Abstract

Ιστορικό

LGR5 (πλούσιες σε λευκίνη επανάληψης που περιέχουν G-πρωτεΐνη υποδοχέα 5) είναι η πιο εδραιωμένη δείκτη για εντερική βλαστικών κυττάρων. μοντέλα Mouse δείχνουν ότι τα κύτταρα LGR5 + είναι τα κύτταρα προέλευσης για καρκίνο του εντέρου, και η έκφραση LGR5 είναι αυξημένη σε ανθρώπινους ορθοκολικούς καρκίνους, ωστόσο πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη λειτουργία LGR5 ή τη συμβολή του με τον φαινότυπο βλαστοκυττάρων και για καρκίνο του παχέος εντέρου.

Principal Εκτίμηση

Έχουμε διαμορφωμένου την έκφραση των LGR5 με RNAi (ανασταλτική RNAs) ή υπερέκφραση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές. Παραδόξως, κατάλυση της LGR5 προκαλεί αυξημένη εισβολή και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη, και ενισχύει το ογκογόνο σε ξενομοσχεύματα πειράματα. Αντιστρόφως, η υπερέκφραση του LGR5 αυξάνει κυτταρικής προσκόλλησης, μειώνει κλωνογονικότητας και εξασθενίζει το ογκογόνο. Έκφραση προφίλ αποκάλυψε ενισχυμένη σηματοδότηση Wnt και προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων EMT κατά νοκ ντάουν της LGR5, με αντίθετες μεταβολές στην LGR5 υπερεκφράζουν κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι LGR5 είναι σημαντική στον περιορισμό βλαστικών κυττάρων για τη θέση τους, και ότι η απώλεια της LGR5 ταυτόχρονα με ενεργοποιημένη σηματοδότηση Wnt μπορεί να συμβάλει στην επεμβατική φαινότυπο του παχέος καρκινώματα

Παράθεση:. Walker F, Zhang HH, ODORIZZI α, Burgess AW (2011) LGR5 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της ογκογόνο, Ανταγωνίζεται Wnt σηματοδότηση και ρυθμίζει την κυτταρική προσκόλληση στον Καρκίνο του παχέος Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 6 (7): e22733. doi: 10.1371 /journal.pone.0022733

Επιμέλεια: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Γαλλία

Ελήφθη: 3 Φλεβάρη του 2011? Αποδεκτές: 4 του Ιούλη 2011? Δημοσιεύθηκε: 28 του Ιούλη 2011

Copyright: © 2011 Walker et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από NHMRC πρόγραμμα επιχορήγησης αριθμό 487922. υποστήριξη Χρηματοδότηση για AO επίσης παρέχονται από το Ίδρυμα Pezcoller, Τρέντο, Ιταλία. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το Επιχειρησιακό Πρόγραμμα Ενίσχυσης της Υποδομής που παρέχονται από την κυβέρνηση της Βικτώρια. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

Η έννοια του καρκίνου βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ: ​​επανεξετάζονται από [1]), προκύπτει από την ετερογένεια των πιο συμπαγών όγκων και την αντοχή τους σε χημειοθεραπευτικά καθεστώτα: σύμφωνα με αυτήν την έννοια, μετά από θεραπεία με εναπομένουσα πληθυσμού του καρκίνου ανθεκτικών στα φάρμακα βλαστικά κύτταρα θα επιβιώσουν και να πολλαπλασιαστούν ταχέως να αποκαταστήσει τους όγκους ([2]). Η σχετική αντίσταση σε χημειοθεραπευτικό φάρμακο έχει αποδοθεί σε λήθαργο ή αργή εξάπλωση των ΚΕΠ, ένα χαρακτηριστικό από κοινού με φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων (βλέπε για παράδειγμα [3]). Υποστήριξη για την ύπαρξη της ανθρώπινης ΚΕΠ είναι η παρουσία, εντός των όγκων, των κυτταρικών υποσυνόλων που εκφράζουν πρωτεΐνες που συνήθως συναντάμε σε βλαστικά κύτταρα και να χαθεί κατά τη διαφοροποίηση? Αυτές οι πρωτεΐνες έχουν χρησιμοποιηθεί για τον εμπλουτισμό των υποθετικών CSCs σε διαφορετικούς τύπους όγκων, και για να αποδειχθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα εμπλουτισμένα για αυτούς τους δείκτες δημιουργεί όγκους με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα από ό, τι το μη επιλεγμένο πληθυσμό [4]. Δεδομένης της συνάφειας των ΚΕΠ για την ογκογένεση και τη μετάσταση [5], [6], πιο αποτελεσματικές θεραπείες όγκων απαιτούν μια καλύτερη γνώση των χαρακτηριστικών αυτού του υποσυνόλου των καρκινικών κυττάρων και των παραγόντων, εξωγενείς και ενδογενείς, οι οποίες συμβάλλουν στην «βλαστική ικανότητα» τους . Η εκτίμηση της συνάφειας και φυσιολογικός ρόλος των «βλαστικών κυττάρων δείκτες» στο φαινότυπο των βλαστικών κυττάρων θα αυξήσει σημαντικά την κατανόησή μας των ΚΕΠ και θα πρέπει να βοηθούν στην επινόηση επιλεκτικές θεραπείες.

