Αφηρημένο

Ιστορικό

Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα να διατηρήσουν τελομερή να προστατεύουν τα κύτταρα από τη γήρανση μέσω της δραστηριότητας της τελομεράσης (TA) ή εναλλακτικά επιμήκυνση των τελομερών (ALT) σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Επιπλέον, κυτταρική γήρανση μπορεί να παρακαμφθεί από επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου σε διαφορετικές συμπαγείς όγκους. Ωστόσο, δεν έχει διευκρινιστεί τα χαρακτηριστικά της συντήρησης των τελομερών και την ικανότητα εξέλιξη μετά από μακροχρόνια καλλιέργεια σε κύστης καρκινικά κύτταρα Τ24 με στυτική hTERT.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε αυτή τη μελέτη, με χρησιμοποιώντας μια κυρίαρχη αρνητική μεταλλαγμένο ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (hTERT) φορέα για την αναστολή TA στα κύτταρα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης Τ24, παρατηρήσαμε την εμφάνιση της μακράς φαινοτύπου του μήκους των τελομερών και το συγκρότημα ALT σχετίζονται με το σώμα PML (APB) μετά από 27

ου πέρασμα, υποδεικνύοντας την εμφάνιση της ALT-όπως μονοπάτι στην επιβίωση των κυττάρων Τ24 /DN868A με την αναστολή της τελομεράσης. Εν τω μεταξύ, η αναστολή της τελομεράσης ως αποτέλεσμα σημαντικές ΕΜΤ όπως φαίνεται από την αλλαγή στον κυτταρικό ταυτόχρονη μορφολογία με μεταβολή των δεικτών EMT. Σταθερά, τα κύτταρα που επιβίωσαν Τ24 /DN868A έδειξαν αυξημένη ικανότητα εξέλιξης

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, βρήκαμε Twist ενεργοποιήθηκε για να μεσολαβήσει EMT στην επιβίωση δείγματα Τ24 /DN868A.

Συμπεράσματα /Σημασία

Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης Τ24 μπορεί να υποβληθεί η τελομεράση για να -ALT-όπως τη μετατροπή και την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου σε προχωρημένο στάδιο μέσω της προώθησης της EMT, παρέχοντας έτσι νέες δυνατή εικόνα για το μηχανισμό αντίστασης στους αναστολείς της τελομεράσης στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Xue Υ, Li L, Zhang D, Wu Κ, Chen Υ, Zeng J, et al. (2011) Twisted Τα επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση Προωθεί εξέλιξη της Surviving καρκίνο της ουροδόχου κύστης Τ24 Κύτταρα με hTERT-δυσλειτουργία. PLoS ONE 6 (11): e27748. doi: 10.1371 /journal.pone.0027748

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Ιούλη 2011? Αποδεκτές: 24, Οκτ 2011? Δημοσιεύθηκε: 15, Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Xue et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το πρόγραμμα του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (NSFC NO. 30772163). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η σταθεροποίηση του τελομερούς είναι κρίσιμη για την άπειρη κυτταρικού πολλαπλασιασμού η οποία είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό όγκων [1]. Τουλάχιστον δύο μηχανισμοί έχουν εντοπιστεί να διατηρήσουν ομοιόσταση των τελομερών σε κύτταρα

in vivo

καθώς και

in vitro

. Πρώτον, τα περισσότερα κύτταρα καρκινώματος χρησιμοποιούν τελομεράση, ένα πολλαπλών υπομονάδων ένζυμο κυτταρικής ριβονουκλεοπρωτεΐνης (αναφέρεται ως μονοπάτι τελομεράσης), για να προστεθεί η τελομερείς επαναλήψεις επάνω άκρα χρωμόσωμα [2]. Η τελομεράση αποτελείται από ένα RNA υπομονάδα, πρωτεΐνη τελομεράσης σχετιζόμενη 1, και τελομεράσης καταλύτη ανάστροφης μεταγραφάσης (hTERT), το οποίο είναι ένα περιοριστικό συστατικό στην ρύθμιση της δραστικότητας τελομεράσης [3]. Δεύτερον, κύτταρα σαρκώματος χρησιμοποιούν μια τελομεράση ανεξάρτητος μηχανισμός ονομάζεται εναλλακτική επιμήκυνση των τελομερών (δηλαδή, ALT οδός) για να διατηρηθεί το χρωμόσωμα άκρα [4]. Η έναρξη της ALT καθορίζεται από την εμφάνιση της μακράς, ετερογενή μήκος των τελομερών, και η εμφάνιση των οργανισμών προμυελοκυτταρική λευχαιμία ALT-συνδέονται (APBs) σε περίπου 10% της ενδιάμεσης πυρήνων [5].

Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι τελομεράσης και ο μηχανισμός ALT μπορούν να συνυπάρξουν σε μερικούς όγκους [4], [6]. Επιπλέον, μια αναστρέψιμη μετατροπή του τελομεράση θετικό σε τελομεράση αρνητικά κύτταρα έχει αναφερθεί σε περιπτώσεις ανθρώπινης τύπου ιού θηλώματος 16 Ε6-αθανατοποιημένων ινοβλαστών [7]. Λόγω της σημασίας της τελομεράσης στο κελί αθανατοποίηση και η έλλειψη έκφρασης της τελομεράσης στα περισσότερα φυσιολογικά σωματικά κύτταρα, οι αναστολείς της τελομεράσης πραγματοποιήθηκε σημαντική υπόσχεση για τη θεραπεία του καρκίνου στο παρελθόν [8]. Όμως, η δυνατότητα της ενεργοποίησης του ALT το οποίο είναι ανθεκτικό σε αναστολείς τελομεράσης περιπλέκει την κατάσταση αυτή [9]. Είναι καλά γνωστό ότι ALT προσδίδει ιδιότητες διαφορετικές από τελομεράσης σε κακοήθεια καρκίνο. Στην περίπτωση του πολύμορφου γλοιοβλαστώματος, ALT συσχετίζονται με μια πρόγνωση καλύτερη ασθενή [10], ενώ μια φτωχή πρόγνωση ανιχνεύθηκε σε ασθενείς με λιποσάρκωμα [11]. Ο λόγος για τη διαφορά της κακοήθειας του καρκίνου παραμένει άπιαστο.

Εκτός από τη διατήρηση των τελομερών, η απόκτηση ενός πλήρως κακοήθη φαινότυπο περιλαμβάνει επίσης την απαίτηση της μετάστασης. Επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη πρωτογενών όγκων προς μεταστάσεων [12]. Οι πρόσφατες παρατηρήσεις δείχνουν ότι η EMT και κυτταρική γήρανση διασταυρώνονται στην εξέλιξη του καρκίνου [13]. Αρκετές διακριτές παράγοντες μεταγραφής, οι οποίες έχουν βρεθεί ότι είναι ικανά να επάγουν προγράμματα EMT, όπως Twist και ZEB1, μπορεί επίσης να προστατεύσει τα κύτταρα από γηρασμό που προκαλείται από τα

ras ογκογονιδίου

[14], [15].

σε αυτή την εργασία, χρησιμοποιήσαμε μια κυρίαρχη αρνητική μετάλλαξη της hTERT να αδρανοποιήσει συστατικά δράση της τελομεράσης (TA) στην ουροδόχο κύστη καρκινικά κύτταρα Τ24. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι μεγάλο μήκος των τελομερών και πολύπλοκη APBs χωρίς το πάνω ρύθμιση TA μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας καλλιέργειας στα καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης

in vitro

. Εντυπωσιακά, μια διασταύρωση μεταξύ της οδού EMT και συντήρηση των τελομερών παρατηρήθηκε ταυτόχρονα με αυξημένη ικανότητα εξέλιξης. Επιπλέον, Twist ενεργοποιήθηκε για να προκαλέσει EMT. Εν ολίγοις, έχουμε περιγράψει ένα νέο μηχανισμό για την απόκτηση των χωροκατακτητικών χαρακτηριστικά και ομοιόσταση των τελομερών μετά την αναστολή της τελομεράσης στα κύτταρα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης Τ24, παρέχοντας έτσι εικόνα αντίστασης του φαρμάκου μετά την αναστολή της τελομεράσης στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πειράματα στα ζώα είναι σύμφωνοι με το

Οδηγίες Φροντίδας ζώων

της Xi’an Jiaotong University και έχει εγκριθεί από την Ethical Review Board (ERB) επιτροπή (το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο του Ιατρικού Κολεγίου, Xi’an Jiaotong Πανεπιστήμιο, Κίνα), και το ID έγκριση του διοικητικού συμβουλίου ηθική είναι SCXK2007-0005.

Αντισώματα

Τα αντισώματα έναντι PML, trf2, Ν-cad, βιμεντίνης , Cytokeratin-18, 19 (CK-18, CK-19), Matrix μεταλλοπρωτεϊνασών-2 (ΜΜΡ-2) και Twist ήταν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).

κυττάρων πολιτισμού

Το ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρική σειρά Τ24 και οστεοσαρκώματος κυτταρική γραμμή U

2ος καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο κατά Dulbecco Eagle που Medium (GIBCO, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS , Sijiqing, Hangzhou, Κίνα) στους 37 ° C με 5% CO

2 σε ένα υγροποιημένο εκκολαπτήριο.

Ίδρυση hTERT

DN868A Σταθερό κύτταρα και παροδική επιμόλυνση Twist

Η κυρίαρχη αρνητική μεταλλαγμένη κατασκεύασμα του hTERT (PCI-neo-hTERT

DN868A) επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας πριν την επιμόλυνση σε καλλιεργημένα κύτταρα Τ24. siRNA για Twist σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από Invitrogen (Σαγκάη, Κίνα). Η αλληλουχία του siTwist ήταν: με νόημα 5′-CACCGGACAAGCUGAGCAAGAUUCACGAAUGAAUCU UGCUCAGCUUGUCC-3 ‘? αντιπληροφοριακό 5’-AAAAGGACAAGCUGAGCAAGAUUCA UUCGUGAAUCUUGCUCAGCUUGUCC-3 ‘. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας LipofectAMINE 2000 (Invitrogen, Inc., Gaithersburg, VA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σταθερά επιμολυσμένα επελέγησαν με 300 μg /ml G418 (Merck, Darmstadt, Germany).

Η τελομεράση Δοκιμασία Δραστηριότητα

δραστικότητα της τελομεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας TRAP-PCR-ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche, Βασιλεία, Ελβετία). Εν συντομία, 2 χ 10

5 κύτταρα εναιωρήθηκαν με ρυθμιστικό λύσης, και το αντίστοιχο ποσό των πυρηνικών υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε ως ένα εκμαγείο για TRAP αντίδραση PCR. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 25 ° C για 30 λεπτά, και στη συνέχεια PCR ενισχύθηκε για 35 κύκλους στους 94 ° C για 30 s δευτερόλεπτα και 59 ° C για 60 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια, το προϊόν αναμίχθηκε με ένα διάλυμα υβριδισμού και επωάστηκε στους 37 ° C για 1 ώρα, ακολουθούμενη από πλύση και επώαση για 30 λεπτά. Στη συνέχεια chromogenized και ανιχνεύθηκε η απορρόφηση.

TRF ανάλυση

DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης DNA (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) και κλάσματα (2 μg) χωνεύεται 2 ώρες με το ένζυμα περιορισμού

Rsa

Ι και

Ηίηί

I. Υποστεί πέψη DNA θραύσματα διαχωρίστηκαν σε πηκτές αγαρόζης 0,8% και κηλιδώθηκε επί θετικά φορτισμένη νάιλον μεμβράνες. θραύσματα περιορισμού των τελομερών αποκαλύφθηκαν μέσω υβριδοποίησης με DIG-σημασμένο ανιχνευτή τελομερών και ανίχνευση χημειοφωταύγειας.

