Αφηρημένο

Forkhead κουτί M1 (FOXM1) είναι ένας πολλαπλασιασμός που σχετίζεται μεταγραφικού παράγοντα σημαντικό για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Πολυάριθμες μελέτες έχουν τεκμηριώσει ότι FOXM1 έχει πολλαπλές λειτουργίες στην ογκογένεση και τα αυξημένα επίπεδα της συχνά συνδέεται με την εξέλιξη του καρκίνου. Εδώ, χαρακτηριζόμενη από το ρόλο του ERK σηματοδότησης /FOXM1 στη μεσολάβηση του μεταστατικού δυναμικού των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. αναλύσεις ανοσοϊστοχημική (IHC), ανοσοαποτύπωση και ημι-ποσοτική RT-PCR βρέθηκε ότι τόσο φωσφο-ΕΚΚ και FOXM1 ήταν συχνά υπερεκφράζεται σε καρκίνους των ωοθηκών. Περιέργως, υπερεκφρασμένης φωσφο-ΕΚΚ (

σ

& lt? 0.001) και FOXM1 (

σ

& lt? 0.001) συσχετίζονταν σημαντικά με υψηλής ποιότητας όγκους των ωοθηκών με την επιθετική συμπεριφορά, όπως η μετάσταση στους λεμφαδένες (5 από 6). Επιπλέον, οι εκφράσεις της φωσφο-ΕΚΚ και FOXM1 είχε σημαντικά θετική συσχέτιση (

σ

& lt? 0.001). Λειτουργικά, έκτοπη έκφραση της FOXM1B αξιόλογα αυξημένη κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή, ενώ FOXM1C όχι μόνο αύξησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά επίσης προωθούνται κυτταρική μετανάστευση /εισβολή. Αντιστρόφως, η αναστολή της έκφρασης FOXM1 είτε θειοστρεπτόνη ή U0126 μπορούσε σημαντικά εξασθενίζουν FOXM1 μεσολάβηση ογκογόνο ικανότητες. Ωστόσο, η ρύθμιση προς τα κάτω των FOXM1 είτε θειοστρεπτόνη ή U0126 απαιτούσε την παρουσία του ρ53 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Συλλογικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση της FOXM1 ενδέχεται να προκύψουν από την ουσιαστικά δραστική ΕΚΚ που παρέχει τις μεταστατικό δυνατότητες στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Η απομείωση των μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων με αναστολείς FOXM1 υπογραμμίζει θεραπευτική αξία του σε προχωρημένους όγκους ωοθηκών

Παράθεση:. Lok GTM, Chan DW, Liu VWS, Hui WWY, Leung THY, Γιάο KM, et al. (2011) ανώμαλη ενεργοποίηση της ERK /FOXM1 Σηματοδοσίας Cascade Πυροδοτεί την κυττάρων Μετανάστευση /Εισβολή στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (8): e23790. doi: 10.1371 /journal.pone.0023790

Επιμέλεια: Μαρία Γ Castro, το Πανεπιστήμιο του Michigan, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Δεκεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 26 Ιουλίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 του Αυγ 2011

Copyright: © 2011 Lok et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Φιλανθρωπικό Ίδρυμα Wong Cheuk Εκείνη. Η υποστήριξη αυτή είναι από ιδιωτικές δωρεές, και την ιστοσελίδα κανενός χρηματοδότη είναι διαθέσιμο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι ένα από τα πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια σε όλο τον κόσμο. Λόγω των μη ειδικά συμπτώματα, οι περισσότερες των περιπτώσεων καρκίνου των ωοθηκών παρουσιάζονται με προχωρημένο στάδιο της νόσου και να συνδεθούν με υψηλό ποσοστό θνησιμότητας [1]. Στο προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών, τα καρκινικά κύτταρα είναι ιδιαίτερα επεμβατική και η επακόλουθη μετάσταση καρκίνου οδηγεί στο θάνατο [2]. Τόσο η κυτταρική μετανάστευση και εισβολή συμβάλλουν τα μεταστατική ικανότητα των κυττάρων του όγκου και το γενετικό μηχανισμό που ρυθμίζει τη μετάσταση παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Συνεπώς, είναι υψίστης σημασίας για τον προσδιορισμό μοριακών μεσολαβητές παρέχουν το μεταστατικό δυναμικό των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα που μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες όγκου στην πρόβλεψη κίνδυνο εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών.

Forkhead Box Μ1 (FOXM1) είναι ένα τυπικό μεταγραφή παράγοντας που ανήκει στην οικογένεια Forkhead Box [3]. FOXM1 είναι γνωστή για κρίσιμο ρόλο της στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με τη ρύθμιση της G1 /S και G2 /M φάσεις μετάβασης του κυτταρικού κύκλου και την εξασφάλιση της ορθής εκτέλεσης του μιτωτικής κυτταρικής διαίρεσης [3], [4], [5]. Ωστόσο, η τοποθέτηση επιβεβαιώνουν την σχέση μεταξύ παρεκκλίνουσα έκφραση FOXM1 και ανθρώπινων καρκινωμάτων όπως καρκίνου του παγκρέατος, καρκινωμάτων των βασικών κυττάρων, γλοιοβλαστώματα και τον καρκίνο του τραχήλου [6], [7], [8], [9]. Το πιο σημαντικό, η αυξημένη έκφραση του FOXM1 έχει αξιοσημείωτη συσχέτιση με τις προοδευτικές φάσεις πολυάριθμων ανθρώπινων καρκίνων [6], [9], [10], [11], [12]. Ως εκ τούτου, FOXM1 όχι μόνο προάγει την ογκογένεση με τη διάθεση πολλαπλασιαστική ικανότητα και οδηγώντας σε ανεξέλεγκτη κυτταρική διαίρεση στην πρώιμη περίοδο της ανάπτυξης του καρκίνου, αλλά ενισχύει και άλλες ογκογόνο συμπεριφορές σε άλλα στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου [12], [13], [14]. Μέχρι σήμερα, αρκετές σειρές αποδείξεων έχουν δείξει ότι FOXM1 θα μπορούσαν να ενισχύσουν την αγγειογένεση σε κύτταρα γλοιώματος [15], ανεξάρτητη από προσκόλληση ικανότητα ανάπτυξης σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα [6], η ικανότητα ανάπτυξης του όγκου των κυττάρων γλοιώματος [7] και η μετάσταση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος κυττάρων σε άτριχων ποντικών [16], υπονοώντας τους διαφορετικούς ρόλους των FOXM1 στην ογκογένεση. Πρόσφατα, ο καρκίνος Genome Atlas Δίκτυο Έρευνας χρησιμοποίησε μια πιθανολογική γραφικό μοντέλο (ΝΕΑ) να αποδείξει ότι η σηματοδότηση FOXM1 είναι κριτικά σχετίζεται με ορώδες παθοφυσιολογία του καρκίνου των ωοθηκών [17]. Ωστόσο, η κατάσταση έκφρασης και λειτουργικούς ρόλους των FOXM1 στον καρκίνο των ωοθηκών, ιδιαίτερα στην κυτταρική μετανάστευση /εισβολή είναι σε μεγάλο βαθμό θεωρητική. Αυτό τονίζει την επείγουσα ανάγκη να οριοθετηθούν το μοριακό μηχανισμό βασίζεται η εξέλιξη του καρκίνου, έτσι ώστε να αυξηθεί το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών.