Στην περίπτωση του καρκίνου του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα (CCSC) προς το παρόν τα καλύτερα χαρακτηρίζεται «βλαστικών κυττάρων» δείκτες είναι οι επιφανειακά αντιγόνα CD133 [4], [7] CD166 [8], CD44 και CD24 ([9], [10] (κριτική από [11]). η ενδοκυτταρική δείκτες CCSCs περιλαμβάνουν Musashi-1 ([12], [13]), ο ΔΜΣ-1 [14] και της ALDH [15] (που επισκοπείται στο [16]. Ωστόσο, η πιο επιλεκτική και πολλά υποσχόμενη δείκτη του βλαστικού κυττάρου σε εντερικό επιθήλιο και του εντερικού καρκινικά βλαστικά κύτταρα είναι LGR5 [17] (UniProt Accession # O75473? UniGene # Hs.658889? ονομάζεται επίσης GPR49) σε κανονική έκφραση έντερο LGR5 περιορίζεται στην ζώνη των βλαστικών κυττάρων στη βάση της κρύπτης [18] και μονά κύτταρα από. το λεπτό έντερο που εκφράζουν LGR5 μπορεί να δημιουργήσει δομές που μοιάζουν με εντερική κρύπτες «in vitro» [19], [20]. το πιο σημαντικό, Barker et al. [21] έδειξαν σε μοντέλα ποντικών που εντερικών όγκων προκύπτουν από LGR5 θετικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα σήματα η εντερική καρκινικά βλαστικά κύτταρα. LGR5 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο ορθοκολικό αδενωμάτων και καρκινωμάτων σχέση με το φυσιολογικό βλεννογόνο [22]: έτσι LGR5 υπερέκφραση ανιχνεύεται από τα πρώτα στάδια της ογκογένεσης παχέος. LGR5 είναι ένα Wnt γονίδιο στόχος [23], και η Wnt οδός ενεργοποιείται νωρίς στην εξέλιξη της πλειονότητας των καρκίνων του παχέος εντέρου μέσω της αποκοπές του APC (αδενωματώδη πολυποδίαση Coli) και, λιγότερο συχνά, μεταλλάξεις β-κατενίνης (ανασκόπηση από [24 ]). Δεν είναι σαφές, ωστόσο, εάν LGR5 ρύθμιση προς τα άνω σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα συμβάλλει σημαντικά στην ογκογένεση μέσω της συντήρησης του παχέος CSC, ή είναι απλά μια αντανάκλαση των ενεργοποιημένων σηματοδότηση Wnt, χωρίς άμεσο λειτουργικό ρόλο.

Λίγα είναι γνωστά για LGR5 λειτουργία στην ανάπτυξη και καρκινογένεση. LGR5 είναι ένας υποδοχέας «ορφανό» που ανήκει στον υποδοχέα G-πρωτεΐνη (GPCR) οικογένεια [25]? συνδετήρα και τον τρόπο ενδοκυτταρικής σηματοδότησης της είναι επί του παρόντος ασαφής [26]. Knockout του LGR5 σε ποντικούς οδηγεί σε νεογνική θνησιμότητα που σχετίζεται με κρανιοπροσωπικών ελαττωμάτων (ankyloglossia) [27]. Μια ενδελεχής μελέτη από Garcia et al [28] της προγεννητικής εντερικής ανάπτυξης στην GPR49-LacZ μεταλλαγμένα ποντίκια (LGR5 null) δείχνει ότι η απώλεια της LGR5 δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό ή μετανάστευση των εντερικών κυττάρων. Ωστόσο, οι συγγραφείς παρατήρησαν μια ισχυρή επαγωγή της διαφοροποίησης των κυττάρων Paneth στα έμβρυα LGR5 νοκ-άουτ, και ένα χαρακτηριστικό μοριακή υπογραφή του απορυθμίζεται σηματοδότηση Wnt.

Όπως φαίνεται LGR5 να είναι ένας δείκτης της CCRCs, ερευνήσαμε το οποίο παραμέτρους της κυτταρικής ανάπτυξης και η διαφοροποίηση επηρεάζονται από τη διαφοροποίηση της έκφρασης LGR5 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές. Λόγω της λειτουργικής απόλυση πολλών μορίων σηματοδότησης και των ισχυρών βρόχους ανάδρασης που διατηρούν την ομοιόσταση, αυτές οι μελέτες είναι δύσκολο να ερμηνευθούν σε ζωικά μοντέλα, ενώ οι χαμηλές αποδόσεις επιμόλυνσης και οι περιορισμοί σχετικά με τη μακροπρόθεσμη κουλτούρα αποτρέψει αυτές τις μελέτες σε δείγματα ανθρώπινου πρωτοπαθούς όγκου. Για την παράκαμψη αυτών των δυσκολιών που έχουμε χρησιμοποιήσει δυο ορθοκολικού καρκινώματος κυτταρικές γραμμές, LIM1215 [29] και LIM 1899 [30] ως πρότυπο σύστημα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι LGR5 φίμωση και υπερέκφραση έχουν αντίθετες επιδράσεις στην φαινοτύπου των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, τη μετανάστευση και σχηματισμό όγκων ως ξενομοσχεύματα σε ποντικούς. Παραδόξως, η καταστολή της έκφρασης LGR5 ενισχύει ογκογένεσης και συνδέεται με μια πιο μεσεγχυματικά φαινότυπο. Μια μελέτη των προτύπων γονιδιακής έκφρασης μετά τη διαφοροποίηση των κυτταρικών επιπέδων LGR5 από siRNA νοκ ντάουν ή διαγονιδιακών υπερέκφραση δείχνει ότι η απώλεια της LGR5 απορυθμίζει γονιδίων Wnt ανταπόκριση και βασικά γονίδια EMT οδού? Αντιστρόφως, η υπερέκφραση του LGR5 ευνοεί προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία της LGR5, όχι απλά ως δείκτης του παχέος καρκινικών κυττάρων, αλλά και ως ρυθμιστής της Wnt απαντήσεων, την κινητικότητα των κυττάρων και προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου.

Αποτελέσματα

LGR5 εκφράζεται σε ορθοκολικού κυτταρικές γραμμές με μεταλλάξεις β-κατενίνης και ρυθμίζεται αυξητικά από Wnt διέγερση σε κύτταρα με μεταλλάξεις APC

