Αφηρημένο

Για να προωθηθεί ο συστηματικός εντοπισμός των νέων γονιδίων με σημαντικές λειτουργικές ρόλους στον καρκίνο του παγκρέατος, έχουμε επινόησε μια στρατηγική διαλογής πολλαπλών σταδίων για να παρέχει μια λογική βάση για την επιλογή των εξαιρετικά επίκαιρο μυθιστόρημα υποψήφια γονίδια με βάση τα αποτελέσματα των αναλύσεων λειτουργικών υψηλής περιεκτικότητας. Η ροή εργασιών περιελάμβανε τρία διαδοχικά στάδια: 1) την έκφραση του γονιδίου σειριακή αναλύσεων, των πρωτογενών ανθρώπινων παγκρεατικών ιστών, καθώς και μια σειρά από

in vivo

και

in vitro

μοντέλα χαρακτηριστικών ογκο-σχετικών προκειμένου για τον εντοπισμό γονιδίων με εμφανή τα πρότυπα έκφρασης? 2) η χρήση της τεχνολογίας «αντίστροφη διαμόλυνση συστοιχία» για μεγάλης κλίμακας παραλληλοποιημένων λειτουργικές αναλύσεις των δυνητικών υποψηφίων γονιδίων σε δοκιμασίες που βασίζονται στα κύτταρα? και 3) την επιλογή των επιμέρους υποψήφια γονίδια για περαιτέρω εις βάθος εξέταση των κυτταρικών τους ρόλους τους. Ένα σύνολο των 14 γονιδίων, μεταξύ των οποίων 8 από «druggable» οικογένειες γονιδίων, ταξινομήθηκαν ως υποψήφιοι υψηλή προτεραιότητα για μεμονωμένες λειτουργικό χαρακτηρισμό. Ως παράδειγμα για να αποδείξει την εγκυρότητα της προσέγγισης, ολοκληρωμένη λειτουργικά δεδομένα για υποψήφιο γονίδιο ADRBK1 /ΟΚΚ2, η οποία έχει προηγουμένως δεν είχε εμπλακεί στον καρκίνο του παγκρέατος, παρουσιάζεται

Παράθεση:. Buchholz Μ, Honstein Τ, Kirchhoff S , Kreider R, Schmidt Η, Sipos Β, et al. (2015) Μια Multistep High-Content προσέγγιση διαλογής για την Αναγνώριση Νέων λειτουργικά γονίδια στόχους σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 10 (4): e0122946. doi: 10.1371 /journal.pone.0122946

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Chunhong Yan, Γεωργία Regents του Πανεπιστημίου, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 23 Ιούλη του 2014? Αποδεκτές: 30 Δεκ του 2014? Δημοσιεύθηκε: 7 του Απρίλη, 2015

Copyright: © 2015 Buchholz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Τα δεδομένα έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων ArrayExpress στο Ευρωπαϊκό Κέντρο για την Βιοπληροφορική (EBI). Τα δεδομένα μπορεί να έχει πρόσβαση στην βάση δεδομένων ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress), υπό τους ακόλουθους αριθμούς πρόσβασης: Δεδομένα που με το μοντέλο SUIT2 μετάστασης: E-mtab-3344? Σύνολο δεδομένων σε κύτταρα SPC Μεταχείριση PaTuII: E-mtab-3363? Σύνολο δεδομένων για την πρωτοβάθμια ανθρώπινων παγκρεατικών ιστών: E-mtab-3365? Σύνολο δεδομένων σχετικά με τις Patù-8988s και -t μοντέλο διαφοροποίησης: E-mtab-3366? Σύνολο δεδομένων για την επίδραση των μεταλλάξεων RAS στο TGFB1 που προκαλείται φαινοτύπου των κυττάρων PANC-1: E-mtab-3364? Σύνολο δεδομένων για την ανάπτυξη του παγκρέατος: E-mtab-3368? σύνολο δεδομένων σχετικά με την επεξεργασία ATRA των κυττάρων NB4: E-mtab-3369? σύνολο στοιχείων σχετικά με την αντοχή απόπτωση σε Capan-1 κύτταρα: E-mtab-3370? Σύνολο δεδομένων σε 2D εναντίον 3D πολιτισμό:. E-mtab-3372

Χρηματοδότηση: Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το 6ο ΠΠ της ΕΕ LSHB-CT-2006 – 018771 επιχορήγηση (Integrated Project «MolDiag-Paca»), το γερμανικό ομοσπονδιακό Υπουργείο παιδείας και έρευνας (BMBF) στο πλαίσιο του προγράμματος της ιατρικής έρευνας του γονιδιώματος (PaCa-Net? ID έργο PKB-01GS08 και 01GS08178), το γερμανικό Ίδρυμα Ερευνών (DFG? χορηγούν Bu 1536 /3-1 για να MB), και το 7ο ΠΠ της ΕΕ δεν χορηγούν. 602783 (ολοκληρωμένο έργο μεγάλης κλίμακας «CAM-PAC»). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

PDAC είναι μια θανατηφόρα ασθένεια που έχει ένα ποσοστό πενταετούς επιβίωσης κάτω από 6%, το οποίο είναι το χαμηλότερο για όλους τους συμπαγείς όγκους [1]. Τα πρώιμα συμπτώματα είναι σπάνια και ασυνήθιστη, έτσι ώστε μόνο το 8% των PDAC περιπτώσεις θα είναι σε τοπικό και χειρουργήσιμη στάδιο κατά τη στιγμή της διάγνωσης, ενώ η πλειοψηφία των ασθενών θα πρέπει να διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο, περιφερειακές (27%) ή απομακρυσμένα (53 %) στάδιο. Από την προηγμένη PDAC είναι εγγενώς ανθεκτικό στις περισσότερες διαθέσιμες θεραπείες, οι περισσότεροι ασθενείς πεθαίνουν τέσσερις έως έξι μήνες μετά τη διάγνωση [1].

Οι ασθενείς με μεταστατική νόσο λαμβάνουν συστηματική παρηγορητική χημειοθεραπεία, με γεμσιταβίνη είναι το πρότυπο της περίθαλψης [2]. Πολυάριθμες μάταιη δοκιμές έχουν διεξαχθεί για να βελτιωθεί η έκβαση σε ασθενείς με μεταστατική νόσο με τη χρήση συνδυασμών με gemcitabine-ραχοκοκαλιάς. Μόνο πρόσφατα, οι νέες αγωγές χημειοθεραπείας συνδυασμού, όπως FOLFIRNOX [3] πέτυχαν σημαντικό όφελος επιβίωσης, αν και το κόστος της σημαντικά ενισχυμένη τοξικότητα. Πολλαπλές δοκιμές νέων στοχευμένων θεραπειών απέτυχε να παρουσιάσει ανωτερότητα έναντι μόνη γεμσιταβίνη [4], με τον αναστολέα erlotinib τυροσίνης κινάσης είναι ο μόνος παράγοντας στόχος να δείξει ένα μικρό αλλά σημαντικό όφελος επιβίωσης 14 ημερών [5]. Καινοτόμες προσεγγίσεις για τη βελτίωση της χορήγησης φαρμάκων, όπως η λευκωματίνη δεσμεύεται paclitaxel [6], έχουν αναπτυχθεί και να δείξει ελπιδοφόρα αποτελέσματα στις πρώτες δοκιμές, αλλά θα ave να τεκμηριώνονται. Υπάρχει έτσι μια συνεχής και επιτακτική ανάγκη για την ταυτοποίηση νέων εννοιών και των στόχων που μπορούν να παρέχουν νέους τρόπους για να πολεμήσουν την ασθένεια αυτή.

Όπως και για πολλές άλλες ασθένειες, μεγάλης κλίμακας γονιδιωματική, transcriptomic και, σε κάπως μικρότερο βαθμό, πρωτεομική αναλύσεις έχουν συμβάλει στη δημιουργία ολοκληρωμένης καταλόγους των μορίων που έχουν αλλοιωθεί ως προς τη δομή ή /και την αφθονία τους σε όγκους του παγκρέατος (π.χ. [7-21]. Πολύ λιγότερο ανεπτυγμένες είναι έννοιες και τις μεθόδους για να ανακρίνουν τις λειτουργίες των γονιδίων σε μεγάλη κλίμακα, προκειμένου να διαφοροποιούν «οδηγός» αλλαγές, οι οποίες συμβάλλουν άμεσα στην κακοήθη μετασχηματισμό και την εξέλιξη του όγκου, από το «επιβάτης» αλλαγές, οι οποίες έχουν ελάχιστη ή καμία επίδραση στην βιολογία του όγκου. Κατά συνέπεια, παραδείγματα επιτυχημένων μετάφραση των γνώσεων που παράγονται από προσεγγίσεων «-ωματικής» σε μυθιστόρημα κλινικές έννοιες και εφαρμογές είναι λίγες και σπανίζουν.

Περιγράφουμε εδώ μια πολυσταδιακή στρατηγική με σκοπό να παρακάμψει αυτό το πρόβλημα παρέχοντας μια λογική βάση για την επιλογή των εξαιρετικά επίκαιρο μυθιστόρημα υποψήφια γονίδια με βάση τα αποτελέσματα των λειτουργικών αναλύσεων υψηλής περιεκτικότητας . Για το σκοπό αυτό, η ροή εργασίας της μελέτης περιελάμβανε τρία διαφορετικά στάδια: 1) δημιουργία προφίλ έκφρασης γονιδίου σειριακές αναλύσεις πρωτογενών ανθρώπινων παγκρεατικών ιστών, καθώς και μια σειρά από

in vivo

και

in vitro μοντέλα

της ανάπτυξης παγκρέατος, κυτταρική διαφοροποίηση, εισβολή, μετάσταση, αντίσταση απόπτωση κ.λπ. χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες συστοιχίες των εστιασμένων συλλογές cDNA για τον εντοπισμό γονιδίων με εμφανή μοτίβα έκφρασης? 2) η χρήση του «αντίστροφη σειρά διαμόλυνση« τεχνολογία [22,23] για μεγάλης κλίμακας παραλληλοποιημένων λειτουργικές αναλύσεις των υποψηφίων γονιδίων που επιλέγονται από το στάδιο 1 σε δοκιμασίες με βάση κύτταρα εκτελούνται σε μικροσκόπιο μορφή συστοιχίας slide? και 3) την επιλογή των μεμονωμένων υποψηφίων γονιδίων που δείχνουν σχετικές λειτουργικές επιδράσεις στην παραλληλισθέντες δοκιμασίες για περαιτέρω εις βάθος εξέταση των κυτταρικών τους ρόλους τους. Ως παράδειγμα για να αποδείξει την εγκυρότητα αυτής της προσέγγισης, ολοκληρωμένα στοιχεία σχετικά με προηγουμένως άγνωστες λειτουργίες ενός υποψηφίου γονιδίου επιλέγονται μέσω αυτής της διαδικασίας (ADRBK1 /ΟΚΚ2) σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα παρουσιάζεται.

Η πλήρης ροή του πολλαπλών βημάτων γονιδίου επιλογή /διαδικασία χαρακτηρισμού σχηματικά σκιαγραφείται στο Σχήμα 1.

η

ΥΛΙΚΑ κΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

παραγωγή σειρά cDNA και υβριδισμού

παραγωγή συστοιχίες cDNA, εξόρυξη και ραδιενεργών επισήμανση των ολικού RNA, καθώς και την υβριδοποίηση και την ποσοτικοποίηση των σημάτων υβριδισμού διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [24,25]. Εν συντομία, τα cDNA ενισχύθηκαν με PCR και παρατάσσονται εις διπλούν πάνω σε μεμβράνες νάιλον με τη χρήση ρομποτικών συσκευών.