Συστατική ενεργοποίηση της σηματοδότησης ERK συνδέεται συνήθως με νεοπλασματικό μετασχηματισμό όπως η ανεξέλεγκτη κυτταρική ανάπτυξη από τόνωση διαδρομή κυτταρικής επιβίωσης και αύξηση της κυτταρικής κινητικότητας [18], [19], [20], [21]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι ERK δρα ανάντη του FOXM1 και η φωσφορυλίωση της ERK FOXM1 από απαιτούνται για την μετατόπιση πυρήνα και την επακόλουθη διενεργοποίησης [22]. Επιπλέον, FOXM1 έχει δειχθεί ότι είναι ένας από τους τελεστές ERK σε καρκίνωμα ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού και του καρκίνου του μαστού [23], [24]. Ωστόσο, η λειτουργία της ERK /FOXM1 καταρράκτη στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης σηματοδότησης /εισβολές δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί σαφώς.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε κατ ‘αρχάς ανέλυσε την κατάσταση έκφρασης και κλινικοπαθολογικών συσχέτιση των FOXM1 στον καρκίνο των ωοθηκών. Αρκετές ογκογόνο δοκιμασίες διεξήχθησαν σε μοντέλα με καρκίνο των ωοθηκών κυττάρων χρησιμοποιώντας gain- και απώλειας λειτουργίας του FOXM1 μέσω εκτελεστεί έκφραση FOXM1 ή αναστολή της ενδογενούς FOXM1 με θειοστρεπτόνη ή U0126. Δώσαμε, επίσης, τα στοιχεία που δείχνουν τη σημασία της κατάστασης p53 στη χρήση των αναστολέων FOXM1. Επιπλέον, παρείχε την πρώτη

in vitro

απόδειξη της ERK /FOXM1 καταρράκτη σηματοδότησης για την προώθηση της κυτταρικής μετανάστευσης /εισβολής σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Αυτό παρέχει ένα ενθαρρυντικό στόχο για την καταπολέμηση προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών.

Αποτελέσματα

FOXM1 είναι υπερ-εκφράζεται και συσχετίζεται με pERK έκφρασης και υψηλής ποιότητας υπότυπο του καρκίνου των ωοθηκών

Για να μελετήσουμε η σημασία της έκφρασης FOXM1 στην ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών, η ανάλυση IHC σε μια εμπορική σειρά ιστού της 97 δείγματα ωοθηκικού ιστού, συμπεριλαμβανομένων των 2 κανονικό, 2 καλοήθη, 1 οριακά cystademoma και 96 δείγματα κακοήθους όγκου διεξήχθη. υψηλή έκφραση FOXM1 συσχετίστηκε σημαντικά με όγκους υψηλού βαθμού (Grade 3) (

P

& lt? 0.001), στην οποία 73,33% του Βαθμού 3 όγκων περιπτώσεις παρουσίασαν υπερέκφραση του FOXM1, ενώ το 68% των τάξεων 1 και 2 όγκοι περιπτώσεις έδειξαν χαμηλή έκφραση του FOXM1 (Πίνακας 1). Αναφορικά με τον υπότυπο του όγκου, η έκφραση του FOXM1 είχε υψηλή συσχέτιση με αδενοκαρκίνωμα endometriod (

P

& lt? 0,05), στην οποία 74.07% των περιπτώσεων αποδεικνύεται υπερ-έκφραση του FOXM1 (Πίνακας 1). Επιπλέον, 5 από τις 6 περιπτώσεις με μετάσταση λεμφαδένα έδειξε υπερ-έκφραση του FOXM1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρά το περιορισμένο μέγεθος του δείγματος, θα μπορούσε να αποτελέσει σημείο αναφοράς για μια συσχέτιση μεταξύ FOXM1 και μακρινή μετάσταση. Εκτός αυτού, μια αξιοσημείωτη συσχέτιση ανιχνεύθηκε μεταξύ του πάνω ρύθμιση τόσο FOXM1 και pERK (

P

& lt? 0.001) (Πίνακας 1). Παρόμοια με FOXM1, μια σημαντική συσχέτιση ανιχνεύθηκε μεταξύ της έκφρασης pERK και όγκων υψηλού βαθμού (

P

& lt? 0.001), στην οποία 66.67% του βαθμού 3 όγκων έδειξαν υψηλή έκφραση pERK (Πίνακας 2). Συγκλίνουσες αδύναμη σε πολύ έντονη χρώση των pERK και FOXM1 παρατηρήθηκαν επίσης από οριακά cystademoma στον βαθμό 3 όγκου, εμπλέκοντας τη σημασία των δύο πρωτεϊνών στην πρόοδο του όγκου του καρκίνου των ωοθηκών (σχ. 1Α).

(Α) Αντιπροσωπευτική IHC έδειξε τα ανοσοδραστικότητα των FOXM1 και pERK σε οριακά, Grade 1, Grade 2 και της κατηγορίας 3 όγκου σε σειρά καρκίνου των ωοθηκών ιστού (OVC1021) (x20). Αύξηση χρώση τόσο FOXM1 και pERK παρατηρήθηκε μαζί με την εξέλιξη του καρκίνου η οποία εμπλέκει το δυναμικό τους ρόλους τους στην ογκογένεση. (Β) κηλίδωση Western έδειξαν τις εκφράσεις του pERK, ERK και FOXM1 σε σωλήνες και κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών. (C) σε πραγματικό χρόνο ανάλυση QPCR αποκάλυψε τις εκφράσεις των ισομορφών FOXM1?

FOXM1B

και

FOXM1C

σε σωλήνες και κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών.

FOXM1A

είχε παραμεληθεί σε αυτό το πείραμα, επειδή αναφέρθηκε ως μεταγραφικά ανενεργοί.

Η

Η

Για την μελέτη κυτταρικών σειρών, οι εκφράσεις του pERK και FOXM1 έδειξε επίσης ένας καλός συσχετισμός σε ένα πάνελ του καρκίνου των ωοθηκών και κυτταρικές σειρές σωλήνων. Και οι δύο πρωτεΐνες υψηλής έκφρασης σε καρκινικό κύτταρο γραμμές, ειδικά σε OVCAR3, SKOV3, OVCA429 και A2780cp, ενώ έδειξε χαμηλότερη εκφράσεις σε ΣΩΛΗΝΑ κυτταρικές σειρές (Εικ. 1Β). Ομοίως, σε πραγματικό χρόνο ανάλυση QPCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές σύμφωνα με την προηγούμενη έκθεση [12] αποκάλυψε ότι τόσο η

FOXM1B

(27 έως 250 φορές) και

FOXM1C

(25-172 φορές) ήταν μέχρι -regulated σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών σε σύγκριση με μάνικα κυτταρικές γραμμές (Σχ.1 Γ). Αυτό το αποτέλεσμα ήταν συνεπές με τα ευρήματα της ανάλυσης στυπώματος Western και επίσης έδειξε ότι δεν υπήρχε διαφορά από τα μοτίβα έκφρασης μεταξύ δύο ισομορφών σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι και οι δύο δραστικότητα ERK και έκφραση FOXM1 είναι επάνω ρυθμισμένη και συσχετίζονται θετικά σε καρκίνους των ωοθηκών, ιδιαίτερα σε επιθετικούς όγκους υψηλής ποιότητας, το οποίο εμπλέκει την κοινή χρήση μιας κοινής οδού σε εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών.

FOXM1 προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων /εισβολή

Δεδομένου ότι οι όγκοι υψηλής ποιότητας ήταν ιδιαίτερα πολλαπλασιαστικές και μεταστατικό, εμείς αιτιολογημένη ότι FOXM1 παίζει κάποιο ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής κινητικότητας και την εισβολή. Για την ανίχνευση των ογκογόνο ρόλους των FOXM1 στον καρκίνο των ωοθηκών, αξιολογήσαμε τις λειτουργικές συνέπειες των δύο ενεργών ισομορφών FOXM1, FOXM1B και FOXM1C, επί A2780cp και OVCA433 κύτταρα (Σχ. 2Α). Συνεπής με προηγούμενες αναφορές [14], [25], FOXM1C θα μπορούσε να αυξήσει την ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε A2780cp (

P

& lt? 0.005) και OVCA433 (

P

= 0,006) ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, ενώ FOXM1B έδειξε μόνο ελαφρά αυξημένη επίδραση (Εικ. 2Α). Από την άλλη πλευρά, έκτοπη έκφραση της FOXM1B και FOXM1C θα μπορούσε να προωθήσει το κλείσιμο τραύματος σε ταχύτερη A2780cp και OVCA433 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με προσδιορισμό επούλωσης πληγών (Σχ. 2Β). Με επικοινωνούντα δοκιμασίες μετανάστευσης /εισβολής, εισαγωγή FOXM1B και FOXM1C παρουσίασαν επίσης σημαντική αύξηση της μετανάστευσης των κυττάρων (

P

& lt? 0,05 σε A2780cp και

P

& lt? 0.005 σε OVCA433). (Εικ 2C ) και την κυτταρική εισβολή (

P

& lt? 0,05 σε A2780cp και

P

& lt?. 0.01 σε OVCA433) (Εικ 2Δ) ικανότητες A2780cp και OVCA433 κυττάρων σε σύγκριση με τους μάρτυρες φορέα. Είναι ενδιαφέρον, FOXM1B είχαν σχετικά ισχυρότερη επίδραση στην προώθηση της μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής σε σύγκριση με FOXM1C. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα προσδίδουν ότι FOXM1 ισομορφές θα μπορούσαν να προωθήσουν διαφορικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μετανάστευση /την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

(Α) ΧΤΤ δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων έδειξαν ότι FOXM1C μπορούσε αξιοσημείωτα να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του σε A2780cp (*

P

& lt? 0.005) και OVCA433 (**

P

= 0,006) ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, ενώ FOXM1B μόλις είχε ελαφρώς αποτέλεσμα. Κηλίδωση Western έδειξε τις εκφράσεις του FOXM1B (1Β) και FOXM1C (1C) σε A2780cp και OVCA433 κύτταρα με τη χρήση αντι-FOXM1 (Κ19). Ο κενός φορέας χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (V). (Β) Πληγή επούλωσης δοκιμασία έδειξαν ταχύτερη πληγή ποσοστό κλεισίματος των FOXM1B ή FOXM1C έκτοπη έκφραση A2780cp (*

P

& lt? 0,05) και OVCA433 (**

P

& lt? 0,01) κύτταρα σε σύγκριση με φορέα ελέγχου (*

P

& lt? 0,05). (C) δοκιμασία μετανάστευσης Transwell και το ιστόγραμμα έδειξε υψηλότερο ποσοστό μεταναστευτικών στην FOXM1B και FOXM1C έκτοπη έκφραση κύτταρα A2780cp (*

P

& lt? 0,05) και OVCA433 (*

P

& lt? 0.005 ) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα τους (V). (D) δοκιμασία Transwell κυττάρων εισβολή και το ιστόγραμμα έδειξε υψηλότερο ποσοστό εισβολής μέσω Matrigel επικαλυμμένο με μεμβράνη στην FOXM1B και FOXM1C έκτοπη έκφραση κύτταρα A2780cp (*

P

& lt? 0,05) και OVCA433 (*

P

& lt? 0,01) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα τους (V). Τα παραπάνω πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές ανεξάρτητα και το αποτέλεσμα παραστάθηκε γραφικά.

Η

Η αποτελεσματική αναστολή της έκφρασης FOXM1 με θειοστρεπτόνη απαιτεί ρ53

Η θειαζόλη αντιβιοτικό θειοστρεπτόνη μπορούν να αναστείλουν ειδικά την έκφραση του γονιδίου σε FOXM1 επίπεδο υποκινητή σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [26], και ως εκ τούτου χρησιμοποιήθηκε για να καταστρέφουν την έκφραση FOXM1 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Κατά θειοστρεπτόνης θεραπεία, παρατηρήσαμε διαφορετικές αποκρίσεις του FOXM1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών που φέρουν διαφορετικές καταστάσεις p53 γονοτυπικής: OVCA433 (ρ53 άγριου τύπου), A2780cp (ρ53 μεταλλαγμένη) και SKOV3 (διαγράφονται p53). OVCA433 και A2780cp κύτταρα έδειξαν έντονη πτώση της έκφρασης FOXM1 με χρονο και δοσολογία με τρόπο που εξαρτάται, όπως επίσης και μία αυξημένη έκφραση του p53 σε υψηλότερη δόση (20 μΜ) του θειοστρεπτόνη (Εικ. 3Α). Από την άλλη πλευρά, SKOV3 ήταν ανθεκτική σε θειοστρεπτόνη και έκφραση FOXM1 διατηρήθηκε σε 10, 30 και 50 μΜ. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ρ53 μπορεί να εμπλέκεται στον μηχανισμό θειοστρεπτόνη υποκριτική. Λαμβάνοντας υπόψη τις πολύ απέναντι τους ρόλους των p53 και FOXM1 στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και τις αρνητικές επιπτώσεις της p53 στην έκφραση FOXM1 φαίνεται στο προηγούμενο αποτέλεσμα μικρο-array [5], [27], [28], [29], [30], που αξιολόγησε την έκφραση του FOXM1 κατόπιν μεταβολής της έκφρασης p53 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Παροδική επιμόλυνση p53 μειωθεί εντυπωσιακά FOXM1 όχι μόνο σε επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ. 3Β), αλλά και σε επίπεδο mRNA (Σχ. 3C) σε OVCA433, A2780cp και SKOV3. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ρ53 ρυθμίζει αρνητικά τόσο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του FOXM1 και ρ53 είναι απαραίτητη για την θειοστρεπτόνη να ασκήσει την αναστολή στην έκφραση FOXM1 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

(Α) Κηλίδωση Western αποκάλυψε την προς τα κάτω ρύθμιση του FOXM1 και αυξητική ρύθμιση της ρ53 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών? OVCA433 και A2780cp, αλλά όχι σε SKOV3 κατά την κατεργασία θειοστρεπτόνης υπό διάφορες δόσεις και χρονικά διαστήματα. (Β) κηλίδωση Western έδειξε ότι παροδική επιμόλυνση με ρ53 θα μπορούσε να καταστείλει έκφραση FOXM1 σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα (OVCA433, A2780cp και SKOV3). (C) σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση των

FOXM1

μεταγραφές από την παροδική επιμόλυνση του p53.

Η

κάτω ρύθμιση των FOXM1 παρεμποδίζει την κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή

Υποθέσαμε ότι θειοστρεπτόνη μπορεί να καταστέλλουν την μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων /εισβολή των ωοθηκών αναστέλλοντας την έκφραση του FOXM1. Από θειοστρεπτόνης θα μπορούσε να επάγει αποπτωτικό αποτέλεσμα σε καρκινικά κύτταρα [26], δοκιμασίες ΧΤΤ διεξήχθησαν τρεις φορές για να αποκλείσει τον παράγοντα της μειωμένης κυτταρικής βιωσιμότητας που μπορούν να επηρεάσουν την ακρίβεια της χρήσης του τραύματος χρόνος κλεισίματος για την αξιολόγηση της μετανάστευσης των κυττάρων. Πράγματι, η κυτταρική βιωσιμότητα των ανωτέρω κυτταρικών σειρών δεν έδειξε σημαντικές μεταβολές κατά την κατεργασία του δοσολογικού εύρους από 0 έως 10 μΜ θειοστρεπτόνη (Εικ. S1). Κατά την επεξεργασία με θειοστρεπτόνη, OVCA433 κύτταρα έδειξαν προφανή καταστολή της κυτταρικής μετανάστευσης, με ~ 50% μείωση του τραύματος ποσοστό κλεισίματος σε σχέση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα σε δοκιμασία επούλωσης πληγών (

P

& lt? 0,05). (Σχ 4Α ). Παρόμοια ανασταλτική επίδραση στην κυτταρική μετανάστευση παρατηρήθηκε σε A2780cp κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, η θεραπεία για SKOV3 δεν έδειξε σημαντική επίδραση στην κυτταρική μεταναστευτικών αναστολής (Εικ. S2). Επιπλέον, η θεραπεία 10 μΜ θειοστρεπτόνη επί OVCA433 επίσης δραματικά μειωμένη μετανάστευση περίπου 37% των κυττάρων (

P

& lt? 0,05), και το 75% την εισβολή των κυττάρων (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση με τις ικανότητες με τους ελέγχους σε δοκιμασία Matrigel (σχ. 4Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι FOXM1 ρυθμίζει σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων /εισβολή σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

(Α) πληγών δοκιμασία επούλωσης έδειξαν χαμηλότερο ρυθμό κλεισίματος τραύματος της OVCA433 κυττάρων θειοστρεπτόνη αντιμετωπίζονται ως σύγκριση με μη επεξεργασμένα έλεγχο (*

P

& lt? 0,05). (Β) Transwell δοκιμασία της μετανάστευσης και το ιστόγραμμα έδειξε σημαντικά χαμηλότερο αριθμό των μεταναστευτικών κυττάρων μέσω της Matrigel επικαλυμμένο με μεμβράνη στην OVCA433 κύτταρα FOXM1 εξαντλημένο από τον έλεγχο (*

P

& lt? 0,05) (

ανώτερο

). Φρεατίων δοκιμασία κυττάρων εισβολή και το ιστόγραμμα έδειξε χαμηλότερο ποσοστό εισβολή στο OVCA433 κύτταρα FOXM1 εξαντλημένο παρακάτω θειοστρεπτόνης θεραπείας, σε σύγκριση με τον έλεγχο (*

P

& lt? 0,05) (

κάτω

). (C) Κηλίδωση Western αποκάλυψε την προς τα κάτω ρύθμιση FOXM1 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών (OVCA433 και Ον2008) κατά την επεξεργασία με U0126 για διάφορα χρονικά διαστήματα. (D) τυλιγμένο δοκιμασία επούλωσης αποδειχθεί χαμηλότερο ρυθμό κλεισίματος τραύματος της U0126 επεξεργασμένου OVCA433 κύτταρα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο μάρτυρα (*

P

& lt? 0,05). Τρία ανεξάρτητα πειράματα και το αποτέλεσμα καταγράφεται.

Η

δραστηριότητα ΕΚΚ ρυθμίζει τη μετανάστευση των κυττάρων που προκαλείται από FOXM1 στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Καθώς η παραπάνω μελέτη συνεπάγεται την εύλογη σύνδεση της δραστηριότητας ΕΚΚ και έκφραση FOXM1 (Εικ. 1Α και 1Β), είναι ενδιαφέρον να διερευνηθεί η υποκείμενη μοριακό μηχανισμό. OVCA433 και Ον2008 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον αναστολέα U0126 ΜΕΚ και τα επίπεδα των pERK και FOXM1 αξιολογήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία με ανάλυση κηλίδος Western. Μια αξιοσημείωτη μείωση pERK επίπεδο παρατηρήθηκε και στις δύο κυτταρικές σειρές συντομότερο 30 λεπτά και υπήρχε μια συνακόλουθη μείωση της έκφρασης FOXM1 (Εικ. 4C). Εκτός αυτού, η αναστολή της έκφρασης FOXM1 παρατεταμένης όσο διάστημα η δραστηριότητα ΕΚΚ παρέμεινε καταστέλλεται (Εικ. 4C). Από ERK βρίσκεται ανάντη του FOXM1 [23], [24], μπορούμε αιτιολογημένη ότι η αναστολή της δραστηριότητας ΕΚΚ να καταργήσει κυτταρική μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μέσω κάτω ρύθμιση FOXM1. Πράγματι, με τη χρήση επούλωσης πληγών δοκιμασία, OVCA433 κύτταρα κατεργασμένα με U0126 παρουσίασαν σημαντική αύξηση του τραύματος χρόνος κλεισίματος (2-φορές περισσότερο) σε σύγκριση με τον μάρτυρα (

P

& lt? 0,05) (Εικ. 4D). Από την άλλη πλευρά, δεν υπήρχε μείωση της έκφρασης FOXM1 και κυτταρική κινητικότητα σε κύτταρα SKOV3 (ρ53 διαγράφεται) κατά την αγωγή του U0126 (Εικ. S3), υποδεικνύοντας ότι η παρουσία του ρ53 απαιτείται για U0126 ή διαμεσολαβείται θειοστρεπτόνη αναστολή FOXM1. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν ουσιαστικό ρόλο του FOXM1 στη διαμεσολάβηση της επίδρασης του ERK για τη μετανάστευση των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

ΜΜΡ-9 και uPAR είναι FOXM1 κατάντη στόχοι που ρυθμίζουν κυτταρική μετανάστευση /εισβολή

Εξωκυττάρια πρωτεάσες όπως μεταλλοπρωτεάση-9 (MMP-9) και του υποδοχέα ουροκινάσης (uPAR) είναι δείκτες για την απόκτηση του μεταστατικού ικανότητας [2]. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε τα επίπεδα του

MMP-9

και

uPAR

να επιβεβαιώσει την επίδραση της FOXM1 στην κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή. Με καταστολή της έκφρασης FOXM1 με 5 και 10 μΜ σε θειοστρεπτόνη OVCA433, τα επίπεδα και των δύο

MMP-9

και

uPAR

μειώθηκαν κατά περίπου 20 έως 30% (Εικ. 5). Αντιστρόφως, παροδική υπερέκφραση FOXM1 αυξηθεί

MMP-9

και

uPAR

επίπεδα από -1.7-φορές και περίπου 2.4 φορές, αντίστοιχα (Εικ. 5). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι FOXM1 ρυθμίζει την κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή μέσω μεταγραφικά up-ρυθμίζουν τις εκφράσεις του

MMP-9

και

uPAR

.

Ημι-ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι η αναστολή της έκφρασης FOXM1 από θειοστρεπτόνη (5 και 10 μΜ) σε OVCA433 προκάλεσε μείωση του

MMP-9

και

uPAR

εκφράσεις (

αριστερά

), ενώ παροδικά επιμόλυνση με το πλασμίδιο FOXM1 έκφρασης (1 και 2 μg) σε OVCA433 παρουσίασαν αύξηση της τάξης του

MMP-9

και

uPAR

έκφρασης (

δεξιά

). Η αριθμητική τιμή κάτω από κάθε πίνακα που αναφέρεται στο επίπεδο έκφρασης του mRNA σε σχέση με τον έλεγχο.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε έδειξε ότι FOXM1 ήταν έκτροπα up-ρυθμίζεται στον καρκίνο των ωοθηκών , ιδιαίτερα σε υψηλής ποιότητας υπο-τύπου. Ομοίως, η αυξημένη φωσφο-ΕΚΚ σε ταυτόχρονη με FOXM1 ήταν σημαντικά σχετίζονται με τον καρκίνο των ωοθηκών υψηλής ποιότητας. Έτσι προτείνεται η FOXM1 υπερέκφραση ενδέχεται να προκύψουν από μόνιμα ενεργοποιημένη σηματοδότηση ΕΚΚ που συμβάλλει στη μεταστατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων. Η μελέτη μας δείχνει ότι η ERK /FOXM1 καταρράκτη σηματοδότησης μπορεί να είναι ένας υποσχόμενο στόχο για θεραπευτική παρέμβαση σε καρκίνο των ωοθηκών.

και άλλες ομάδες έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι FOXM1 συχνά απορυθμισμένη σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων [31]. Είναι σημαντικό ότι, η αυξημένη έκφραση FOXM1 συνδέθηκε με την εξέλιξη του όγκου των ανθρώπινων καρκίνων [6], [9], [10], [11], [12]. Ωστόσο, οι λειτουργικές ρόλοι των FOXM1 στον καρκίνο των ωοθηκών παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη. Εδώ, δείξαμε ότι τα επίπεδα τόσο του mRNA και η πρωτεΐνη του FOXM1 ήταν πάνω ρυθμισμένα σε καρκινικούς ιστούς ωοθηκών και κυτταρικές σειρές. FOXM1 υπερέκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με όγκους των ωοθηκών υψηλής ποιότητας, υποδεικνύοντας ότι FOXM1 μπορεί να παίζει ένα ρόλο ογκογόνο στον καρκίνο των ωοθηκών, ιδιαίτερα στον τομέα της υψηλής ποιότητας υπότυπο. Ως εκ τούτου, διερεύνησε την επίδραση της FOXM1 σε κυτταρική μετανάστευση /εισβολής η οποία είναι ένα κοινό ογκογονική σενάριο που παρατηρήθηκαν σε επιθετικούς όγκους υψηλού βαθμού

Και οι δύο μεταγραφικά ενεργή παραλλαγές ματίσματος του FOXM1.?

FOXM1B

και

FOXM1C

φαίνονται να είναι αυξημένα σε πολλές ανθρώπινων καρκίνων. Ιδιαιτέρως, FOXM1B καταδείχθηκε για την προώθηση της αγγειογένεσης, της ανάπτυξης του όγκου των κυττάρων γλοιώματος και μετάσταση του HCC σε απουσία Arf ενώ FOXM1C βρέθηκε να ενισχύει την ανάπτυξη των κυττάρων και αγκύρωση-ανεξάρτητη ικανότητα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων [6], [7], [15 ], [16]. Εδώ, επιβάλλεται έκφραση είτε FOXM1B ή FOXM1C θα μπορούσε να προωθήσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Παρά το γεγονός ότι τα ευρήματά μας έδειξαν ότι FOXM1C κατά προτίμηση αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων ενώ FOXM1B προωθείται κύτταρο μετανάστευση /την εισβολή, την ταυτόχρονη μείωση και των δύο ισομορφών FOXM1 χρησιμοποιώντας θειοστρεπτόνη οδήγησε σε αντίστοιχες επιδράσεις τόσο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, καθώς και κυττάρων μετανάστευση /εισβολή. Η επίδραση της FOXM1 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με την εξέταση τις εκφράσεις των γνωστών δεικτών στην κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή,

MMP-9

και

uPAR

, οι οποίες είναι σύμφωνες με το μεταστατικό ρόλο της FOXM1 αναφέρθηκαν σε άλλων ανθρώπινων καρκίνων [9], [16], [32], [33]. Είτε FOXM1 ρυθμίζουν άμεσα αυτούς τους δείκτες ή άλλους μεταγενέστερους τελεστών απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Παρ ‘όλα αυτά, όλες αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η παρεκκλίνουσα πάνω ρύθμιση του FOXM1 αποδίδει τις ογκογονικές ιδιότητες στον καρκίνο των ωοθηκών υψηλής ποιότητας.

ERK είναι ένα από μια κρίσιμη μεσολαβητή σε Raf /ERK /ΜΑΡΚ σηματοδότησης άξονα διατηρώντας διάφορες κυτταρικές λειτουργία συμπεριλαμβανομένης κυτταρικό πολλαπλασιασμό, απόπτωση όπως επίσης και τη μετανάστευση [34]. Προηγουμένως, ERK έχει δειχθεί ότι είναι συστατικώς δραστική στον καρκίνο των ωοθηκών και τον προσδιορισμό μας υψηλού επιπέδου έκφρασης pERK σε ιστολογικές υψηλής ποιότητας ωοθηκών και κυτταρικές σειρές υποδηλώνει κρίσιμο ρόλο στην πρόκληση επιθετικών ογκογένεση [35]. Περιέργως, βρέθηκε ότι τα επίπεδα pERK και FOXM1 είχαν σφικτά συσχετίζεται κατά την διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου, ειδικά στον καρκίνο των ωοθηκών υψηλής ποιότητας. Έχουμε σκεφτεί ότι η αυξημένη έκφραση FOXM1 πυροδοτείται από την συστατική ενεργοποίηση της ERK, πράγμα που οδηγεί σε αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων στον καρκίνο των ωοθηκών. Όπως ήταν αναμενόμενο, η σχέση τους επιβεβαιώθηκε με χειρισμό της δραστηριότητας του ΕΚΚ, η οποία οδήγησε σε παράλληλες αλλαγές της έκφρασης FOXM1. Σε μια άλλη μελέτη, έχουν μοτίβα που μοιάζουν με την αλληλουχία στόχο ERK έχουν βρεθεί σε FOXM1 και ενεργοποίηση της δραστικότητας ERK δείχθηκε ότι επάγει την ικανότητα μετενεργοποιητική του FOXM1C [22]. Έτσι, καταστέλλοντας δραστηριότητα ΕΚΚ από U0126 θα μειώσει φωσφορυλίωση FOXM1 η οποία οδηγεί τελικά στην αναστολή της έκφρασης FOXM1 διαταράσσοντας τη δική θετικής ανάδρασης του [36]. Αν και μας έδωσε μια ένδειξη ότι η τρανσενεργοποίηση του FOXM1 εξαρτάται από φωσφορυλίωση από ΕΚΚ στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο, υπάρχει έλλειψη αναφορών σχετικά με τις λειτουργικές ιδιότητες των ενεργοποιημένων ΕΚΚ /FOXM1 άξονα σηματοδότησης στον καρκίνο των ωοθηκών. Στη μελέτη επούλωσης πληγών, στην πραγματικότητα, η μείωση του τραύματος ρυθμού κλεισίματος λόγω ανέστειλε δραστηριότητα ERK και η μείωση της έκφρασης FOXM1 κατά την κατεργασία U0126 υποδηλώνει έντονα ότι FOXM είναι ένας από τους σημαντικότερους κατάντη τελεστές της σηματοδότησης ERK. Επιπλέον, θειοστρεπτόνης και U0126 κατέστειλε την κυτταρική μετανάστευση σε παρόμοια έκταση (40% έναντι 50%). Στο σύνολό τους, πιστεύουμε ότι μέχρι ρυθμιζόμενων δραστηριότητα ΕΚΚ και την επακόλουθη αύξηση της έκφρασης FOXM1 συμβάλει περαιτέρω πρόκληση ογκογόνων συμπεριφορές, υποστηρίζοντας ότι η ERK /FOXM1 άξονα σηματοδότησης διευκολύνει τη μετανάστευση των κυττάρων στον καρκίνο των ωοθηκών.

Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει το υποσχόμενη επίδραση της θειοστρεπτόνης σε αλλοιώνοντας τα ογκογόνο συμπεριφορές που προκαλούνται από FOXM1 [26], [37], [38]. Δεδομένης της διαφορετικής ευαισθησίας της FOXM1 προς τα κάτω ρύθμιση με θειοστρεπτόνη θεραπεία σε κυτταρικές σειρές με διάφορες κατάσταση του p53, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε τη σημασία του p53 για τη δράση της θειοστρεπτόνης. Με βάση το γεγονός ότι η απώλεια της λειτουργίας ρ53 είναι ένα κοινό συμβάν σε όγκους και FOXM1 ρυθμίζεται αρνητικά από ρ53, εμείς εικάζουν ότι η απώλεια έκφρασης p53 μπορεί να προκαλέσει την απελευθέρωση των FOXM1 και έτσι να προκαλέσει την κυτταρική καταστροφή, ακόμη και καρκίνο. Εδώ, το ρ53 διαγράφεται κυτταρική γραμμή SKOV3 δεν έδειξαν απόκριση του FOXM1 σε διάφορες δόσεις θειοστρεπτόνης καθώς αναστολέα ΜΕΚ, U0126, ενώ FOXM1 μπορούσε να κατασταλεί εύκολα σε πολλαπλές δόσεις σε OVCA433 και A2780cp οποία φέρουν άγριου τύπου και μεταλλαγμένα γονίδια ρ53 αντίστοιχα. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι μπορεί να προκαλέσει θειοστρεπτόνη αποπτωτική επίδραση επί των καρκινικών κυττάρων με τη σταθεροποίηση της έκφρασης p53 [39] και την αυξητική ρύθμιση της ρ53 σε υψηλότερη δοσολογία μπορεί περαιτέρω να βοηθήσει την καταστολή της FOXM1. Είναι ενδιαφέρον, θειοστρεπτόνη ή U0126 δεν είχε καμία επίδραση στην SKOV3 μεταφέρουν διαγραφεί το γονίδιο p53, ενώ έκτοπη έκφραση της p53 κατάργησε την έκφραση FOXM1 τόσο σε RNA και πρωτεϊνών επίπεδο, σύμφωνα με άλλες μελέτες [28], [30]. Αυτό αποκαλύπτει το απαιτούμενο ρόλο της ρ53 στη διαμεσολάβηση της κατασταλτική επίδραση θειοστρεπτόνης στην έκφραση FOXM1. Εκτός από την μείωση της ικανότητας κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή, μια άλλη ομάδα έδειξε επίσης ότι η χρήση του σε θειοστρεπτόνη θα μπορούσε επίσης να αυξήσει την απόπτωση και πολλαπλασιαστικές σύλληψης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, τα οποία υπογραμμίζει περαιτέρω την θεραπευτική αξία των θειοστρεπτόνη [26], [37], [38], [39], [40]. Συλλογικά, η μελέτη μας υποστηρίζει ότι οι λειτουργίες θειοστρεπτόνης καταστέλλοντας την έκφραση FOXM1 μέσω p53 για την ανακούφιση των υστέρων την γένεσιν όγκων και up-ρύθμισης ρ53 να επάγει τον κυτταρικό θάνατο.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας αποκάλυψε μια σχέση μεταξύ της ERK /FOXM1 άξονα σηματοδότησης και η μεταστατική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Επιπλέον, αποκάλυψε ένα κρίσιμο ρόλο της p53 στη μεσολάβηση της δράσης των θειοστρεπτόνης. Ως εκ τούτου, και οι δύο U0126 και θειοστρεπτόνης αντιπροσωπεύουν ελπιδοφόρα σημεία εκκίνησης για τη δημιουργία αντικαρκινική θεραπεία στον καρκίνο των ωοθηκών, μέσω της καταστολής της FOXM1.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

Πέντε απαθανάτισε ανθρώπινα κύτταρα επιθηλιακά επιφάνεια των ωοθηκών χρησιμοποιήθηκαν: HOSE10-2, HOSE11-12, HOSE17-1, HOSE20-3 και HOSE21-3 (από τον καθηγητή Γεώργιο Τσάο, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ). Εννέα κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιήθηκαν: τα A2780S A2780cp, OV2008, C13 * (από τον καθηγητή Benjamin Tsang, Το Πανεπιστήμιο της Οτάβα), OV420, OV429, OV433, OVCAR3 και SKOV3 (American Type Culture Collection, Rockville). Όλες οι κυτταρικές σειρές επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 είτε σε ελάχιστο βασικό μέσο ή τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (Gibco-BRL, Gaithersburg) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco) και 1% Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη ( Gibco).

πλασμίδια και επιμόλυνση

Οι λεντοϊού πλασμίδια pCDH-FOXM1B και pCDH-FOXM1C παρήχθησαν με υποκλωνοποίηση FOXM1B και FOXM1C cDNA από pcDNA3-FOXM1B και πλασμίδια pcDNA3-FOXM1C σε pCDH-MSCV- MCS-EF1-GFP-Puro βραδέος ιού πλασμιδίου (SBI, Mountain View, CA) αντίστοιχα. Το πλασμίδιο pRcCMV-p53 ήταν από τον καθηγητή Randy YC Poon (Τμήμα Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ Επιστήμης και Τεχνολογίας, το Χονγκ Κονγκ). LipofectAMINE ™ αντιδραστήριο επιμόλυνσης 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση των κυττάρων σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Οι pCDH-MSCV-MCS-EF1-GFP-Puro και pcDNA3.0 κενούς φορείς χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Για να διαπιστωθεί FOXM1B και FOXM1C σταθερώς εκφράζοντα κύτταρα, κύτταρα μολυσμένα λεντοϊού επιλέχθηκαν με 2 μg /ml πουρομυκίνη (Sigma) για 2 εβδομάδες και επαληθεύεται με ανάλυση στυπώματος western.

ημι-ποσοτική (SQ-PCR) και Ποσοτική ( QPCR) ανάστροφης μεταγραφάσης-πολυμεράσης αλυσιδωτή αντίδραση

Ολικό RNA απομονώθηκε από ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφή κιτ αντιδραστηρίου (Applied Biosystems, Foster City). Στη συνέχεια, το cDNA χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει PCR χρησιμοποιώντας ειδικά γονίδια εκκινητές του

FOXM1B

(προς τα εμπρός, 5′-TTGCCCCCAAGGTGCTGCTA-3 ‘και αντίστροφος, 5′- GGAGATTGGGACGAATCCTC-3’),

FOXM1C

( προς τα εμπρός, 5′-CACCCATCACCAGCTTGTTT3 »και να αντιστραφεί, 5′-GGAGATTGGGACGAATCCTC-3 ‘),

ΜΜΡ9

(προς τα εμπρός, 5′-CATCGTCATCCAGTTTGGTG και να αντιστραφεί, 5′-GCCTTGGAAGATGAATGGAA-3′) και

uPAR

(προς τα εμπρός, 5′-GCCTTACCGAGGTTGTGTGT-3 ‘και αντίστροφος, 5′-GGCAGATTTTCAAGCTCCAG -3’) υπό την προϋπόθεση των 94 ° C (5 λεπτά), που ακολουθείται από 30-35 κύκλους των 95 ° C (30 δευτερόλεπτα), 57 ° C (30 δευτερόλεπτα) και 72 ° C (30 δευτερόλεπτα), τότε τελικά 72 ° C (10 λεπτά) και 4 ° C. Η σχετική ποσότητα του γονιδίου κανονικοποιήθηκε έναντι GAPDH mRNA.

Q-PCR διεξήχθη με TaqMan® Gene Expression Δοκιμασίες και SYBR Green Gene Expression Assay. Για να επικυρώσετε την έκφραση του

FOXM1

ισομορφές, ειδικούς εκκινητές που στοχεύουν ενάντια

FOXM1B

και

FOXM1C

σχεδιάστηκαν σύμφωνα με Kalin

et al

[11] και αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. Για να εξεταστεί η έκφραση της ρ53, ειδικών ανιχνευτών TaqMan (Applied Biosystems) που περιλαμβάνεται στο μείγμα PCR υποβλήθηκαν σε PCR υπό την προϋπόθεση 95 ° C για 2 λεπτά, 40 ° κύκλοι C στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό. Σχετική ποσότητα RNA σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε με συγκριτική μέθοδο CT με το λογισμικό 7500 Σύστημα SDS (έκδοση 1.3.1), από την οποία η αναδίπλωση διαφορά σε σύγκριση με τον εσωτερικό έλεγχο

18S

και

ΤΒΡ

και η σχετική διαφορά φορές ήταν συνέχεια κανονικοποιούνται στο βαθμονομητή. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης του γονιδίου στόχου ερμηνεύθηκε ως η διαφορά φορές προς το ενδογενές ελέγχου.

κηλίδωση Western και η ανοσοϊστοχημική (IHC) αναλύσεις

Συνολική πρωτεΐνη παρασκευάστηκε με προσθήκη κατάλληλης ποσότητας ρυθμιστικού λύσης 1χ στο κυτταρικό ίζημα.