Αφηρημένο

11β-υδροξυστεροειδούς αφυδρογονάσες (11β-HSD) διαμορφώνουν αλατοκορτικοειδών μετενεργοποίηση υποδοχέα από γλυκοκορτικοειδή και ρυθμίζουν την πρόσβαση με τον υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών. Το ισοένζυμο 11β-HSD2 εκφράζεται επιλεκτικά σε μεταλλοκορτικοειδών ιστούς στόχους και δραστικότητα του μειώνεται σε διάφορες καταστάσεις ασθένειας με ανώμαλη κατακράτηση νατρίου και υπέρταση, συμπεριλαμβανομένης της εμφανούς περίσσειας αλατοκορτικοειδών. Καθώς το 50% των ασθενών με ιδιοπαθή υπέρταση είναι ανθεκτικοί στην ινσουλίνη και υπερινσουλιναιμίας, υποθέσαμε ότι η ινσουλίνη ρυθμίζει προς τα κάτω την δραστηριότητα 11β-HSD2. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι η ινσουλίνη μείωσε την δραστηριότητα 11β-HSD2 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου (HCT116, SW620 και ΗΤ-29) στο μεταγραφικό επίπεδο, σε ένα χρόνο και εξαρτάται από τη δόση τρόπο. Η ρύθμιση προς τα κάτω ήταν αναστρέψιμη και απαιτείται νέα πρωτεϊνική σύνθεση. ανάλυση Pathway χρησιμοποιώντας mRNA προφίλ αποκάλυψε ότι η θεραπεία με ινσουλίνη τροποποιημένου την έκφραση του παράγοντα μεταγραφής της οικογένειας C /EBPs (/πρωτεΐνες ενισχυτή δέσμευσης CCAAT), αλλά και των ενζύμων που σχετίζονται με γλυκόλυση. κηλίδα Western και σε πραγματικό χρόνο PCR επιβεβαίωσε την ανοδική ρύθμιση των ισομορφών βήτα C /EBP (LAP και LIP) με μια πιο έντονη αύξηση στην ανασταλτική ισομορφή LIP. EMSA και δοκιμασίες γονιδίου αναφοράς απέδειξε το ρόλο της βήτα ισομορφές Ο /ΕΒΡ στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης HSD11B2. Επιπλέον, η έκκριση του γαλακτικού, υποπροϊόν της γλυκόλυσης, δείχθηκε ότι μεσολαβεί ινσουλινο-εξαρτώμενο HSD11B2 μειορύθμιση. Εν ολίγοις, έχουμε αποδείξει ότι η ινσουλίνη ρυθμίζει προς τα κάτω HSD11B2 μέσω της αυξημένης έκφρασης LIP και επαυξημένη έκκριση γαλακτικού οξέος. Τέτοιοι μηχανισμοί έχουν ενδιαφέρον και δυνητική σημασία για την επαναρρόφηση νατρίου στο κόλον

Παράθεση:. Andrieu Τ, Fustier P, Alikhani-Koupaei R, Ignatova ID, Guettinger Α, Frey FJ, et al. (2014) Η ινσουλίνη, CCAAT /Πρωτεΐνες Enhancer-Binding και γαλακτικό ρυθμίζεται η ανθρώπινη 11β-υδροξυστεροειδούς τύπου Έκφραση 2 Gene στο Colon Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (8): e105354. doi: 10.1371 /journal.pone.0105354

Επιμέλεια: Jaap Α Joles, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου της Ουτρέχτης, Ολλανδία

Ελήφθη: May 24, 2013? Αποδεκτές: 23 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 18 Αύγ του 2014

Copyright: © 2014 Andrieu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ελβετική Εθνική Ίδρυμα για την Επιστημονική Έρευνα Nr. 3100-122135, 3100 – 61.505,00, 3100A0-102153 /1 και 3100A0-138670 (BMF & amp? FJF). Εθνικά Κέντρα Ικανοτήτων στην Έρευνα (NCCR), TransCure (FJF). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας των αλατοκορτικοειδών (MR) είναι απαραίτητη για τη νεφρική χειρισμό του νατρίου σε επιθηλιακούς ιστούς όπως του παχέος εντέρου και των νεφρών και για τον έλεγχο της πίεσης του αίματος στους ανθρώπους. Ο φυσιολογικός συνδετήρας του MR είναι αλδοστερόνης [1]. Ένα άλλο στεροειδές επινεφριδίων, η κορτιζόλη, επιδεικνύει μια παρόμοια δυνητική συγγένεια και μετενεργοποίηση για το MR ως αλδοστερόνης. Οι συγκεντρώσεις στον ορό της κορτιζόλης είναι 100 έως 1000 φορές υψηλότερη από την αλδοστερόνη. Ο μηχανισμός που επιτρέπει αλδοστερόνης να είναι η προτιμώμενη συνδέτης για τον MR

in vivo

, παρά τις υψηλότερες συγκεντρώσεις κορτιζόλης είναι ένα ένζυμο το οποίο απενεργοποιεί κορτιζόλη, ειδικά σε κύτταρα που εκφράζουν MR [2]. Αυτό το ένζυμο, 11β-υδροξυστεροειδούς αφυδρογονάσης τύπου 2 (11β-HSD2) κωδικοποιείται από το γονίδιο HSD11B2 και μετατρέπει βιολογικά ενεργό κορτιζόλη σε κορτιζόνη, ένα στεροειδές με αμελητέα συγγένεια και δυναμικό ενεργοποίησης για την MR [3]. Έτσι, μια μειωμένη δραστηριότητα της 11β-HSD2 προκαλεί ενεργοποίηση MR κορτιζόλης μεσολάβηση, οδηγώντας σε νεφρική κατακράτηση νατρίου, την καταστολή της ρενίνης και ενός άλατος ευαίσθητη αύξηση της αρτηριακής πίεσης [4], [5].