Το συνολικό RNA αντίστροφη μεταγραφεί και radiactively επισημαίνονται με 33Ρ-dATP χρησιμοποιώντας το StripEZ-RT Kit (Ambion) και υβριδοποιήθηκε όλη τη νύχτα σε νάιλον συστοιχίες μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης ULTRArray (Ambion) στους 50 ° C. Τα ραδιενεργά σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα STORM φωσφόρου απεικόνισης (Amersham Biosciences, Feiburg, Γερμανία) και ποσοτικά με το λογισμικό ArrayVision (InterFocus, Haverhill, Μεγάλη Βρετανία). εντάσεις σήματος κανονικοποιήθηκαν προς την μέση ένταση σήματος όλων των χαρακτηριστικών σε μεμονωμένη συστοιχία

Γονίδια ορίστηκαν ως εκφράζονται διαφορικά μεταξύ δύο σύνολα δειγμάτων εάν: (1). η μέση τιμή της έκφρασης κανονικοποιούνται υπέρβαση 0,5 σε τουλάχιστον ένα από τα δύο σύνολα δειγμάτων, (2) η διαφορά μεταξύ των μέσων τιμών ομαλοποιημένη έκφραση ήταν τουλάχιστον διπλάσιο μεταξύ των σετ δείγματος και (3) ένα διπλής όψης t test έδωσε αξία ap μικρότερη από 0,05.

Raw δεδομένα όλων των πειραμάτων μπορεί να έχει πρόσβαση σε https://www.staff.uni-marburg.de/~buchhol3/RevTrans/

Το παρακάτω γονιδιακής έκφρασης προφίλ πειράματα των ιστών και

in vivo /in vitro

μοντέλα για τη σειριακή χαρακτηρισμό των υποψηφίων γονιδίων διεξήχθησαν:.

Πρωτοβάθμια ανθρώπινους ιστούς

Ένα σύνολο 16 κλινικά δείγματα από πορογενές αδενοκαρκίνωμα, 6 δείγματα από χρόνια παγκρεατίτιδα, και 4 δείγματα από μορφολογικά κανονικών περιθωρίων εκτομή από χρόνιες resectates παγκρεατίτιδα αναλύθηκαν. Τα δείγματα που παρέχονται από το τμήμα Χειρουργικής στο Πανεπιστήμιο του Ulm (Γερμανία), καθώς και το τμήμα παθολογίας του Πανεπιστημίου του Κιέλου (Γερμανία). Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από τη χρήση δειγμάτων ιστών. Η μελέτη εγκρίθηκε από τις τοπικές επιτροπές δεοντολογίας στα Πανεπιστήμια του Ulm και Κίελο (Ethikkommission der Universität Ulm? Ethikkommission der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel)

Παγκρέατος Ανάπτυξης

Το συνολικό RNA.. από κανονικό ανθρώπινο πάγκρεας ενηλίκου και εμβρύου ανθρώπινο πάγκρεας αγοράσθηκαν από την Clontech. Κάθε ομαδοποιημένο δείγμα ανεξάρτητα επισημαίνονται και υβριδοποιήθηκε 3 φορές.

θεραπεία ATRA των κυττάρων λευχαιμίας ΝΒ4.

Η οξεία προμυελοκυτταρική κυτταρική γραμμή λευχαιμίας που προέρχεται, ΝΒ4 [26], αναπτύχθηκε στους 37 ° C σε 5% CO2 σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 2 mM Ε-γλουταμίνη και 10% αποσυμπληρωμένο ορό εμβρύου μοσχαριού. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες με ή χωρίς 1 μΜ All-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA? Sigma-Aldrich). Αντίγραφα των 3 ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκαν.

θεραπεία SPC των κυττάρων Patù ΙΙ.

Sphingosylphosphorylcholine (SPC) είναι μια βιοδραστικών λιπιδίων με πολλαπλές βιολογικές ρόλους συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης της διαφοροποίησης σε εμβρυϊκά και καρκινικά κύτταρα. Patu II καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (ΡΑΑ, Pasching, Αυστρία) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα και 5% CO2, 95% αέρα σε 37 ° C. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 15 μΜ SPC σε 2 ώρες άνευ ορού Medium FPR ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Αντίγραφα των 3 ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκαν.

2D εναντίον καλλιέργειες 3D κυττάρων.

Το παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική σειρά A818-1 αναπτύχθηκε είτε σε 2D μονοστιβάδες ή σε 3-διαστάσεων «κοίλες σφαίρες» όπως περιγράφεται [27]. Ολικό RNA εξήχθη από 3 ανεξάρτητα πειράματα και αναλύθηκαν εις διπλούν.

patu-8988s and-t μοντέλο διαφοροποίησης.

patu-8988s και Patù-8988t είναι δύο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από το ίδιο μετάσταση στο ήπαρ ενός ανθρώπινου πρωτογενούς παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, αλλά διαφέρουν ως προς την κατάσταση διαφοροποίησης τους και μεταστατική ικανότητα [28]. Η κακώς διαφοροποιημένη κυτταρική γραμμή Patù-8988t ήταν επιμολυσμένα με ένα κατασκεύασμα έκφρασης ή φορέα αναφοράς Ε-καδερίνης, αντίστοιχα, και οι μεμονωμένοι κλώνοι αναλύθηκαν με προφίλ έκφρασης. Επιπλέον, 3 ανεξάρτητα παρασκευάσματα του αγρίου τύπου Patù-8988s κύτταρα αναλύθηκαν.

μοντέλο SUIT2 μετάστασης.

S2-007 και S2-028 είναι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από την ίδια πρωτογενή παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα αλλά displying μεγάλες διαφορές σε επεμβατικές και μεταστατικό δυναμικό τους τόσο in vitro όσο και in vivo [29]. Τρεις ανεξάρτητες παρασκευάσματα κάθε ένα από τα πολύ μεταστατικός S2-007 και το χαμηλό μεταστατικό S2-028 κυτταρική γραμμή αναπτύχθηκε σε κυτταρική καλλιέργεια 2D (ϋΜΕΜ (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (ΡΑΑ , Pasching, Αυστρία) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα και 5% CO2, 95% αέρα στους 37 ° C) αναλύθηκαν με προφίλ έκφρασης.

απόπτωση αντοχής σε κύτταρα Capan-1.