Q-FISH για κυτταρογενετική ανάλυση

Τα χρωμοσώματα από κολκεμίδης κύτταρα σύλληψης παρασκευάστηκαν και ακολούθησε μια τυποποιημένη τεχνική Q-FISH [16] χρησιμοποιώντας το FISH τελομερούς PNA /FITC σετ (Dako Cytomation, USA). Εν συντομία, ανεξάρτητο κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 mmol /L ΚΟΙ και στερεώνονται σύμφωνα με 3:01 μεθανόλη /παγόμορφο οξικό οξύ? Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν διαφάνειες. Τελομερούς ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΡΙΤΟ-συζευγμένο πεπτίδιο νουκλεϊνικό οξύ (ΡΝΑ) ανιχνευτή και αντίθετα με DAPI. Ψηφιακές εικόνες συλλήφθηκαν υπό συνεστιακή μικροσκοπία σε 60 × ή 120 × στόχους.

Διπλή ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA). Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα διαπερατά χρησιμοποιώντας 0.1% Triton διάλυμα Χ-100 και δεσμεύτηκαν με 10% ορό γαϊδάρου. Μετά την επώαση με τα πρωτογενή αντισώματα PML και trf2, αυτά επωάστηκαν με τα φθοριζόντως επισημασμένα δευτερογενή αντισώματα Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555/568 (Invitrogen). Εικόνες συλλέχθηκαν υπό συνεστιακή μικροσκοπία και επεξεργασία χρησιμοποιώντας το Adobe Photoshop 7.0.

κηλίδωση Western

κηλίδωση Western διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, τα δείγματα αναλύθηκαν με 12% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, και ανιχνεύθηκαν με τα πρωτεύοντα αντισώματα και δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας, τότε ανιχνεύεται από το σύστημα χημειοφωταύγειας ανίχνευσης ECL (Amersham, Piscataway, NJ).

εισβολή και δοκιμασία μετανάστευσης

Η ικανότητα εισβολή και η μετανάστευση των κυττάρων Τ24 προσδιορίστηκαν με την δοκιμασία Transwell. Για τη δοκιμασία εισβολής, 50 μι Matrigel (Sigma, Inc.) εφαρμόστηκε σε μm-μεγέθους πόρων των φίλτρων 8 μεμβράνης πολυανθρακικού (Corning, Inc., Corning, ΝΥ), κάτω θάλαμο της συσκευής που περιέχει ϋΜΕΜ με 20% FBS . 5 × 10

3 Τ24, Τ24 /PCI, και το 32

ου πέρασμα του T24 /DN868A (ορίζεται ως επιζών Τ24 /DN868A στην ακόλουθη μελέτη) κύτταρα σπάρθηκαν με ένα μέσο ελεύθερο ορού, και στη συνέχεια επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C. Μετά την επώαση, τα κύτταρα εισέβαλαν που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με Giemsa. Οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν σε τρία τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία (10 ×) ανά μεμβράνη. Η δοκιμασία μετανάστευσης διεξήχθη όπως περιγράφεται για την δοκιμασία εισβολή, χωρίς επικάλυψη Matrigel.

Πρόσφυση

δοκιμασία

Matrigel ήταν αραιώστε με DMEM ελεύθερο ορού 1:20 και επιστρώνεται επί του πυθμένα 96-φρεατίων. 1 × 10

4 κύτταρα ήταν συγκομιδή και σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων με θρεπτικό μέσο ελεύθερο ορού και αφέθηκαν να προσκολληθούν σε Matrigel. Μετά από 6 ώρες, το μέσο με μη συνδεδεμένα κύτταρα απομακρύνθηκε και προστέθηκαν ΜΤΤ. 4 ώρες επώασης αργότερα, DMSO προστέθηκαν για τη διαλυτοποίηση των κρυστάλλων φορμαζάνης και η απορρόφηση (OD) στα 590 nm μετρήθηκε.

αποικίας μαλακού άγαρ Δοκιμασία Σχηματισμού

Η δοκιμασία σχηματισμού αποικιών έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, ένα σύνολο από 500 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 2 ml ϋΜΕΜ που περιέχει 0.3% άγαρ χαμηλού σημείου τήξεως και επικαλύπτει το στρώμα 2 mL βάσης αποτελούμενο από 2 × ϋΜΕΜ και% άγαρ 1,2 (1:01 μικτή) σε πλάκες έξι φρεατίων. Μετά από επώαση στους 37 ° C με 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή για 14 d, οι αποικίες πάνω από 50 κύτταρα μετρήθηκαν.

Ογκογονικότητα Δοκιμασία

σε Vivo

Η

παλιά Τέσσερις έως έξι εβδομάδες γυμνά αθυμικά ποντίκια BALB /C (Σαγκάη Πειραματικό Κέντρο ζώων, Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση ογκογονικότητας. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν, και επαναιωρήθηκαν σε DMEM ελεύθερο ορού σε συγκέντρωση 1 × 10

7 κύτταρα /ml, και 1 × 10

6 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν μετά από 8 εβδομάδες για τη μέτρηση του βάρους του όγκου. Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι αναλύσεις των δεδομένων έγιναν από το λογισμικό SPSS 13.0 για Windows.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε ως η οριακή τιμή για την στατιστική σημαντικότητα

Αποτελέσματα

δραστηριότητα της τελομεράσης στον κλώνο κυττάρων T24 εκφράζει κυρίαρχο-αρνητικό (DN) hTERT

για να αδρανοποιήσουν ιδιοσυστατικά hTERT, ο ανθρώπινος καρκίνος της ουροδόχου κύστης Τ24 κυτταρική γραμμή με υψηλά TA επιμολύνθηκε με πλασμίδιο που κωδικοποιεί DN-hTERT ή κενό φορέα PCI, και ξεχωριστοί κλώνοι κυττάρων απομονώθηκαν με διαλογή G418 για 7 εβδομάδες. ανάλυση TRAP-PCR-ELISA έδειξε ότι σε Τ24 κύτταρα /DN868A στην 3

πέρασμα rd, TA ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα (Εικ. 1). Τρεις κλώνοι με μειωμένη ΤΑ ελέγχθηκαν και ορίζεται ως T24 /DN868A (M1~3). Τα κενά κύτταρα ελέγχου φορέα-επιμολυσμένα ορίστηκαν ως Τ24 /PCI.

