο αριθμός των DNA DSBs προσδιορίστηκε με χρώση 53BP1. Ένα βήμα στερέωσης με 4% παραφορμαλδεΰδη ακολουθήθηκε από διαπερατοποίηση με 0,2% Triton Χ-100. Ακολούθως τα κύτταρα αποκλείσθηκαν με PBS + (1% αλβουμίνη βόειου ορού, 0,15% γλυκίνη) για 60 λεπτά και επωάστηκαν για μία νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα 53BP1 (αραίωση 1: 500, NB100-305, Novus Biologicals) στους 4 ° C. Την επόμενη ημέρα τα κύτταρα επωάστηκαν με τα δευτερεύοντα αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού Alexa-488 (αραίωση 1: 200, Α-11034, Life Technologies) και αντι-ποντικού προβάτου Cy-3 (αραίωση 1: 500, 016-160- 084, Jackson Lab) για 1 ώρα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich Chemie) και τα κύτταρα καλύφθηκαν με Vectashield

® Τοποθέτηση Medium (Linaris). Η ανάλυση διεξήχθη με το μικροσκόπιο φθορισμού Biorevo ΒΖ-9000 (Keyence). Για όλες τις πειραματικές συνθήκες διατηρήθηκαν οι χρόνοι έκθεσης και ο αριθμός εστιών των 60 κύτταρα ανά συνθήκη προσδιορίστηκε.

2.9 Επικύρωση της exosomal σταθερότητας

Για να δοκιμαστεί η σταθερότητα, εξωσώματα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε 37 ° C είτε με RNase α από την Qiagen (5 μg /μl ή 400 μg /μl) ή ένα απορρυπαντικό-πεπτιδάσης-μίγμα (0,2% Triton Χ-100 /θρυψίνη, 2: 1). Στη συνέχεια, οι εξωσώματα χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμασίες επιδιόρθωσης του DNA όπως περιγράφεται παραπάνω.

2.10 Πρωτεΐνη ανάλυση

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης II (25 mM Tris ρΗ 7,5, 120 mM NaCl, 1% Triton Χ -100, 1% PSMF, 1 mM Νοε, 1 mM λευπεπτίνη) επί 1 ώρα επί πάγου. Μετά από φυγοκέντρηση, η συγκέντρωση πρωτεΐνης των υπερκειμένων που συλλέγονται προσδιορίσθηκε με την εφαρμογή του BCA-δοκιμασία χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο (Pierce

™ Kit BCA Protein Assay, Thermo Fisher Scientific).

ανάλυση Western blot επιτεύχθηκε σύμφωνα με τυποποιημένες διαδικασίες χρησιμοποιώντας 10 μg κυτταρικής πρωτείνης και έναν όγκο 12 μλ προϊόντος λύσης εξωσωμάτων που αντιστοιχεί στο ποσό εξωσωμάτων σε 30 ml ρυθμισμένο μέσο για ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS. Διαχωρισμένες πρωτεΐνες στυπώθηκαν επί μεμβρανών νιτροκυτταρίνης και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα που κατευθύνονται έναντι CD63 (sc15363, SantaCruz), HSP70 (MA3-007, Affinity Bioreagents), ακτίνη (SAB1305567, Sigma-Aldrich Chemie) και καλνεξίνη (sc11397, SantaCruz). αντισώματα αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού υπεροξειδάση χράνου-συζευγμένο (sc2004 και sc2005, SantaCruz) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση αντισώματος σύνδεσης αντιγόνου μέσω χημειοφωταύγειας (κιτ ανίχνευσης Amersham ECL, GE Healthcare).

2.11 Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή των ανεξάρτητων, βιολογικών επαναλήψεων ± τυπική απόκλιση (SD). Σημασία των n-φορές αλλαγές υπολογίστηκε με τη χρήση του paired t-test. Για να συγκριθεί μέσω τριών ή περισσοτέρων μεταβλητών εφαρμόστηκε αμφίπλευρη ANOVA. Για όλες τις στατιστικές αναλύσεις p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική και η P & lt? 0,01 και p & lt? 0.001 κρίθηκε ιδιαίτερα σημαντική.

3 Αποτελέσματα

3.1 ακτινοβολία αυξάνει την απελευθέρωση εξωσωμάτων από τα κύτταρα καρκίνου κεφαλής και τραχήλου

Εξωσώματα απελευθερώνεται από το κεφάλι και το λαιμό των καρκινικών κυττάρων γραμμή BHY ήταν απομονωμένος με διαφορική υπερφυγοκέντρηση. Για να επικυρώσετε τα εξωσώματα μέθοδο απομόνωσης έγιναν ορατά με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Η αντιπροσωπευτική μικροφωτογραφία έδειξε γύρο, δομές σχήματος κυπέλλου με διάμετρο 30-100 nm (Σχήμα 1Β). Για περαιτέρω επαλήθευση της ταυτότητας εξωσωμάτων ο πρωτεΐνες δείκτες exosomal HSP70, ακτίνη και CD63 ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western σε BHY εξωσώματα καθώς και σε προϊόντα λύσης των κυττάρων BHY. Δεν ανιχνεύσιμες πρωτεΐνες ήταν παρούσες σε μέσο καλλιέργειας που δεν έχει χρησιμοποιηθεί, σε αχρησιμοποίητο μέσο συμπληρωμένο με εξωσωμάτων-εξαντλημένο ορό εμβρύου μόσχου ή στο υπερκείμενο του ρυθμισμένου μέσου μετά υπερφυγοκέντρηση. Η απουσία καλνεξίνη στα προϊόντα λύσης εξωσωμάτων καταδεικνύει ότι τα παρασκευάσματα εξωσωμάτων δεν είχαν μολυνθεί με κυτταρικές μεμβράνες που προέρχονται από αποπτωτικά σώματα ή νεκρά κύτταρα (Σχ 1C). Επιπλέον, η κατανομή του μεγέθους και του αριθμού των απομονώθηκε εξωσωμάτων ποσοτικοποιήθηκαν σε έξι ανεξάρτητες προετοιμασίες για κάθε επεξεργασία χρησιμοποιώντας τεχνολογία NanoSight. Η προσέγγιση αυτή επιβεβαιώθηκε ένα ομοιογενές παρασκεύασμα εξωσωμάτων με μέσο μέγεθος 111-124 nm (η = 6) για τα εξωσώματα απομονώθηκαν είτε από ακτινοβολημένα ή μη ακτινοβολημένα κύτταρα (Σχήμα 1 D). Η μέτρηση NanoSight έδειξε επίσης μια αύξηση του αριθμού των εξωσωμάτων ανακτάται από ακτινοβολημένα (ΕΞΩ 3 Gy, ΕΞΩ 6 Gy) σε σύγκριση με μη-ακτινοβολημένα (EXO 0 Gy) κύτταρα 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση (Σχήμα 1 Ε).

3.2 ακτινοβολία αυξάνει την πρόσληψη εξωσωμάτων από κύτταρα δέκτες

Είμαστε σε σύγκριση πρόσληψη κινητική εξωσωμάτων που απομονώνονται από ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα του δότη καθώς και την υιοθέτησή τους από τα ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με ΡΚΗ67-επισημασμένο εξωσώματα και η πρόσληψη εξωσωμάτων ακολουθήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού και κυτταρομετρία ροής.

μικροσκοπία φθορισμού αποκάλυψε μια εξαρτώμενη από το χρόνο πρόσληψης εξωσωμάτων. Μετά από 3 ώρες συμπλέγματα επισημασμένου εξωσωμάτων άρχισαν να συσσωρεύονται κατά μήκος των κυτταρικών μεμβρανών. Αύξηση του αριθμού των εξωσωμάτων επισυνάπτονται την πάροδο του χρόνου και προκάλεσε διάχυτη επισήμανση κυτταροπλάσματος, πράγμα που συνεπάγεται μια εσωτερικοποίηση και διάλυση εξωσωμάτων (Σχήμα 2Α).

ΡΚΗ67-επισημασμένο εξωσώματα απομονώνονται από ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα BHY συν-καλλιεργείται με κύτταρα BHY. (Α) Αντιπροσωπευτική φθορισμού εικόνων μικροσκοπίας για πρόσληψη εξωσωμάτων μετά από 3, 6 και 24 ώρες επώασης. Τα εξωσώματα χρωματίστηκαν σε πράσινο και πυρήνες χρωματίστηκαν μπλε με Hoechst 33342. (Β) πρόσληψη εξωσωμάτων απομονώθηκε από 6 Gy-ακτινοβολημένα (EXO 6 Gy) και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα BHY (EXO 0 Gy) μετά από 3, 6, 8, 10 και επώαση 24 ωρών. Η μέση τιμή φθορισμού των μη επεξεργασμένων κυττάρων και κυττάρων μετά από επώαση με χρωματίζονται εξωσώματα ή εξωσωμάτων-αρνητικό μάρτυρα (-εξω) δείχνεται (η = 3). (Γ) Εξάρτηση της exosomal πρόσληψη προσδιορίσθηκε μετά από 24 ώρες με τη χρήση ενός σειριακή αραίωση ενός παρασκευάσματος εξωσωμάτων. (D) πρόσληψη του επισημασμένου εξωσωμάτων κατά 0, 2 και 4 Gy-ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες μετά από 24 ώρες. Σε όλα τα πειράματα ένα ελάχιστο 10,000 κύτταρα αναλύθηκαν για κάθε δείγμα [n ≥ 3, ± SD, π-τιμή & lt? 0.05].

Η

Σας ποσοτικά επίσης την πρόσληψη εξωσωμάτων με κυτταρομετρία ροής. Τα ληφθέντα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν προηγούμενες παρατηρήσεις μικροσκοπία μας και έδειξαν ότι η πρόσληψη εξωσωμάτων εξαρτιόταν ώρα (Σχήμα 2Β) και γραμμική με την προστιθέμενη αριθμό εξωσωμάτων (Σχήμα 2C). Η επίδραση της ακτινοβολίας επί της προσλήψεως εξωσωμάτων από κύτταρα δέκτες διερευνήθηκε με σύγκριση της κινητικής της πρόσληψης εξωσωμάτων που απομονώνονται από μη ακτινοβολημένα κύτταρα σε εκείνα τα εξωσώματα απομονώνονται από ακτινοβολημένα κύτταρα. Το σχήμα 2Β δείχνει ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην κινητική μεταξύ της πρόσληψης εξωσωμάτων που προέρχονται από ακτινοβολημένο ή μη ακτινοβολημένα κύτταρα δότη. Υπήρχε, ωστόσο, μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση της πρόσληψης εξωσωμάτων με ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες σε σύγκριση με εκείνη από μη ακτινοβολημένα κύτταρα. Έτσι, exosomal πρόσληψη ήταν σημαντικά αυξημένη κατά 1,3 φορές για εξωσώματα που προέρχονται από μη-ακτινοβολημένα κύτταρα και 1,4 φορές για εξωσώματα από ακτινοβολημένα κύτταρα δότη, εφόσον επωάστηκαν για 24 ώρες με ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες (4 Gy) σε σύγκριση με την πρόσληψη από μη-ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες (Σχήμα 2D). Στο σύνολό τους αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πρόσληψη εξωσωμάτων από κύτταρα-αποδέκτες ήταν το χρόνο και εξαρτάται από τη συγκέντρωση και ότι η ακτινοβόληση των κυττάρων δεκτών αυξημένη ικανότητά τους να αναλάβουν εξωσώματα.

3.3 Εξωσώματα είτε από μη ακτινοβολημένα ή ακτινοβολημένα κύτταρα αυξάνουν την επιβίωση των δικαιούχων κύτταρα

μας ενδιέφερε αν εξωσώματα από ακτινοβολημένα κύτταρα εμφανίζουν τα ίδια βιολογικά αποτελέσματα στα κύτταρα δέκτες όπως εξωσώματα από μη-ακτινοβολημένα κύτταρα. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα έχουμε προσθέσει εξωσώματα απομονώθηκαν από κύτταρα του δότη ακτινοβολούνται με 0, 3, 6 και 9 Gy σε μη ακτινοβολημένα κύτταρα-αποδέκτες και να μετρηθεί ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων. κύτταρα BHY σε επεξεργασία με εξωσώματα έδειξαν μεγαλύτερη πολλαπλασιασμού από ότι τα κύτταρα καλλιεργούνται χωρίς εξωσώματα (Σχήμα 3Α). Κατά συνέπεια, η επίστρωση αποδοτικότητα στην ανάλυση σχηματισμού αποικίας είναι μεγαλύτερη για κύτταρα που αναπτύσσονται με εξωσώματα ό, τι για κύτταρα που αναπτύσσονται χωρίς εξωσώματα (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, καμία σημαντική διαφορά ανιχνεύθηκε μεταξύ των θεραπειών με εξωσώματα απομονώθηκαν από 0, 3, 6 ή 9 Gy-ακτινοβολημένα κύτταρα (Σχήμα 3Α).

(Α) τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που καλλιεργούνται για 3 ημέρες σε μέσο που περιέχει εξωσώματα απομονωμένος από ακτινοβολημένα ή μη ακτινοβολημένα κύτταρα. Ως μάρτυρας ίση ποσότητα PBS χωρίς εξωσωμάτων προστέθηκε στα κύτταρα δέκτες. (Β) απόδοση επιμετάλλωση των κυττάρων που καλλιεργούνται για 5 ημέρες σε μέσο που περιέχει εξωσώματα απομονώνονται από ακτινοβολημένα ή μη-ακτινοβολημένα κύτταρα. Ως μάρτυρας ίση ποσότητα PBS χωρίς εξωσωμάτων προστέθηκε στα κύτταρα δέκτες. (Γ) Κλωνογόνος επιβίωση των κυττάρων BHY συν-καλλιεργείται με εξωσώματα απομονώνονται από ακτινοβολημένα ή μη-ακτινοβολημένα κύτταρα και κύτταρα ελέγχου (BHY + PBS) επωάστηκαν για 5 ημέρες μετά την ακτινοβολία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις [n = 3, ± SD, ρ- αξίας: * αν p & lt? 0,05, ** αν p & lt? 0.01 και **** αν p & lt? 0.0001].

Η

Στη συνέχεια η επιρροή εξωσωμάτων στην ευαισθησία ακτινοβολίας των κυττάρων BHY αναλύθηκε. Τα κύτταρα επωάστηκαν με εξωσώματα, κατόπιν ακτινοβολείται με δόσεις έως 10 Gy και επωάστηκαν για 5 ημέρες. Στη συνέχεια, η κλωνογονική επιβίωση προσδιορίστηκε. Σύμφωνα με την παρατηρούμενη πολλαπλασιασμού διεγερτική επίδραση εξωσωμάτων σε μη ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες (Σχήμα 3Α και 3Β) στην επιβίωση των ακτινοβολημένων κυττάρων δεκτών αυξήθηκε με την προσθήκη εξωσωμάτων (Σχ 3C και S3 Πίνακα). Εδώ, τα εξωσώματα απομονώθηκαν από κύτταρα ακτινοβολούνται με 6 Gy διήγειρε μεγαλύτερο επίπεδο αντίστασης ακτινοβολίας από εξωσώματα από μη-ακτινοβολημένα κύτταρα (Σχ 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι εξωσώματα από τα κύτταρα BHY γενικά υποστηρίζουν τον πολλαπλασιασμό και την ακτινοβολία αντίστασης.

3.4 Εξωσώματα επηρεάζουν τα ποσοστά του DNA διπλό σκέλος επισκευή διάλειμμα

Από Dutta et al. έδειξε ότι εξωσώματα απελευθερώνονται από κύτταρα καρκίνου του μαστού μπορεί να αλλάξει την κατάσταση φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης βλαβών του DNA [21], αναλύσαμε το ποσοστό του DNA διπλό σκέλος διάλειμμα (DSB) επισκευή σε ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες για τη διαλεύκανση του μηχανισμού για την αυξημένη επιβίωση των κυττάρων μετά την προσθήκη του εξωσωμάτων. Τα εξωσώματα από ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα BHY μεταφέρθηκαν σε ακτινοβολημένα κύτταρα BHY (2 Gy) και τον αριθμό των DNA DSB εστιών αναλύθηκε μετά από 1 και 6 ωρών. Ποσοτικοποίηση του DNA DSB επισκευή εστίες 1 ώρα μετά την έκθεση σε ακτινοβολία δεν αποκάλυψε καμία διαφορά στον αριθμό των εστιών που επάγεται μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και τα κύτταρα επωάζονται με εξωσώματα είτε από μη-ακτινοβολημένα ή από ακτινοβολημένα κύτταρα δότη (Σχήμα 4Α). Έξι ώρες μετά τη θεραπεία βρήκαμε ένα μειωμένο αριθμό εστιών επισκευής σε κύτταρα BHY επωάστηκαν με εξωσώματα απομονώθηκαν 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση των κυττάρων BHY όταν συγκρίνονται με κύτταρα που επωάστηκαν με εξωσώματα από κύτταρα μη-ακτινοβολημένα BHY, γεγονός που υποδηλώνει μια ταχύτερο ρυθμό της επισκευής (Εικόνα 4Β και 4C). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν μετά από 6 ώρες για εξωσώματα απομονώθηκαν 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση (Σχήμα 4C). Επίσης, η ανάλυση της κατανομής των εστιών αριθμούς ανά κύτταρα μετά από επώαση με εξωσώματα αντανακλούσε την αυξημένη επισκευή σε κύτταρα κατεργασμένα με εξωσώματα από ακτινοβολημένα κύτταρα δότη. Ειδικά ο αριθμός των κυττάρων με υψηλό αριθμό εστιών (& gt? 12) μειώνεται μετά από επώαση με ΕΞΩ 6 Gy (S1A Εικ). Επιπλέον, οι παρατηρούμενες επιδράσεις ήταν επίσης παρόντες 8 και 10 ώρες μετά την ακτινοβόληση (S1B σχήμα). Εάν τα κύτταρα προ-επωάστηκαν για 24 ώρες με τα εξωσώματα, κατόπιν ακτινοβολείται με 2 Gy και σταθερά μετά από 6 ώρες, η ταχύτερη επισκευή επάγεται από εξωσώματα από ακτινοβολημένα κύτταρα δότη ήταν ακόμη παρατηρήσιμα (S1B Εικ). Μια προσθήκη εξωσωμάτων από μη ακτινοβολημένα κύτταρα BHY φάνηκε να αυξάνει ελαφρώς τον αριθμό εστιών σε σύγκριση με τον μάρτυρα (PBS) στα κύτταρα δέκτες 6 ώρες μετά την ακτινοβόληση (Εικόνα 4Β και 4C). Η επίδραση αυτή δεν ήταν παρούσα μετά την προ-επώαση των κυττάρων με εξωσωμάτων και επακόλουθη ακτινοβολία (S1c Σχήμα).

(Α) Αριθμός 53BP1 εστιών στα κύτταρα BHY 1 ώρα μετά την ακτινοβόληση με 0 και 2 Gy και μεταφορά του BHY εξωσώματα απομονώθηκαν 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με 0 και 6 Gy [n = 5]. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του 53BP1 εστιών στα κύτταρα BHY 6 ώρες μετά 2 Gy και μεταφορά του BHY εξωσωμάτων απομονώθηκαν 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με 0, 3, 6 ή 9 Gy (53BP1 εστίες πράσινο, πυρήνες μπλε). (C) Αριθμός 53BP1 εστιών στα κύτταρα BHY 6 ώρες μετά 2 Gy και μεταφορά του BHY εξωσωμάτων απομονώθηκαν 24 και 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση [n

1 (έλεγχος? ΕΞΩ 0 Gy 24 ώρες? ΕΞΩ 6 Gy 24 ώρες) = 6 , n

2 (ΕΞΩ 0 Gy 48 ώρες? ΕΞΩ 3 Gy? ΕΞΩ 6 Gy 48 ώρες? ΕΞΩ 9 Gy) = 3]. (Δ) Αριθμός 53BP1 εστιών στα κύτταρα FaDu 6 ώρες μετά από 2 Gy και τη μεταφορά των FaDu εξωσωμάτων [n = 3]. (Ε) Αριθμός 53BP1 εστιών στα κύτταρα FaDu 6 ώρες μετά από 2 Gy και τη μεταφορά των BHY εξωσωμάτων [n = 3]. (F) Αριθμός 53BP1 στα κύτταρα BHY μετά από 2 Gy και τη μεταφορά των αποσταθεροποίησε εξωσωμάτων BHY. Τα εξωσώματα από κύτταρα BHY απομονώθηκαν 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με 0 και 6 Gy υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΚΝάση Α ή ένα μίγμα από Triton και θρυψίνη [n

1 (έλεγχος? Άθικτου) = 6? n

2 (RNase Α 5 μg /μl) = 2? n

3 (RNase A 400 μg /μl? Triton + θρυψίνη) = 3]. Για όλα τα πειράματα ο ± SD δείχθηκε και ρ-τιμές που υπολογίζονται για τον έλεγχο θεωρήθηκαν σημαντικές εάν ρ * & lt? 0.05 και εξαιρετικά σημαντική ** αν p & lt? 0,01, ενώ

▲ p & lt? 0,05 και

▲▲ p & lt? 0.01 δείχνουν σημαντικές διαφορές στο εξω 0 Gy.

Η

εξωσωμάτων διεγείρεται επιδιόρθωση του DNA επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας ένα δεύτερο κεφάλι και κυτταρική σειρά καρκίνου του τραχήλου FaDu. Και πάλι η επώαση των κυττάρων δεκτών FaDu με εξωσώματα απομονώθηκαν από ακτινοβολημένα κύτταρα FaDu μειώθηκε το ποσό της επιδιόρθωσης του DNA εστιών (Εικ 4D). Για να δοκιμαστεί η ειδικότητα κυτταρικού τύπου εξωσωμάτων που προκαλείται επιπτώσεις προσθέσαμε εξωσώματα απομονώθηκαν από τα κύτταρα BHY σε ακτινοβολημένα κύτταρα FaDu. Τα εξωσώματα από κύτταρα BHY είναι σε θέση να εκτελέσει παρόμοιες ραδιοπροστατευτικών επιδράσεις στα κύτταρα FaDu (Σχήμα 4Ε).

Τέλος αποσταθεροποιηθεί εξωσώματα μέσω της υψηλής συγκέντρωσης ΚΝάσης Α θεραπεία ή με την προσθήκη ενός απορρυπαντικού-πεπτιδάσης-μίγμα. Αποσταθεροποιημένη 0 Gy και 6 Gy εξωσώματα δεν ήταν σε θέση να αλλάξετε τον αριθμό των επισκευών εστιών σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα εξωσώματα που δείχνει μια απώλεια λειτουργίας λόγω της θεραπείας (Σχήμα 4F). Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα αυτά, εξωσώματα επηρεάσει την επιδιόρθωση του DNA DSBs σε μια δοσοεξαρτώμενη, τύπος κυττάρων απροσδιόριστα τρόπο.

4 Συζήτηση

Κυτταρική επικοινωνία μέσω εξωσώματα είναι σε θέση να επηρεάσει την τύχη των κυττάρων σε καταστάσεις στρες [9, 10, 22, 23]. Δείχνουμε τώρα μια συμβολή εξωσωμάτων στην αυξημένη επιβίωση του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κυττάρων μετά την ακτινοβόληση. Τα εξωσώματα εκκρίνεται εντός 24 ωρών μετά την ακτινοβολία έχουν αντίκτυπο επί του πολλαπλασιασμού, της επιβίωσης των κυττάρων, και την αποτελεσματικότητα επιδιόρθωση του DNA. Κατά συνέπεια, η επικοινωνία των κυττάρων μέσω εξωσώματα κατά τη διάρκεια της ακτινοβολίας κατά του όγκου μπορεί να προωθήσει την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων και ενισχύει την επιβίωση του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κύτταρα και τα δύο, εντός και εκτός του πεδίου ακτινοβολίας. Ως εκ τούτου, θα χρειαστεί μια καλύτερη κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών εξωσωμάτων στην απάντηση της ακτινοβολίας για τη βελτίωση των στρατηγικών για την ακτινοθεραπεία.

4.1 Εξωσώματα αυξάνει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων πλακώδους καρκινώματος κεφαλής και του τραχήλου

δείχνουμε ότι εξωσώματα επηρεάσει την τύχη των ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα BHY και FaDu. Τα εξωσώματα αυξάνουν την επιβίωση των ακτινοβολημένων κυττάρων δεκτών. Οι prosurvival επιδράσεις εξωσωμάτων από ακτινοβολημένα κύτταρα του δότη ήταν πιο έντονη από εκείνες που προκαλούνται από εξωσώματα από μη-ακτινοβολημένα κύτταρα δότη. Σύμφωνα Hazawa et al. έδειξε ότι η μεταφορά των εξωσωμάτων από μη-ακτινοβολημένα κύτταρα σε 8 Gy-ακτινοβολημένα μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων έχει σαν αποτέλεσμα αυξημένη επιβίωση [24].

Αντίστοιχα, εξωσώματα επάγουν πολλαπλασιασμό σε μη-ακτινοβολημένα κύτταρα δέκτες. Αυτή η επίδραση είναι ανεξάρτητη από την ακτινοβολία-επεξεργασία των κυττάρων εξωσωμάτων δότη. Στην πρόσφατη βιβλιογραφία οι επιπτώσεις εξωσωμάτων στον πολλαπλασιασμό συζητηθεί αμφιλεγόμενα. Παρόμοια με τα αποτελέσματά μας, εξωσώματα που προέρχονται από καρκινικά κύτταρα κύστης, χρόνια μυελοειδή κύτταρα λευχαιμίας, ή σιτευτικά κύτταρα αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων-δεκτών μετά τη μεταφορά εξωσωμάτων [8, 25-27]. Ωστόσο, Jella et al. έδειξε μειωμένη βιωσιμότητα των κερατινοκυττάρων μετά από επώαση σε μέσο καλλιέργειας εξωσωμάτων που περιέχουν [14].

4.2 Εξωσώματα επηρεάζουν το DNA διπλό σκέλος επισκευής διάλειμμα μετά την ιονίζουσα ακτινοβολία στο κεφάλι και το λαιμό κύτταρα πλακώδους καρκινώματος

υποτιθέμενη ότι εξωσώματα μπορεί να προάγει την επιβίωση πυροδοτώντας την επιδιόρθωση του DNA, όπως δείχθηκε ότι η φωσφορυλίωση των κρίσιμων πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA επηρεάζεται από εξωσώματα [21]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι επιδιόρθωσης DNA δεν επηρεάστηκε από εξωσώματα σε πρώιμο χρονικό σημείο μετά την ακτινοβόληση (1 ώρα), ενώ αυξημένη επιδιόρθωση του DNA βρέθηκε μετά από επώαση με εξωσώματα από ακτινοβολημένα κύτταρα δότη σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (6-10 h). Καθώς η αυξημένη επιδιόρθωσης του DNA ήταν εξίσου ανιχνευθεί για μια επώαση 6 ώρες κατά την οποία μόνο ένας περιορισμένος αριθμός εξωσωμάτων συνδέεται με τα κύτταρα και μετά από μια προ-επώαση με εξωσώματα υποθέτουμε ότι μία μικρή ποσότητα εξωσωμάτων είναι επαρκής για να επάγει τα παρατηρούμενα αποτελέσματα. Διαφορετικές πτυχές των επιπτώσεων εξωσωμάτων για την επιδιόρθωση του DNA αναλύθηκαν σε δύο πρόσφατες μελέτες. Ένα έδειξε ότι παρατηρήθηκε αυξημένος αριθμός των εστιών επιδιόρθωσης του DNA μετά τη μεταφορά εξωσωμάτων από μη ακτινοβολημένα κύτταρα καρκίνου του μαστού σε φυσιολογικά ανθρώπινα πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα του μαστού [21]. Χρησιμοποιώντας τον κομήτη-δοκιμασία, Al-MAYAH et al. Από την άλλη πλευρά έδειξε ότι εξωσώματα αυξάνουν την βλάβη του DNA των καρκινικών κυττάρων του μαστού επιθηλιακών [12].