παγκρέατος τα καρκινικά κύτταρα είναι εγγενώς ιδιαίτερα ανθεκτικά σε αυθόρμητη ή προκαλούμενη από χημειοθεραπεία απόπτωση. Η ανθρώπινη παγκρεατική καρκινική κυτταρική σειρά Capan-1 (pRB + /p16-) ήταν σταθερά επιμολυσμένα με έκφραση ρ16 κατασκευάσματα ή πλασμίδια ελέγχου όπως περιγράφεται [30] για να απενεργοποιηθούν λειτουργικά pRB. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν και αναλύθηκαν εις διπλούν.

Επίδραση των μεταλλακτών RAS στην TGFB1 επαγόμενη φαινότυπο των κυττάρων PANC-1.

Έχουμε περιγράψει προηγουμένως προφίλ έκφραση της επιρροής των μεταλλακτών RAS σχετικά με την TGFB1 επαγόμενη φαινότυπο του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρική γραμμή PANC-1 [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα PANC-1 σταθερά επιμολυσμένα με ένα κυρίαρχο αρνητικό HRAS (S17N) μετάλλαξη, μία ουσιαστικά δραστική KRAS2 (G12V) μετάλλαξη, ή ψευδο-διαμολυσμένα με κατασκεύασμα έκφρασης EGFP υποβλήθηκαν σε αγωγή με TGFB1 ή αφεθεί χωρίς θεραπεία, αντίστοιχα. Τρία ανεξάρτητα πειράματα έκαστο αναλύθηκαν εις διπλούν.

Κυτταρικές γραμμές για παραλληλισθέντες και μεμονωμένες λειτουργικές δοκιμασίες

Panc-1 [31] και ΗΕΚ-293 [32] κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, USA). S2-007 και S2-028 ήταν από Τ Iwamura [33] (Miyazaki Medical College, Μιγιαζάκι, Ιαπωνία). κύτταρα IMIM-PC1 ευγενικά παρέχεται από Ρ.Χ. Πραγματικό [34] (CNIO, Μαδρίτη, Ισπανία).

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Eagle Medium του Dulbecco (DMEM) που περιέχει 10% FBS και 0,05 mg /ml γενταμικίνη σε 37 ° C και 5% (ν /ν ) CO2.

Αντίστροφη συστοιχίες επιμόλυνση

Πλήρης μήκος ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs) όλων των υποψηφίων και τον έλεγχο των γονιδίων είχαν αγοραστεί ως cDNA κλώνοι από Open Biosystems (Lafayette, CO, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής), PCR- ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ειδικούς εναρκτήρες και κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pENTR (Invitrogen /Life Technologies, Darmstadt, Germany). ORFs κατόπιν μπαλάκι στους φορείς έκφρασης pdECFP και pdEYFP [35] χρησιμοποιώντας το σύστημα κλωνοποίησης πύλης (Invitrogen /Life Technologies, Darmstadt, Germany). Κάθε ORF ήταν επομένως διαθέσιμο ως ένα Ν-τερματική σύντηξη με κατασκεύασμα κυανό φθορίζουσα πρωτεΐνη (CFP), καθώς και μια C-τερματική σύντηξη κατασκεύασμα με κίτρινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (YFP).

Για την παραγωγή του «αντίστροφη μικροσυστοιχίες διαμόλυνση ‘ , κατασκευάσματα έκφρασης κηλιδώθηκαν πάνω σε γυάλινες πλάκες σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο τροποποιημένο από [22]. 4 μg από κάθε πλασμίδιο DNA αναμίχθηκε με 11 μΙ PBS και 2 μΙ Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) σε μία πλάκα 96 φρεατίων καλλιέργειας κυττάρων. Μετά από 20 λεπτά επώαση σε RT, 15 μΐ ζελατίνη (0,1% σε PBS) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. μείγματα επιμόλυνσης ήταν παραταγμένα σε γυάλινες πλάκες Superfrost Plus (Menzel GmbH, Braunschweig, Γερμανία) χρησιμοποιώντας μια Tecan Miniprep 75 αυτοματοποιημένης επεξεργασίας του δείγματος (Tecan, Männedorf, Ελβετία), δημιουργώντας σημείο μεγέθη διαμέτρου 0,5-1,5 mm. Τα πλακίδια ξηραίνονται και αποθηκεύονται έως 3 εβδομάδες σε μια ξηρή ατμόσφαιρα στους 4 ° C. Για την παραγωγή των ζώντων μικροσυστοιχίες κυττάρων, τα πλακίδια τοποθετήθηκαν σε πλάκες quadriPERM (Sarstedt, Nümbrecht, Γερμανία), σπάρθηκε με 4,5 χ 10

5 ΗΕΚ-293, 4 x 10

5 Panc-1, ή S2-007: 5 χ 10

4 S2-007 σε ΟΜΕΜ /10% FCS και επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Ζωντανές μικροσυστοιχίες κυττάρων σταθεροποιήθηκαν για 15-30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4% σε PBS και βάφτηκαν αντίθετα και συναρμολογείται χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης DAPI περιέχει (Vector Laboratories, Burlingame, USA). Έκφραση κατασκευασμάτων σύντηξης και υποκυτταρικός εντοπισμός των προϊόντων του γονιδίου τεκμηριώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Axiovert 200 φθορισμού μικροσκόπιο (Carl Zeiss GmbH, Göttingen, Germany). Ενδεχομένως, οπτικές ενότητες του φθορισμού δείγματα παρήχθησαν σε μεγέθυνση 630χ χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Zeiss ApoTome (https://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/apotome-2-for-biology.html).

Antibody επώαση και ανίχνευση πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για τα μεμονωμένα αντισώματα, αντίστοιχα. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν:

αντι-Κί67: 1: 400, κουνελιού πολυκλωνικό, ab833, Abcam, Cambridge, UK

αντί-Κυκλίνη Β1: 1: 100, μονοκλωνικό ποντικού, cat. # 4135, Cell Signaling Technology, Danvers, USA

αντι-ACTIVE-Casapse-3: 1: 150, κουνελιού πολυκλωνικό, cat. # G7481, Promega, Madison, USA

αντι-βιμεντίνης: 1: 200, μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, ab28028, Abcam, Cambridge, UK

αντι-Ε-καδχερίνη: 1: 100, μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού , Γάτα. # 610181, BD Biosciences, Sparks, USA

IgG αντι-κουνελιού (Cy3) 1: 500, πολυκλωνικά κατσίκας, ab6939, Abcam, Cambridge, UK

αντι-ποντικού IgG (Cy3) 1 : 500, πολυκλωνικό κατσίκα, ab97035, Abcam, Cambridge, UK

η

απομόνωση του mRNA και της πρωτεΐνης εξόρυξη

απομόνωση του RNA έγινε με τη χρήση του peqGOLD ολικό RNA Kit (Biotechnology peqlab GmbH, Erlangen, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συγκεντρώσεις ποσοτικοποιήθηκαν με τη NanoDrop ND-1000 (peqlab Biotechnology GmbH) που ακολουθείται από σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA από 1 μg συνολικού RNA χρησιμοποιώντας το κιτ Omniscript και το πρωτόκολλο (Qiagen, Hilden, Germany).

Για ολική πρωτεΐνη τα εκχυλίσματα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε μέσο καλλιέργειας (13 000 rpm, RT, 5 λεπτά). Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε PBS, συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεϊνάσης (G-Biosciences, Maryland Heights, USA) και επεξεργασία με υπερήχους με ένα Labsonic U (B.Braun, Melsungen, Germany). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτείνης Bradford και μετριέται με το Multiskan FC φωτόμετρο (Thermo Scientific, Langenselbold, Γερμανία).

qRT-PCR και ανοσοστύπωμα

πρώτου κλώνου cDNA ενισχύθηκαν σε 7.500 Fast real-Time PCR System (Applied Biosystems, Warrington, USA) χρησιμοποιώντας Ισχύς SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) και ειδικά ζεύγη εκκινητών σχεδιάστηκε με το πρόγραμμα PrimerExpress (Applied Biosystems, για ακολουθίες δείτε συμπληρωματικό υλικό).

για κηλίδα Western, 10 ng της συνολικής πρωτεΐνης εκχυλίσματα φορτώθηκαν και διαχωρίστηκαν με 10 ή 15% SDS-PAGE. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Whatman GmbH, Dassel, Germany) και αποκλείστηκαν για 4-6 ώρες στους 4 ° C σε 1xTBS, 0,1% Tween 20 και 5% γάλα σε σκόνη. Πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν 1: 1 000 σε ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. ΤΒδ-Τ (0,1%) χρησιμοποιήθηκε ως ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης. Το συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα κατσίκας-αντι-κουνελιού αραιώνεται 1:10 000 και επωάστηκαν για 1-2 ώρες στους 4 ° C σε ρυθμιστικό αποκλεισμού. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ανοσοαποτύπωση ECL (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Γερμανία).

Κατασκευή και ανάλυση των μικροσυστοιχιών ιστού

Για την κατασκευή του μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs), 1 mm ( όγκου) και 1,5 mm (φυσιολογικός ιστός) μεγέθους βιοψίες ιστού εκχυλίστηκαν από μπλοκ δότη παραφίνης και μεταφέρθηκε σε προ-διάτρητες τρύπες σε μπλοκ παραφίνης παραλήπτη με ένα microarrayer ιστού (Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, USA) εξοπλισμένη με μία αναμνηστική TMA (Alphelys, Plaisir, Γαλλία). σχεδιαγράμματα του δικτύου για όγκο και φυσιολογικό παγκρεατικό ιστό TMAs έχουν σχεδιαστεί με το λογισμικό TMA Designer 2 (Alphelys). Τα μπλοκ δέκτη σφραγίστηκαν επί 10 λεπτά στους 56 ° C και 30 λεπτά στους 4 ° C. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε δύο φορές. Τα μπλοκ TMA κόπηκαν σε 3.5 μm τομές και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια SuperFrost Plus για ανοσοϊστοχημική χρώση. Η χρήση ανθρώπινων ιστών για ερευνητικούς σκοπούς εγκρίθηκε από τοπική επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου, Tübingen (470 /201BO1), και Κλινική Χειρουργικής του Πανεπιστημίου της Χαϊδελβέργης, στη Γερμανία (301/2001).

Η ανοσοϊστοχημική χρώση ήταν εκτελείται με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ADRBK1 (Thermo Fischer, # MA5-15840? αραίωση 1: 1000), για το σύστημα BenchMark XT Ventana (Ventana Medical Systems, Tucson, USA), συμπεριλαμβανομένης της αποπαραφινώσεως των τμημάτων ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και η θερμότητα που προκαλείται από το αντιγόνο-ανάκτησης.

η ανάλυση των εντάσεων κηλίδωσης διεξήχθη με ένα παθολόγους με εμπειρία σε όγκους του παγκρέατος (BS) με τυφλό τρόπο σχετικά με τις παραμέτρους των όγκων. Η αναλογία των θετικών κυττάρων που δείχνει μια σημαντική χρώση σε περιοχές του όγκου υπολογίστηκε σε εκατοστιαίο ποσοστό και διαιρείται σε βαθμολογίες (1-10% -weak, 11-50% -moderate, & gt? 50% -ισχυρή

επιμόλυνση. του siRNAs

Για μεσολάβηση RNAi αποσιώπηση της έκφρασης ADRBK1, προσχεδιασμένες Silencer siRNAs (Applied Biosystems /Ambion, Austin, ΤΧ, USA) επιμολύνθηκαν σε μία συγκέντρωση 40 nmol χρησιμοποιώντας το λιπιδικό αντιδραστήριο siLentFect (βιο- Rad, München, Germany). Accell μη στόχευση siRNA # 1 (Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Προϊόντα, Lafayette, LA, USA) χρησιμοποιήθηκε ως μη φίμωση του ελέγχου.

αναλύσεις πολλαπλασιασμού και της βιωσιμότητας

Για προσδιορισμούς ενσωμάτωσης BrdU χρησιμοποιώντας κυτταρικού πολλαπλασιασμού ELISA Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 5 000 έως 7 500 κύτταρα επανασπάρθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση σε ένα ViewPlate-96 Μαύρο πλάκα κυτταροκαλλιέργειας (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ , USA). Μετά από όλη τη νύχτα την καλλιέργεια, τα κύτταρα επωάστηκαν 4-6 ώρες με BrdU που περιέχουν μέσο. Μετά από σταθεροποίηση για 1 ώρα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν για 1,5 ώρα με το συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-BrdU αντίσωμα, υπόστρωμα χημειοφωταύγειας προστίθεται και το εκπεμπόμενο φως ποσοτικά με ένα Centro LB 960 φωτόμετρο (Berthold Technologies GmbH, Στουτγάρδη, Γερμανία).

Για προσδιορισμούς ΜΤΤ, 20 000 σε 25 000 κύτταρα επανασπάρθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 24 φρεατίων. Μετά από επιπλέον καλλιέργεια για 24 ώρες ή 48 ώρες, το υπερκείμενο αντικαταστάθηκε από μέσο που περιέχει ΜΤΤ (θειαζολύλιο μπλε, ο Carl Roth GmbH) και οι πλάκες επωάστηκαν για 2 ώρες στους 37 ° C. Μέσο αντικαταστάθηκε με διάλυμα διαλυτοποίησης (10% Triton-100, 0.1 Μ υδροχλωρικό οξύ σε 2-προπανόλη). Εξαφάνιση μετρήθηκε στα 570 nm με την Multiskan FC φωτόμετρο (Thermo Scientific, Schwerte, Γερμανία).

κυτταρομετρία ροής

θρυψίνη κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 1,200 rpm για 3 λεπτά. Μετά την πλύση με PBS, σφαιρίδια διεξοδικά επαναιωρήθηκαν σε 50-100 μΙ PBS και το κυτταρικό εναιώρημα μεταφέρεται στάγδην σε παγωμένο αιθανόλη (70%) υπό συνεχή ανάδευση. Μετά από φυγοκέντρηση σε 1 000 g για 5 λεπτά, το υπερκείμενο προσεκτικά απορρίφθηκε, το σφαιρίδιο πλένεται με 500 μλ παγωμένο PBS και επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ προπιδίου-ιωδιούχου μίγμα (1 mg /ml προπίδιο-ιωδίδιο (Sigma Aldrich) + 500 μg /ml ϋΝΑση ελεύθερο ΚΝάσης (Roche Diagnostics) σε PBS). Τα δείγματα επωάστηκαν για 30-45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και στη συνέχεια μετρήθηκαν με την flowcytometer LSR II (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Για την αξιολόγηση των δεδομένων, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό ModFit LT (Verity Software House, Topsham, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Serial χαρακτηρισμό των υποψηφίων PDAC γονίδια από την έκφραση προφίλ χρησιμοποιώντας cDNA υβριδισμοί σειρά, ανάλυση των δεδομένων και επιλογή των υποψηφίων γονιδίων

Ως ένα πρώτο βήμα προς τη συστηματική ταυτοποίηση νέων λειτουργικά σχετική υποψήφια γονίδια για τον καρκίνο του παγκρέατος, που παράγεται έθιμο συστοιχίες cDNA με παγκρεατική συλλογές cDNA κλώνος ειδική για τον καρκίνο (n = 468 από [7] και [36]), τα οποία επιπροσθέτως επαυξημένης με συλλογές μεγάλης κλίμακας κλώνων cDNA (n = 1.492) από δυνητικά σχετικές οικογένειες γονιδίων όπως κινάσες, φωσφατάσες, γονίδια απόκριση ορού κτλ (βλέπε σύνολα δεδομένων σε συμπληρωματικές πληροφορίες για λεπτομέρειες των συνθέσεων συστοιχίας ). Αυτές οι συστοιχίες στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για έκφραση γονιδίου αναλύσεις πρωτογενών ανθρώπινων παγκρεατικών ιστών, καθώς και μια σειρά από

in vivo

και

in vitro

μοντέλα ανάπτυξης παγκρέατος, κυτταρική διαφοροποίηση, εισβολή, μετάσταση, απόπτωση αντίσταση κ.λπ. (σημειώστε ότι, δεδομένου ότι οι συλλογές κλώνου cDNA για την παραγωγή των σειρών ήταν συνεχώς επεκτάθηκε κατά τη διάρκεια αυτών των μελετών, δεν είναι όλα τα cDNA υβριδοποιήθηκαν με όλους τους πειραματικά μοντέλα). Για να επιλεγούν για περαιτέρω λειτουργικός χαρακτηρισμός, υποψήφια γονίδια έπρεπε να απελευθερωθεί σημαντικά σε καρκίνο του παγκρέατος (υπερεκφράζονται ή προς τα κάτω σε πρωτογενή παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με χρόνια παγκρεατίτιδα και φυσιολογικά δείγματα πάγκρεας), καθώς και επίδειξη σημαντική ρύθμιση σε ένα τουλάχιστον των λειτουργικών συστημάτων μοντέλο (βλ Υλικού & amp? Μέθοδοι ενότητα για λεπτομέρειες σχετικά με την ποσοτικοποίηση του σήματος υβριδισμού και τον ορισμό της διαφορικής έκφρασης).

Αυτή η πρώτη λίστα των πιθανών υποψηφίων γονιδίων με το χέρι σε επιμέλεια για τον αποκλεισμό γονιδίων τα οποία είχαν προηγουμένως εντατικά μελετηθεί σε καρκίνο του παγκρέατος, καθώς και αποκλείουν εκφράζεται ετικέτες αλληλουχίας (ESTs) από το καρκίνο του παγκρέατος ειδική συλλογή cDNA η οποία έδειξε ανεπαρκής ομολογία με σχολιασμένο ανθρώπινα γονίδια. Χρησιμοποιώντας αυτά τα κριτήρια, επιλέχθηκαν συνολικά 50 γονίδια για παραλληλοποιημένων λειτουργικό χαρακτηρισμό (βλέπε παρακάτω). Ο κατάλογος αυτός εμπλουτίζεται με 17 υποψήφια γονίδια τα οποία είχε δείξει PanIN-συγκεκριμένα μοτίβα έκφρασης σε προηγούμενες αναλύσεις μας μικροδιατομή δείγματα φυσιολογικού αγωγών καθώς και προ-καρκινικές βλάβες και καρκινικές από ανθρώπινο πάγκρεας [11]. Τέλος, μια επιλογή από 14 γνωστά γονίδια με ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες προστέθηκαν ως θετικοί έλεγχοι για τις λειτουργικές αναλύσεις. Η πλήρης λίστα των επιλεγμένων υποψήφιων και τον έλεγχο των γονιδίων δίνεται στον Πίνακα S1 (συμπληρωματικές πληροφορίες).

Παραλληλισμός δοκιμασίες με βάση κύτταρα

Για να ελέγξουν γρήγορα για λειτουργικές επιδράσεις όλων των 67 υποψηφίων γονιδίων σε παράλληλα, κατασκευάσματα έκφραση των υποψηφίων γονιδίων, καθώς και 14 γονίδια ελέγχου με γνωστές λειτουργίες κλωνοποιήθηκαν με τη μορφή Ν-τερματικές συγκολλήσεις με κυανό φθορίζουσα πρωτεΐνη (CFP), καθώς και C-τερματικές συντήξεις με κίτρινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (YFP). Το πλασμίδιο DNA, συμπλεγμένο με αντιδραστήρια επιμόλυνσης, ήταν ντυμένη επάνω σε πρότυπο γυάλινες πλάκες μικροσκοπίου και επικαλύπτονται με εναιωρήματα καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος (Panc-1, S2-007) ή μη-μετασχηματισμένα κύτταρα ελέγχου (ΗΕΚ-293). Κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού, σημεία επιμολυσμένα κύτταρα αναγνωρίζονται εύκολα λόγω των ειδικών σημάτων φθορισμού της ΚΑΠ ή πρωτεΐνες σύντηξης YFP, η οποία επέτρεψε επίσης άμεση σύγκριση με τις γειτονικές μη επιμολυσμένα κύτταρα.

Οι συστοιχίες αντίστροφη επιμόλυνσης ήταν τότε χρησιμοποιούνται για παραλληλοποιημένων λειτουργικές αναλύσεις για τον εντοπισμό νέων υποψηφίων γονιδίων με δυνητικά σημαντικές λειτουργίες σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Σε έναν πρώτο γύρο αξιολόγησης, υποκυτταρικό εντοπισμό των γονιδιακών προϊόντων (καθώς και τη συνολική μορφολογία σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα), αμφότερα υπό την παρουσία και απουσία ορού, καταγράφηκε και συγκρίθηκε μεταξύ καρκίνου και του ελέγχου των κυττάρων (βλέπε Εικόνα 2 για παραδείγματα διαφορετικών εντοπίσεις). Σε μεταγενέστερες αναλύσεις, συστοιχίες στερεωμένα κύτταρα επωάστηκαν με αντισώματα έναντι σαφώς καθορισμένες δεικτών απόπτωσης (διασπασμένη κασπάση-3), πολλαπλασιασμό (Ki-67, κυκλίνη Β) και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά δια-(ΕΜΤ? Μεσεγχυματικά βιμεντίνη δείκτη, επιθηλιακά δείκτη Ε -cadherin). Παραδείγματα αποτελεσμάτων χρώσης που εμφανίζονται στο σχήμα 3. Η συχνότητα και η ένταση της χρώσης καταγράφηκαν, βαθμολογήθηκαν οπτικά και συγκρίθηκε μεταξύ επιμολυσμένα και μη επιμολυσμένα κύτταρα. Επαναλαμβανόμενες διαφορές μεταξύ επιμολυσμένα και μη επιμολυσμένα κύτταρα βαθμολογήθηκαν ως «++» (ισχυρά αποτελέσματα), «+» (μέτρια αλλά αναπαραγώγιμη επιδράσεων) και «(+)» (ασθενής και /ή μεταβλητών εφέ). Ο Πίνακας 1 παραθέτει όλα τα γονίδια για τα οποία τουλάχιστον ένα σκορ «++» ή τουλάχιστον τρεις βαθμολογίες των «+» καταγράφηκαν σε ανεξάρτητα πειράματα επανάληψη και οι οποίες ως εκ τούτου ορίζεται ως κατάλληλο για μεμονωμένους εις βάθος αναλύσεις. Οι επιλεγέντες υποψήφιοι περιελάμβανε 3 κινάσες (ADRBK1, FASTK, PRKCZ), 3 φωσφατάσες (PPM1G, PPP2R1A, PPP2R4), 2 παράγοντες μεταγραφής (FRA-2, GTF2F2), 2 πρωτεϊνών ακτίνης αλληλεπιδρούν (CFL1, RRAS), 1 διαμεμβρανική πρωτεΐνη ( TM4SF1), 1 ιστόνης μεθυλ τρανσφεράσης (SUV39H1), 1 συζευγμένου με πρωτεΐνη υποδοχέα (EBI2) και 1 ιντερφερόνης-επαγώγιμη πρωτεΐνη με άγνωστη κυτταρική λειτουργία (IFI27). Κανένας από αυτούς δεν είχαν συσχετιστεί με καρκίνο του παγκρέατος κατά το χρόνο που είχαν συμπεριληφθεί στις συστοιχίες αντίστροφη επιμόλυνση.