δραστηριότητα της τελομεράσης (TA) σε κύτταρα Τ24 επιμολυσμένα με διάφορες κατασκευές προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι (*

P

& lt ? 0,05)

η

δυναμική μήκος των τελομερών σε κυτταρικό κλώνο Τ24 που εκφράζουν DN hTERT

για να απεικονίσει το μήκος των τελομερών των κυττάρων /DN868A Τ24 σε διαφορετικές πέρασμα από προηγούμενες αργότερα, ακολούθησε η ανάλυση TRF. σε αυτές τις τρεις απομονωμένων κλώνων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η μέση μήκος των τελομερών ήταν ~4.3 kb σε 6

ου πέρασμα του T24 /DN868A-M1 και συνεχή βράχυνση των τελομερών παρατηρήθηκε μέχρι την 27

ου πέρασμα. Το φαινόμενο αυτό συνοδεύεται από μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού από 1 πέρασμα /2,5 ανά ημέρα έως 1 πέρασμα /6 ανά ημέρα. Μετά από 27

ου πέρασμα, επιμήκυνση των τελομερών ήταν εμφανίστηκε και πάλι. Ένα μεσαίο μήκος ~ 6 kb με την εμφάνιση ενός επιπλέον ζώνη υψηλού μοριακού βάρους σε -21 kb είχε εμφανιστεί σε 29

ου πέρασμα. Επιπλέον, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων /DN868A Τ24 σε αυτό το στάδιο αυξήθηκε σε 1 πέρασμα /3 ανά ημέρα.

A. TRF ανάλυση των κυττάρων κλώνος Τ24 /DN868A με διαφορετικές πέρασμα. DNA εκχυλίστηκε και πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ηλεκτροφορήσεως επί πηκτώματος όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Ανάλυση μήκος Β τελομερούς από την Q-FISH σε μεμονωμένα χρωμοσώματα μετάφασης από τη γονική και να μετατραπεί υποκλώνοι Τ24 των διαφόρων αποσπασμάτων χρησιμοποιώντας FITC-επισημασμένο ΡΝΑ ανιχνευτών των τελομερών (πράσινο) και αντίθετα με DAPI (μπλε). Η ένταση του πράσινου σημάτων αντιστοιχεί στο μήκος των τελομερών. α) U

2ος κύτταρα? β) Τ24? γ) Τ24 /PCI? d~f) Τ24 /DN868A υποκλώνοι από 8

ου, 24

ου, και 27

ου περάσματα, αντίστοιχα? g και h) T24 /DN868A υποκλώνους του 29

ου και 32

ου πέρασμα, αντίστοιχα (120 ×). Γ TA κυττάρων σε κάθε χρονικό σημείο, όταν η ανάλυση του μήκους των τελομερών έγινε. Ιστογράμματα είναι αντιπροσωπευτικά της ΤΑ στο Τ24 /DN868A έναντι γονική κυτταρική σειρά.

Η

Επιπλέον, βάφονται τα metaphasic χρωμοσώματα των κυττάρων /DN868A Τ24 με την τελομερή ΡΝΑ ανιχνευτή, και τα συνέκριναν με εκείνα των γονέων ή τον έλεγχο κύτταρα στην ίδια δίοδο. Η κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος U

2ος χρησιμοποιήθηκε ως ALT-θετικού ελέγχου (Εικ. 2Β α) [20]. Σύκο. 2Β δείχνει ανάλυση Q-FISH ενός από τους κλώνους. Οι πολύ έντονο πράσινο σήματα στο τέλος του χρωμοσώματος αντιστοιχούσε στις μεγάλες τελομερή. Ένα ανιχνεύσιμο σήμα τελομερών FISH θα μπορούσε να θεωρηθεί σχεδόν σε κάθε άκρο του χρωμοσώματος και στην πλειονότητα των πυρήνων σε ένα διαφορετικό πέρασμα των γονικών κυττάρων Τ24 ή Τ24 κύτταρα ελέγχου /PCI? Επιπλέον, η ένταση αυτών των σημάτων στα δύο δύο κυττάρων ήταν συνεπής (Εικ. 2Β b~c). Μετά την αναστολή της τελομεράσης, αν και η ένταση του πράσινου σήματος σε κάθε άκρο του χρωμοσώματος ή στους πυρήνες ήταν σύμφωνο με την προηγούμενη διέλευση Τ24 /DN868A, τα σήματα των τελομερών μειώνεται σταδιακά με κάθε γύρο κυτταρικής διαίρεσης μέχρι το 27

ου πέρασμα , σε ποιο σημείο, η συνολική ένταση του σήματος φθορισμού ήταν χαμηλότερη (Εικ. 2Β d~f). Μετά από αυτό το πέρασμα, τα σήματα με διαφορετική ένταση που αντιπροσωπεύουν ετερογενείς μήκος των τελομερών παρατηρήθηκαν στο τέλος μερικών χρωμοσωμάτων σε κύτταρα /DN868A Τ24 (Εικ. 2Β g~h). Για τα άλλα δύο δοκιμάστηκαν κλώνοι T24 /DN868A εκφράζουν DN hTERT, και οι δύο έδειξαν ισχυρή αναστολή της τελομεράσης, αλλά μόνο ένας (T24 /DN868A-M3) εμφανίζονται διακυμάνσεις του μήκους των τελομερών ως Σχ. 2Α και Β, ενώ το άλλο (T24 /DN868A-M2) πήγε στο κυτταρικό θάνατο και την απώλεια της καλλιέργειας στο 16

ου πέρασμα.

Για να αναλυθεί η φύση των γεγονότων επιμήκυνση των τελομερών, εξετάσαμε ΤΑ σε κάθε χρονικό σημείο, όταν Q-FISH έγινε σε αυτά τα δύο βιώσιμα κλώνους κυττάρων. Αναστολή της ΤΑ από DN hTERT ήταν ισχυρή και συνεχόμενα (μέχρι το 32

ου πέρασμα), και το ίδιο χαμηλό επίπεδο ΤΑ παρατηρήθηκε διαδοχικά στα κύτταρα Τ24 /DN868A (Σχ. 2C). Επομένως, είναι απίθανο ότι το υπόλοιπο της τελομεράσης είναι η αιτία για την παρατηρούμενη επιμήκυνση των τελομερών.

Κατάσταση APBs στον κλώνο κυττάρων Τ24 που εκφράζουν DN hTERT

APBs συγκρότημα είναι ένα υποσύνολο του προμυελοκυτταρική λευχαιμία (PML) φορείς που περιέχουν τελομερές DNA και τις πρωτεΐνες των τελομερών δέσμευσης όπως TRF1 και trf2. APBs μπορούν να διαδραματίσουν πρωταγωνιστικό ρόλο στο μηχανισμό της ALT, και δεν βρίσκονται σε θανάσιμο ή τελομεράση θετικά κύτταρα [21]. Ως εκ τούτου, μπορούμε να ανιχνεύεται η παρουσία APBs με συν-εντοπισμό της PML με trf2 σε διάφορα κύτταρα Τ24 σε διαφορετικές διόδους σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος U

2ος. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, ο συν-εντοπισμό της PML με trf2 δεν μπορούσε να ανιχνευθεί στην γονική Τ24, κύτταρα Τ24 /PCI, ή νωρίτερα περάσματα των κυττάρων /DN868A Τ24. Ωστόσο, στο 29

ου πέρασμα των κυττάρων /DN868A Τ24, τα κίτρινα αστράφτει εκπροσωπούν APBs ήταν σαφώς παρατηρήθηκαν σε ορισμένα κύτταρα Τ24 /DN868A. Επιπλέον, η αύξηση του συνολικού αριθμού των APBs παρατηρήθηκε στο 32

ου πέρασμα των κυττάρων /DN868A Τ24. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα την παρουσία ενός ALT-όπως μηχανισμός σταθεροποίησης των τελομερών στα υποκλώνο των κυττάρων Τ24 /DN868A από το 29

ου πέρασμα. Να διακρίνει το τέλος του περάσματος των κυττάρων Τ24 /DN868A με τα χαρακτηριστικά της ALT-όπως από την προηγούμενη πέρασμα, όλα τα κύτταρα Τ24 /DN868A μετά την 29

ου πέρασμα κλήθηκαν ως επιζώντα κύτταρα Τ24 /DN868A. Ένας από κάθε επιζών κλώνο κυττάρων στο 32

ου πέρασμα χρησιμοποιήθηκε τυχαία για την ακόλουθη μελέτη.

Διπλή ανάλυση ανοσοφθορισμού για APBs σε hTERT αδρανοποιούνται Τ24 σε διάφορα περάσματα. Κόκκινες κηλίδες αντιπροσωπεύουν PML, πράσινα σημεία αντιπροσωπεύουν trf2, κίτρινο και αστράφτει δείχνουν την colocalizaiton της PML με trf2. APBs απουσίαζε στο Τ24, Τ24 /PCI, και νωρίτερα πέρασμα των κυττάρων /DN868A Τ24, αλλά υπάρχει στα κύτταρα /DN868A T24 στο 29

ου και 32

ου διόδου (60 ×).

Πρόκληση EMT στα κύτταρα Τ24 με την αναστολή της τελομεράσης

T24 είναι ένα E-cadherin ανεπαρκή κυτταρική γραμμή η οποία ακόμη παρουσιάζει επιθηλιακά-όπως μορφολογία [22]. Κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας καλλιέργειας, βρήκαμε ότι τα κύτταρα Τ24 με την αναστολή της τελομεράσης εμφάνισαν σταδιακά μια ατρακτοειδή, πιο επιμήκεις μορφολογία και χαλαρή μεσοκυττάρια κόμβους από το 25

ου πέρασμα ενώ Τ24 ή Τ24 /PCI κύτταρα ήταν ακόμη πολυεδρικές και μεγάλωσε σε ένα ερμητικά συνδεδεμένο τρόπο, η οποία πρότεινε ότι τα κύτταρα μπορεί να έχουν υποβληθεί EMT (Σχ. 4Α). Για να δοκιμάσετε αυτό, λεπτομερή μοριακό χαρακτηρισμό των δεικτών EMT των Τ24, Τ24 /PCI, και διαφορετικές πέρασμα των κυττάρων Τ24 /DN868A (συμπεριλαμβανομένων 25

ου, 27

ου, και 32

ου πέρασμα) ανιχνεύθηκαν από κηλίδα Western. Πράγματι, παρατηρήσαμε την απώλεια των επιθηλιακών δεικτών, συμπεριλαμβανομένων CK18 και CK19 και αυξημένα επίπεδα δεικτών μεσεγχυματικών και πρωτεΐνες εισβολή σχετίζονται όπως Ν-cadherin, βιμεντίνη, και ΜΜΡ-2 σε κύτταρα /DN868A Τ24 από 25

ου διόδου (Σχ . 4Β).

Α. κυτταρική μορφολογία των κυττάρων /DN868A Τ24 Τ24, Τ24 /PCI και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (20 ×). μορφολογία των κυττάρων άλλαξε από πολυγωνικό, επιθηλιακά δομή (άνω) να ατρακτοειδόμορφα, μεσεγχυματικά δομής (κάτω). Β Western ανάλυση κηλίδας του Ν-καδερίνη, βιμεντίνη, ΜΜΡ-2, τα επίπεδα CK18, και CK19 σε Τ24, Τ24 /PCI, και διαφορετικές πέρασμα των κυττάρων /DN868A Τ24. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Μειωμένη πρόσφυση, αυξημένη μετανάστευση, εισβολή, και το σχηματισμό των αποικιών των επιζώντων κυττάρων Τ24 /DN868A

in vitro

Η

Για να διερευνήσουν η πιθανή συμμετοχή της συντήρησης των τελομερών και EMT στην ανάπτυξη του όγκου, χρησιμοποιήσαμε επιζώντα κύτταρα Τ24 /DN868A ως μοντέλο για να εξετάσει την κυτταρική συμπεριφορά τους μετά την μετατροπή αυτή. Φρεατίων αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι τόσο η μετανάστευση και επεμβατικές δυνατότητες των επιζώντων κυττάρων Τ24 /DN868A ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με το γονικό έλεγχο ή κύτταρα (Εικ. 5Α).

Α. Transwell δοκιμασία για την κυτταρική εισβολή και την ενδεχόμενη μετάβαση διεξήχθη. δοκιμασία προσκόλλησης Β για συγκολλητική ικανότητα προσδιορίστηκε. δοκιμασία σχηματισμού αποικίας C. μαλακό άγαρ διεξήχθη. (*

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου).

Η

δοκιμασίας προσκόλλησης, Matrigel χρησιμοποιήθηκε για την επικάλυψη της πλάκας 96 φρεατίων για να μιμούνται την εξωκυττάρια μήτρα (ECM) . Η O.D. αξία για λογαριασμό της κόλλας κυττάρων έδειξαν ότι η συγκολλητική ικανότητα επιβίωσης των κυττάρων T24 /DN868A να Matrigel ήταν σημαντικά μειωμένη (Εικ. 5Β).

Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω ο αντίκτυπος αυτής της μετατροπής στο ικανότητας κλωνισμού των κυττάρων Τ24. Όπως αναμενόταν, η δοκιμασία μαλακού άγαρ απέδειξαν ότι τα κύτταρα που επιβιώνουν Τ24 /DN868A σχηματίζονται ευκρινώς περισσότερες και μεγαλύτερες αποικίες από το γονικό Τ24 και Τ24 ελέγχουν /κύτταρα PCI (Εικ. 5C).

Αυξημένη ογκογένεση των επιζώντων T24 κύτταρα /DN868A

in vivo

η

έχει δειχθεί προηγουμένως ότι η οδός ALT δεν υποκαθιστά τελομεράσης στη διαδικασία της ογκογένεσης

in vivo

[23]? Ως εκ τούτου, ιδρύσαμε το ξενομόσχευμα όγκου με υποδόρια ένεση 1 × 10

6 Τ24, Τ24 /PCI ή επιζώντα κύτταρα Τ24 /DN868A σε 6-8 εβδομάδων άτριχων ποντικών (n = 4 ποντικοί ανά ομάδα). Τα δείγματα όγκων αναλύθηκαν περαιτέρω με Η &? Χρώση Ε. Οι όγκοι αναπτύχθηκαν σε όλα γυμνά ποντίκια 3-4 εβδομάδων μετά την ένεση. Ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα που επιβίωσαν Τ24 /DN868A έδειξε μια έντονη επιτάχυνση της ταχύτητας στο σχηματισμό όγκων (Σχ. 6Α) με ένα μεγαλύτερο μέσο όγκο 383,5 ± 51,08 mm

3 μετά από 8 εβδομάδες μετά την ένεση, ενώ ο μέσος όγκος του όγκου σε ποντικούς που ενέθηκαν με Τ24 ή Τ24 /PCI κυττάρων ήταν 90,3 ± 12,89 και 82,6 ± 10,07 χιλιοστά

3, αντίστοιχα (Εικ. 6Β).

Α. δοκιμασία ανάπτυξης όγκου. Τα κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό γυμνών ποντικών και ο όγκος του όγκου μετρήθηκε την εβδομάδα μέχρι 8 εβδομάδες μετά την ένεση (*

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με Τ24 και Τ24 /PCI κύτταρα). Β Εκπρόσωπος όγκοι απομονώνονται από Τ24, Τ24 /PCI, και επιβιώνουν T24 /DN868A-ένεση γυμνά ποντίκια. Γ HE και ανοσοϊστοχημική χρώση των δεικτών EMT σε όγκους που προέρχονται από Τ24, Τ24 /PCI, και επιβιώνουν κύτταρα Τ24 /DN868A, αντίστοιχα (40 ×).

Η

Η ιστολογική χρώση έδειξε ότι οι όγκοι που προέρχονται από τα σωζόμενα T24 /κυττάρων DN868A ήταν καλώδιο που μοιάζει και πιο επιθετικό, ενώ οι όγκοι που προέρχονται από Τ24 ή Τ24 κύτταρα /PCI συνελήφθησαν και λιγότερο κακοήθη (Εικ. 6C). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι επιζώντα κύτταρα Τ24 /DN868A υποβλήθηκε EMT

in vivo

, ανοσοϊστοχημική εξέταση πραγματοποιήθηκε σε δείγματα όγκων από γυμνά ποντίκια. Ως αποτέλεσμα, αυξημένα επίπεδα Ν-καδερίνης και βιμεντίνης στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα, καθώς και μειωμένα επίπεδα CK18 και CK19 μεταξύ παρατηρήθηκαν κυτταρικές διασυνδέσεις σε ιστούς που προέρχονται από επιβιώσαντα κύτταρα Τ24 /DN868A (Εικ. 6C).

Twist ενεργοποιήθηκε για να μεσολαβήσει EMT στην επιβίωση T24 /DN868A κύτταρα

στη συνέχεια αναρωτηθήκαμε τον μοριακό μηχανισμό με τον οποίο η μετατροπή Τ24 /DN868A θα μπορούσε να διαμορφώσει EMT. Εξετάσαμε πολλούς παράγοντες μεταγραφής, όπως Slug, Twist, σαλιγκάρι, Smad4 και ZEB1 με RT-PCR. Οι αλληλουχίες εκκινητών για RT-PCR φαίνονται στον πίνακα S1. Ως αποτέλεσμα, μόνο Slug και Twist ενισχύθηκαν στα επιζώντα κύτταρα Τ24 /DN868A, ενώ οι άλλοι παράγοντες μεταγραφής δεν δείχνουν προφανώς αλλάξει (Εικ. S1). Από Twist περιλαμβάνει την προώθηση του ΕΜΤ [24], και είναι σε θέση να ξεπεράσει ογκογονίδιο που προκαλείται από γηρασμό σε μια ποικιλία ανθρώπινων κυττάρων [25], εστιάσαμε στην μεταβολή της σε επιζώντα κύτταρα Τ24 /DN868A. Ως αποτέλεσμα, Twist ήταν δραματικά ρυθμίζεται αυξητικά σε αυτά τα κύτταρα και στα δύο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης (Εικ. 7Α και η Εικ. S2). Επιπλέον, ανοσοϊστοχημική χρώση δειγμάτων ιστού εμφάνισε υψηλό ποσοστό χρώσης Twist σε επιζώντα κύτταρα Τ24 /DN868A. Εκτός από καφέ κουκίδες αντιπροσωπεύουν Twist στον πυρήνα της πλειοψηφίας των κυττάρων, ένας αριθμός κυττάρων έδειξε επίσης τόσο κυτταροπλασματική και πυρηνική χρώση (Εικ. 7Β). Για να διερευνήσουν περαιτέρω τη σημασία της Twist σε αυτή τη διαδικασία EMT, εμείς γκρέμισε Twist με siRNA. Αξίζει να σημειωθεί ότι, κάτω-ρύθμιση της Twist οδηγούν σε μειωμένη ικανότητα της μετανάστευσης και της εισβολής σε επιβιώνουν T24 /DN868A κύτταρα (Σχ. 7C και 7D). Εν τω μεταξύ, οι παραλλαγές αυτές ήταν ταυτόχρονη με την ανύψωση του CK18, CK19, και την καταστολή της Ν-καδερίνης, βιμεντίνη και ΜΜΡ-2 σε κύτταρα που επιβίωσαν Τ24 /DN868A (Εικ. 7Ε).

A. RT-PCR και ανάλυση Western blot της έκφρασης Twist σε Τ24, Τ24 /PCI, και επιβιώνουν κύτταρα /DN868A Τ24. B. Η ανίχνευση της έκφρασης Twist με ανοσοϊστοχημική χρώση σε δείγματα γυμνούς ποντικούς όγκων. Γ και Δ Επιζών T24 DN868A κύτταρα /υποβλήθηκαν σε θεραπεία με siRNA ειδικό για να στρίψει, και αναλύθηκαν για την εισβολή και την ικανότητά της μετανάστευσης. ανάλυση κηλίδος Ε ​​Western της EMT που σχετίζονται πρωτεΐνες.

Η

Συζήτηση

Κατά τη διάρκεια της κακοήθη εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων, τη συντήρηση του μήκους των τελομερών αποτελεί κρίσιμη προϋπόθεση για την απαθανάτιση τους [26], η οποία επιτυγχάνεται με τη δράση της τελομεράσης (ΤΑ) ή εναλλακτικά επιμήκυνση των τελομερών (ALT) [27]. Η αναστολή της TA θεωρείται ως δυνητικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου? Ωστόσο, η κατάσταση περιπλέκεται από την ύπαρξη του μηχανισμού ALT. Η τρέχουσα κατανόηση της κινητικής μήκος των τελομερών σε απουσία ΤΑ και την επακόλουθη δέσμευση της οδού ALT βασίζεται κυρίως σε παράταιρα επισκευή ανεπάρκεια ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου και του λάρυγγα κύτταρα καρκινικής κυτταρικής σειράς Hep-2 [28], [29]. Στην εργασία αυτή, DN hTERT χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει λειτουργικά TA στην κύστη Τ24 καρκίνου, 5637, και κυτταρικές γραμμές 253J, και προσδιορίστηκε η αλληλουχία αλλοίωση μήκους του τελομερούς προσδιορίστηκε. Δυστυχώς, μετά την διαμόλυνση, τα περισσότερα από αυτές τις κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως πήγε στο θάνατο, και όχι μόνο κλώνος κύτταρο θα μπορούσε να καλλιεργηθούν και ανακαλλιεργήθηκαν εκτός για τα κύτταρα Τ24. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι αν και ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων Τ24 με την αναστολή της τελομεράσης ήταν καθυστερημένος και το μήκος των τελομερών μειώθηκε σε παλαιότερες πέρασμα, τα χαρακτηριστικά που σχετίζονται με ALT-όπως μονοπάτι παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας καλλιέργειας. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι το συνολικό επίπεδο της PML και σύνθετων MRN αυξημένη προφανώς, δεδομένου ότι περισσότερες εστίες MRE11, RAD50 και NBS1 παρατηρήθηκαν στον πυρήνα στον επιζώντα T24 /DN868A κύτταρα (Εικ. S3). Ενώ αναστολή της τελομεράσης σαν αποτέλεσμα είτε τον κυτταρικό θάνατο ή την επανεμφάνιση TA όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [30], [31], παρούσα μελέτη μας αποκαλύπτει καμία προφανή πάνω ρύθμιση τελομεράσης σε κάθε πέρασμα με βάση την Q-FISH και δοκιμασία TRF, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι απίθανο ότι απομένει τελομεράση είναι η κύρια αιτία για την παρατηρούμενη επιμήκυνση των τελομερών στα κύτταρα /DN868A Τ24. Αντ ‘αυτού, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ALT-όπως μηχανισμός θα μπορούσε να είναι ο εναλλακτικός τρόπος με τον οποίο ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης κύτταρα να ξεφύγουν από την αναστολή της τελομεράσης.

Η ενεργοποίηση της ALT αποτελέσματα από σύνολα γενετικές αλλαγές που έχουν όγκο συγκεκριμένο τύπο, και πολλοί παράγοντες συμβάλλουν στην επιλογή αυτού του μηχανισμού για τη συντήρηση των τελομερών. κύτταρα Τ24 εκφράζουν μία μεταλλαγμένη ρ53 ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη και ένα πολύ χαμηλό επίπεδο MSH6 [32], [33], τα οποία θεωρούνται ως παράγοντες που συμβάλλουν για την ενεργοποίηση ALT [34], [35]. Αυτό μπορεί να εξηγήσει εν μέρει γιατί μεταξύ πολλών καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές, μόνο T24 δραπέτευσε από το στάδιο των κυττάρων κρίσης και συνέχισε να είναι ζωντανός.

Αν και ALT σε όγκους δεν έχει μελετηθεί εκτενώς, τώρα καθίσταται σαφές ότι τα κύτταρα του επιθηλιακής προέλευσης διατηρήσουν τελομερή τους μέσω της οδού της τελομεράσης, ενώ ALT είναι συχνότερα παρόν σε όγκους μεσεγχυματικής προέλευσης [5]. EMT είναι μια διαδικασία κατά την οποία τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν επιθηλιακά φαινότυπο τους και να αποκτήσουν νέα χαρακτηριστικά του μεσέγχυμα [36]. Είναι ενδιαφέρον, κυτταρική γήρανση μπορεί να παρακαμφθεί κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης του ΕΜΤ που συνοδεύει συνήθως την εξέλιξη του όγκου [15]. Σε καταρρακτώδης επιθηλιακών κυττάρων του φακού σκύλου, η διαδικασία της ΕΜΤ περιλαμβάνει επίσης TERT [37]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε παρατηρήσει ότι η μορφολογία των κυττάρων Τ24 hTERT-αδρανοποιηθεί έδειξαν μια σταδιακή αλλαγή μεσεγχυματικών από 25

ου πέρασμα κατά τη συνεπή κουλτούρα, όπως αποδεικνύεται από άξονα το σχήμα και την απώλεια των μεσοκυττάρια κόμβους. Μειωμένη επιθηλιακά δείκτες και αυξημένη δείκτες μεσεγχυματικών εκτέθηκαν στις δύο επιβιώσαντα κύτταρα Τ24 /DN868A πριν από την επί σειρά ALT-όπως χαρακτηριστικά, και τα δείγματα όγκων που προέρχονται από επιβιώσαντα κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η EMT ενεργοποιήθηκε για να παρακάμψει κυτταρική γήρανση, όπως φαίνεται σε άλλες δημοσιεύσεις (13 , 15). Με βάση το διαφορετικό χρόνο της APBs εμφάνιση και το σχηματισμό EMT, πολύ πιθανό, τα μονοπάτια που οδηγούν σε αυτές τις αλλαγές μπορεί να είναι διαφορετική.

Η τελομεράση και ALT πιστεύεται ότι είναι λειτουργικά άδικη προτρέποντας την εξέλιξη του όγκου, αλλά παραμένει αντιφατική η οποία οδός είναι πιο επιθετική. Ορισμένες μελέτες δείχνουν ότι η οδός ALT, τουλάχιστον σε μερικές κυτταρικές γραμμές, δεν υποκαθιστά λειτουργικά τελομεράσης σε σχέση με ογκογονικότητα και μεταστατικών βλαβών [38]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την ικανότητα εξέλιξης των επιζώντων κυττάρων Τ24 /DN868A. Σε σύγκριση με εκείνες του γονικού T24 ή κύτταρα ελέγχου, κινητικότητα, εισβολή, και την ικανότητα σχηματισμού κλώνου

in vitro

και ογκογονικότητα

in vivo

επιβιώνουν T24 κύτταρα /DN868A ενισχύθηκαν σημαντικά, ενώ συγκολλητική ικανότητα του επιζώντα κύτταρα Τ24 /DN868A

in vitro

ανεστάλη, παρέχοντας έτσι ισχυρή υποστήριξη που αυτό το πλήρως κακοήθη φαινότυπο πυροδοτήθηκε σε επιζώντα κύτταρα Τ24 /DN868A με EMT.

Η βασική έλικα-βρόχος-έλικα ( bHLH) παράγων μεταγραφής Twist είναι ταχύτερη της EMT [39], και η υπερέκφραση του είναι συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο και την ποιότητα των ανθρώπινων όγκων της ουροδόχου κύστης [40]. Στο πλαίσιο της καρκινογένεσης, Twist μπορεί να καταστείλει ταυτόχρονα την απόκριση γήρανση και επάγουν ΕΜΤ [41]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι Twist υπερεκφράζεται σε κύτταρα που επιβίωσαν Τ24 /DN868A από 24

ου πέρασμα, και περαιτέρω συγκεντρωτικά σε καρκινικούς ιστούς των ζώων της ουροδόχου κύστης. Συνέπεια, η εξάντληση των Twist μειώνει την ικανότητα εξέλιξης των επιζώντων T24 /DN868A και προκαλεί μεσεγχυματικών-to-επιθηλιακά (ΚΟΑ) -όπως αλλαγή. Ως εκ τούτου, η ενεργοποίηση της EMT υπό αναστολή της τελομεράσης απαιτεί τη συνεργασία του Twist-μονοπάτι σηματοδότησης στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Στο σύνολό τους, δείχνουν τα δεδομένα μας, που χαρακτηριστικά που σχετίζονται με ALT-όπως μηχανισμός και EMT θα μπορούσε να προκληθεί μετά την αναστολή της τελομεράσης στην