ορθοκολικούς όγκους χαρακτηρίζονται από μεταλλάξεις σε Wnt οδό σηματοδότησης συστατικά [31], [32], [33], κυρίως APC και β-κατενίνης, οδηγώντας σε απορυθμισμένη ή κύτταρο-αυτόνομες αποκρίσεις σε Wnt. LGR5 υπερεκφράζεται σε πρωτογενείς όγκους του παχέως εντέρου [34], [35]: υπερέκφραση μπορούσε θεωρητικά να οφείλεται σε εμπλουτισμό των κυττάρων βλαστικών-όπως », στην προς τα πάνω ρύθμιση της Wnt μονοπατιού σηματοδότησης, και /ή να Wnt μονοπάτι που εξαρτάται από τη συντήρηση του« βλαστική ικανότητα «. Χρησιμοποιήσαμε ένα πάνελ προηγουμένως χαρακτηριζόμενη ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκινώματος [33] για να συγκρίνουν την έκφραση LGR5 με την έκφραση του άλλου υποθετικού εντερικών δείκτη βλαστικών κυττάρων, Μουσάσι-1 (MSI-1) [36], [12], [37]. Κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα LGR5 γενικά δεν εκφράζουν υψηλά επίπεδα Msi-1, και αντίστροφα (Εικ. 1Α). Είναι ενδιαφέρον, ανιχνεύσαμε ανυψωμένα επίπεδα LGR5 mRNA μόνο σε κυτταρικές γραμμές που φέρουν μεταλλάξεις β-κατενίνης (Σχήμα 1Α). Η ανύψωση του LGR5 σε μεταλλαγμένα κύτταρα β-κατενίνης είναι εντυπωσιακή, γεγονός που υποδηλώνει ότι μεταλλάξεων ενεργοποίηση των β-κατενίνης είναι υπεύθυνη για την υπερέκφραση LGR5, ενώ η μετάλλαξη του APC δεν είναι επαρκής για να επάγει ανιχνεύσιμη έκφραση LGR5 σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Για να ελέγξετε την Wnt εξάρτηση της έκφρασης LGR5, εμείς διεγείρονται τα κύτταρα με L-κυττάρων που προέρχονται Wnt3A, wnt5a ή τον έλεγχο ρυθμισμένα μέσα. επίπεδα LGR5 και Μουσάσι-1 mRNA εξετάστηκαν παράλληλα από qRT-PCR 12 ώρες μετά τη διέγερση (Εικ. 1Β). Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα έκφρασης LGR5 είναι αμετάβλητη με διέγερση Wnt3A στην β-κατενίνης μεταλλαγμένη κυτταρική γραμμή LIM1899 αλλά επιλεκτικά απορυθμίζεται με Wnt3A σε κυτταρικές γραμμές APC-μεταλλαγμένο LIM 2537, LIM 2405 και Lim1863 (Σχ. 1Β, αριστερό πάνελ). Wnt διέγερση δεν επηρέασε τα επίπεδα έκφρασης του Msi-1 σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχ. 1Β, δεξί πάνελ). Προς τα πάνω ρύθμιση LGR5 από κανονική σηματοδότηση Wnt σε απόκριση κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκε με ανοσοχρώση με ένα επικυρωμένο αντίσωμα για LGR5 (Εικ. S1 Α). Σε αυτά τα πειράματα, τα μέγιστα επίπεδα της πρωτεΐνης LGR5 παρατηρήθηκαν 48 ώρες μετά τη διέγερση των κυττάρων με Wnt3A, ενώ ούτε Wnt 5a ή L-κυττάρων που επάγεται ρυθμισμένο μέσο έκφρασης LGR5 (Εικ. S1B και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι αυξημένα επίπεδα LGR5 σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα είναι πιθανό να είναι δευτερεύουσα σε ενεργοποιημένα κανονική σηματοδότηση Wnt, και οι μεταλλάξεις σε β-κατενίνης παράκαμψης η απαίτηση για εξωγενή συνδετήρες. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι κυτταρικές σειρές LIM με ετερόζυγη μεταλλάξεις APC έχουν ασθενώς ενεργοποιημένο σηματοδότηση Wnt προκύπτουν από αυτοκρινή παραγωγή κανονικών Wnts [33]: η έλλειψη LGR5 υπερέκφραση σε αυτά τα κύτταρα με την απουσία εξωγενών Wnt3A υποδηλώνουν επίδραση κατωφλίου για επαγωγή LGR5.

επίπεδα Α) έκφρασης για LGR5 και το MSI-1 προσδιορίστηκαν με qRT-PCR όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως έκφραση γονιδίου σε σχέση με τον ενδογενή HPRT ελέγχου μέσα σε κάθε κυτταρική γραμμή. Τα κύτταρα έχουν ομαδοποιηθεί σύμφωνα με β-κατενίνης τους ή APC κατάστασης μεταλλάξεων. γραμμές Β) των κυττάρων που φέρουν μετάλλαξη β-κατενίνης (LIM 1899) ή μεταλλάξεις APC (LIM2537, LIM2405, LIM1863) διεγέρθηκαν για 12 ώρες με μέσο καλλιέργειας (χωρίς ερέθισμα), με ρυθμισμένο μέσο από L-κύτταρα που εκφράζουν Wnt 3α ή Wnt 5α, ή με μη επιμολυσμένα L-κυττάρων ρυθμισμένο μέσο (CM ελέγχου). Έκφραση LGR5 (αριστερό πάνελ) και Μουσάσι-1 (δεξί πάνελ) προσδιορίστηκε με qRT-PCR όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Για κάθε κυτταρική σειρά, μπάρες αντιπροσωπεύουν το επίπεδο έκφρασης της διεγείρεται σε σχέση με μη διεγερμένα κύτταρα.

Η

Ρύθμιση της έκφρασης LGR5 έχει βαθιές επιπτώσεις στην κλωνογενοποιήσεως και ογκογένεσης

Αν η υπερέκφραση του LGR5 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα διαμεσολαβείται από Wnt μονοπάτι υπερ-ενεργοποιηθεί, τι ρόλο παίζει LGR5 στο Wnt απαντήσεις, και δεν έκφραση LGR5 συμβάλει στη διατήρηση της «βλαστική ικανότητα του καρκίνου»; Για να αντιμετωπιστεί η λειτουργική σημασία της έκφρασης LGR5 σε κυτταρικές γραμμές CRC, μειώσαμε την έκφρασή του σε κύτταρα που φέρουν μια μετάλλαξη β-κατενίνης (LIM1215 και LIM1899) χρησιμοποιώντας ανασταλτικές RNAs. Αρχικά χρησιμοποιείται λεντοϊού μεταγωγή του shRNA (σύντομη φουρκέτα RNA) σε LGR5. Ως μάρτυρες, χρησιμοποιήσαμε Τα siRNAs που κατευθύνονται προς τυχαίες αλληλουχίες (που δεν αποτελούν στόχο, ΝΤ) ή σε Msi-1. Musashi-1 εκφράζεται σε ανώριμα κύτταρα του εντέρου [12], [37] και υπερεκφράζεται σε όγκους παχέος εντέρου [35], αλλά δεν είναι ένα γονίδιο Wnt-απόκρισης (Σχ. 1Β). Χρησιμοποιήσαμε τέσσερα ξεχωριστά κατασκευάσματα shRNA για κάθε γονίδιο στόχο: όλα ήταν αποτελεσματικά, και μετέπειτα πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας την πιο αποδοτική Τα siRNAs. Τα μετατραπέντα κύτταρα επιλέγονται χύδην πουρομυκίνη για δύο εβδομάδες για να εμπλουτίσει για τα shRNA-εκφράζοντα κύτταρα, στη συνέχεια άλλαξαν σε μέσο ελεύθερο αντιβιοτικών για λειτουργικό χαρακτηρισμό. Knockdown αποτελεσματικότητα παρακολουθήθηκε με qRT-PCR και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ και σχηματισμού αποικίας σε μαλακό άγαρ. Λεντοϊών παράδοση των shRNA να LGR5 ή να Musashi-1 ήταν αποτελεσματική σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και να οδηγήσει σε μια σήμανση και ειδική μείωση στην έκφραση των γονιδίων-στόχων (Σχ. 2 Α, Β, Β). Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με LGR6 και το MSI-2 ήταν ανεπηρέαστες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιβεβαιώσαμε απώλεια LGR5 πρωτεΐνης μετά knockdown χρήση ανοσοφθορισμού (Σχ S2.), Όπως LGR5 αντισώματα δεν είναι κατάλληλα για την ανίχνευση των ενδογενών επιπέδων αυτής της πρωτεΐνης με Western Blot

Α) και Β):. LIM1215 (Α κύτταρα) και LIM1899 (Β) μετήχθησαν με λεντοϊού σωματίδια που περιέχουν shRNA να μη αλληλουχίες στόχους (ΝΤ), να LGR5 (shLGR5) ή σε Musashi-1 (shMsi-1) και χύδην επιλέγονται πουρομυκίνη. Έκφραση LGR5 (αριστερά πάνελ) και Μουσάσι-1 (δεξιά πάνελ) εκτιμήθηκε με qRT-PCR δύο εβδομάδες μετά την μεταγωγή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως έκφραση γονιδίου σε σχέση με τις γονικές κυτταρικές σειρές. Αυτά τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά & gt? 5 ξεχωριστά πειράματα. C): Τα κύτταρα που εκφράζουν Τα siRNAs (shLGR5, shMsi-1 και ΝΤ) και γονικά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο από αντιβιοτικά για τρεις ημέρες, στη συνέχεια εξετάζονται για την ικανότητά τους να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ όπως περιγράφεται στις Μεθόδους .. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αποικία σχηματίζοντας αποδοτικότητα των δειγμάτων δοκιμής σε σχέση με τον έλεγχο (μη επιμολυσμένα) γονικά κύτταρα και είναι ο μέσος όρος και SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. D): Αντιπροσωπευτικές εικόνες των αποικιών σε μαλακό άγαρ πλάκες βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Οι εικόνες ελήφθησαν με ένα 90i Nikon με μια φωτογραφική μηχανή DXM 1200C.

Η

εξόντωση είτε LGR5 ή τα επίπεδα Msi-1 δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων ως προσκολλημένες μονοστιβάδες (Εικ. S3A), ωστόσο η απώλεια LGR5 και Msi-1 είχε εντυπωσιακή και αντίθετες επιδράσεις στην κλωνογονικότητας των κυττάρων σε μαλακό άγαρ (Σχ. 2C). Εξόντωση Musashi-1 οδηγεί σε μείωση της ικανότητας σχηματισμού αποικιών των δύο κυττάρων LIM1215 και LIM1899, σύμφωνα με την απώλεια του πολλαπλασιασμού και του όγκου ικανότητα σχηματισμού του ορθοκολικού κυτταρικής γραμμής HCT116 μετά προς τα κάτω ρύθμιση του Msi-1 όπως αναφέρεται από Sureban et al [ ,,,0],13]. Σε αντίθεση, η απώλεια του LGR5 προκάλεσε μια επαναλήψιμη και βαθιά

αυξήσει

στην κλωνογονικότητας τόσο LIM1215 και LIM1899 (Εικ. 2 C, D). Αυτές οι επιδράσεις επί του σχηματισμού αποικιών παρατηρήθηκαν με συνέπεια και στις δύο κυτταρικές γραμμές και τη χρήση δύο ξεχωριστών, LGR5-ειδική shRNA κατασκευάσματα.

Η επιλογή των κυττάρων σε πουρομυκίνη μπορούσε να οδηγήσει σε αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων, εκτός από LGR5, συμβάλλοντας σε αυτό το εκπληκτικό αποτέλεσμα. Επαναλάβαμε τα νοκ ντάουν πειράματα χρησιμοποιώντας παροδική έκφραση της Cy3 σημασμένο siRNA (μικρά φουρκέτα RNA) σε LGR5. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα κατασκευάσματα και την έκφραση της Cy3 σημασμένο siRNA παρακολουθήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, αξιολογείται από έκφραση Cy3 χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού, ήταν & gt? 80% στην LIM1899, αλλά & lt? 20% LIM1215? . Κατά συνέπεια τα επόμενα πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας LIM1899 κύτταρα

εξόντωση LGR5 με siRNA ήταν πολύ αποδοτική (& gt? 90%) (Εικ. 3Α) και την ειδική. Σημαντικά, shRNA και siRNA knockdown του LGR5 είχαν ταυτόσημες επιδράσεις στην κλωνογονικότητας του LIM1899, επιβεβαιώνοντας ότι αυτό φαινότυπος είναι το αποτέλεσμα της προς τα κάτω ρύθμιση LGR5 και δεν αποτελεί τεχνούργημα της διαδικασίας επιλογής (Σχ. 3Β).

LIM1899 κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορέα που εκφράζει Cy3 (Cy3) ή Cy3-siRNA να LGR5 (Cy3 siLGR5). Α) έκφραση LGR5 με qRT-PCR σε μη επιμολυσμένα κύτταρα (γονική) και κύτταρα επιμολυσμένα με Cy3 ή Cy3-siRNA να LGR5. Αγροτεμάχια αντιπροσωπεύουν έκφραση LGR5 των δειγμάτων δοκιμής σε σχέση με το γονικό (μη-επιμολυσμένα) κυτταρική γραμμή. Β) LIM 1899 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μαλακό άγαρ δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση στα 5 χ 103 κύτταρα /ml και καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες. Οι αριθμοί των αποικιών αξιολογήθηκαν μετά από χρώση με κρυσταλλικό ιώδες χρησιμοποιώντας ένα ανατομικό μικροσκόπιο. Αγροτεμάχια αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των αποικιών σε δείγματα δοκιμής σε σχέση με τα γονικά κύτταρα. Η αύξηση του αριθμού των αποικιών μετά την αποσιώπηση του LGR5 είναι εξαιρετικά σημαντική (*** = ρ & lt? 0,0001 από το μη συζευγμένο t-test). Για δύο συλλέκτες δεδομένων είναι μέσες και sd των δειγμάτων εις τριπλούν και είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 3 ξεχωριστά πειράματα.

Η

Από μια μείωση στα επίπεδα LGR5 ενισχύει ειδικά την κλωνογενοποιήσεως του καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, ερευνήσαμε αν LGR5 υπερέκφραση θα μειώσει την ανάπτυξη αυτών των κυττάρων σε μαλακό άγαρ εκτελώντας τόσο παροδική και σταθερή υπερέκφραση LGR5 σε ορθοκολικού κυτταρικές σειρές. Επιλέξαμε να χρησιμοποιούν τις ίδιες κυτταρικές γραμμές τόσο για σίγηση και υπερέκφραση του LGR5 προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί μη-ειδική LGR5 αλλαγές στην κυτταρική παραμέτρους. Ενώ αυτή η στρατηγική κινδυνεύει να υποτιμούμε τις επιπτώσεις της LGR5 υπερέκφραση, επιτρέπει την άμεση σύγκριση μεταξύ των επιμολυσμένων κυττάρων και διευκολύνει την ερμηνεία των χαρακτηριστικών έκφρασης.

LIM1899 και τα κύτταρα LIM1215 είχαν επιμολυνθεί με φορέα pTUNE που περιέχει την αλληλουχία του ανθρώπινου LGR5 πλαισιώνεται από myc και ακολουθίες σημαία. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης για LIM1899 διέφερε σε αυτά τα πειράματα μεταξύ 30 και 60% όπως αξιολογήθηκε μέσω ανοσολογικής χρώσης των κυττάρων με αντισώματα anti-σημαία, ενώ η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης ήταν μεταξύ 10-20% για LIM1215 κύτταρα: ως εκ τούτου τα επόμενα πειράματα διεξήχθησαν σε κύτταρα LIM1899 . Η υπερέκφραση του flag-tagged LGR5 σε επιμολυσμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR και με ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας αντι-flag και αντισώματα αντι-LGR5 (Εικ. 4 Α, Β). Υπερεκφράζεται LGR5 ήταν παρούσα τόσο στο κυτοσόλιο και στην πλασματική μεμβράνη? με συσσώρευση σε στικτή δομών (Σχ. 4Α). Αυτή η κατανομή είναι παρόμοια με την κατανομή του ενδογενούς LGR5 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα μετά από διέγερση Wnt (Εικ. S2). Το σύστημα pTune είναι σχεδιασμένο για IPTG- επαγώγιμη έκφραση πρωτεϊνών, ωστόσο υψηλά επίπεδα έκφρασης ήταν παρόντες σε απουσία IPTG, με μόνο μια μέτρια αύξηση μετά την επαγωγή (Εικ. 4 Β). Η υπερέκφραση του LGR5 σε LIM1899 είχε ως αποτέλεσμα σημαντική απώλεια της ικανότητας σχηματισμού αποικιών σε μαλακό άγαρ (Εικ. 4C) χωρίς να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό υπό προσκολλημένα συνθήκες (Εικ. S3). Παράλληλη διαμόλυνση των κυττάρων με Cy3-siRNA να LGR5 προκάλεσε την αναμενόμενη αύξηση του αριθμού των αποικιών στην ίδια δοκιμασία (Σχ. 4C). Σταθερές κυτταρικές γραμμές που υπερεκφράζουν LGR5 δημιουργήθηκαν με επιλογή των επιμολυσμένων κυττάρων σε νεομυκίνη: LGR5 έκφραση σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, όπως αξιολογείται με qRT-PCR και ανοσοφθορισμού, αυξήθηκε σημαντικά (Εικ. S4 Α, Β), και αντιστρόφως ανάλογη με κλωνογονικότητας σε μαλακό άγαρ (Εικ. S4 C, D). Έτσι LGR5 διαμόρφωση έχει συνεπή και συγκεκριμένες επιδράσεις στην κλωνογονικότητας ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικών γραμμών.

LIM1899 κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορέα pTune περιέχουν ανθρώπινο LGR5 πλαισιώνεται από μία αλληλουχία σημαία και αναλύθηκαν 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση. Α) συνεστιακή μικροσκοπία: LIM 1899 κύτταρα επιμολυσμένα με pTune /LGR5 συν-χρώση με αντίσωμα αντι-σημαία (Μ2) που ακολουθείται από Alexa488 αντι-ποντικού Ig (πράσινο), αντι-LGR5 αντίσωμα HPA012530 ακολουθείται από Alexa 546 αντι-κουνελιού Ig ( κόκκινο) και η DAPI πυρηνική χρώση. Παρουσιάζεται είναι μια συγχωνευμένη εικόνα (όλα τα κανάλια) και αποχρώσεις του γκρι εικόνες των πράσινων και κόκκινων κανάλια, αντίστοιχα. Συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Β) qRT-PCR: μη-επιμολυσμένα κύτταρα (γονική) και κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα έκφρασης LGR5 καλλιεργήθηκαν για τρεις ημέρες με ή χωρίς IPTG (100 μΜ). Εκχύλιση RNA και qRT-PCR διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Το γράφημα δείχνει το επίπεδο της έκφρασης των LGR5 σε επιμολυσμένα σε σχέση με τα γονικά κύτταρα. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος +/- SD τριπλών δειγμάτων, και είναι αντιπροσωπευτικές της & gt? 3 ξεχωριστά πειράματα. Γ) κλωνογονική δοκιμασία: μη επιμολυσμένα κύτταρα και κύτταρα επιμολυσμένα με pTune /LGR5 ή με Cy3-siRNA να LGR5 σπάρθηκαν σε πλάκες μαλακού άγαρ σε 5 χ 103 κύτταρα /πλάκα όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. IPTG (100 μΜ). Προστέθηκε σε τριπλές πλάκες για μόνο γονικών και LGR5-εκφράζοντα κύτταρα. Οι πλάκες επωάστηκαν για 10 ημέρες μετά χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και οι αποικίες μετρήθηκαν με ένα ανατομικό μικροσκόπιο. Το γράφημα δείχνει μέσα και τυπική απόκλιση τριών ξεχωριστών πειραμάτων, κάθε κανονικοποιούνται στους αριθμούς των αποικιών για γονικά κύτταρα. Η διαφορά μεταξύ των γονικών και επιμολυσμένα κύτταρα είναι εξαιρετικά signficant (** = ρ & lt? 0.005 και *** = ρ & lt? 0,001 για τις δύο συνθήκες καλλιέργειας)

Η

κλωνογονικότητας σε ημι-στερεό μέσο των καρκινικών κυττάρων. συχνά συσχετίζεται με την ικανότητα τους να σχηματίζουν όγκους σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς. Χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος για να ελέγξετε αν διαφοροποίησης των LGR5 επηρεάζει την ογκογόνο των κυττάρων LIM1899. LIM1215 δεν ελέγχθηκε σε αυτό το σύστημα, δεδομένου ότι είναι τόσο κακή εμφάνιση όγκων ως ξενομόσχευμα και transfects με πολύ χαμηλή απόδοση. κύτταρα LIM1899 επεκτάθηκαν και επιμολύνονται χύδην με Cy3-siRNA να LGR5 ή με pTune-LGR5. Τα επιμολυσμένα και γονικά κύτταρα επεκτάθηκαν για δύο ημέρες, στη συνέχεια συλλέγονται για παράλληλη προσδιορισμό της έκφρασης LGR5 με qRT-PCR, κλωνογονικότητας «in vitro» και ικανότητα σχηματισμού όγκων «in vivo» (Εικ. 5). Η αναλογία των επιμολυσμένων κυττάρων, παρακολουθήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού για έκφραση Cy3siRNA και ανοσοχρώση με το αντίσωμα αντι-flag για LGR5 υπερέκφραση, ήταν 80% και 60%, αντίστοιχα. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν για τα ξενομοσχεύματα είχε την αναμενόμενη μείωση ή αύξηση στην LGR5mRNA (Σχήμα 5Β).: Καταστολή της έκφρασης LGR5 παρέμεινε για μέχρι δύο εβδομάδες σε κύτταρα επεξεργασμένα με siRNA, ενώ η υπερέκφραση του LGR5 επανήλθαν στη γραμμή βάσης από 14 ημέρες (Σχ. 5C). Η κλωνογονικότητας των κυττάρων που χρησιμοποιούνται σε ξενομοσχεύματα ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το επίπεδο έκφρασης του LGR5 (Σχ. 5D). Κύτταρα που εκφράζουν siRNA να LGR5 έδειξαν αυξημένη σχηματισμό όγκων? Αντιστρόφως, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν LGR5 ήταν λιγότερο ογκογόνο (Εικ. 5Α, Β). Η διαφορά στο μέγεθος του όγκου μεταξύ της LGR5 νοκ ντάουν και των γονικών κυττάρων ήταν άκρως σημαντική (ρ & lt? 0,0001) σε όλα τα χρονικά σημεία, ωστόσο, η ανάπτυξη των όγκων που υπερεκφράζουν LGR5 διέφερε σημαντικά από γονικά κύτταρα μόνο για τις πρώτες 10 ημέρες του πειράματος ξενομοσχευμάτων (Εικ . 5Α). Η διαφορά στη σταθερότητα έκφρασης του siRNA προς LGR5 εναντίον του κατασκευάσματος LGR5 (Εικ. 5C) είναι συνεπής με τις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις της LGR5 αρνητική ρύθμιση και των πιο παροδικές επιδράσεις των LGR5 ρύθμιση προς τα άνω επί των ξενομοσχευμάτων. Παρατηρήσαμε πολύ καλή συσχέτιση (R = 0,996) μεταξύ της ικανότητας κλωνισμού σε μαλακό άγαρ και το ογκογόνο (Εικ. 5D), επιβεβαιώνοντας την εγκυρότητα της πρώην ως δοκιμασία υποκατάστατο.

LIM1899 κύτταρα ψευδο-επιμολυσμένα (χωρίς φορέα), επιμολυσμένα με Cy3LGR5 ή με pTune /LGR5. Τα κύτταρα επεκτάθηκαν για δύο διπλασιασμούς (48 ώρες) μετά την επιμόλυνση, τότε συλλέγονται για τον εμβολιασμό σε γυμνά ποντίκια, προσδιορισμός της ανάπτυξης σε μαλακό άγαρ και μέτρηση της έκφρασης LGR5 με qRT-PCR όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Α) Αριστερό πλαίσιο: ξενομοσχεύματα καμπύλες ανάπτυξης όγκου, δεξιά πάνελ: μάζα του όγκου σε day18. Η αύξηση των υποδόριων όγκων μετρήθηκε τρεις φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας δαγκάνες, και τον όγκο που καθορίζεται από τον τύπο V = 1/2 (μήκος Χ πλάτος

2). Στο τέλος του πειράματος (ημέρα 18) οι όγκοι αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν. Τα δεδομένα είναι μέσοι όροι και τυπικά σφάλματα για κάθε ομάδα (16 όγκοι /ομάδα). Δεν υπήρχε στατιστική διαφορά μεταξύ των γονικών και pTune μάζα Lgr5 του όγκου, ωστόσο, η διαφορά μεταξύ των γονικών και siLGR5 όγκων είναι σημαντική (*** = ρ & lt? 0.001). Β) Ένα δείγμα κυττάρων που χρησιμοποιούνται για την ένεση ξενομοσχεύματος ελέγχθηκε με qRT-PCR για την έκφραση LGR5. Τα δεδομένα αναλύθηκαν σε ΑΒΙ 7300 (μελέτη ΔΔCt), και παρουσιάζονται ως έκφραση LGR5 σε σχέση με τα γονικά κύτταρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι και τυπικά σφάλματα. C) Χρόνος διάρκεια της έκφρασης διαγονιδίου σε καλλιεργημένα ΕΑΥ 1899. Η έκφραση των LGR5 σε κύτταρα επιμολυσμένα με siLGR5 ή pTune LGR5 ακολούθησε κατά τη διάρκεια μιας περιόδου δύο εβδομάδων από qRT-PCR. Τα επίπεδα της έκφρασης LGR5 παρουσιάζονται σε σχέση προς τον φορέα ελέγχου για κάθε ένα από τα χρονικά σημεία. Δ) Ένα δείγμα κυττάρων που χρησιμοποιούνται για το πείραμα ξενομοσχεύματος καλλιεργήθηκε σε πλάκες μαλακού άγαρ σε 5 × 10

3 κύτταρα /πλάκα για να καθορίσει την αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης. Οι πλάκες επωάστηκαν για 10 ημέρες, μετά χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και αποικία αριθμούς προσδιορίζεται με οπτικό μικροσκόπιο. *** = Ρ & lt? 0.001. Ε) Η συσχέτιση μεταξύ της μάζας του όγκου (διάγραμμα Α) και της αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης (γράφημα D).

Η

Αναλύσαμε τις υποδόριων όγκων για την έκφραση LGR5 χρήση ανοσοφθορισμού. Αντιπροσωπευτικές εικόνες των όγκων χρωματίστηκαν με heamatoxilin και ηωσίνη (Α), ή συν-βάφτηκαν με LGR5 και β-κατενίνης (εικόνες ανοσοφθορισμού) δείχνονται στο Σχ. 6. Μορφολογικά, όλοι οι όγκοι αποτελούνταν από καλά καθορισμένες αδένων, και θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως μετρίως διαφοροποιημένα αδενοκαρκινώματα (Σχ. 6Α). Όγκοι που προέρχονται από siLGR5 LIM1899 έτειναν να έχουν πιο διαταραγμένο μορφολογία, η οποία αντανακλάται στη λεπτή αλλά σημαντική διαφορά στον αριθμό των καλοσχηματισμένα αδένες ανά τομέα μεταξύ των γονικών όγκων (26 +/- 3 n = 16) και οι όγκοι siLGR5 (15 + /-2 η = 16? p = 0,0014). Ο αριθμός των αδένων ανά πεδίο αυξήθηκε σε όγκους που υπερεκφράζουν LGR5 (31 +/- 2, n = 16), ωστόσο, η διαφορά από τα πατρικά όγκοι δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Σε όλα τα δείγματα όγκων χρώση LGR5 ήταν περισσότερο εμφανής στους αδένες, ιδιαίτερα προς τον αυλό αδένα, και ήταν ασθενέστερη στις πιο άμορφες περιοχές του όγκου (Σχ. 6Β). Η χρώση για LGR5 ήταν ειδική, καθώς δεν ανιχνεύθηκε σήμα σε δείγματα επωάζονται με (Εικ. 6C) φυσιολογικό ορό κουνελιού. LGR5 ανοσοαντιδραστικότητα οριακά αυξημένο σε όγκους που προέρχονται από κύτταρα επιμολυσμένα με LIM1899 pTune LGR5, αλλά όχι σε όλες τις περιοχές των όγκων. χρώση LGR5 μειώθηκε, αλλά όχι εντελώς απούσα, σε όγκους που προέρχονται από κύτταρα επιμολυσμένα με LIM1899 siLGR5. Σε αυτά τα δείγματα, έκφραση LGR5 εμφανίστηκε περιορίζεται στα αδενικό δομές (Εικ. 6Β).

Α) Haematoxilin και χρώση ηωσίνης κατεψυγμένων τμημάτων από εκπρόσωπο όγκοι που δημιουργούνται από τη γονική LIM1899, LIM1899 επιμολυσμένα με siRNA να LGR5 ή LIM1899 επιμολυσμένα με pTune-LGR5 κατασκευή. Φωτεινού εικόνες αποκτήθηκαν σε ένα 90i μικροσκόπιο Nikon με φακό 20 ×. Β) Ομοεστιακή εικόνες των κατεψυγμένων τομών χρωματίζονται με αντισώματα εναντίον της β-κατενίνης (κόκκινο), LGR5 (πράσινο) ή ο λεκές DAPI DNA (μπλε). Όλες οι εικόνες είναι Ζ-στοίβες των ομοεστιακό τμήματα. Για κάθε σετ, ο άνω πάνελ δείχνει τα τρία συνδυασμένα λεκέδες, ο LGR5 μεσαίο πάνελ (κλίμακα του γκρι), και ο κάτω πίνακας β-κατενίνης (κλίμακα του γκρι). Εικόνες ελήφθησαν σε Nikon C1 συνεστιακό μικροσκόπιο με ένα φακό λάδι 60 ×. C) Εξειδίκευση έλεγχος για χρώση LGR5: παγωμένες τομές χρωματίστηκαν με αντίσωμα προς β-κατενίνης και φυσιολογικό ορό κουνελιού, ακολουθούμενο από Alexa 488 αντι-κουνελιού Ig (πράσινο) και Alexa 546 αντι-ποντικού Ig (κόκκινο) και το DAPI πυρηνική χρώση ( μπλε). Το πράσινο κανάλι (NRS) και το κόκκινο κανάλι (β-κατενίνης) εμφανίζονται χωριστά σε αποχρώσεις του γκρι. Εικόνες λήφθηκαν όπως στο Β).

Η

Η προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και η μετανάστευση ρυθμίζονται από τα επίπεδα LGR5

επίπεδα

LGR5 έχουν σοβαρές συνέπειες για την αγκύρωση ανεξάρτητο πολλαπλασιασμό του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων σε vitro «και» in vivo «? ωστόσο πως LGR5 διαμορφώνει ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη είναι ασαφής. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν LIM1899 LGR5 τείνουν να αναπτύσσονται σε «αποικίες» με σφιχτό επαφές κυττάρου-προς-κύτταρο, ενώ LIM1215 και LIM1899 κυττάρων με μειωμένη LGR5 είναι περισσότερο διάχυτες στην πλαστική επιφάνεια (δεν φαίνεται). Τα αντίθετα φαινότυποι που παρατηρήθηκαν μετά knockdown ή υπερέκφραση LGR5, και τη συνοχή τους σε παροδικές και σταθερές συστήματα έκφρασης, δείχνουν ότι το φαινόμενο αυτό συσχετίζεται άμεσα με τα επίπεδα LGR5. Έτσι LGR5 μπορεί να διαμορφώνει την ισορροπία μεταξύ κυττάρου-κυττάρου και προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος. Για να χαρακτηρίσουμε κυττάρου-μήτρας και των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου καλλιεργήσαμε κύτταρα ως σφαιροειδή σε κρεμαστά σταγόνες [38] και πραγματοποιείται δύο ποσοτικούς προσδιορισμούς τραύματος και προσδιορισμούς κινητικότητα για τη μέτρηση του δυναμικού μετανάστευση των κυττάρων. Κρεμαστή δοκιμασίες σταγόνες μετρούν την πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυττάρων εν απουσία αλληλεπιδράσεων κυττάρου-μήτρας? δοκιμασίες πληγή αξιολογηθεί ο ρυθμός της κίνησης του ενός κυττάρου μονοστιβάδας, και η δοκιμασία κινητικότητας μετρά τον ρυθμό μετανάστευσης των κυττάρων μέσω του ECM στους πόρους του φίλτρου.

γονικά κύτταρα LIM1899, ή κύτταρα LIM1899 επιμολυσμένα με άδειο φορείς, μεγαλώνουν σε κρεμαστά σταγόνες ως αδρανή υλικά με πυκνή κέντρα (Εικ. 7Α). Σε παράλληλες καλλιέργειες, τα σφαιροειδή κυττάρων με μειωμένα επίπεδα LGR5 (siLGR5) που περιβάλλεται από ένα φωτοστέφανο χαλαρά που σχετίζονται με κύτταρα και εύκολα διαταράσσονται, ενώ τα κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα LGR5 (M2LGR5), είτε παροδικά είτε σταθερά, το πακέτο σε συμπαγή σφαιροειδή ανθεκτικά σε μηχανική διάσπαση (Σχ. 7Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η διαφορά στην πυκνότητα των κυττάρων αντικατοπτρίζεται στον όγκο των σφαιροειδών σε σχέση με την κυτταρικότητα τους: ενώ σφαιροειδή από διαφορετικές κυτταρικές γραμμές περιέχουν παρόμοιο αριθμό κυττάρων (Εικ. 7Α, δεξιό γράφημα χέρι), η διαφορά όγκου μεταξύ σφαιροειδή siLGR5 και σφαιροειδή υπερεκφράζουν LGR5 (Εικ. 7Α, αριστερό γράφημα χέρι) είναι σημαντική (p = 0,001), αντικατοπτρίζοντας ένα αυστηρότερο συσκευασία των κυττάρων σε M2LGR5.

Lim1899 κύτταρα επιμολυσμένα με τους ελέγχους φορέα (Cy3V και pTuneV), με Cy3- siLGR5 ή με pTune /LGR5. Η γονική, παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα (Tr) ή σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές (St) καλλιεργήθηκαν υπό τις ακόλουθες συνθήκες: Α) Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 30 σταγονίδια μΐ σε μια πλαστική επιφάνεια, και η πλάκα αναστρέφεται για να δημιουργήσει κρέμονται σταγόνες όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Εικόνες ελήφθησαν μετά από 8 ημέρες από την εκ νέου αναστρέφοντας την πλαστική υποστήριξη και απεικόνισης σε φωτεινό πεδίο με ένα 90i μικροσκόπιο Nikon και ένα φακό 10 ×. Ψηφιακές εικόνες αποκτήθηκαν με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Photometrics CoolSnap. Σφαιροειδές όγκους (γράφημα αριστερά) υπολογίστηκαν από αυτές τις εικόνες χρησιμοποιώντας το τροποποιημένο ελλειψοειδές τύπο. Σφαιροειδές μεγέθη διέφερε σημαντικά μεταξύ siLGR5 ή M2LGR5 επιμολυσμένα κύτταρα και των ομολόγων τους επιμολυσμένα με άδειο φορέα (ρ = 0,0312 και ρ = 0,321, αντίστοιχα, από το μη συζευγμένο t-test). Η κυτταρικότητα των σφαιροειδών (δεξιά γραφική παράσταση χεριού) αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Σε αμφότερες τις γραφικές παραστάσεις των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή και την τυπική απόκλιση των 10 ατομικές σφαιροειδή ανά κυτταρική γραμμή. Β) γονικά κύτταρα και κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με pTune /LGR5 (κλώνοι 6-1) απλώθηκαν σε υψηλή πυκνότητα σε πλάκες 24 φρεατίων. Τα τραύματα ήταν γδαρμένο στα προσκολλημένα monolyers και τα φρεάτια απεικονίστηκαν κάθε δύο ημέρες με ένα μικροσκόπιο Nikon90i χρησιμοποιώντας ένα φακό 10 × (άνω πλαίσια). Η μικροφωτογραφία στην κάτω δεξιά δείχνει μια υψηλότερη μεγέθυνση LGR5 6-1 τραύματος κατά την ημέρα 6 (20 × φακό). Εισάγετε: Ισοτιμία του κλεισίματος του τραύματος πάνω από 96 ώρες. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε).