Αφηρημένο

Ιστορικό

Ως επιτακτική ανάγκη μέρος της PI3K /Akt /mTOR μονοπάτι , στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα και όγκοι. Η έρευνά μας διερεύνησε τη σχέση μεταξύ του πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP) rs2295080 στο

mTOR

περιοχή του υποκινητή και του κινδύνου καρκίνου του στομάχου (GC).

Μέθοδοι

επτακόσια πενήντα -Τρία (753) ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα στομάχου και 854 υγιή άτομα στρατολογήθηκαν στην μελέτη σύνδεσης του καρκίνου και 60 ιστοί που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της έκφρασης του

mTOR

. Άνευ όρων λογιστικής παλινδρόμησης επιλέχθηκε για να αξιολογήσει τη σχέση μεταξύ του rs2295080 Τ & gt? G πολυμορφισμό και τον κίνδυνο GC. Στη συνέχεια εξετάζεται η λειτουργικότητα αυτού του υποκινητή γενετική παραλλαγή με δοκιμασία λουσιφεράσης και EMSA.

Αποτελέσματα

Τα άτομα με G αλληλόμορφο είχαν 23% μειωμένο κίνδυνο του GC, σε σύγκριση με εκείνους που φέρουν το αλληλόμορφο Τ (προσαρμοσμένο OR = 0.77, 95% CI = 0,65 – 0,92). Αυτή η προστατευτική δράση της G αλληλόμορφο ξεχώρισαν καλύτερα στο αρσενικό ομάδα. Εν τω μεταξύ, οι ασθενείς GC μεταφέρουν TG /GG γονότυπο εμφανίζεται επίσης ένα μειωμένο επίπεδο του mRNA της

mTOR

(

P

= 0,004). Στην δοκιμασία λουσιφεράσης, Τ αλληλίου έτειναν να ενισχύσουν την μεταγραφική δραστικότητα του

mTOR

με κατά προσέγγιση 0,5-φορές πάνω G αλληλόμορφο. Επιπλέον, οι δοκιμές EMSA εξήγησε ότι διαφορετικά αλληλόμορφα του rs2295080 εμφανίζονται διαφορετικές συγγένειες σε κάποιο μεταγραφικό παράγοντα.

Συμπέρασμα

Το

mTOR

rs2295080 πολυμορφισμός υποκινητή συσχετίστηκε σημαντικά με τον κίνδυνο GC. Αυτό το SNP, η οποία επηρέασε ουσιαστικά την έκφραση

mTOR

, μπορεί να είναι ένα νέο βιοδείκτη της έγκαιρης διάγνωσης του καρκίνου του στομάχου και ένα κατάλληλο δείκτη της αξιοποίησης αναστολέας mTOR για τη θεραπεία της GC

Παράθεση:. Xu Μ, Τάο G, Kang Μ, Gao Υ, Zhu Η Gong W, et al. (2013) ένας πολυμορφισμός (rs2295080) στο

mTOR

Ανάδοχος Περιφέρεια και η σύνδεσή της με τον καρκίνο του γαστρικού σε ένα κινεζικό πληθυσμό. PLoS ONE 8 (3): e60080. doi: 10.1371 /journal.pone.0060080

Επιμέλεια: Paolo Peterlongo, IFOM, Fondazione Istituto di FIRC Oncologia Molecolare, Ιταλία

Ελήφθη: 26 Νοεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 21 Φεβρουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 Μαρτίου του 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81230068, 30972444, 81001274 και 81102089), το Πρόγραμμα Κλειδί του Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (BK2010080), Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (BK2011773 και BK2012842), το πρόγραμμα βασικού για την Βασική Έρευνα της Jiangsu Provincial Τμήμα Επιστημών της Αγωγής (11KJB330002 και 12KJA330002), το Πρόγραμμα Qing-Lan των Jiangsu επαρχιακή Υπουργείο Παιδείας, και την προτεραιότητα Ακαδημαϊκό Πρόγραμμα Ανάπτυξης των Jiangsu Ιδρυμάτων Ανώτατης Εκπαίδευσης (Δημόσιας Υγείας και προληπτικής Ιατρικής). Θα θέλαμε επίσης να ευχαριστήσουμε Luo Υ (Nanjing Ερυθρός Σταυρός Κέντρο Αίματος) για τη βοήθειά της με λειτουργικά πειράματα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει καμία σύγκρουση συμφερόντων

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενες καρκίνου σε όλο τον κόσμο μεταξύ των ανδρών με 640.556 και γυναίκες με 349.042 νέες περιπτώσεις και 738.069 θάνατοι που σχετίζονται με το 2008 [1]. Κατά την εξέταση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας, χειρουργική εκτομή μπορεί να είναι πρωτοταγείς θεραπευτική αγωγή για πρώιμο στάδιο των ασθενών GC [2]. Δυστυχώς, οι περισσότεροι ασθενείς με γαστρικό καρκίνο ανιχνευθεί σε προχωρημένο στάδιο, περίοδο κατά την οποία ο όγκος είναι ανεγχείρητο πια. Επιπλέον, η υποτροπή μετά από χειρουργική επέμβαση είναι ένα άλλο φοβερό γεγονός για ένα φτωχό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών. Λαμβάνοντας υπόψη τους ασθενείς με προχωρημένο ή υποτροπιάζοντα καρκίνο του στομάχου, είναι χωρίς αμφιβολία ότι η ανακάλυψη βιοδεικτών και την εφαρμογή τους συνοδεύεται με την παραδοσιακή διάγνωση μπορεί να είναι μια πολύτιμη ένδειξη και μια εκτεταμένη βοήθεια για να διαμορφώσει τη στρατηγική πρόληψης και θεραπείας.

θηλαστικών στόχου ραπαμυκίνης (mTOR) αποτελείται από 2549 αμινοξέα τοποθετημένα σε υψηλά συντηρημένη περιοχή [3]. Δομικά, mTOR περιέχει έναν τομέα δεσμεύσεως ραπαμυκίνης στο κεντρικό του τμήμα και ένα πεδίο κινάσης στο [4] Ο-άκρο. Ως βασικό συστατικό του μονοπατιού PI3K /Akt /mTOR, mTOR είναι στενά σχετικές με το κεφάλαιο κυτταρικές διαδικασίες όπως η κυτταρική ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό, τον μεταβολισμό, τη μετανάστευση, την αγγειογένεση και απόπτωση [5] – [7]. Μέχρι τώρα,

mTOR

προϊόντων αυτών ως δύο διακριτά συμπλέγματα (δηλαδή, mTORC1 και mTORC2) με διαφορετική ευαισθησία [8], [9]. mTORC1 είναι μια ραπαμυκίνη ευαίσθητη συγκροτήματος το οποίο περιλαμβάνει mTOR συν FK506-δέσμευσης πρωτεΐνης 12 kDa (FKBP12), LST8 θηλαστικών (mLST8), και το ρυθμιστικό που σχετίζεται με πρωτεΐνη mTOR (αρπακτικών). Σε αντίθεση, mTORC2 αποτελείται με SIN1, mLST8, και ραπαμυκίνη-αναίσθητη σύντροφος του mTOR (rictor) [10] – [12]. Δυσλειτουργία του

mTOR

εμφανίζεται συχνά σε διάφορα είδη καρκίνων κατά τη διάρκεια της καρκινογένεση και την υποβάθμιση. Ωστόσο, οι λόγοι για αυτήν την παρεκκλίνουσα το φαινόμενο είναι ακόμα κορεσμένη με συζητήσεις.

Μια σειρά από μελέτες έχουν διερευνήσει το ρόλο των πολυμορφισμών απλού νουκλεοτιδίου (SNPs) του

mTOR

γονιδίου στην αιτιολογία των καρκίνων σε διάφορα όργανα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του οισοφάγου [13], ο καρκίνος του πνεύμονα [14], καρκίνος της ουροδόχου κύστης [15], καρκίνος του παχέος εντέρου, του καρκίνου του ορθού [16], και οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία [17]. Τα περισσότερα από αυτά τα SNPs εντοπίσετε στα εξώνια ή εσώνια με άγνωστα λειτουργικά αποτελέσματα. Πρόσφατα, ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν επικεντρωθεί στην καθίσματα SNPs σε περιοχή προαγωγού του γονιδίου, οι οποίες αποδείχθηκε ότι επηρεάζουν την ικανότητα δέσμευσης με κάποια μεταγραφικών παραγόντων (ΤΡ) και να επηρεάσει την ακόλουθη μεταγραφή γονιδίου. Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι

mTOR

rs2295080 Τ & gt? G πολυμορφισμό εντός της περιοχής του υποκινητή μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία σε GC. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, είμαστε ο γονότυπος τη συχνότητα του

mTOR

rs2295080 να δοκιμαστεί η σημασία του για τον κίνδυνο GC σε εξέλιξη, το νοσοκομείο με βάση, μελέτη ασθενών-μαρτύρων μας σε ένα κινεζικό πληθυσμό. Κατά συνέπεια, εντοπίσαμε τις

mTOR

επίπεδα mRNA με διαφορετικούς γονότυπους στους ιστούς των ασθενών με καρκίνο του στομάχου. Επιπλέον, χαρακτηρίσαμε περαιτέρω τη λειτουργικότητα αυτής της γενετικής παραλλαγής για το

mTOR

μεταγραφής υποκινητή με δοκιμασία λουσιφεράσης και EMSA.

Υλικά και Μέθοδοι

Θέματα Μελέτη

Αυτή η μελέτη περιελάμβανε 753 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα στομάχου ιστολογικά επιβεβαιωμένες και 854 του καρκίνου χωρίς ελέγχους. Όλοι οι ασθενείς είχαν προσληφθεί από τον καρκίνο Κλινικής Έρευνας Βάσης της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο από τον Μάρτιο του 2006 και τον Ιανουάριο του 2010. Και όλα δημογραφικές και κλινικές πληροφορίες, όπως η ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, η περιοχή του όγκου, τον ιστολογικό τύπο, το βάθος της εισβολής, λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες, μακρινή μετάσταση, και το στάδιο TNM, ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα σύντομο ερωτηματολόγιο και κλινική ιατρικά αρχεία.

η συχνότητα-μάρτυρες σε αυτές τις περιπτώσεις με την ηλικία (± 5 έτη) και το φύλο συλλέχθηκαν κατά την ίδια περίοδο και τις περιφέρειες της άσχετα γενετική σχέση με γαστρική νόσο και το πεπτικό σύστημα των όγκων. Κάθε συμμετέχων υπογράψει έγγραφη συγκατάθεση και δώρισε 5 ml φλεβικού αίματος για την εξαγωγή γονιδιακού DNA. Το ερευνητικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

DNA Εξόρυξη και SNP Γονοτυπικές

Το γονιδιακό DNA εκχυλίζεται από δείγματα αίματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Γονοτυπική ολοκληρώθηκε με TaqMan Δοκιμασία SNP γονοτυπική χρησιμοποιώντας ΑΒΙ 7900HT πραγματικού χρόνου PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) και Sequence Detection System έκδοση 2.4 (SDS 2.4). Οι αλληλουχίες των εκκινητών και ανιχνευτών ήταν διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος, και έλεγχοι που περιέχονται σε κάθε πλάκα για να εξασφαλιστεί η ακρίβεια των γονότυπου. Η δοκιμασία γονοτυποποίηση διεξήχθη από δύο άτομα ανεξάρτητα με τυφλό τρόπο. Περισσότερο από το 10% των δειγμάτων επιλέχθηκαν τυχαία για επιβεβαίωση, και τα αποτελέσματα ήταν 100% συγκλίνουσες. Εκκινητές και ανιχνευτές που παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Cell Culture και Κατασκευή Ανάδοχος Reporter πλασμίδια

Ένα φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο επιθηλιακά κυτταρική σειρά (GES-1) και τρεις διαφορετικές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (BGC -823, MGC-803, και SGC-7901) εγκρίθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Τροποποιημένο /High γλυκόζη μέσο καλλιέργειας ϋυΐββοοο Egale Medium με 10% FBS, 10 mM HEPES, 2 mM L-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 95% αέρα και

2 5% CO. Τα περισσότερα από τα αντιδραστήρια ελήφθησαν από την GIBCO (Burlington, Ontario, Canada)

λουσιφεράσης πλασμίδια ανταποκριτές, ο ανθρώπινος

mTOR

αλληλουχίες προαγωγού με διαφορετικά αλληλόμορφα για rs2295080 Τ & gt?. G πολυμορφισμό συνετέθησαν και κατασκευασμένα σε pGL3-βασικό φορέα (Promega, Madison, WI, USA) με Generay Εταιρείας (Σαγκάη, Κίνα). Όλα τα πλασμίδια επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA. Εκκινητές που εμπλέκονται στη δοκιμή είχαν παρατίθενται στον Πίνακα S2.

παροδική επιμόλυνση και Λουσιφεράσης Δοκιμασία

GES-1, BGC-823, MGC-803, και SGC-7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) με 0.8 μα από κάθε κατασκευασμένο φορέα, είτε με Τ αλληλίου ή με G αλληλόμορφο. Ταυτόχρονα, 10 ng pRL-SV40 ανά φρεάτιο επίσης επιμολυσμένα ως εσωτερικός έλεγχος για τη διόρθωση αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Πριν, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων όλη τη νύχτα για να εξασφαλιστεί το 90% -95% συρροή κατά τη στιγμή της διαμόλυνσης. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, η δράση της λουσιφεράσης μετρήθηκε με την Dual-Luciferase Reporter System Assay (Promega, Madison, WI, USA) και εκφράζονται ως ο λόγος του Firefly λουσιφεράσης για λουσιφεράση της Renilla δραστηριότητες. Όλα τα κύτταρα έγιναν εις τριπλούν με τους ίδιους όρους

Κινητικότητα ηλεκτροφορητικής Shift Δοκιμασία (EMSA)

Η αίσθηση αλληλουχίες ανιχνευτή ήταν ως εξής: rs2295080 καθετήρα Τ, 5′-AGGGTTCCCATCCCTGAGGAC-3 ‘?. rs2295080 G ανιχνευτή, 5’-AGGGTTCCCAGCCCTGAGGAC-3 ‘. Πυρηνικές πρωτεΐνες εκχυλίζονται με NE-PERTM των πυρηνικών και κυτταροπλασματικά εκχύλισης Αντιδραστήρια (Pierce, Ροκ-ford, IL, USA). ανιχνευτές DNA παρασκευάστηκαν με την Βιοτίνη 3’-άκρο του DNA Labeling Kit (Pierce, Ροκ-ford, IL, USA). δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA) πραγματοποιήθηκε με ένα κιτ LightShift Χημειοφωταυγές EMSA (Pierce, Ροκ-ford, IL, USA). Οι αντιδράσεις δέσμευσης πραγματοποιήθηκαν ως εξής: πυρηνικά εκχυλίσματα (8 μg πρωτεΐνης) και το ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 1 × με 2,5% γλυκερόλη, 5 mM MgCl

2, 50 ng /μl πολυ (dI-dC), 0,05% ΝΡ-40, και 20 fmol επισημασμένο με βιοτίνη rs2295080 T /rs2295080 ανιχνευτές G επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά σε έναν όγκο 20 μΙ. Για τις μελέτες ανταγωνισμού, πυρηνικά εκχυλίσματα επωάστηκαν με μη επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο για 30 λεπτά πριν από την προσθήκη του επισημασμένου ολιγονουκλεοτιδίου.

Τα επίπεδα έκφρασης του

mTOR

mRNA.

Ολικό RNA από 60 γαστρικό καρκινικούς ιστούς, που περιλαμβάνεται στην 753 περιπτώσεις, με διαφορετικούς γονοτύπους εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Το mRNA μετρήθηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (ABI 7300) μετά από αντίστροφη μεταγραφή. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός ποσοτικού ελέγχου για κάθε δείγμα. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του mTOR ήταν F: 5′-TTGCTTGAGGTGCTACTG-3 ‘και R: 5′-CTGACTTGACTTGGATTCTG-3′? Οι εκκινητές για GAPDH ήταν F: 5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3 ‘και R: 5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’. Σχετική ποσοτικοποίηση των

mTOR

mRNA υπολογίστηκε με τη μέθοδο 2-ΔΔCt. Διπλώστε αλλαγές ομαλοποιήθηκαν σε σχέση με GAPDH, και κάθε δοκιμασία έγινε εις τριπλούν.

Στατιστική ανάλυση.

Hardy-Weinberg ισορροπία (HWE) αξιολογήθηκε από το chi-square τεστ καλής προσαρμογής να συγκρίνουν τις παρατηρούμενες συχνότητες γονοτύπου με την αναμενόμενη από τους ελέγχους. Συσχετίσεις μεταξύ των γονότυπων και τον κίνδυνο του καρκίνου του στομάχου εκτιμήθηκε υπολογίζοντας αναλογίες πιθανοτήτων (OR) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (ΠΙ) από λογιστικής παλινδρόμησης αναλύσεις με προσαρμογή ως προς την ηλικία και το φύλο. Δύο όψεων χ

2 τεστ στατιστικής σημαντικότητας πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SAS (έκδοση 9.1.3? SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημασίας.

Αποτελέσματα

χαρακτηριστικά των συμμετεχόντων στη μελέτη

τα επιλεγμένα χαρακτηριστικά αυτών των υποθέσεων και των ελέγχων συνοψίζονται στον πίνακα 1. Οι περιπτώσεις και οι έλεγχοι φαίνεται να ταιριάζουν επαρκώς στην ηλικίας (

P

= 0,424) και το φύλο (

P

= 0,406). Μεταξύ των 753 περιπτώσεις, θέσεις όγκου περιλαμβάνονται 295 καρκίνου καρδιακή (39,2%) και 458 καρκίνο μη-καρδιακό (60,8%). Οι ασθενείς με τύπου διάχυτη (437, 58,0%) έδειξε ελαφρώς υψηλότερη αναλογία από το εντερικό τύπο (316, 42,0%). Με βάση την ταξινόμηση ΤΝΜ της American μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC εγχειρίδιο καρκίνο στάσης, 6

η έκδοση) [19], 17,3%, 17,3%, 50,6% και 14,8% των ασθενών είχαν Τ1, Τ2, Τ3, και Τ4, αντίστοιχα. Εν τω μεταξύ, το 60,6% των ασθενών παρουσίασε θετική μετάσταση στους λεμφαδένες και 13,0% υπήρχε μακρινή μετάσταση. Σύμφωνα με αυτά τα κλινικά χαρακτηριστικά, όλοι οι ασθενείς τελικά εντοπιστεί στο στάδιο Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και IV, με 26,8%, 21,9%, 35,3% και 16,0%, αντίστοιχα.

Η

των συνολικών επιπτώσεων των rs2295080 Πολυμορφισμός σχετικά με τον κίνδυνο GC

Ο γονότυπος οι διανομές και οι συχνότητες αλληλόμορφο του rs2295080 παρουσιάζονται στον πίνακα 2. Οι συχνότητες γονοτύπου στους ελέγχους ήταν σε συμφωνία με το μοντέλο HWE (

P

= 0,569 ). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, οι συχνότητες γονοτύπου του rs2295080 ήταν 64,0%, 32,7%, και 3,3% για τους γονότυπους ΤΤ, TG, και GG μεταξύ των περιπτώσεων, και 58,2%, 35,7%, και 6,1% μεταξύ των ελέγχων, αντίστοιχα. Η διαφορά μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων ήταν στατιστικώς σημαντική (

Ρ = 0,008

). Επίσης, η συχνότητα αλληλόμορφο G ήταν σημαντικά χαμηλότερη μεταξύ των περιπτώσεων από τους ελέγχους (19,7% έναντι 23,9%,

P

= 0,003). Επιπλέον, η συνδυασμένη συχνότητα γονότυπο TG /GG ήταν χαμηλότερη μεταξύ των περιπτώσεων από τους ελέγχους (36,0% έναντι 41,8%,

P

= 0,016). Κατά τη λήψη ΤΤ γονότυπο ως σημείο αναφοράς, διαπιστώσαμε ότι οι γονότυπους παραλλαγή (TG και GG) συσχετίστηκαν με μειωμένο κίνδυνο GC με τρόπο δόσης-απόκρισης σε σύγκριση με το γονότυπο ΤΤ (προσαρμογή OR = 0.83, 95% CI = 0,67 – 1,02 για TG, και 0,49, 0,30 – 0,80 για το GG?

P

τάση = 0,003). Ομοίως, παρατηρήσαμε επίσης ότι οι συνδυασμένες TG /GG γονότυπους που σχετίζονται με στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη ευαισθησία σε GC σε σύγκριση με το γονότυπο ΤΤ (0,78, 0,64 – 0,96). Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η

mTOR

αλληλόμορφο rs2295080 G μπορεί να είναι ένας πιθανός προστατευτικός αλληλόμορφο.

Η

Τα αρσενικά είναι πιο ευάλωτο στον καρκίνο του γαστρικού με rs2295080 Πολυμορφισμός

Όπως είναι καθιερωμένη, η ηλικία και το φύλο ήταν σημαντικοί παράγοντες στην καρκινογένεση όγκων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου. Σύμφωνα με την ανάλυση στρωματοποίησης με την ηλικία και το φύλο παράγοντες, διαπιστώσαμε ότι σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε σε αρσενικούς ομάδα, παρά σε γυναικεία ομάδα (Πίνακας 3). Στους άνδρες, που μεταφέρουν rs2295080 αλληλόμορφο G ήταν σημαντικά μειωμένη παράγοντα κινδύνου (OR = 0,72, 95% CI = 0,56 – 0,93 για το TG /GG έναντι ΤΤ), σε σύγκριση με την άσκηση αλληλόμορφο Τ. Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία στατιστική διαφορά μεταξύ νέων και ηλικιωμένων ατόμων.

Η

Η ανάλυση διαστρωμάτωσης των Ενώσεων μεταξύ rs2295080 Πολυμορφισμός και κλινικές μεταβλητές της γαστρικός καρκίνος

Εμείς πραγματοποίησε την ανάλυση διαστρωμάτωση της rs2295080 πολυμορφισμός σε όλα τα μαθήματα από τα κλινικά χαρακτηριστικά του GC. Μεταξύ όλων των ανεξάρτητων μεταβλητών, οι προστατευτικές επιδράσεις παρατηρήθηκαν κυρίως σε υποομάδες των ασθενών με καρδιακή γαστρικό καρκίνο (OR = 0,68, 95% CI = 0,52 – 0,91), εντερικό τύπο (0,73, 0,56 – 0,96), Τ3 βάθος εισβολή (0.78, 0.60 -1.00), μετάσταση θετικό λεμφαδένα (0,79, 0,62 – 1,00), αρνητικό μακρινή μετάσταση (0,76, 0,62 – 0,94), και εντοπισμένη στάδιο (0,76, 0,59-0,98) (Πίνακας 4).

Η

επίδραση του rs2295080 πολυμορφισμός στην μεταγραφική δραστηριότητα

για να αποκτήσουν μια εικόνα για το βιολογικό λειτουργικό αποτέλεσμα του rs2295080 πολυμορφισμού στο

mTOR

μεταγραφή, GES-1, BGC823, MGC803 και SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με διαφορετικά πλασμίδια έκθεση της λουσιφεράσης, συμπεριλαμβανομένου του άγριου τύπου (Τ αλληλόμορφου) και μεταλλάσσονται τύπου (G αλληλόμορφο). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, βρήκαμε ότι η δραστικότητα μεταγραφής του Τ αλληλίου ήταν υψηλότερο από G αλληλόμορφο με ένα περίπου 1,5 φορές σε πάνω από τέσσερις κυτταρικές γραμμές, γεγονός που υποδηλώνει ότι αλληλόμορφο rs2295080 G εργαστεί ως αμυντικός για καρκίνο του στομάχου, μειώνοντας τη μεταγραφή του

mTOR

.

(Α) Ανάδοχος δραστηριότητα των διαφορετικών αλληλόμορφων του

mTOR

rs2295080 πολυμορφισμό. Τ αλληλόμορφο περιγράφηκε περίπου 0,5 φορές πάνω από την ικανότητά αλληλόμορφο G μέσα σε δοκιμασία λουσιφεράσης από τέσσερα είδη των γαστρικών κυτταρικές σειρές (GES-1, BGC-823, MGC-803 και SGC-7901). (Β) Πυρηνικές πρωτεΐνες δραστηριότητα των διαφορετικών αλληλόμορφων των δεσμευτικών

mTOR

rs2295080 πολυμορφισμό. Βιοτινυλιωμένο ανιχνευτές (20 fmol) επωάστηκαν με 8 μα πυρηνικά εκχυλίσματα από SGC-7901 κύτταρα. Σε πειράματα ανταγωνισμού, 10-, 100-, και 200-πλάσια γραμμομοριακή περίσσεια μη επισημασμένου rs2295080 Τ /rs2295080 ανιχνευτές G χρησιμοποιήθηκαν για να αποδείξουν την ιδιαιτερότητα κάθε αντίδραση σύνδεσης.

Η

πυρηνική πρωτεΐνη δραστικότητα δέσμευσης των παραλλαγών στο rs2295080

στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα EMSA να αναλύσει τις βιολογικές συνέπειες της rs2295050 πολυμορφισμού στη ΓΓΕ-7901 κύτταρα. Μία ισχυρή ζώνη (σύμπλεγμα πρωτεΐνης) μετατοπίζεται όταν τα πυρηνικά εκχυλίσματα επωάστηκαν με βιοτίνη σημασμένο ανιχνευτή rs2295080 Τ, ενώ παρατηρήθηκε η ασθενέστερη ζώνη όταν τα πυρηνικά εκχυλίσματα επωάστηκαν με επισημασμένο με βιοτίνη με ανιχνευτή rs2295080 G. Οι μετατοπισμένες ζώνες ήταν σημαντικά αναστέλλεται από μια μοριακή περίσσεια ενός μη επισημασμένου rs2295080 Τ ή rs2295080 ανταγωνιστή G με δοσο-εξαρτηθεί τρόπο (Εικ. 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι rs2295080 G αλληλόμορφο θα μπορούσε να μειώσει τη δραστικότητα δέσμευσης πυρηνικής πρωτεΐνης σε κάποιο βαθμό.

Σύνδεσης μεταξύ

mTOR

rs2295080 Πολυμορφισμός και τα επίπεδα έκφρασης του

mTOR

mRNA

Εξήντα τρεις γαστρικό καρκίνο ιστούς με διαφορετικούς γονότυπους του

mTOR

rs2295080 ήταν διαθέσιμα στην παρούσα μελέτη μας. Λόγω της χαμηλής συχνότητας του GG γονότυπου, αυτό προσθέσαμε στα δείγματα με TG γονότυπο για ανάλυση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, τα επίπεδα έκφρασης του

mTOR

mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερη σε άτομα με ΤΤ γονότυπο σε σχέση με εκείνους με TG ή GG γονότυπο (Μέσος όρος ± SEM του ΤΤ έναντι TG /GG: 12,35 ± 1,51 έναντι 6,17 ± 1,32,

P

= 0,004).

TT έναντι TG γονότυπους /GG,

P

= 0.004.

Η

Συζήτηση

η παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι το G αλληλόμορφο του

mTOR

υποστηρικτής rs2295080 πολυμορφισμού συσχετίστηκε με σημαντικά μειωμένο κίνδυνο GC. Βρήκαμε ότι η Τ προς G αλλαγή στο rs2295080 μεταβληθεί ουσιωδώς μεταγραφική δραστηριότητα του

mTOR

γονιδίου μέσω επηρεάζουν τη σύνδεση κάποιου μεταγραφικού παράγοντα. Παρατηρήσαμε επίσης ότι

mTOR

αλληλόμορφο rs2295080 Τ συσχετίστηκε με υψηλότερα

mTOR

επίπεδα έκφρασης του mRNA της

in vivo

.

θηλαστικών στόχος της ραπαμυκίνης (mTOR) , επίσης γνωστή ως FRAP1, είναι ένα απαραίτητο μέλος της PI3K /Akt μονοπατιού /mTOR και κεντρικής σημασίας για μεταβολική σηματοδότηση [20], [21]. Μπορεί να ενεργοποιηθεί με ινσουλίνη, η ινσουλίνη αυξητικούς παράγοντες και άλλους παράγοντες ανάπτυξης, και αδρανοποιείται κατά την κυτταρική πείνα. mTOR υπάρχει δύο διαφορετικά είδη συγκρότημα, που ονομάζεται mTORC1 και mTORC2, αντίστοιχα [22]. Το συγκρότημα mTORC1 φωσφορυλιώνει μεταγενέστερος τελεστή της p70S6K, το οποίο θα μπορούσε να προκαλέσει την υποβάθμιση του υποστρώματος υποδοχέα ινσουλίνης και περαιτέρω αύξηση της Akt δράση της ινσουλίνης-οδηγείται. Το συγκρότημα mTORC2 φωσφορυλιώνει την C-τελικό άκρο της Akt σε Ser473, η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε ολόκληρη την ενεργοποίηση της Akt [9]. Ως θεραπευτικός στόχος σε άλλους καρκίνους [4], [8], [23] – [27], mTOR θα μπορούσε επίσης να προκύψει ως πιθανός στόχος για θεραπεία του καρκίνου του στομάχου, αυθόρμητα. Sirolimus [28] και everolimus [29], οι αναστολείς mTOR, εντοπίστηκαν να οδηγήσει σε G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου και ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών κυτταρικές σειρές. Πρόσφατα, μία νέα δυνητική

mTOR

rs2295080 πολυμορφισμός υποκινητή έχει περιγραφεί σε διάφορες μελέτες [30] – [32]. Ωστόσο, η ανεπαρκής λειτουργικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί ο ρόλος αυτής της γενετικής παραλλαγής στη ρύθμιση του

mTOR

έκφρασης. Σε GC, τα ευρήματά μας παρέχονται τα στοιχεία που rs2295080 Τ αλληλόμορφου θα μπορούσε να ενισχύσει τη δράση μεταγραφή του

mTOR

σε κάποιο βαθμό στην GES-1 κυτταρική γραμμή μετά επιμολυσμένα

in vitro

. Και περαιτέρω λουσιφεράσης δοκιμασία σε τρεις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (δηλαδή, BGC-823, MGC-803 και SGC-7901) επιβεβαίωσε περαιτέρω αυτή την επίδραση του rs2295080 πολυμορφισμό. Αυτά τα αποτελέσματα παρούσα μελέτη μας ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα της νεφρικής κυτταρική σειρά καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και του καρκίνου κυτταρική γραμμή [32]. Σε δοκιμασία EMSA, rs2295080 είχε προβλεφθεί για να εντοπίσετε σχετικά με την ενδεχόμενη θέση δέσμευσης, των οποίων οι πολυμορφικές παραλλαγές θα μπορούσε να επηρεάσει την πρόσληψη των μεταγραφικών παραγόντων (χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα π-match, η οποία χρησιμοποιεί θέσεις σύνδεσης στο TRANSFAC? Www.gene-regulation.com). Ληφθούν αυτά τα αποτελέσματα μαζί, είναι εύλογο ότι

mTOR

rs2295080 πολυμορφισμός θα μπορούσε να επηρεάσει το επίπεδο έκφρασης του

mTOR

και ευαισθησία του κάθε ατόμου σε διάφορες μορφές καρκίνου.

Οι rs2295080 SNP, καθώς και ως ένα άλλο ιντρόνιο SNP rs11121704, για πρώτη φορά αναφέρθηκε από Hildebrandt

et al.

για να εντοπίσετε το

mTOR

δυναμικό περιοχή του υποκινητή [13]. Όπως περιγράφεται στον καρκίνο του οισοφάγου, rs2295080 φάνηκε καμία σχέση ή λειτουργία με την επιβίωση μετά την χημειοραδιοθεραπεία και τη χειρουργική επέμβαση. Αλλά μέχρι τώρα, αρκετές μελέτες έχουν εντοπίσει το αποτέλεσμα αυτού του πολυμορφισμού σε

mTOR

για τον κίνδυνο καρκίνου [30] – [32], τα οποία όλα θεωρούνται rs2295080 Τ αλληλίου ως παράγοντα κινδύνου. Στην παρούσα μελέτη, η συσχέτιση μεταξύ αλληλόμορφο rs2295080 Τ και τον κίνδυνο GC ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα των προηγούμενων τριών μελετών [30] – [32]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας πρότειναν επίσης ότι αυτός ο πολυμορφισμός μπορεί να είναι ένα βιολογικό ουσία στην ανάπτυξη του GC. Λόγω των διαφορετικών πληθυσμών και διαφορετικούς μηχανισμούς μεταξύ εμφάνιση, την ανάπτυξη και την επιβίωση, έχουμε σκεφτεί τις διαφορές εθνικότητας και μηχανιστική διακρίσεις μπορεί να εξηγήσει αυτές τις ασυμφωνίες.

Ένα άλλο μυθιστόρημα αποτέλεσμα προέρχεται από την ένωση μεταξύ των δύο φύλων και

mTOR

rs2295080 πολυμορφισμού στην στρωματοποιημένη ανάλυση. Αυτός ο πολυμορφισμός rs2295080 αποκάλυψε πιο ισχυρή σημασία στους άνδρες από τις γυναίκες. Επιπλέον, Hartgrink

et al

. (2009), έχει αναφερθεί η αναλογία ανδρών γυναικών που έχουν προσβληθεί από καρκίνο του στομάχου είναι περίπου 2:01 ετησίως [33]. Περαιτέρω εξηγήσεις για τις συνδέσεις των αποτελεσμάτων αυτών πρέπει να αναζητηθεί, καθώς και διάφορα είδη των ορμονών έκφραση στα αρσενικά και τα θηλυκά να γίνει η καλύτερη εξέταση, ορθολογικά. Σε μια μελέτη του καρκίνου του μαστού, Galoian

et al.

Έδωσε τα δεδομένα που prolinerich πολυπεπτίδιο-1 ασκεί αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα μέσω αναστολής δραστικότητας κινάσης mTOR σε ΕΚ-αρνητικά MDA-231, αλλά όχι ανασταλτικό αποτέλεσμα υπάρχει σε αυλού Τ47 -D κύτταρο το οποίο επιτελεί ως κυτταρική σειρά ER-θετικών [34]. Ωστόσο, για τις μελέτες των ανδρογόνων, θεωρήθηκε ότι θα μπορούσαν να διεγείρουν ανδρογόνων δραστικότητα του mTOR σε ΡΤΕΝ ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Μια πρόσφατη μελέτη σε υποδοχέα ανδρογόνων βελτίωσε το ρόλο των ανδρογόνων σε up-ρύθμιση δραστηριότητας mTORC2 [35]. Είναι πιθανό ότι ανδρογόνων, αντί των οιστρογόνων, μπορεί να αυξήσει την

mTOR

έκφραση? ανδρογόνων μπορεί να οδηγήσει στην υψηλή συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του στομάχου στους άνδρες και την ισχυρή σημασία του

mTOR

rs2295080 στην ανδρική ομάδα στη μελέτη μας.

Ορισμένοι από τους περιορισμούς της παρούσας μελέτης μας θα πρέπει να επισημανθεί ως εξής . Κατ ‘αρχάς, rs2295080 δεν ήταν η μόνη πολυμορφισμός σημαντικά τις υφιστάμενες στο

mTOR

, και η σημασία του συνδυασμού SNPs παραμελήθηκε στη μελέτη μας. Δεύτερον, ως ζωτικής σημασίας παράγοντες για την γαστρική καρκινογένεση, η έλλειψη του

Helicobacter pylori

πληροφορίες, το κάπνισμα πληροφορίες, και πίνοντας πληροφοριών ήταν επίσης ανεπαρκής στη μελέτη μας, είναι ατυχές για μας για την περαιτέρω διερεύνηση των επιπτώσεων αυτού του πολυμορφισμού. Επιπλέον, λόγω του σχετικά μικρού μεγέθους του δείγματος στη μελέτη μας, υπάρχουν σημαντικά αποτελέσματα φάνηκε να βρεθεί σε ιδιαίτερα στρώματα (υποομάδες ηλικίας, υποομάδα των γυναικών, και άλλες κλινικο-παθολογικές υποομάδες) της στρωματοποιημένης αναλύσεις (Πίνακας S3 και S4). Περαιτέρω μεγαλύτερη μελέτη με περισσότερες πληροφορίες αναμένεται να επαληθεύσει τα ευρήματα μας.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας φωτίζονται τα

mTOR

rs2295080 τον εντοπισμό στην περιοχή του υποκινητή του

mTOR

γονίδιο ήταν σημαντικά που σχετίζονται με τον κίνδυνο του καρκίνου του στομάχου σε ένα κινεζικό πληθυσμό.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1.

Εκκινητές και ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται για γονοτυπική

doi:. 10.1371 /journal.pone.0060080.s001

(DOC)

Πίνακας S2.

Αστάρια για την κατασκευή των πλασμιδίων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0060080.s002

(DOC)

Πίνακα S3.

Αλληλεπίδραση αναλύσεις

mTOR

rs2295080 πολυμορφισμό και την ηλικία ή την κατάσταση του φύλου στη μελέτη ασθενών-μαρτύρων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0060080.s003

(DOC)

Πίνακας S4.

Αλληλεπίδραση αναλύσεις

mTOR

rs2295080 πολυμορφισμό και την ηλικία /φύλο ή την κλινική χαρακτήρες σε περίπτωση που μόνο μελέτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0060080.s004

(DOC)

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Luo Υ (Nanjing Ερυθρός Σταυρός Κέντρο αίματος) για τη βοήθειά της με λειτουργικά πειράματα.