Πολλοί ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 έχουν χαμηλή δραστικότητα ρενίνης στο πλάσμα και είναι το αλάτι ευαίσθητα [6] – [8]. Επιπλέον, παρατηρήσαμε πρόσφατα μια ένωση του αλατιού-ευαισθησίας και μειωμένη δραστηριότητα της 11β-Ηδϋ2 στους απογόνους του τύπου 2 διαβητικούς ασθενείς [9]. Ετσι, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι η ινσουλίνη ρυθμίζει προς τα κάτω HSD11B2, και με τον μηχανισμό αυτό, προκαλεί κορτιζόλης μεσολάβηση νεφρική ή του κόλου κατακράτηση νατρίου με επακόλουθη καταστολή της ρενίνης.

Έχει δειχθεί ότι η ινσουλίνη και υπερινσουλιναιμία ρυθμίζουν την οικογένεια του μεταγραφικοί παράγοντες πρωτεΐνες δέσμευσης /ενισχυτή CCAAT (C /EBPs) [10], [11] και ότι τα μέλη αυτής της οικογένειας έλεγχο η μεταγραφή του HSD11B1 [12] – [14]. Η ανάλυση του υποκινητή του γονιδίου HSD11B2 από τη βάση δεδομένων του παράγοντα μεταγραφής (TRANSFAC) πρόγραμμα αποκάλυψε διάφορες υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για C /EBPs στις θέσεις -4362 bp, -1985 bp, -177 bp και -198 bp από την θέση εκκίνησης της μεταγραφής του ανθρώπινου γονιδίου HSD11B2. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η ινσουλίνη ρυθμίζει προς τα κάτω HSD11B2 μέσω C /EBPs.

Υλικό και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και Αναλώσιμα

υλικό της κυτταρικής καλλιέργειας ήταν από την Becton Dickinson Labware (Basel, Ελβετία) και Corning (Bodenheim, Γερμανία). Του Dulbecco Τροποποιημένο Μέσο Eagle (DMEM) και Mc Coy που αγοράστηκαν από την Sigma Chemicals (Buchs, Ελβετία). Ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) ήταν από Biochrom AG (Βερολίνο, Γερμανία). Η ινσουλίνη, κυκλοεξιμίδιο (CHX), PD098059, διχλωροοξικό νάτριο (DCA), νάτριο L-γαλακτικού οξέος και 5,6-διχλωροβενζιμιδαζόλιο 1β-D-ριβοφουρανοσίδη (DRB) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Fluka AG, Buchs, Switzerland). Οι ακόλουθες κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA): ανθρώπινου κόλον κυτταρική γραμμή καρκινώματος ΗΤ-29 (αριθμός πρόσβασης: ΗΤΒ-38), SW-620 (CLL-227), HCT116 (CCL-247) και JEG-3 (ΗΤΒ-36). Akt Inhibitor VIII ήταν από την Calbiochem (Merck, Zug, Ελβετία). 5′-τριφωσφορική αδενοσίνη [γ-

32Ρ] ([γ

32Ρ] ΑΤΡ) ήταν από την Perkin Elmer (Maanstraat, Ολλανδία).

Κυτταροκαλλιεργειών

HCT116, SW-620 και ΗΤ-29 αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mmol /L γλουταμικό, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο 5% CO2-95% αέρα. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας και αναπτύχθηκαν σε DMEM 10% FBS μέχρι συρροής. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 0,3% FBS κατά τη διάρκεια της θεραπείας με ινσουλίνη και DCA. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή 48 ώρες με DCA και 24 ώρες με ινσουλίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 10% FBS κατά την διάρκεια της θεραπείας γαλακτικό μετά το συγχρονισμό 24 ώρες σε ϋΜΕΜ 0,3% FBS.

παρασκεύασμα RNA και το επίπεδο έκφρασης

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen AG, Basel , Ελβετία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ολικό RNA (1 μg) χρησιμοποιήθηκε για την σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA με τη χρήση του IMPROM-ΙΙ αντίστροφης μεταγραφάσης (RT) σε ρυθμιστικό RT (Promega Catalys AG, Wallisellen, Ελβετία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η έκφραση του ειδικού mRNA προσδιορίστηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR) σε ένα ΑΒΙ PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Multiplex PCR διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Foster City, CA). Δοκιμασίες-on-Demand (Gene Expression Δοκιμασία Mix) ήταν ευκαρυωτικών 18S rRNA ενδογενούς ελέγχου (4310893E), HSD11B2 (Hs00388669_m1), CCAAT /πρωτεΐνη δέσμευσης ενισχυτή (C /EBP) άλφα (Hs00269972_s1), Ο /ΕΒΡ βήτα (Hs00270923_s1) και C /ΕΒΡ δέλτα (Hs00270931_s1). Σχετική έκφραση γονιδίου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συγκριτικής CT (κύκλος κατωφλίου), το οποίο αποτελείται από την ομαλοποίηση του αριθμού των αντιγράφων του γονιδίου-στόχου σε ένα ενδογενές γονίδιο αναφοράς (18S rRNA), που ορίζονται ως βαθμονομητή. Το επίπεδο της HSD11B2, Ο /ΕΒΡ άλφα, Ο /ΕΒΡ-β και Ο /ΕΒΡ έκφραση mRNA δέλτα εκάστου των κατεργασμένων κυττάρων κανονικοποιήθηκε προς το αποτέλεσμα που λαμβάνεται από μη επεξεργασμένα κύτταρα. Η ποσότητα του στόχου ρυθμίζεται σύμφωνα με την 18S rRNA ενδογενούς αναφορά δίνεται από τον τύπο: 2

-ΔΔCT. Για να επιβεβαιώσετε την επαναληψιμότητα του προσδιορισμού του mRNA, πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον 3 ανεξάρτητες ολικού RNA εκχυλίσεις. Κάθε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης-αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR) αναλύθηκε εις τριπλούν και εκφράζονται ως μέση τιμή +/- SD.

Μέτρηση της δραστικότητας 11β-HSD2

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 6- φρεατίων σε πυκνότητα 0,5 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά τη θεραπεία, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για 45 λεπτά σε 1 ml μέσο που περιέχει 2 μCi [1,2,6,7-

3Η] Η κορτιζόλη (60-80Ci /mmol, Amersham, Buckinghamshire, UK) σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά την επώαση η αντίδραση σταμάτησε και τα στεροειδή εκχυλίζονται με την προσθήκη τριών όγκων οξικού αιθυλεστέρα. Μετά από φυγοκέντρηση, η οργανική φάση απομακρύνθηκε και εξατμίστηκε σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπόλειμμα ανασυστάθηκε σε 30 μΐ διαλύματος διακοπής (2 mM κορτιζόλης και 2 mM κορτιζόνη σε μεθανόλη). Δέκα μικρολίτρα εφαρμόστηκαν σε πλάκες διοξειδίου του πυριτίου επικαλυμμένα TLC (G-25, UV254, Macherey-Nagel, Oensingen, Switzerland) και να επιλυθεί χρησιμοποιώντας χλωροφόρμιο: αιθανόλη (9:01). Τα στεροειδή κατέστησαν ορατά υπό υπεριώδες φως και αποξέστηκαν σε υγρό σπινθηρισμού. Η ραδιενέργεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν Packard 2000CA Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzer (Packard Instrument Co, Downers Grove, IL). Τα πειράματα διεξήχθησαν υπό μη υπόστρωμα περιοριστικούς όρους, όπου ο μεταβολισμός ήταν πάντα μικρότερη από 40%. Ειδική δραστικότητα εκφράστηκε ως picomoles (pmoles) ανά μικρογραμμάρια πρωτεΐνης ανά ώρα. Τα πειραματικά αποτελέσματα υπολογίσθηκαν εκφράζοντας τις τιμές μετατροπής της κορτιζόλης σε κορτιζόνη σε παρουσία ινσουλίνης, ως ποσοστό του ότι στην αντίστοιχη ελέγχου απουσία της ινσουλίνης [15].

ανάλυση κηλίδος Western

εκχύλιση πρωτεϊνών και κηλίδος Western πραγματοποιήθηκαν όπως αναφέρθηκε νωρίτερα [16]. Εν συντομία, πυρηνικά εκχυλίσματα απομονώθηκαν με το πρωτόκολλο CelLytic πυρηνικής εκχύλισης (Sigma Chemicals, Buchs, Ελβετία). Για ανάλυση στυπώματος Western, ολική πρωτεΐνη (100 μg) και πυρηνικά εκχυλίσματα (60 μg) φορτώθηκαν σε αποδιατακτικό πήκτωμα 10% πολυακρυλαμιδίου. Η μεμβράνη αποκλείστηκε διάρκεια της νύχτας και επωάζονται με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού για την 11β-Ηδϋ2 (H-145,1:500), Ο /ΕΒΡ άλφα (sc-61X, 1:5000), Ο /ΕΒΡ βήτα (sc-150X, 1: 5000), β-ακτίνη (SC-1616R, 1:500) ή HDAC1 (SC-7872, 1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Τα πλυμένα μεμβράνες νιτροκυτταρίνης επωάστηκαν με ένα συζυγές υπεροξειδάσης κοχλιαρίας IgG αίγας αντι-κουνελιού (SC-2004, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) και αναπτύχθηκε με τη χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) αντιδραστήριο (Amersham, Buckinghamshire, UK). Πυκνομετρία εκτεθειμένα φιλμ διεξήχθη και το επίπεδο της πρωτεΐνης που εκφράζεται ως αυθαίρετες μονάδες.

Για την ανίχνευση του IGF1 και ινσουλίνη υποδοχείς κύτταρα είτε μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με 100 ηΜ ινσουλίνης για 24 ώρες και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 2 μg /ml απροτινίνη, 1 μg /ml λευπεπτίνη, 1 mM φαινυλομεθανοσουλφονυλο φθορίδιο. Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν είτε με IGFR ή αντισώματα Υποδοχέα Ινσουλίνης (3027, 3025, Cell Signaling) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Το πρωί, τα δείγματα επωάστηκαν με Πρωτεΐνη Α /G Plus Agarose (Santa Cruz Biotechnology) για 1 ώρα στους 40 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν, ζέση σε ρυθμιστικό φόρτωσης SDS και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE.

De ηονο σύνθεση πρωτεΐνης

ΗΤ-29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και προκατεργάστηκαν με τον αναστολέα σύνθεσης πρωτεΐνης (ή επιμήκυνση μεταφραστική), CHX (10 μΜ) για 1 ώρα πριν από την προσθήκη ινσουλίνης (10

-7 Μ). Στο τέλος της θεραπείας 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την απομόνωση του RNA και ανάλυση qRT-PCR.

HSD11B2 mRNA σταθερότητα

ΗΤ-29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ινσουλίνη ( 10

-7 Μ) για 12 ώρες. Μεταγραφή διεκόπη με DRB (25 μΜ) και τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε διακριτά φορές (0-12 h) για την απομόνωση του RNA και ανάλυση qRT-PCR.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) πειράματα

ΗΤ-29 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Το μείγμα επιμόλυνσης απομακρύνεται μετά από 24 ώρες επώασης. Τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης για άλλες 24 ώρες πριν από την εκχύλιση mRNA. Τα siRNA δίπολα για Ο /ΕΒΡ άλφα ή Ο /ΕΒΡ βήτα (Qiagen AG, Basel, Switzerland) και ένας αρνητικός έλεγχος siRNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για την επιμόλυνση σε μια τελική συγκέντρωση 50 ηΜ.

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA) και η παρασκευή πυρηνικού εκχυλίσματος

Περίπου πέντε εκατομμύρια από προσκολλημένα κύτταρα αποκολλήθηκαν με 3 ml PBS επί πάγου και κατακρημνίσθηκαν επί 5 λεπτά σε 900 g. Τα ιζήματα φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση πρωτεϊνών. προετοιμασία Πυρηνική εκχύλισμα και EMSA διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [18]. Η απόδοση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford. EMSA ανιχνευτές δημιουργήθηκαν με αναδιάταξη συμπληρωματικών μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια και σημάνθηκαν με [gamma

32Ρ] ΑΤΡ και Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση. Ειδική δέσμευση ανταγωνίστηκε με μη επισημασμένη ολιγονουκλεοτίδια που ακολουθίας αναγνωρίζεται από τους παράγοντες C /ΕΒΡ σε 100Χ-μοριακή περίσσεια (5′-tgcagattgcgcaatctgca-3 ‘? Οι νουκλεοτιδικές μοτίβα ενδιαφέροντος είναι παχύτερο). Οι αντιδράσεις δέσμευσης εκτελέστηκαν σε 10 μΐ ρυθμιστικού [20 mM HEPES, ρΗ 7.5? 35 mM NaCl? 60 mM ΚΟΙ? 0,01% ΝΡ 40? 2 mM DTT? 0,1 mg /ml BSA? 4% ficoll] που περιέχει 1.75 pmol του σημασμένο ανιχνευτή, 4 μg πυρηνικών πρωτεϊνών και 1 μg πολυ (dI-dC). Μείγματα επωάστηκαν στους 4 ° C για 20 λεπτά σε παρουσία ή απουσία μη επισημασμένου ανταγωνιστή. συμπλέγματα ϋΝΑ-πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 5% σε 0.5 ρυθμιστικό × Τρις-βορικού-ΕϋΤΑ για 90 λεπτά στους 140 V. Τα πήγματα ξηραίνονται 2 ώρες στους 80 ° C και αναλύθηκε σε PhosphoImager Cyclone (Packard).

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση

δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Upstate Biotechnology Inc, όπως έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [18]. Καθαρισμένα DNA θραύσματα ενισχύθηκαν με εκκινητές PCR για την ανίχνευση ενός θραύσματος 210 bp που περιέχει το -177C /ΕΒΡ, τοποθεσίες -198C /ΕΒΡ εντός του υποκινητή HSD11B2 (προς τα εμπρός: 5′-GCAACTTTGGGACTTTGTTCCGGC-3 ‘? Αντίστροφος: 5′-AGAGGGACACTCGCTTTCTCTGCT-3’ ).

qRT-PCR ανάλυση χρησιμοποιώντας ανθρώπινου διαβήτη RT

2 Profiler PCR Πίνακες

Το RT

2 Profiler PCR Συστοιχίες ΠΑΥ-30C (SA Βιοεπιστημών, MD, USA) ήταν σχεδιαστεί για να αναλύσει 84 γονίδια που σχετίζονται με την ανθρώπινη μονοπάτι σηματοδότησης ινσουλίνης. Η RT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν για 24 ώρες με ινσουλίνη (10

-7 Μ). Ολικό RNA (1 μg) χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για να συνθέσει cDNA με το RT

2 κιτ First Strand (SABiosciences). Η προϋπόθεση κύκλος PCR ήταν ως ακολούθως: 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s, 60 ° C για 60 s. Στο τέλος των σταδίων ποδηλασίας PCR, τα δεδομένα για κάθε δείγμα που εμφανίζεται ως καμπύλη τήξης. Το λογισμικό ΑΒΙ SDS (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί ένα κρίσιμο όριο (CT), η οποία ήταν ο αριθμός του κύκλου όπου η γραμμική φάση για κάθε δείγμα πέρασε το κατώφλι. Βήτα-2-μικροσφαιρίνη χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο καθαριότητας. Η έκφραση των HSD11B2 για τις 3 όσον αφορά τα πειράματα παρακολουθήθηκε παράλληλα με PCR σε πραγματικό χρόνο που επιβεβαιώνει σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω από την ινσουλίνη. Εγγραφές καθαιρέθηκαν στη βάση δεδομένων GEO με αριθμό ένταξης GSE51677.

Η παροδική επιμόλυνση και γονίδιο αναφοράς δοκιμασία

Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με αντιδραστήριο επιμόλυνσης FuGENE HD (Roche, Rotkreuz, Ελβετία) χρησιμοποιώντας 3 ml διάλυμα για 1 mg πλασμιδίου. Ο φορέας ρΟΜν-HRL (

Renilla reniformis

λουσιφεράσης) (Promega Catalys AG, Wallisellen, Ελβετία) χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση των αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Το κατασκεύασμα p4.5 kb-HSD11B2 ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον de. Κ Yang [19]. Το πλασμίδιο κατασκεύασμα p0.2 kb-HSD11B2 περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Για την έκφραση των παραγόντων μεταγραφής, διάφορες ποσότητες των φορέων pCMV-LIP και pCMV-LAP, ένα γενναιόδωρο δώρο από τον U. Schibler [20], προστέθηκαν στο μίγμα του DNA. Μετά από 6 ώρες το μέσο διαμόλυνσης αντικαταστάθηκε με κανονικό μέσο ανάπτυξης για 18 ώρες. Στη συνέχεια τα κύτταρα λύθηκαν και οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης ανιχνεύθηκαν με το Dual-σύστημα αναφοράς της λουσιφεράσης Δοκιμασία (Promega Catalys AG, Wallisellen, Ελβετία) και MediatorsPhL φωτόμετρο (Μεσολαβητές Diagnostic Systems, Βιέννη, Αυστρία). δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly εκφράστηκε σε σχέση με λουσιφεράση της Renilla να ληφθούν υπόψη οι διαφορές σε αποδοτικότητα διαμόλυνσης. Όταν ένας φορέας ελέγχου CMV-LacZ επιμολύνθηκε, Dual-Light σύστημα (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας της λουσιφεράσης. Οι επιμολύνσεις επιβεβαιώνεται από πολλαπλές ανεξάρτητα πειράματα.

τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση

μεταλλάξεις υποστηρικτής HSD11B2 παρήχθησαν στην p4.5 kb-HSD11B2 και p0.2 kb-HSD11B2 κατασκευάσματα χρησιμοποιώντας QuikChange II XL ιστοσελίδα -κατευθυνόμενης κιτ μεταλλαξογένεσης (Stratagene, Βασιλεία, Ελβετία). Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: 5′-GTGGAACTTGAGAGCTCGAGCAGTTCCCTTCACCTCTGG-3 ‘και 5′-CCAGAGGTGAAGGGAACTGCTCGAGCTCTCAAGTTCCAC-3′ για -4362 Ο /ΕΒΡ και 5’-CTCGAGCGCAGCCGCTCCAGGACTTTGTTCCGGCTTTTTC-3 ‘και 5′-GAAAAAGCCGGAACAAAGTCCTGGAGCGGCTGCGCTCGAG- 3’ για -198 C /EBP. Υπογραμμισμένο και με έντονα γράμματα γράμματα αντιπροσωπεύουν μεταλλαγμένες βάσεις.

Βιοπληροφορική και στατιστικά

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή +/- SD των δειγμάτων εις τριπλούν ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος επαναλαμβάνεται τουλάχιστον τρεις φορές. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση

t

test του Student ή αναλύσεις ANOVA και ακολουθήθηκε από μια δοκιμασία αντίθεση με Tukey προστασία σφάλμα. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε

σ

& lt? 0,05, *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

p

& lt? 0.001. μεταγραφικού παράγοντα θέσεις πρόσδεσης αναλύθηκαν με το πρόγραμμα Match.

Αποτελέσματα

Η συνεχής θεραπεία με ινσουλίνη μειώνει την 11β-Ηδϋ2 δραστηριότητα και την έκφραση του γονιδίου HSD11B2 σε κυτταρικές σειρές παχέος καρκίνο

Κανονισμός του ενζύμου δραστικότητα από την ινσουλίνη εξετάστηκε σε HSD11B2 εκφράζουν [16] – [18], [21] ανθρώπινο κολονικό κυτταρικές γραμμές (HCT116, SW620 και ΗΤ-29) (Εικ 1Α.). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με ινσουλίνη (10

-11 M-10

-7 Μ) σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει 0.3% FBS. Η ινσουλίνη προκάλεσε μία μείωση δόσης-απόκρισης σε δραστηριότητα 11β-HSD2 σε όλες τις δοκιμασμένες του παχέος κυτταρικές σειρές με μία σημαντική μείωση κατά 10

-9 Μ σε HCT116 κυτταρική γραμμή (

ρ

& lt? 0,05). Αυτό το αποτέλεσμα δεν περιορίζεται σε κυτταρικές σειρές του κόλου αφού παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με HSD11B2 εκφράζουν [19] JEG-3 κύτταρα (Σχ. S1). Λόγω της ισχυρή απόκριση (μείωση ≈30%), χαρακτηρίσαμε περαιτέρω των μοριακών μηχανισμών σε κύτταρα ΗΤ-29.

(

A

) δραστηριότητα 11β-HSD2 μετρήθηκε με

3Η κορτιζόλης /κορτιζόνης δοκιμασία μετατροπής του παχέος κυτταρικές σειρές 24 ώρες μετά την επώαση με ινσουλίνη (10

-11 – 10

-7 Μ). Η δραστικότητα που μετρήθηκε για HCT116 σε απουσία ινσουλίνης καθορίστηκε ως 100%. (

Β

) επίδραση δόσης-απόκρισης της ινσουλίνης (10

-9 – 10

-5 Μ) για HSD11B2 mRNA (γκρι γραμμές) και δραστηριότητα (καμπύλη) σε ΗΤ-29 κύτταρα υποβάλλονται σε θεραπεία για 24 h. (

C

) Χρόνος-εξαρτώμενη επίδραση της ινσουλίνης (10

-7 Μ) επί HSD11B2 mRNA (γκρίζες ράβδοι) και δραστηριότητα (καμπύλη) σε κύτταρα ΗΤ-29. (

D

) Χρόνος-εξαρτώμενη επίδραση της ινσουλίνης (10

-7 Μ) σε επίπεδο πρωτεΐνης 11β-Ηδϋ2.

Η

Παρατεταμένη θεραπεία με ινσουλίνη μειώνει γονίδιο HSD11B2 έκφρασης, τη δραστηριότητα και πρωτεΐνης σε κύτταρα ΗΤ-29 σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο

επόμενο επιβεβαιωθεί αν ινσουλίνη μειωμένη δραστικότητα 11β-HSD2 συμπίπτει με το γονίδιο και την έκφραση της πρωτεΐνης (Εικ. 1Α) του. Αυξανόμενες συγκεντρώσεις της ινσουλίνης που κυμαίνονται από 10

-9 να 10

-5 Μ προκάλεσε μία εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση στα επίπεδα mRNA HSD11B2 24 ώρες μετά τη θεραπεία (Εικ. 1Β). Ένα μέγιστο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε συγκέντρωση 10

-7 Μ, όπου HSD11B2 mRNA μειώθηκε κατά 50% (

ρ

& lt? 0,05) (Σχήμα 1Β).? και η δραστηριότητα κατά 35% (

σ

& lt? 0,05) (Σχήμα 1Β.). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η εξαρτώμενη από το χρόνο ρυθμιστική δράση της ινσουλίνης επί της έκφρασης γονιδίου HSD11B2, δραστηριότητα, και το επίπεδο της πρωτεΐνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, μία εξαρτώμενη από το χρόνο μείωση της δραστικότητας 11β-HSD2 παρατηρήθηκε με σημαντική μείωση 12 ώρες μετά τη θεραπεία (

ρ

& lt? 0,05). Είναι ενδιαφέρον ότι το mRNA HSD11B2 αυξήθηκε στις πρώτες 10 ώρες και στη συνέχεια μειώθηκε. Μετά από 16 ώρες το mRNA που επιτεύχθηκε ελάχιστα επίπεδα και παρέμειναν χαμηλά μέχρι 48 ώρες (

σ

& lt? 0,05) (Εικ. 1Γ). Σε συμφωνία, HSD11B2 πρωτεΐνη μειώθηκε κατά 18 ώρες και 24 ώρες της θεραπείας με ινσουλίνη (Εικ. 1ϋ).

Η ρύθμιση προς τα κάτω της HSD11B2 ήταν αναστρέψιμη με την αφαίρεση της ινσουλίνης από το μέσο 24 ώρες μετά την επώαση. Πράγματι, 48 ώρες μετά την απομάκρυνση, τα επίπεδα mRNA HSD11B2 στον έλεγχο και την ινσουλίνη αντιμετωπίζονται συνθήκες ήταν παρόμοιες (Εικ. 2Α). Στη συνέχεια, ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν 24 ώρες με ινσουλίνη σε απουσία και παρουσία του αναστολέα πρωτεϊνικής σύνθεσης, κυκλοεξιμίδιο (CHX). Η επίδραση της ινσουλίνης στη μείωση HSD11B2 mRNA καταργήθηκε με την παρουσία CHX, υποδεικνύοντας ότι

de novo πρωτεϊνική σύνθεση

απαιτήθηκε (Εικ. 2Β). Για να καθοριστεί εάν η ινσουλίνη μειώνει τον HSD11B2 mRNA σταθερότητα, αξιολογήσαμε την ημιζωή του mRNA HSD11B2 με μία πρότυπη δοκιμασία διάσπασης mRNA χρησιμοποιώντας 25 μΜ DRB, ένας αναστολέας της σύνθεσης mRNA. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, η ινσουλίνη δεν μετέβαλλε την ημιζωή του HSD11B2 mRNA.

(

A

) δραστηριότητα 11β-HSD2 μετρήθηκε σε ΗΤ-29 κύτταρα σε παρουσία (μαύρες ράβδοι) και απουσία (λευκές ράβδοι) 10

-7 Μ ινσουλίνη για 24 ώρες. Η επίδραση της ινσουλίνης ήταν αναστρέψιμες σε έκπλυση με PBS 24 ώρες ή 48 ώρες παρακολούθησης (διακεκομμένες μπάρες). (

B

) έκφραση HSD11B2 εκτιμήθηκε με qRT-PCR σε ΗΤ-29 σε προεπεξεργασία με το CHX αναστολέα πρωτεϊνικής σύνθεσης (10 μΜ) για 1 ώρα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ινσουλίνη (10

-7 Μ) για 24 h. Κάθε σημείο δεδομένων εκφράζεται ως ποσοστό της τιμής ελέγχου. (

C

) ΗΤ-29 κύτταρα προκατεργάστηκαν με (μαύροι κύκλοι) ή χωρίς (γεμάτα ρόμβος) ινσουλίνη (10

-7 Μ) για 12 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μΜ του αναστολέα της σύνθεσης του mRNA DRB, χωρίς ή με ινσουλίνη (10

-7 Μ) (που ορίζεται ως χρόνος μηδέν). Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία στη συνέχεια, το συνολικό RNA απομονώθηκε, και το επίπεδο σταθερής κατάστασης του mRNA HSD11B2 αξιολογηθεί. Κάθε σημείο δεδομένων εκφράζεται ως ποσοστό της μέγιστης προσδιορίστηκε σε χρόνο μηδέν.

Η

Insulin μονοπάτι ανάλυση

Προκειμένου να γίνει κατανοητή η μοριακή μηχανισμός με τον οποίο η ινσουλίνη ρυθμίζει προς τα κάτω HSD11B2 στοχεύσαμε για τον χαρακτηρισμό της οδού ινσουλίνης σε ΗΤ-29. πειραμάτων Western Blot που απέδειξαν την έκφραση και την ενεργοποίηση του IGF-1 (IGFI-R) και τους υποδοχείς ινσουλίνης (IR) σε ένα χρόνο και εξαρτάται από τη δόση τρόπο (Σχ. 3 Α, Β). Και οι δύο υποδοχείς φωσφορυλιώνονται εντός των πρώτων 10 λεπτών μετά τη θεραπεία με ινσουλίνη, ενώ IR ήταν περισσότερο ευαίσθητη από IGFI-R σε χαμηλές δόσεις ινσουλίνης (Σχ. 3 Α, Β). Ο ρόλος των κατάντη κινασών σε ινσουλινο-εξαρτώμενο HSD11B2 καταστολή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας αναστολείς PD098059 και ΑΚΤ VIII. Η Εικόνα 3C δείχνει ότι και οι δύο οδοί, ο ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και η οδός ΡΙ3Κ, μεσολαβεί την επίδραση της ινσουλίνης.

(

A

) Έκφραση και φωσφορυλίωση του υποδοχέα ινσουλίνης από την ινσουλίνη σε έναν χρόνο (0 έως 60 min) και η δόση (0 έως 1000 ηΜ) εξαρτώμενο τρόπο. (

B

) Έκφραση και φωσφορυλίωση του IGF-1 υποδοχέα από την ινσουλίνη σε έναν χρόνο και εξαρτάται από τη δόση τρόπο. (

C

) HSD11B2 έκφραση του mRNA που παρακολουθούνται από qRT-PCR παρουσία της ινσουλίνης, αναστολέας της ΑΚΤ (AKTVIII, 0.1 μΜ και 10 μΜ) ή αναστολέα ΜΕΚ (PD098059, 1 μΜ).

Η

Συνολική mRNA του ΗΤ-29 κύτταρα επεξεργασμένα με ινσουλίνη εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε RT

2 profiling να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση των συστατικών οδού ινσουλίνης. Η ανθρώπινη ινσουλίνη μονοπάτι σηματοδότησης RT

2 Profiler PCR Array προφίλ της έκφρασης των 84 γονιδίων που σχετίζονται με την ινσουλίνη γονιδίων που αποκρίνονται. Είκοσι δύο γονίδια διαφορικά ρυθμίζονται σε ΗΤ-29 κυττάρων μετά την αγωγή με ινσουλίνη αναφέρονται στον Πίνακα S1 και οι οδοί που εμπλέκονται απεικονίζεται στο σχήμα της Εικόνας 4. RT

2 Profiler αποκάλυψε ένα χαρακτηριστικό πρότυπο αναισθησία στην ινσουλίνη, με μειωμένη έκφραση της ινσουλίνης συστατικά μονοπάτι: IR, IGFI-R, υπόστρωμα υποδοχέα ινσουλίνης (IRS2) και ινσουλίνη ρυθμίζονται μεταφορέα γλυκόζης (GLUT-4). Παρατεταμένη θεραπεία με ινσουλίνη προώθησε επίσης τη γλυκόλυση σε ΗΤ-29 κύτταρα. Ενώ ινσουλίνη ρυθμισμένη έκφραση μεταφορέα γλυκόζης GLUT-4 ρυθμίζεται προς τα κάτω, GLUT-1 που κωδικοποιεί αγγελιοφόρος αυξήθηκε, διευκολύνοντας την εισαγωγή της γλυκόζης στα κύτταρα, ανεξάρτητα του αυξητικού παράγοντα διέγερσης. Εξοκινάσης 2, το ένζυμο που φωσφορυλιώνει τη γλυκόζη σε γλυκόζη-6-Ρ, ένα περιοριστικό ρυθμό βήμα της γλυκόλυσης, ήταν ρυθμισμένη, μαζί με πυροσταφυλική κινάση 2 (PKM2), η οποία μετατρέπει PEP σε πυροσταφυλικό. Σε αντίθεση, το ένζυμο το οποίο αποφωσφορυλιωμένο φρουκτόζη 1, 6 διφωσφορικής φρουκτόζης σε 6-φωσφορική και συνέβαλε στην ανταγωνιστική γλυκόλυση ήταν ρυθμίζεται προς τα κάτω.

mRNAs ποσοτικοποιήθηκαν 24 ώρες μετά ινσουλίνη (10

-7 Μ) θεραπεία με τη χρήση RT

2 Profiler PCR Συστοιχίες ΠΑΥ-30C. Μέχρι ρυθμιζόμενες μεταγραφές φαίνεται στο κόκκινο και είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω μεταγραφές φαίνεται στο πράσινο.

Η

Επίδραση της ινσουλίνης επί C /EBP άλφα, Ο /ΕΒΡ-β, και τα επίπεδα Ο /ΕΒΡ δέλτα mRNA

παρουσιάζουμε αποδείξεις στο Σχήμα 5Β, την προηγούμενη θεραπεία του ΗΤ-29 κυττάρων με διάφορες συγκεντρώσεις της ινσουλίνης (10

-9-10

-5 Μ) για 24 ώρες προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αύξηση στη C /ΕΒΡ έκφραση του mRNA βήτα. Αντίθετα, η ινσουλίνη κατέστειλε την έκφραση του mRNA έκφραση άλφα Ο /ΕΒΡ με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε συγκέντρωση 10

-7 Μ, η ινσουλίνη μείωσε το mRNA άλφα C /ΕΒΡ κατά 51% (

σ

& lt? 0.01), ενώ η C /ΕΒΡ έκφραση mRNA δέλτα ήταν αμετάβλητη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ινσουλίνη εξαρτώμενη μείωση του HSD11B2 mRNA, συσχετίζεται με την μορφή έκφρασης του 2 στους 3 διερευνήθηκαν μελών της οικογένειας Ο /ΕΒΡ παραγόντων μεταγραφής σε κύτταρα ΗΤ-29.

(

A

) εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επιδράσεις της ινσουλίνης επί 11β-HSD2, Ο /ΕΒΡ άλφα, βήτα και των επιπέδων της πρωτεΐνης Ο /ΕΒΡ. ΗΤ-29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες χωρίς και με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της ινσουλίνης (10

-9-10

-5 Μ), στη συνέχεια συλλέγονται για κηλίδωση Western για να αξιολογηθεί η έκφραση του 11β-HSD2, Ο /ΕΒΡ άλφα , Ο /ΕΒΡ beta. (

B

) εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επιδράσεις της ινσουλίνης επί C /EBP άλφα, Ο /ΕΒΡ-β, και /ΕΒΡ έκφραση mRNA δέλτα C. ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν όπως στο (Α). Το επίπεδο του Ο /ΕΒΡ άλφα (ανοιχτοί κύκλοι), Ο /ΕΒΡ βήτα (ανοικτά τετράγωνα), και C /EBP δέλτα (γεμάτα τρίγωνα) mRNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR με S18 ως εσωτερικός έλεγχος. Τα επίπεδα έκφρασης σε κατεργασμένα κύτταρα κανονικοποιήθηκαν σε χωρίς θεραπεία ελέγχους (100%). Αντιπροσωπευτικά δεδομένα για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η σχετική ένταση προσδιορίστηκε με πυκνομετρική σάρωση. Η αναλογία σχετικές πυκνότητες του 11β-HSD2 σε βήτα-ακτίνης σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν κατά την απουσία ορμόνης θεωρήθηκε ως 100% (έλεγχος). Η αναλογία σχετικές πυκνότητες των πρωτεϊνών πυρηνικού εκχυλίσματος να HDAC σε κύτταρα καλλιεργημένα χωρίς ορμόνη θεωρήθηκε ως 100% (έλεγχος). * LIP ήταν ανιχνεύσιμο στα δείγματα ελέγχου, οπότε η αναλογία LAP /LIP δεν υπολογίστηκε. (

C, D

) κατασιγάσει του C /ΕΒΡ άλφα (

C

) και C /EBP βήτα (

D)

πραγματοποιήθηκε με τη χρήση siRNA. Η έκφραση του C /ΕΒΡ άλφα, C /EBP βήτα (αριστερό πάνελ) και HSD11B2 (δεξιά πλευρά) mRNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR.

Η

ινσουλίνη ρύθμιση του C /ΕΒΡ άλφα και C /ΕΒΡ βήτα πρωτεΐνες

Για να διερευνηθεί αν ο /ΕΒΡ άλφα ή ο /ΕΒΡ βήτα παίζουν ένα ρόλο στην ινσουλίνη εξαρτώμενη καταστολή της έκφρασης του γονιδίου HSD11B2, η έκφραση του ο /ΕΒΡ άλφα και ο /ΕΒΡ βήτα σε HT- 29 κύτταρα αναλύθηκαν με κηλίδες Western (εικ. 5Α). mRNA Ο /ΕΒΡ άλφα μπορεί να οδηγήσει σε δύο πολυπεπτίδια με μέγεθος 42 kDa και 30 kDa [22], [23] ενώ Ο /ΕΒΡ βήτα θα μπορούσε να εξελιχθεί σε ένα ενεργοποίησης ή μία ανασταλτική ισομορφή (LAP, 38 kD ή LIP, 21 kDa , αντίστοιχα) [20], [24]. Θεραπεία της ΗΤ-29 κυττάρων με ινσουλίνη για 24 ώρες αύξησε τις πυρηνικές επίπεδα Ο /ΕΒΡ άλφα (ισομορφή 42 kDa), και των δύο Ο /ΕΒΡ βήτα ισομορφές LAP και LIP, και μειωμένη των πυρηνικών επίπεδα Ο /ΕΒΡ άλφα (ισομορφή 30 kDa) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Παράλληλα, η έκφραση του HSD11B2 μειώθηκε ταυτόχρονα με ένα μέγιστο αποτέλεσμα που λαμβάνεται σε 10

-6 Μ ινσουλίνης (Σχ. 5Α). Ωστόσο, σε απάντηση στην ίδια δόση της ινσουλίνης, η αύξηση της LIP (≈130 φορές σε 10

-6 Μ ινσουλίνη) ήταν μεγαλύτερη από ότι σε LAP (≈3 φορές σε 10

-6 Μ ινσουλίνη), με αποτέλεσμα τη μείωση της αναλογίας LAP /LIP (Εικ. 5Α). Έκφραση του Ο /ΕΒΡ άλφα (ισομορφή 42 kDa) ήταν ελαφρώς αυξημένη, ενώ η έκφραση του Ο /ΕΒΡ άλφα (ισομορφή 30 kDa) μειώθηκε κατά 50% (Εικ. 5Α).

γονιδιακή έκφραση HSD11B2 είναι ανάντη ρυθμίζεται από Ο /ΕΒΡ alpha /beta φίμωση

Η επίδραση του Ο /ΕΒΡ alpha /beta knockdown επί HSD11B2 αξιολογήθηκε σε κύτταρα ΗΤ-29. Υπάρχουν στοιχεία από αυτό το πείραμα διαμόλυνσης siRNA ότι η C /άλφα ΕΒΡ και mRNA /ΕΒΡ βήτα Ο μειωτικά σημαντικά (Εικ. 5C, D, αριστερό πάνελ). Είναι σημαντικό, τα επίπεδα του mRNA της HSD11B2 αυξήθηκε μετά την επιμόλυνση με siRNA εναντίον δύο ισομορφές (Εικ. 5C, D, δεξί πάνελ).

ρύθμιση της ινσουλίνης συμπλεγμάτων /ΕΒΡ-DNA C

Το

in silico

ανάλυση της αλληλουχίας του υποκινητή του γονιδίου HSD11B2 ανθρώπινη αποκάλυψε 4 υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για C /EBPs βρίσκονται στις θέσεις -4361, -1985, -198 και -177 bp από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (Πίνακας 1). Η περιοχή -4361 έχει την υψηλότερη αγώνα με την συναινετική αλληλουχία (Πίνακας 1). Διαφορετικοί ανιχνευτές σημάνθηκαν και επωάστηκαν σε παρουσία πυρηνικά εκχυλίσματα που απομονώνονται από ινσουλίνη έλαβαν κύτταρα ΗΤ-29. EMSA εκτελείται με τον ανιχνευτή που περιέχει την συναινετική Ο /ΕΒΡ θέση σύνδεσης αποκάλυψε τρία ειδικά σύμπλοκα (Σχ. 6Α, λωρίδα 1, σημειώνεται C1-3). Τα σήματα ανατράπηκαν από τον ανταγωνισμό με το μη σημασμένο ανιχνευτή που φιλοξενεί το χώρο /ΕΒΡ συναίνεση C (Εικ. 6Α, λωρίδα 6), ενώ δεν επηρεάζεται όταν ο ανιχνευτής έτρεφε τις μεταλλαγμένες θέσεις C /EBP (Εικ. 6Α, λωρίδα 7). Ως εκ τούτου, τα σήματα C1-3 μπορεί να αντιστοιχεί σε συμπλέγματα /ΕΒΡ /DNA C. Η C /σύνδεση με τη συναίνεση ανιχνευτή ΕΒΡ ανυψώθηκε με αυξημένη διάρκεια της θεραπείας με ινσουλίνη (Εικ. 6Α, λωρίδες 1-5) που αντικατοπτρίζει το αυξημένο επίπεδο του Ο /ΕΒΡ βήτα βρέθηκε από Western Blot (Σχ. 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, η ένταση του C2 αυξήθηκε περισσότερο από C1, C2 είναι πιο άφθονα σε σχέση προς C1 24 ώρες μετά τη θεραπεία με ινσουλίνη σε σύγκριση με μάρτυρες (διαδρομές 1, 5).

(Α) πυρηνικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν από HT -29 κύτταρα συνδέονται με προσδιορίζονται Ο /ΕΒΡ sites alpha /beta.

4 μg πυρηνικών εκχυλισμάτων που απομονώνονται από ινσουλίνη αγωγή (για την υποδεικνυόμενη χρονική περίοδο, 10

-7 Μ) ή μη επεξεργασμένο ΗΤ-29 κύτταρα επωάστηκαν με ραδιοσημασμένο ανιχνευτή που περιλαμβάνει το /ΕΒΡ άλφα συναινετική θέση C /βήτα παρουσία ή απουσία του μη-ραδιοσημασμένου (100 ×) καθετήρας ανταγωνιστής (μειονεκτήματα ο /ΕΒΡ άλφα /βήτα ή Mut ο /ΕΒΡ alpha /beta) (lanes1-7) . Τα βέλη υποδεικνύουν Ο /ΕΒΡ άλφα /βήτα /μετατοπίσεις DNA (C1, C2, C3) διαχωρίζεται από το ελεύθερο ανιχνευτή με ηλεκτροφόρηση πηκτής.