Abstract

καρκίνων του πνεύμονα εκφράζουν την χολινεργική αυτοκρινή βρόχο, το οποίο διευκολύνει την εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων. Οι ανταγωνιστές του mAChRs δειχθεί να καταστέλλουν την ανάπτυξη των μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLCs). Στη μελέτη αυτή προορίζεται να διερευνηθεί το αποτέλεσμα αναστολής αύξησης του R2HBJJ, ενός νέου ανταγωνιστή μουσκαρινικών, σε κύτταρα μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) και τους πιθανούς μηχανισμούς. Η δοκιμασία ανταγωνιστικής πρόσδεσης αποκάλυψε ότι R2HBJJ είχαν μια υψηλή συγγένεια με Μ3 και Μ1 AChRs. R2HBJJ παρουσίασε ισχυρή αντιχολινεργική δραστικότητα επί καρβαχόλη επαγόμενη συστολή της τραχείας ινδικού χοιριδίου. R2HBJJ κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC, όπως Η1299, Η460 και Η157. Σε Η1299 κύτταρα, τόσο R2HBJJ και οδηγώντας την ένωση του R2-PHC εμφανίζεται σημαντική αντι-πολλαπλασιαστική δράση ως ανταγωνιστής υποδοχέων Μ3 δαριφενασίνη. Εξωγενείς αναπλήρωση της ACh θα μπορούσε να μετριάσει R2HBJJ που προκαλείται αναστολή της ανάπτυξης. Σίγαση Μ3 υποδοχέα ή συνομιλίας, με ειδική-siRNAs οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης του 55,5% και 37,9% επί Η1299 κύτταρα 96 ώρες μετά την επιμόλυνση, αντίστοιχα. Περαιτέρω μελέτες αποκάλυψαν ότι η θεραπεία με R2HBJJ συνέλαβαν τον κυτταρικό κύκλο σε G0 /G1 με ρύθμιση προς τα κάτω της κυκλίνης D1-CDK4 /6-Rb. Ως εκ τούτου, η τρέχουσα μελέτη αποκαλύπτει ότι τα κύτταρα NSCLC εκφράζουν ένα αυτοκρινή και παρακρινή σύστημα χολινεργικών η οποία διεγείρει την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC. R2HBJJ, ως νέο ανταγωνιστή mAChRs, μπορεί να εμποδίσει την τοπική χολινεργική βρόχο από τον ανταγωνισμό κυρίως Μ3 υποδοχείς και αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC, που δείχνουν ότι ανταγωνιστής υποδοχέων Μ3 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός χημειοθεραπευτική αγωγή για NSCLC

Παράθεση:. Hua Ν , Wei Χ, Liu X, Ma X, Ο Χ, Zhuo R, et al. (2012) A Novel ανταγωνιστής των μουσκαρινικών R2HBJJ Αναστέλλει μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα την ανάπτυξη των κυττάρων και συλλήψεις η κυτταρικού κύκλου σε G0 /G1. PLoS ONE 7 (12): e53170. doi: 10.1371 /journal.pone.0053170

Επιμέλεια: Michihiko Kuwano, το Πανεπιστήμιο Kyushu, Ιαπωνία

Ελήφθη: 14 του Αυγούστου, 2012? Αποδεκτές: 26 του Νοεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Hua et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θνησιμότητας παγκοσμίως και ο αριθμός των κρουσμάτων και των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο του πνεύμονα είναι σε άνοδο σε πολλά μέρη του κόσμου. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει σχεδόν το 80% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα. Παρά τις επιθετικές προσπάθειες, θεραπείες δεν είναι ικανοποιητικές και τα ποσοστά επιβίωσης παραμένουν μελαγχολική (& lt? 20%) [1]. Ως εκ τούτου, η περαιτέρω κατανόηση της βιολογίας του NSCLC και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για την θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα είναι απαραίτητη.

Η ακετυλοχολίνη (ACh) είναι ένας σημαντικός νευροδιαβιβαστής στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα και παίζει βασικούς ρόλους στη μάθηση, μνήμη, αυτόνομου ελέγχου, και μυϊκή συστολή μέσω ενεργοποίησης των υποδοχέων ακετυλοχολίνης (AChRs), συμπεριλαμβανομένης της μουσκαρινικών (mAChRs) και νικοτινικούς υποδοχείς (nAChRs). Πρόσφατα, έχει βρεθεί ότι ACh είναι επίσης ευρέως συντίθεται από μια ποικιλία μη νευρωνικών κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών αεραγωγών κυττάρων [2], της πνευμονικής υπεζωκότα [3], λεπτό και παχύ έντερο, τη χοληδόχο κύστη, κερατινοκύτταρα [4], νευρογλοία [5], του αγγειακού ενδοθηλίου [6] και πιο κοινή καρκινικά κύτταρα, όπως NSCLC, μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα (SCLC), καρκίνο του παχέος εντέρου, νευρογλοιακά και καρκινώματα των ωοθηκών [7]. Η ευρέως διαδεδομένη έκφραση των μη νευρωνικών ακετυλοχολίνης συνοδεύεται από την πανταχού παρουσία της χολίνης ακετυλοτρανσφεράσης (ChAT), της χολινεστεράσης και υποδοχέων (nAChRs, mAChRs). Αν και η πρωτεύουσα λειτουργία διαλευκανθεί ελλιπώς, μη νευρωνικών ακετυλοχολίνης φαίνεται να εμπλέκεται στην ρύθμιση σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως μίτωση, τροφικά λειτουργία, αυτοματισμός, μετακίνηση, τη δραστηριότητα των κροσσών, επαφής κυττάρου-κυττάρου, κυτταροσκελετού, καθώς και φράγμα και το ανοσοποιητικό λειτουργίες [7] – [9]. Επομένως, η μη-νευρωνική χολινεργικού συστήματος και της ακετυλοχολίνης, που ενεργεί ως ένα τοπικό αυτοκρινείς και παρακρινείς ορμόνες, θα πρέπει να διακριθούν από τη νευρωνική χολινεργικού συστήματος και νευρωνικό ακετυλοχολίνης.