Ορατή είναι Κοινής Αλιευτικής Πολιτικής (Α) ή YFP (Β-Γ) κατασκευές σύντηξης. Μετά την επιμόλυνση και τη σταθεροποίηση των κυττάρων επί ανάστροφης μικροσυστοιχίες επιμόλυνση, καλυπτρίδες εφαρμοστεί χρησιμοποιώντας ϋΑΡΙ περιέχον μέσο στερέωσης. Για πρωτεΐνες σύντηξης της ΚΑΠ, τα σήματα DAPI φαίνεται στον καφέ (ψευδές χρώμα) για να παρέχει κατάλληλο αντίθεσης (Α). Ορατή είναι παραδείγματα καθαρώς κυτοπλασμική (Α), ομοιόμορφο πυρηνικά κυτταροπλασματική (Β) και καθαρά πυρηνικού εντοπισμού (C), καθώς και εντοπισμού για να ενδόσωμα-όπως δομές (D). Οι αρχικές μεγεθύνσεις υποδεικνύονται στις εικόνες

Η

Α:. Caspase-3 κηλίδωση (Cy-3, κόκκινο), κύτταρα ΗΕΚ-293 διαμολυνθέντα με H1F0-YFP (πράσινο)? Β: χρώση Ki-67 (Cy-3, ερυθρό), ΗΕΚ-293 επιμολυσμένα με NKX2-5-YFP (πράσινο)? C: χρώση κυκλίνης Β (Cy-3, ερυθρό), PANC-1 επιμολυσμένα με PRKCZ-YFP (πράσινο)? D: βιμεντίνης χρώση (Cy-3, ερυθρό), PANC-1 επιμολυσμένα με FASTK-YFP (πράσινο)? Ε: χρώση Ε-καδερίνης (Cy-3, κόκκινο), PANC-1 επιμολυσμένα με PPP2R1A-YFP (πράσινο). Τα αυθεντικά μεγεθύνσεις που αναφέρονται στις εικόνες.

Η

Λειτουργική επικύρωσης /σε βάθος ατομικές χαρακτηρισμό του υποψηφίου γονιδίου ADRBK1

Ως απόδειξη της ιδέας να επιβεβαιώσει την εγκυρότητα της λειτουργικά δεδομένα που λαμβάνονται μέσω των παραλληλισθέντες δοκιμασίες με βάση κύτταρα, εμείς υποδειγματικά δείχνουν λεπτομερή

in vitro

λειτουργικά δεδομένα χαρακτηρισμός ενός γονιδίου, ADRBK1, το οποίο ήταν το πρώτο γονίδιο (με αλφαβητική σειρά) στον κατάλογο των υποψηφίων υψηλής προτεραιότητας (Τραπέζι 1). Λεπτομερής

in vivo

και

in vitro

χαρακτηρισμός των άλλων υποψήφιων γονιδίων μέχρι την παραγωγή της γενετικής μηχανικής μοντέλα ποντικών είτε στον Τύπο ή στο πλαίσιο της προετοιμασίας και θα αναφερθεί αλλού.

υποκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης ADRBK1 /CRK2.

ADRBK1 (αδρενεργικοί, Beta, κινάση υποδοχέα 1), επίσης γνωστή ως ΟΚΚ2 (G-πρωτεΐνη υποδοχέα κινάσης 2) είχε αρχικά συμπεριληφθεί στις συστοιχίες cDNA ως μέλος της η οικογένεια γονιδίων κινάσης, που αντιπροσωπεύουν το ιδανικό druggable γονιδίων στόχων. Βρέθηκε ότι υπερεκφράζεται σε PDAC κατά τη διάρκεια των πειραμάτων διαδοχικών έκφραση προφίλ. Στα πειράματα αντίστροφης συστοιχία επιμόλυνση, ADRBK1 /CRK2 είχε δείξει σημαντικές διαφορές στο υποκυτταρικό εντοπισμό ανάλογα με την παρουσία ή απουσία ορού (κυτταροπλασματική εντόπιση παρουσία, πυρηνικά και κυτταροπλασματικά τοποθεσία με την απουσία ορού). Παραδοσιακά ( «προς τα εμπρός») διαμόλυνση των κατασκευασμάτων σύντηξης ADRBK1 σε κύτταρα PANC1 επιβεβαίωσε την παρατήρηση αυτή, που δείχνει τα αναμενόμενα σήματα φθορισμού στον πυρήνα αποκλειστικά σε ορό κύτταρα στερούνται 24h μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 4Α και 4Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, μετά από παρατεταμένη χρόνους επώασης, υπήρχε μια ισχυρή τάση του σήματος να μετατοπιστεί προς τον πυρήνα, ανεξάρτητα από την παρουσία ή απουσία ορού (Εικόνα 4C και 4D), ενδεχομένως υποδεικνύοντας ένα ρόλο ADRBK1 σε αντίδραση των κυττάρων στην εξάντληση των θρεπτικών συστατικών ή /και αυξητικούς παράγοντες.

κατασκευάσματα σύντηξης

ADRBK1-YFP (πράσινο σήματα) επιμολύνθηκαν σε καλλιεργημένα κύτταρα Panc-1 καλλιεργήθηκαν απουσία (Α, C) ή παρουσία (Β, D) του 10% ορό . Μετά από 24 ώρες ή 48 ώρες επώασης, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε σήματα). Μετά από 24 ώρες, τα σήματα ADRBK1-YFP ήταν ανιχνεύσιμα τόσο, κυτταρόπλασμα και πυρήνες, των κυττάρων που καλλιεργούνται χωρίς ορό (Α), ενώ οι πυρήνες των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν με ορό ήταν άνευ YFP φθορισμού (Β). Αντίθετα, μετά από 48 ώρες επώασης, τα κύτταρα αναπτύσσονται υπό οποιαδήποτε κατάσταση έδειξε εξέχοντα χρώση των πυρήνων (C, D). https://www.staff.uni-marburg.de/~buchhol3/RevTrans/:

doi:10.1371/journal.pone.0122946.s001

(XLS)

S2 Siegel R, Naishadham D, στατιστικά Τζεμάλ Α Καρκίνου. CA Cancer J Clin. J Clin Oncol. J Clin Oncol. Cancer Res. Am J Pathol. Cancer Res. Cancer Res. JAMA. Cancer Res. Αηη Ν Υ Acad Sci. Cancer Res. J Natl Cancer Inst. Int J Cancer. Cancer Res. Cancer Res. Cancer Res.