Ομοίως, μη-νευρωνικά ACh διεγείρει την ανάπτυξη των κυττάρων μέσω είτε μουσκαρινικών χολινεργική ή νικοτινικό χολινεργικών οδών. Έχει αναφερθεί ότι η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων επιταχύνθηκε μέσω ενεργοποίησης του mAChRs στο παχύ έντερο [10], του πνεύμονα [11] – [12], νευρογλοιακά [13], και του προστάτη [14]. Σε ωοθηκών καρκινώματα, η έκφραση του mAChR συσχετίζεται με μία φτωχή πρόγνωση [15]. Song

κ.ά.

ανέφεραν ότι η διακοπή του αυτοκρινούς μουσκαρινικών χολινεργικών σηματοδότηση με Μ3 ανταγωνιστή υποδοχέα ιωδιούχο 1,1-διμεθυλο-4-diphenylacetoxypiperidinium (4-DAMP) ή δαριφενακίνης έχει τη δυνατότητα να αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων SCLC τόσο

σε vitro

και

in vivo

[16]. Επιπλέον, πολλοί ερευνητές έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση των nAChRs με νικοτίνη ή παράγωγο καρκινογόνο 4- (μεθυλονιτροζαμινο) -1- (3-πυριδυλ) -1-βουτανόνη (ΝΝΚ) διεγερμένα ανάπτυξη κυττάρων όγκου στο μαστό [17], του πνεύμονα του [18 ], μεσοθηλίωμα υπεζωκότα [19], του παχέος εντέρου [20], της ουροδόχου κύστης [21] και του καρκίνου του τραχήλου [22]. Αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι το Α7 είναι ο κύριος υπομονάδα του nAChR που μεσολαβεί τις πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της νικοτίνης σε καρκινικά κύτταρα.

υδροχλωρική Penehyclidine (PHC) είναι ένα αντι-χολινεργική φάρμακο που προέρχεται από υοσκυαμίνη και αναπτύχθηκε ανεξάρτητα από ινστιτούτο μας. Ως δυνητικοί αντιχολινεργική δράση του, έχει διατεθεί στο εμπόριο για τη θεραπεία της οξείας οργανοφωσφορικών φυτοφαρμάκων δηλητηρίαση και η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ) [23] – [24]. PHC είναι μία ρακεμική ένωση με δύο χηλικά κέντρα, τα οποία συνθέτουν τέσσερα οπτικά ισομερή (Εικ. 1). προηγούμενη εργασία μας έδειξε ότι το ισομερές με R, R ‘, διαμόρφωση (R2-PHC) εμφανίζει την υψηλότερη δραστηριότητα αντιχολινεργικών. Για να μειώσει τις παρενέργειες πιέζοντας πρόσβαση στο κεντρικό νευρικό σύστημα, μια νέα αντιχολινεργικού παράγοντα (R2HBJJ) έχει σχεδιαστεί με την εισαγωγή μιας ομάδας τεταρτοταγούς άλατος αμμωνίου προς το R2-PHC μόριο για τη θεραπεία των περιφερικών νόσων, όπως οι καρκίνοι του πνεύμονα και η ΧΑΠ. Στην παρούσα μελέτη, η επιλεκτικότητα των R2HBJJ για τους υποδοχείς Μ1-Μ5 αξιολογείται λεπτομερώς και η αντικαρκινική δράση της R2HBJJ σε κυτταρικές σειρές NSCLC

in vitro

και πιθανούς μηχανισμούς της διερευνώνται. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για τη διερεύνηση της επίδρασης του ανταγωνιστή Μ3 στα κύτταρα NSCLC.

Η

Αποτελέσματα

R2HBJJ εμφανίζεται υψηλότερη εκλεκτική συγγένεια με Μ

3 και Μ

1 υποδοχέα

Ο κορεσμός δεσμευτική ανάλυση απέδωσε σταθερά δέσμευσης (Κ

D) τιμές για την συγγένεια [

3Η] NMS σε ανθρώπινο Μ1, Μ2, Μ3, Μ4 και Μ5 των 0,29 ± 0,04, 0,81 ± 0,17, 0,53 ± 0,09, 0,19 ± 0,03, και 0,48 ± 0,13 ηΜ, αντίστοιχα. Η σχετική εκλεκτικότητα για Μ1-Μ5 AChR υποτύπων του R2HBJJ προσδιορίστηκε για πρώτη φορά στο επίπεδο της συγγένειας δέσμευσης του υποδοχέα σε ανθρώπινα mAChRs πρωτεΐνες (Εικ. 2). Οι τιμές του IC

50 και Κ

i του R2HBJJ αναστολής [

3Η] NMS σύνδεση προς υποτύπους υποδοχέα Μ1-Μ5 συνοψίστηκαν στον Πίνακα 1. R2HBJJ επέδειξαν μία σχετική υψηλότερη συγγένεια για Μ3 και Μ1 υποδοχέα από Μ2 αισθητήριο νεύρο. Η κλιμακωτή συγγένεια των R2HBJJ για πέντε διαφορετικές mAChRs ήταν Μ3 & gt? M1 & gt? M4 & gt? M5 & gt?. Μ2

mAChRs πρωτεΐνες επωάστηκαν με [

3Η] -NMS στους 37 ° C για 2 ώρες σε περίπτωση απουσίας και παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων R2HBJJ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν.

Η

R2HBJJ ανέστειλε καρβαχόλη που προκαλείται τραχείας συστολή

Για να προσδιοριστεί η επίδραση αποκλεισμού της R2HBJJ για mAChR, ένα ex vivo μοντέλο του ινδικού χοιριδίου συστολή της τραχείας εφαρμόστηκε. Η συρρίκνωση της λωρίδας τραχείας που απομονώνονται από ινδικού χοιριδίου προκλήθηκε με 1 μΜ καρβαχόλη, μη επιλεκτικό μουσκαρινικό αγωνιστή. Και στη συνέχεια, αυξανόμενες συγκεντρώσεις R2HBJJ (10

-10-10

-6.5 Μ) ή ατροπίνη ως ανταγωνιστής ελέγχου, προστέθηκαν αθροιστικά στο λουτρό οργάνου. Ελήφθη Η ανασταλτική απόκριση συγκέντρωση κατά καρβαχόλη επαγόμενη συστολή. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι R2HBJJ ανέστειλε εξάρτηση από τη συγκέντρωση των συσταλτικών αποκρίσεων τραχεία ινδικού χοιριδίου στην καρβαχόλη (Εικ. 3). Η συγκέντρωση αναστολής 50% (IC

50) ήταν 7,58 ± 1,05 ηΜ, η οποία ήταν στατιστικά σημαντικά μικρότερη από εκείνη της ατροπίνης (10.21 ± 1.04 ηΜ,

P

& lt? 0,05). Τα στοιχεία έδειξαν ότι R2HBJJ επέδειξε μία ισχυρή ανταγωνιστική δραστικότητα επί mAChRs εκφράζονται σε τραχεία ινδικού χοιριδίου.

καρβαχόλη (1 μΜ) χρησιμοποιήθηκε για την επαγωγή συσταλτική απόκριση. Μετά από αυτό, οι υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις R2HBJJ ή ατροπίνη προστέθηκαν σωρευτικά στο λουτρό οργάνου και οι ανασταλτικές αποκρίσεις συγκέντρωση κατά καρβαχόλη επαγόμενη συστολή ελήφθησαν. Οι τιμές εκφράστηκαν ως ποσοστά της μέγιστης συσταλτικής απόκρισης απουσία οποιουδήποτε ανταγωνιστή. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SD των πέντε ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

κυτταρικές σειρές NSCLC εξέφρασε χολινεργικών υποδοχέων και ακετυλοτρανσφεράση χολίνης

Αν μια χολινεργική αυτοκρινούς βρόχου είναι λειτουργικό σε NSCLC, τότε τα κύτταρα πρέπει να εκφράζουν χολινοακετυλοτρανσφεράση (chat), mAChRs ή /και nAChRs για ACh να παρέχουν αυτοκρινείς χολινεργική διέγερση της ανάπτυξης των κυττάρων NSCLC. Για να καθοριστεί εάν κυτταρικές σειρές NSCLC εκφράζουν AChRs και το chat, το mRNAs των πέντε υποτύπους του mAChRs (M1-M5), τρεις υπότυποι του nAChRs (α7, α9 και α10) και να συνομιλήσετε εξετάσθηκαν με RT-PCR σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC Η1299, Η157, Η460, Α549 και ανθρώπινη απαθανάτισε βρόγχων επιθηλιακών κυττάρων BEP2D. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, οι Μ1, Μ2, Μ5, α7, α9, α10 υποτύπους υποδοχέα και ChAT ήταν σχεδόν εκφράζονται σε όλα τα κύτταρα NSCLC δοκιμάστηκαν. υποτύπο υποδοχέα Μ3 εκφράστηκε σε Η1299, Η460 H157and, και ήταν απούσα σε Α549. υποτύπο υποδοχέα Μ4 εκφράστηκε σε Η1299 και Η157, αλλά όχι σε Η460 και Α549. Αντίθετα, τους βρόγχους των επιθηλιακών κυττάρων του ανθρώπου απαθανάτισε BEP2D εξέφρασε τα mRNAs των διαφορετικών AChRs υποτύπους σε χαμηλότερα επίπεδα, με εξαίρεση α10 υποτύπου και chat. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ακετυλοχολίνης αυτοκρινή βρόχο στις κύτταρα NSCLC.

RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ολικό RNA που παρασκευάζεται από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. Οι εκκινητές που περιγράφονται στον Πίνακα 3. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

R2HBJJ ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό in vitro NSCLC

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της R2HBJJ στην κυτταρική ανάπτυξη των NSCLCs, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις R2HBJJ (1,6 – 100 μΜ) για 72 ώρες και η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με την χρησιμοποίηση της δοκιμασίας Β σουλφοροδαμίνης (SRB). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με R2HBJJ κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο με τον Η1299, Η460 και Η157 κυττάρων, με 50% συγκέντρωση ανασταλτική της ανάπτυξης (GI

50) του 8.5, 8.8 και 28.5 μΜ, αντίστοιχα. Σε σύγκριση, Α549 και κύτταρα BEP2D ήταν ανθεκτικά σε R2HBJJ, με ΓΕ

50 άνω των 100 μΜ, την υψηλότερη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (Εικ. 5Α). Τα δεδομένα πρότειναν ότι η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του R2HBJJ ήταν ανάλογα με τα χαρακτηριστικά των κυτταρικών γραμμών και όχι η μη εκλεκτική κυτταροτοξικότητα.

Επιδράσεις της R2HBJJ επί ανθρώπινων κυτταρικών σειρών NSCLC και ανθρώπινα αθανατοποιημένα βρόγχων επιθηλιακών κυττάρων BEP2D (Α ) και τα αποτελέσματα της mAChR και nAChR ανταγωνιστών σε κυτταρικές σειρές Η1299 (Β και C, αντίστοιχα). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις R2HBJJ ή χολινεργικού ανταγωνιστές των υποδοχέων για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία SRB. Κύτταρα κατεργασμένα με διαλύτη (DMSO) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος, με σετ βιωσιμότητα 100%. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

Επιπλέον, οι επιδράσεις άλλων mAChRs (Εικ. 5Β) και nAChRs (Εικ. 5C) παρατηρήθηκαν ανταγωνιστών επί Η1299. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β και 5C, οι γνωστές εκλεκτικοί ανταγωνιστές Μ3 mAChR δαριφενασίνη ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Η1299 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ το μη επιλεκτικό mAChR ανταγωνιστής ατροπίνη, μη επιλεκτικό nAChR ανταγωνιστής μεκαμυλαμίνη, εκλεκτικός Μ1 mAChR ανταγωνιστής πιρενζεπίνη, εκλεκτικός α4β2 /α4β4 ανταγωνιστής DhβE, και εκλεκτικός ανταγωνιστής α7 α-BGT δεν είχε εμφανή αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Το Μ2 /M4-επιλεκτικός ανταγωνιστής AF-DX116 είχε επίσης αναστολή επί του πολλαπλασιασμού κυττάρου στην υψηλότερη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε. Σε σύγκριση, R2HBJJ και γονικής ένωσης του R2-PHC ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Η1299 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο, η οποία ανασταλτική ισχύ ήταν περίπου 3.7 φορές μεγαλύτερη από εκείνη της δαριφενακίνης, την καλύτερη μεταξύ των ανταγωνιστών δοκιμάστηκαν παραπάνω. Επειδή εφαρμόστηκε καμία εξωγενή αγωνιστή AChR, τα δεδομένα αποκάλυψαν ότι η ενδογενής ACh λειτούργησε ως αυτοκρινής αυξητικός παράγοντας σηματοδότησης σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC, εν μέρει μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα Μ3.

Εξωγενείς AChR αγωνιστή εξασθενημένος R2HBJJ επαγόμενη αναστολή ανάπτυξης

Για να προσδιοριστεί η συσχέτιση μεταξύ των χολινεργικών οδών σήματος και R2HBJJ που προκαλείται από την αναστολή της ανάπτυξης, εξωγενή αγωνιστή AChR ACh χρησιμοποιήθηκε. Παρατηρήθηκαν Οι επιδράσεις της ACh στην ανάπτυξη των Η1299 και R2HBJJ επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης. Διαπιστώθηκε ότι η εξωγενής ACh μόνη της σε 1, 10, και 100 μΜ για 72 ώρες δεν είχε σημαντικές επιδράσεις στην ανάπτυξη των κυττάρων Η1299 (Πίνακας 2). R2HBJJ μόνη στα 10 μΜ και 20 μΜ μείωσε την βιωσιμότητα των κυττάρων από το 100 ± 1,61% έως 54,13 ± 3,89% και 23,23 ± 2,14% (n = 3), αντίστοιχα. Όταν ACh χορηγήθηκε πριν από τη θεραπεία R2HBJJ, την αναστολή ανάπτυξης που προκαλείται από R2HBJJ (τόσο 10 και 20 μΜ) atttenuated παρουσία εξωγενούς ACh σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) έδειξε siginificant επίδραση της θεραπείας R2HBJJ, θεραπεία ACh, και η θεραπεία R2HBJJ × αλληλεπίδραση θεραπεία ACh (

P

& lt? 0,0001, αντίστοιχα). post-hoc δοκιμές επιβεβαίωσαν ότι οι ακόλουθες προεπεξεργασία συγκεντρώσεις της ACh, 10 μΜ και 100 μΜ, εξασθενημένα σημαντικά την αναστολή της ανάπτυξης που επάγεται από 10 μΜ ή 20 μΜ R2HBJJ. Σε σύγκριση με τη θεραπεία R2HBJJ μόνος στο επίπεδο των 10 μΜ, 10 μΜ και 100 μΜ της ACh προεπεξεργασίας αύξησε την βιωσιμότητα των κυττάρων από 54.13 ± 3.89% σε 82.29 ± 5.82% (

P

& lt? 0,01) και 91,1 ± 3,65% (

P

& lt? 0,01), αντίστοιχα. Σε σύγκριση με τη θεραπεία R2HBJJ μόνος στο επίπεδο των 20 μΜ, 10 μΜ και 100 μΜ της ACh προεπεξεργασίας αύξησε την βιωσιμότητα των κυττάρων από 23.23 ± 2.14% σε 35.57 ± 4.48% (

P

& lt? 0,05) και 58,55 ± 2,83% (

P

& lt? 0.01)., αντίστοιχα (Πίνακας 2)

η

M3- και να συνομιλήσετε ειδικά τα siRNA μείωση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων

Για την περαιτέρω αποδείξει ότι ενδογενούς ACh και το σήμα υποδοχέα Μ3 ενεπλάκησαν σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων NSCLC, κύτταρα Η1299 είχαν επιμολυνθεί με M3- ή chat-ειδικά siRNAs και τον πολλαπλασιασμό τους παρατηρήθηκε την πάροδο του χρόνου. Πρώτον, η ανάλυση κηλίδος western χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων αυτών των γονιδίων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α και 6Β, Μ3 και ChAT επίπεδα πρωτεΐνης μειώθηκαν έντονα 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με στόχευση siRNAs σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο siRNA. Με τη χρήση δοκιμασίας SRB σε πλάκα 96-φρεατίων, η ισχύς της αναστολής της ανάπτυξης που προκαλείται από φίμωση Μ3 ή ChAT ελέγχθηκε στις 48, 72 και 96 ώρες μετά την επιμόλυνση. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι υπήρχε μια εξαρτώμενη από το χρόνο μείωσης της βιωσιμότητας της ανάπτυξης των κυττάρων από M3- ή chat-siRNA στην Η1299 κυττάρων σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα siRNA (Σχ. 6C). Η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της αποσιώπησης Μ3 οπτικοποιήθηκε προφανώς νωρίς σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (

P

& lt? 0,01) και η αναστολή των 55,5% επιτεύχθηκε μέσα σε ένα χρονικό πλαίσιο 96 h (

P

& lt? 0.001). Για ChAT-siRNA, αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του παρουσιάστηκε στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (

P

& lt? 0.001), το οποίο ήταν πιο αργή από Μ3 siRNA? και η αναστολή του 37,9% επιτεύχθηκε 96 ώρες μετά την επιμόλυνση σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα siRNA (Σχ. 6C,

P

& lt? 0.001).

κάτω ρύθμιση του Μ3 και chat πρωτεΐνη ήταν ανιχνεύθηκαν με western blot 72 ώρες μετά την επιμόλυνση των 200 ηΜ siRNAs (Α και Β). Τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία 200 ηΜ siRNA για 48, 72 και 96 ώρες, μετά από αυτό, η βιωσιμότητα κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία SRB και σε σύγκριση με την πλαστή ελέγχου.

**

P

& lt? 0,01,

***

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με τα αρνητικά siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα στο ίδιο χρονικό σημείο (C). Μετά Μ3 ή αρνητικός siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς R2HBJJ (8 μΜ και 16 μΜ) για 72 ώρες και το αποτέλεσμα συνδυασμού Μ3 siRNA knockdown και θεραπεία R2HBJJ επί της κυτταρικής ανάπτυξης ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία SRB.

#

P

& lt? 0,05,

##

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με τα αρνητικά siRNA επιμολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με διαλύτη. (ΡΕ). Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω κατά πόσον η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του R2HBJJ ήταν Μ3 υποδοχέα ειδικών, τα κύτταρα Η1299 υπέστησαν αγωγή με R2HBJJ μετά Μ3 siRNA διαμόλυνση. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι σε αρνητικά κύτταρα κατεργασμένα siRNA, R2HBJJ εμφάνισαν σημαντική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, η κυτταρική βιωσιμότητα ήταν 83,5% (

P

& lt? 0,05) και 57,4% (

P

& lt? 0,01) μετά R2HBJJ 8 μΜ και 16 μΜ θεραπεία. Ωστόσο, μετά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA Μ3, η κυτταρική βιωσιμότητα αναστάλθηκε σε 54,4%? R2HBJJ (8 μΜ και 16 μΜ) δεν επηρέασε περαιτέρω την ανάπτυξη των κυττάρων, η οποία πρότεινε ότι φίμωση υποδοχέα Μ3 στερούνται της κυτταρικής ευαισθησίας στην R2HBJJ και τονίζεται ο ρόλος του Μ3 στην επίδραση της R2HBJJ (Εικ. 6D).

R2HBJJ συνέλαβαν τον κυτταρικό κύκλο σε G0 /G1

φάση

για να διερευνήσει τους πιθανούς μηχανισμούς R2HBJJ-προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα NSCLC, παρατηρήθηκαν οι επιδράσεις της R2HBJJ στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, χρησιμοποιώντας την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα αποτελέσματα από Η1299 κυττάρων έδειξε ότι το ποσοστό των G0 /G1 φάση αυξήθηκε από 40,35% σε 76,60%, και εκείνη της φάσης S μειώθηκε από 46,14% σε 15,93%, μετά από κατεργασία με 20 μΜ R2HBJJ για 72 ώρες (Εικ. 7Α). Επιπλέον, τα κύτταρα Η1299 σε επεξεργασία με ένα εύρος R2HBJJ (2,5-20 μΜ) για 48 ώρες επέδειξε επίσης σημαντική σύλληψη στην φάση G0 /G1, με ποσοστιαία αύξηση από 39,60% έως 70,01% (Σχ. 7Β). Επιπλέον, παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη στην κυτταρική σειρά Η157, με την ποσοστιαία αύξηση G0 /G1 φάση από 55,04% έως 65,46% σε σχέση με τη συγκέντρωση (Σχ. 7C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι R2HBJJ κατέστειλε σημαντικά την πρόοδο του κυτταρικού μιτωτικό σε χρόνο-εξαρτώμενη και εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση ήθη μέσω συλλαμβάνοντας κύτταρα σε G0 /G1 φάση και μειώνοντας τη σύνθεση του DNA.

Τα κύτταρα συγχρονίστηκαν με 1% FBS για 24 ώρες . Μετά από αυτό, τα κύτταρα απελευθερώνονται στο πλήρες μέσο (10% FBS) που περιέχει 20 μΜ R2HBJJ για 24, 48, 72 h (A, Η1299 κύτταρα) ή διάφορες συγκεντρώσεις R2HBJJ (2,5-20 μΜ) για 48 ώρες (B, Η1299 κύτταρα? C, τα κύτταρα Η157). Κύτταρα κατεργασμένα με διαλύτη (DMSO) χρησιμοποιήθηκαν ως ένας έλεγχος. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με χρήση του προσδιορισμού κυτταρομετρίας ροής. Τα ιστογράμματα που εμφανίζονται εδώ ήταν αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων.

Η

R2HBJJ κάτω-ρυθμίζονται τα επίπεδα των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου και Rb φωσφορυλίωσης

μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από G1 προς S ενεργοποιείται κυρίως από δύο διαφορετικά σύνθετα κινάσης: κυκλίνης D1 /CDK4, 6 και κυκλίνη Ε, Α /CDK2. Rb είναι το κύριο υπόστρωμα της κυκλίνης D-εξαρτώμενη κινάση και παίζει ένα ρόλο κλειδί στο δίκτυο των ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Για να διερευνηθούν οι υποκείμενες μοριακών μηχανισμών G0 /G1 σύλληψης που επάγεται από R2HBJJ, οι χρονοεξαρτώμενες μεταβολές πολλών ρυθμιστικών μορίων κυτταρικού κύκλου συναφών αξιολογήθηκαν μετά από κατεργασία με 20 μΜ R2HBJJ σε Η1299 κύτταρα με χρήση ανάλυσης στυπώματος Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 8Α, η θεραπεία με R2HBJJ επαγόμενη δραματική ρύθμιση προς τα κάτω της κυκλίνης D1 πρωτεϊνών, CDK4 και CDK6 χρονικά εξαρτώμενο, ενώ τα επίπεδα της κυκλίνης Ε και CDK2 παρέμεινε βασικά αμετάβλητη κατά την ίδια περίοδο. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της Rb (ιδιαίτερα σε Ser

807/811) μειώθηκε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Η μείωση του Rb φωσφορυλιώνονται στη θέση της Ser

807/811 συνέβη ήδη 3 ώρες μετά την επεξεργασία και πριν εμφανής αλλαγή κυτταρική βιωσιμότητα. Αντίθετα, η έκφραση της βασικής Rb έδειξαν μια σημαντική επίμονη αύξηση και στη συνέχεια μειώθηκε γρήγορα σε ένα μη ανιχνεύσιμο επίπεδο σε 48 ώρες μετά την αγωγή, όταν η καταστολή ανάπτυξης κυττάρου έχει επαχθεί (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), το οποίο μπορεί να υποδηλώνει μία δυνητική κυτταρική προσαρμογή στη μείωση του φωσφορυλιωμένη Rb μετά τη θεραπεία R2HBJJ. Περαιτέρω αξιολογήσαμε την απόκριση συγκέντρωση της φωσφορυλίωσης Rb μειωμένη μετά την επεξεργασία με R2HBJJ για 48 ώρες (Εικ. 8Β). Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η μείωση του Rb φωσφορυλιωμένο στο Ser

807/811 με R2HBJJ ήταν εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση και εμφανίστηκαν στη χαμηλότερη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (1.25 μΜ). Σταθερά, η ρύθμιση προς τα κάτω της Κυκλίνης D1, CDK4 και CDK6 πρωτεΐνες παρατηρήθηκε στα κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με αυξανόμενες συγκεντρώσεις R2HBJJ. Ομοίως, η έκφραση της βασικής Rb παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε σχέση με τη συγκέντρωση στο πρώτο και κατόπιν μειώθηκαν ταχέως σε βασικό επίπεδο. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Rb πρωτεΐνη και το σύνθετο κινάσης της κυκλίνης D1 /CDK4, 6 ήταν κυρίως εμπλέκονται στην κυτταρική G0 /G1 σύλληψη επάγεται από R2HBJJ.

Η1299 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 20 μΜ R2HBJJ για την υποδεικνυόμενη φορές (3-60 h, Α) ή με διάφορες συγκεντρώσεις R2HBJJ (1,25-20 μΜ) για 48 ώρες (Β). Τα κυτταρολύματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι ACh και άλλα συστατικά του χολινεργικών σηματοδοσίας, συμπεριλαμβανομένων των ChAT, της χολινεστεράσης, Μ και Ν χολινεργικών υποδοχέων, υπάρχουν σε μία ποικιλία μη-νευρωνικών ιστών, συμπεριλαμβανομένων των πιο κοινή μορφή καρκίνου κύτταρα όπως NSCLC, SCLC, του παχέος εντέρου, νευρογλοιακά, καρκινώματα μαστού και ωοθηκών. Στο τοπικό περιβάλλον των όγκων, οι συγκεντρώσεις της ACh σε υποδοχείς επιφάνειας μπορεί να είναι ακόμη μεγαλύτερη λόγω υψηλές πυκνότητες κυττάρων σε συμπαγείς μάζες, αυξημένη έκκριση ACh εγγύτητα με την τοποθεσία του υποδοχέα και μειωμένα επίπεδα χολινεστεράσης στον NSCLC [26], η οποία εμπλέκει ότι χολινεργική σηματοδότηση μπορεί να αυξηθεί περαιτέρω. Η μη νευρωνικών χολινεργικού συστήματος και ACh, ως ένα τοπικό σηματοδότησης κυτταρικής ανάπτυξης, παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου και αντιπροσωπεύει ένα δυνητικό νέο μονοπάτι για τη στόχευση της ανάπτυξης του όγκου. Ως εκ τούτου, χολινεργικοί ανταγωνιστές διακόπτουν τα επάνω ρυθμισμένα αυτοκρινής σηματοδότηση μπορεί να παρέχει μία κατευθυνόμενη προς τα ανάντη προσέγγιση στην παρεμπόδιση πολλαπλασιαστικών οδό.

R2HBJJ, ως παράγωγο του αντιχολινεργικού παράγοντα R2-PHC, συνετέθη με ινστιτούτο μας. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την επιλεκτικότητα των R2HBJJ για Μ1-Μ5 μουσκαρινικούς υποδοχείς και αντιχολινεργική δράση της. Επίσης προσδιορίζεται εάν η διακοπή της ενδογενούς χολινεργικής σηματοδότησης με R2HBJJ έχει τη δυνατότητα να αναστείλει την ανάπτυξη NSCLC

in vitro

.

Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι R2HBJJ είχαν σημαντικά υψηλότερη συγγένεια για τους υποτύπους υποδοχέα Μ3 και Μ1 από Μ2 υποτύπου , η οποία πρότεινε λιγότερες καρδιαγγειακές παρενέργειες σχετίζεται με τον υποδοχέα Μ2. Η κλιμακωτή συγγένεια των R2HBJJ για πέντε διαφορετικές mAChRs ήταν Μ3 & gt? M1 & gt? M4 & gt? M5 & gt? Μ2. Το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με αυτό που στην γονική ένωση ΠΦΥ του πριν [27]. Στη λειτουργική μελέτη, R2HBJJ ανέστειλε τις συσταλτικές αποκρίσεις της τραχείας ινδικού χοιριδίου στην καρβαχόλη σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. Η ανασταλτική δραστηριότητα ήταν ισχυρότερη από εκείνη του ανταγωνιστή mAChR, ατροπίνη.

Song

κ.ά.

ανέφεραν ότι SCLC συνθέτουν και εκκρίνουν ακετυλοχολίνη, η οποία δρα ως αυτοκρινής αυξητικός παράγοντας μέσω τόσο νικοτινικών και μουσκαρινικών χολινεργικών μηχανισμών [16]. Η μελέτη μας διευκρινιστεί ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC, όπως SCLC, εκφράζουν τόσο Μ και Ν AChRs, καθώς και chat, πράγμα που σημαίνει ότι ένα λειτουργικό θεμέλιο των χολινεργικών αυτοκρινούς βρόχου είναι παρούσα σε NSCLC. Ως εκ τούτου, η δραστηριότητα αναστολής ανάπτυξης του R2HBJJ σε διάφορες κυτταρικές σειρές NSCLC, συμπεριλαμβανομένων Η1299, Η460 και Η157 κύτταρα, μπορεί να προκληθεί τόσο από το Μ και Ν χολινεργικών μηχανισμών. Αλλά όταν τα κύτταρα Η1299 υπέστησαν αγωγή με γνωστά επιλεκτική ή μη-εκλεκτικοί ανταγωνιστές για M- και Ν- υποδοχείς

in vitro

, βρήκαμε ότι μόνο Μ3 ανταγωνιστής υποδοχέα δαριφενακίνης παρουσίασε σημαντική αναστολή στην ανάπτυξη των κυττάρων. Εν τω μεταξύ, οι ενώσεις μας R2HBJJ και R2-PHC επίσης ανέστειλε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα των Η1299 κυττάρων, με προτιμότερη αποτέλεσμα από δαριφενακίνη. Στη μελέτη του τραγουδιού

et al

, θεραπεία SCLC κυττάρων με ανταγωνιστές των υποδοχέων Μ3 της 4-υγρές ή δαριφενασίνης ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι ανταγωνιστές των υποδοχέων Μ3 έχουν ανασταλτική δράση στο NSCLC, καθώς και. Το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του R2HBJJ επί NSCLC μπορεί να σχετίζονται με ανταγωνιστική δράση επιλεκτική Μ3 υποδοχέα της. Russo P

κ.ά.

ανέφεραν ότι η αναστολή του α7 nAChR-με ένα ισχυρό ανταγωνιστή υψηλής συγγένειας α-CBT επαγόμενη δραστικότητα κατά του όγκου σε NSCLC και πλευρικό μεσοθηλίωμα πυροδοτώντας την απόπτωση [18] – [19]. Ωστόσο, στην έρευνα μας, ένας άλλος ανταγωνιστής α7-nAChR α-BGT χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία Η1299 κυττάρων και η επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων δεν παρατηρήθηκε, η οποία πρότεινε ότι α7-nAChR σηματοδότησης μπορεί να μην είναι ο κύριος μεσολαβητής στην ανάπτυξη των κυττάρων Η1299.

στην παρούσα μελέτη, δεν τήρησε την πολλαπλασιαστική επίδραση των εξωγενών ACh σε Η1299 κύτταρα, τα οποία μπορεί να συνεπάγεται ότι η ενδογενής ACh προσέφερε αρκετά διεγερτικό αποτέλεσμα στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ωστόσο, η εξωγενής αναπλήρωση της ACh χρειάζεται να ανταγωνίζονται ανταγωνιστικά την αναστολή της R2HBJJ επί Η1299 κύτταρα. Το αποτέλεσμα τόνισε ότι η επίδραση της R2HBJJ στην ανάπτυξη των κυττάρων Η1299 επιτεύχθηκε μέσω αντίκτυπο στην ενδογενή σηματοδοσίας ACh. Στην παρούσα μελέτη, ChAT siRNA αποδείχθηκε ότι αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων, η οποία ενισχύεται περαιτέρω αυτή την υπόθεση. Επιπλέον, αξίζει να σημειωθεί ότι η θεραπεία με Μ3 υποδοχέα siRNA είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αναστολή αύξησης επί Η1299 κύτταρα όταν συγκρίνεται με κύτταρα κατεργασμένα αρνητικό έλεγχο siRNA. Η ισχύς αναστολής επιτυγχάνεται 50% ή περισσότερο εντός ενός χρονικού πλαισίου 96 h. Όταν υποδοχέα Μ3 αποτελεσματικά γκρέμισε το Η1299 κύτταρα, τα κύτταρα lossed ευαισθησία τους σε R2HBJJ. Τα αποτελέσματα τονίζεται περαιτέρω το ρόλο του Μ3 στην αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των R2HBJJ. Σύλληψή

κυτταρικού κύκλου είναι ένας σημαντικός μηχανισμός πρόληψη της ανάπτυξης του όγκου. Τα αποτελέσματά μας από την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι R2HBJJ κατέστειλε σημαντικά την εξέλιξη του κυτταρικού μιτωτική σύλληψη μέσω κυττάρων σε Ο0 /Ο1 φάση. Κυττάρων μετάβαση κύκλο από G1 προς S ελέγχει τη σύνθεση του DNA και απαιτεί υπερφωσφορυλίωση ενός ογκοκατασταλτικού, Rb [28]. Κατά τη διαδικασία του κύκλου, η καταλυτική δραστικότητα της κυκλίνης D1 συνδυασμού με CDK4 /6 πρώτα εκδηλώνεται με τα μέσα του G1, αυξάνει σε ένα μέγιστο κατά το G1 /S μετάβαση και συμβάλλει στην έξοδο G1. Ενώ κυκλίνης Ε και κυκλίνης Α συνδέει με CDK2 ενεργοποιείται στην G1 /S μετάβαση ή στην πρώιμη φάση S, αντίστοιχα. Η φωσφορυλίωση της Rb αρχικά ενεργοποιείται από ενεργό Κυκλίνη D1-CDK4 /6 σύμπλοκα και αργότερα επιταχύνεται από κυκλίνη E-CDK2. Αυτή η φωσφορυλίωση επιτρέπει τον διαχωρισμό των παραγόντων μεταγραφής, όπως ο παράγοντας Ε2 υποκινητή δέσμευσης (E2F) και το πρωτο-ογκογονίδιο c-Abl υπερεκφράζεται ή μεταλλάσσεται σε έναν αριθμό των κακοήθων όγκων, η οποία μπορεί να μετενεργοποιούν γονίδια δ-φάση που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που ενισχύουν την διακόπτη και φάση G1 στην S απαιτούνται για την αντιγραφή του DNA [29]. Των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου που εξετάστηκαν στην παρούσα μελέτη, οι εκφράσεις της κυκλίνης D1 πρωτεϊνών, CDK4 και CDK6 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω χρονικά εξαρτώμενο, ενώ τα επίπεδα της κυκλίνης Ε και CDK2 δεν επηρεάστηκαν σημαντικά. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της Rb στη θέση της Ser

807/811 αναστάλθηκε από R2HBJJ χρονικά εξαρτώμενο, το οποίο θα μπορούσε να καταργήσει την αλληλεπίδραση μεταξύ c-Abl και τα Rb και επιβραδύνουν την ενεργοποίηση της c-Abl και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [ ,,,0],30]. Μαζί, τα δεδομένα μας πρότεινε ότι Rb πρωτεΐνη και το σύνθετο κινάσης της κυκλίνης D1 /CDK4, 6 ήταν κυρίως εμπλέκονται στην κυτταρική σύλληψη G0 /G1 που προκαλείται από R2HBJJ. Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι R2HBJJ εξασκείται επιβραδυντική επίδραση της κατά την πρώιμη φάση της G0 /G1.

Στην πραγματικότητα, ρυθμιστικά μόρια που διέπουν νωρίς την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, όπως κυκλίνη D1-CDK4 /6-Rb είναι οι συχνοί στόχοι της γενετικών αλλοιώσεων σε ένα εξαιρετικά υψηλό ποσοστό των καρκίνων του πνεύμονα [31]. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι οι στρατηγικές για τη στόχευση πρωτεϊνών που σχετίζονται με την πρόωρη πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και του σημείου περιορισμού G1 μπορεί να είναι χρήσιμα σε αντικαρκινική θεραπεία [32] – [33]. Η κυκλίνη D1 έχει επίσης δειχθεί να είναι ένας προς τα κάτω στόχος πολλών οδών μεταγωγής σήματος που προκαλείται από τέτοια ογκογονίδια ως Neu, Ras, και β-κατενίνης. Μια πρόσφατη μελέτη υποστηρίζει την υπόσχεση της συνεργασίας στοχεύουν κυκλίνης D1 ως προγνωστική και την προσωποποίηση προσέγγιση για την πρόληψη και τη θεραπεία [34] του καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, ACh ενεργώντας μέσω mAChR έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων με ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ, ERK1 /2 και της ρύθμισης του πρόοδο του κυτταρικού κύκλου [11], [16]. αδημοσίευτα στοιχεία μας έδειξαν επίσης ότι η πρώιμη απόπτωση συμμετείχε στην αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του R2HBJJ, αλλά οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένουν πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη αποκαλύπτει ότι τα κύτταρα NSCLC εκφράσουμε αυτοκρινείς και παρακρινείς χολινεργικού συστήματος η οποία διεγείρει την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC. R2HBJJ, ένα μυθιστόρημα μουσκαρινικός ανταγωνιστής, μπορεί να μπλοκάρει το τοπικό βρόχο χολινεργική από τον ανταγωνισμό κυρίως Μ3 υποδοχείς και αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC. Ο μηχανισμός για την επαγόμενη R2HBJJ κυτταρικού κύκλου G0 /G1 σύλληψης περιλαμβάνει ρύθμιση προς τα κάτω της κυκλίνης D1-CDK4 /6-Rb. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι ανταγωνιστές των υποδοχέων Μ3, ενδεχομένως, να γίνει μια νέα ισχυρή χημειοθεραπευτική αγωγή για NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά