Abstract

Το fulvestrant (ICI-182780) έχει πρόσφατα δειχθεί να καταστέλλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

in vitro

και

in vivo

. Αλλά είναι σαφές εάν microRNAs παίζουν ένα ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης σε ογκογονίδιο fulvestrant αγωγή του καρκίνου του προστάτη. Εδώ, αυτή η μελέτη αναφέρει ότι

HSA-miR-765

ως η πρώτη fulvestrant με γνώμονα, ΕΚβ ρυθμιζόμενων miRNA παρουσιάζουν σημαντικές δραστηριότητες ογκοκατασταλτικό όπως fulvestrant, κατά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη μέσω απόφραξη της προόδου του κυτταρικού κύκλου στην G2 /M μετάβαση και τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή πιθανώς μέσω μείωσης του σχηματισμού filopodia /έντονο στρες-ινών. Το fulvestrant έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει προς τα πάνω

HSA-miR-765

έκφραση μέσω της πρόσληψης του ΕΚβ στο 5′-ρυθμιστική-περιοχή του

HSA-miR-765

. HMGA1, ένα ογκογόνο πρωτεΐνη στον καρκίνο του προστάτη, αναγνωρίστηκε ως κατάντη στόχου της

HSA-miR-765

και fulvestrant σε πειράματα που βασίζονται σε κύτταρα και σε κλινική μελέτη. Τόσο το αντι-οιστρογόνο και το

HSA-miR-765

μιμούνται κατασταλεί η έκφραση της πρωτεΐνης HMGA1. Σε μια μελέτη νεο-επικουρική, τα επίπεδα του

HSA-miR-765

αυξήθηκαν και έκφραση HMGA1 ήταν σχεδόν εντελώς χαθεί σε δείγματα καρκίνου του προστάτη από ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με μια απλή δόση (250 mg) του fulvestrant 28 ημέρες πριν από προστατεκτομή . Αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν έναν καταρράκτη νέα fulvestrant σημάτων που περιλαμβάνουν ΕΡβ μεσολάβηση μεταγραφικό προς τα πάνω ρύθμιση του

HSA-miR-765

που καταστέλλει την έκφραση της πρωτεΐνης HMGA1 ως μέρος του μηχανισμού βασίζεται το ογκοκατασταλτικό δράση του fulvestrant στον καρκίνο του προστάτη.

Παράθεση: Leung YK, Chan QK-Υ, Ng CF, Ma FM-T, Τσε HM, να KF, et al. (2014) HSA-miRNA-765 ως ένας μεσολαβητής κλειδί για την αναστολή της ανάπτυξης, τη μετανάστευση και την εισβολή στην Fulvestrant που έλαβαν τον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (5): e98037. doi: 10.1371 /journal.pone.0098037

Επιμέλεια: Jindan Yu, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Γενάρη του 2014? Αποδεκτές: 28, Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: May 16, 2014

Copyright: © 2014 Leung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Χονγκ Κονγκ Πανεπιστήμιο Grant Συμβούλιο Γενικών Ταμείου Έρευνας (M469107 να KML) και κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ Άμεση Κονδυλίων Έρευνας (CU2041252 και CU2041563 να KML), ένα Υποθέσεων Βετεράνων Merit Award (I01BX000675 να SMH) και επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο υγείας (ES019480, ES020956, ES015584, ES006096, CA112570, CA015776 να SMH) και επιχορήγηση από τον ερευνητή-Σύνδεσμοι Πρόγραμμα Σπουδών της AstraZeneca (έως JM). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Δρ Jodi Maranchie έλαβε το Ερευνητής-Σύνδεσμοι Πρόγραμμα Σπουδών της AstraZeneca. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η φυσιολογική ανάπτυξη και κακοήθων νεοπλασιών του προστάτη ρυθμίζονται όχι μόνο από τα ανδρογόνα, αλλά και από τα οιστρογόνα [1]. Ο υποδοχέας οιστρογόνου (ER) β είναι ο κύριος υποδοχέας εκφράζεται στο επιθήλιο του προστάτη και σε διάφορα στάδια του καρκίνου του προστάτη (PCA), συμπεριλαμβανομένων των μεταστάσεων στα οστά [2], [3]. Το συνθετικό οιστρογόνο διαιθυλοστιλβεστρόλη (DES), μέσα από τη δράση των ανδρογόνων-στέρηση του, ήταν μόλις η πρώτη γραμμή θεραπείας για μεταστατική προστάτη [1], [4]. DES τελικά έχασε την εύνοια εξαιτίας του υψηλού καρδιαγγειακού κινδύνου τοξικότητας και θρομβοεμβολικών της [5], [6], με την παρεντερική οιστραδιόλη-17β (Ε2) κερδίζει πρόσφατη δημοτικότητα ως θεραπεία για μεταστατικό, ο ευνουχισμός ανθεκτικά προστάτη (CRPC) [7], [ ,,,0],8], λόγω του προφίλ της χαμηλής καρδιαγγειακή τοξικότητα και προστατευτική δράση ενάντια στην οστεοπόρωση [9]. Άλλες ρυθμιστές επιλεκτική ER (π.χ., ταμοξιφένη, τορεμιφένη, και reloxifene) έχουν διερευνηθεί σε κλινικές δοκιμές, αλλά βρέθηκε να έχει περιορισμένη αποτελεσματικότητα σε σχέση με DES [10] – [13]. Με την έγκριση, το 2005, fulvestrant (ICI 182,780), ένα καθαρό ανταγωνιστή του υποδοχέα οιστρογόνου χωρίς γνωστή αγωνιστική δράση, για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του μαστού με θετικούς υποδοχείς, το ενδιαφέρον για τη χρήση του για CRPC έχει προκύψει.

Σε προκλινικές μοντέλα, fulvestrant έχει αποδείξει τις δυνατότητές του μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία για προστάτη. Σε ένα οιστρογόνο που προκαλείται μοντέλο προστάτη [14] – [17], φουλβεστράντη απέτρεψε την εξέλιξη των προκαρκινικών βλαβών, αντέστρεψε την Ε2 που επάγεται μεταγραφικό [16], [17], και που προκαλείται από τη δική γονίδιο υπογραφής της [16]. Σε DU145, μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά προστάτη που εκφράζει Ετβ και δεν ΕΡα, fulvestrant κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων μέσω του υποδοχέα [18] και ρυθμίζεται ένα μοναδικό σύνολο των γονιδίων, πιθανώς μέσω cross-talk μεταξύ Ετβ και NFκB [19]. Επιπλέον, fulvestrant κατέστειλε την ανάπτυξη των DU145 και PC-3 ξενομοσχεύματα μέσω ενός ΕΡβ μεσολάβηση μονοπάτι σηματοδότησης KLF5 [20] και ανέστειλε επίσης την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP με προς τα κάτω ρύθμιση του υποδοχέα ανδρογόνων [21].

Στη μόνη φάση II μελέτη του fulvestrant μέχρι τώρα διεξαχθεί [22], 20 CRPC ασθενείς έλαβαν αγωγή φόρτωση δόσης (500 mg την ημέρα 0 και στη συνέχεια 250 mg την ημέρα 14, ημέρα 28, και στη συνέχεια κάθε μήνα). Μετά από έξι μήνες θεραπείας, fulvestrant ήταν καλά ανεκτή, αν και όχι ευνοϊκή κλινική ή PSA απόκριση παρατηρήθηκε [22]. Ωστόσο, με την αύξηση της δόσης φόρτωσης κατά τον πρώτο μήνα (500 mg κάθε 14 ημέρες), το επίπεδο του PSA μειώθηκε αποτελεσματικά κατά 40-99% εντός 0,27 έως 2,67 μήνες σε έξι από τους επτά ασθενείς CRPC ιδιαίτερα προεπεξεργασμένων χωρίς εμφανή τοξικότητα [23 ]. Αυτό το τελευταίο εύρημα προσφέρει υποστήριξη στη διεξαγωγή περισσότερη έρευνα στη βελτιστοποίηση της δόσης και σε βάθος μηχανιστικές μελέτες του fulvestrant ως θεραπεία για την PCA.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρές (17-25 νουκλεοτίδια) μη-κωδικοποίησης RNA που ρυθμίζουν γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφική. Κάθε miRNA μπορούν να δεσμεύονται σε μία ή περισσότερες αλληλουχίες στόχου στην 3′-αμετάφραστη περιοχή-μεταγραφημάτων στόχο της και εκμαιεύσει αποικοδόμηση του mRNA ή καταστολή της μετάφρασης της πρωτεΐνης, ανάλογα με το βαθμό της σύζευξης συμπληρωματικών βάσεων [24]. Μια ενιαία miRNA ρυθμίζει κανονικά έκφραση ενός μεγάλου αριθμού αντιγράφων [25] – [27]. Η ανώμαλη έκφραση ειδικών miRNAs παρέχει πλεονέκτημα ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα έναντι των φυσιολογικών κυττάρων διαταράσσοντας πολλαπλές οδούς ογκογόνο /ογκο-κατασταλτικά. Οι PCA-ειδικές miRNAs έχουν ταυτοποιηθεί [28] – [30], και ορισμένα από αυτά ανδρογόνων συνδέονται με [31]. Μέχρι σήμερα, όμως, καμία miRNA έχει συνδεθεί με οιστρογόνα ή οιστρογόνα σε ΣΕΣΣ.

Εδώ, εξετάσαμε το ρόλο των miRNA στη μεσολάβηση της δράσης του fulvestrant σε προστάτη. Παγκόσμια προφίλ της έκφρασης των miRNAs σε κύτταρα DU145 προσδιορίζονται

HSA-miR-765

ως fulvestrant-ρυθμίζεται miRNA. Οι αναλύσεις υποστηρικτής ορίζεται μια ελάχιστη αλληλουχία στην 5′-ρυθμιστική περιοχή του

HSA-miR-765

που στρατολογεί ΕΡβ και ότι είναι κρίσιμης σημασίας για τη ρύθμιση fulvestrant. Τα αποτελέσματα των miRNA στην ανάπτυξη PCa κυττάρου, μετανάστευση και εισβολή συγκρίθηκαν με αυτά του fulvestrant. Η εξάρτηση του fulvestrant δράσεων για την ΕΚβ αποδεικνύεται από νοκ ντάουν πειράματα. Η αλλαγή στην έκφραση του

HSA-miR-765

και της κατάντη ογκογόνο πρωτεΐνη, η ομάδα υψηλού κινητικότητα AT-hook 1 (HMGA1), αξιολογήθηκε σε δείγματα προστατεκτομή που λαμβάνονται από ασθενείς, αφού είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με fulvestrant για ένα μήνα.

Υλικά και Μέθοδοι

θεραπεία φουλβεστράντη

DU145 και κυτταρικές σειρές PC3 αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA). DU145 κύτταρα (ATCC) διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. PC3 κύτταρα (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS (hiFBS). Η ταυτότητα της κάθε κυτταρική σειρά έχει πρόσφατα επικυρώνονται από ATCC χρησιμοποιώντας σύντομες διαδοχικές μέθοδο επανάληψης προφίλ. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα μέσον hiFBS για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία φαρμάκων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με 10

-6 Μ fulvestrant σε 0.1% ή 0.1% αιθανόλη. Οι καλλιέργειες ελέγχου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα μόνο. ​​

miRNA και γονιδιακή έκφραση

Για miRNA προφίλ, το σύνολο των RNAs εξήχθησαν και επισημαίνονται άμεσα χρησιμοποιώντας το nCode συστήματος έγκαιρης επισήμανσης (Invitrogen, Grand Island, Νέα Υόρκη) και μαζεύτηκαν στο nCode Ανθρωπίνων miRNA μικροσυστοιχιών V3 (Invitrogen).

έκφραση ιστού του miRNA μελετήθηκε από την εκχύλιση του ολικού RNAs από κρυοτομές (5-10 μm) χρησιμοποιώντας ΚΝΑζοΙ RT (Research Center Μοριακή, Cincinnati, ΟΗ), πολυ (Α) και -ουράς αντίστροφη μεταγραφή με καθολικό εκκινητή RT χρησιμοποιώντας το nCode microRNA πρώτου κλώνου cDNA kit (Invitrogen). Real-time PCR διεξήχθη με SYBRGreen PCR Master-Mix (Invitrogen) χρησιμοποιώντας είτε το

HSA-miR-765

ειδικές ή συρραφής U6 μικρό πυρηνικό RNA (RNU6) -ειδικές qRT εμπρός εκκινητή (Πίνακας S2) και ένα καθολική αντίστροφο εκκινητή qPCR (Invitrogen).

Ολικά RNAs παρασκευάσθηκαν με τυχαία εξαμερή (Invitrogen). Ριβοσωμική πρωτεΐνη 3 (RPS3, Πίνακας S2) χρησιμοποιήθηκε σαν τον έλεγχο καθαριότητας. Σχετική έκφραση γονιδίου προσδιορίστηκε με την ΔΔC

μέθοδος T [32].

Κλινικά δείγματα

Οι ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένο, κλινικά εντοπισμένο PCa δόθηκε μία μόνο ενδομυϊκή ένεση 250 mg fulvestrant , 28 ημέρες πριν από την προγραμματισμένη ριζική οπισθοηβική προστατεκτομή. Οι ασθενείς εξαιρέθηκαν εάν είχαν ένα λευκών αιμοσφαιρίων & lt? 3.000 /μl, αριθμός αιμοπεταλίων & lt? 100.000 /μl, αιμοσφαιρίνη & lt? 11 g /dl, INR & gt? 1.6, ή χολερυθρίνη AST ή της κρεατινίνης επίπεδα & gt? 1,5 φορές το ανώτερο φυσιολογικό όριο. Οι ασθενείς επίσης αποκλείσθηκαν εάν απαιτείται κορτικοστεροειδή για τη θεραπεία άλλων συστηματικών νοσημάτων ή είχαν ιστορικό συμφορητικής καρδιακής ανεπάρκειας, ενεργός στηθάγχη, μόλυνση, ή ενεργό δεύτερο κακοήθεια. Όλα τα άτομα είχαν τελικό Gleason ποσό των 6 ή 7 σε προστατεκτομή. Δείγματα από μη επεξεργασμένο ασθενείς με παρόμοιο ποσό Gleason και όλων των δειγμάτων από ασθενείς fulvestrant έλαβαν ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο της Μασαχουσέτης Ιατρική Σχολή (umms) κάτω από ένα πρωτόκολλο (PI. Δρ Maranchie) εγκρίθηκε από την Επιτροπή για την Προστασία των Ανθρωπίνων Θέματα στην Έρευνα και Θεσμικών Διοικητικό κριτική στο umms. Όλα τα θέματα που προβλέπονται γραπτή συγκατάθεση για να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη και είχαν αποχαρακτηρίζονται.

Νοκ ντάουν του ΕΚβ

siRNAs για Ετβ ή αγωνίζομαι siRNA (Invitrogen) μετασκευάστηκε σε κύτταρα DU145 (2 × 10

5) χρησιμοποιώντας Χ-tremeGENE (Roche, Indianapolis, IN). Τα κύτταρα siRNA επεξεργασμένα υπέστησαν αγωγή είτε με fulvestrant ή αιθανόλη για άλλες 2-4 ημέρες και στη συνέχεια υποβάλλεται σε πραγματικό χρόνο RT-PCR, ανάλυση δραστηριότητα υποκινητή, δοκιμασία κυτταρικής ανάπτυξης, και χρώση F-ακτίνης.

5 «-ρυθμιστικών περιοχή αναλύει

5 ‘ανάντη περιοχές του γονιδιώματος του

HSA-miR-765

πρόδρομος (CHR1:. 156,906,923-156,906,036 προσχώρησης δεν NC_000001.10) -3208 – 100 ήταν ενισχύεται και κλωνοποιείται εντός pGL3-βασικό (Promega, Madison, WI) ως

pGL3-HSA-miR-765

. Serial διαγραφές από το 5 ‘άκρο της κλωνοποιημένης ακολουθίας στο φορέα διεξήχθησαν για να δημιουργήσει pGL3-bp miR-765-Δ1192 (αλληλουχία DNA από -2016 έως +100), pGL3-miR-765-Δ1766 bp (αλληλουχία DNA από – 1.442 – 100), pGL3-miR-765-Δ2414 bp (αλληλουχία DNA -792 έως 100), pGL3-miR-765-Δ2618 bp (αλληλουχία DNA -590 έως 100), pGL3-miR-765- Δ2972 bp (αλληλουχία DNA -236 έως 100), και pGL3-miR-765-Δ3113 bp (αλληλουχία DNA -95 – 100). δραστηριότητες Reporter άλλων κουτσουρεμένες ή μεταλλαγμένες φορείς σε κύτταρα DU145 προσδιορίσθηκαν με ή χωρίς fulvestrant και /ή Ετβ siRNA knockdown χρησιμοποιώντας το σύστημα ανάλυση Reporter διπλής λουσιφεράσης (Promega).

miRNA στόχευση ρεπόρτερ δοκιμασία

κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με φορέα αναφοράς λουσιφεράσης pMIR-miR-765 που κλωνοποιήθηκε με συμπληρωματική αλληλουχία της HSA-miR-765 ως τέλειος στόχος miR-765 και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με είτε HSA-miR-765 μιμούνται μιμούνται ή αρνητικού μάρτυρα. Τα λύματα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης. Η 3′-μεταφραστική περιοχή του

ομάδα υψηλής κινητικότητας AT-hook 1

(

HMGA1

) γονίδιο (+ 8026- + 9332) δημιουργήθηκε με PCR (εκκινητές στον πίνακα S2) και κλωνοποιήθηκε σε pMIR-ΕΚΘΕΣΗ (Invitrogen) ως

pMIR-HMGA1-3UTR

. Η

HSA-miR-765

μιμούνται (σειρά στον πίνακα S2) κλωνοποιήθηκε σε pMIR ως

pMIR-miR-765

. Η επίδραση του

HSA-miR-765

μιμούνται στην έκφραση λουσιφεράσης προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία λουσιφεράσης (Promega), με το

pMIR-άδειο

περιλαμβάνεται ως μάρτυρας.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθισης δοκιμασία

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με δημοσιευμένες μεθόδους [19]. Εν συντομία, τα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με fulvestrant ή έλεγχο για 45 λεπτά. συμπλέγματα ϋΝΑ-πρωτεΐνης διασυνδέθηκαν με 1% φορμαλδεΰδη. Πυρηνική σύμπλοκα υποβλήθηκαν σε υπερήχους (250-500 bp). Πέντε μικρογραμμάρια IgG ποντικού (Millipore, Billerica, ΜΑ), αντι-RNA πολυμεράσης II (Millipore) ή αντι-ERβ1 (Serotec, Raleigh, NC) αντισώματα εφαρμόστηκαν για την ολονύκτια ανοσοκαταβύθισης. Τα συμπλέγματα ϋΝΑ-πρωτεΐνης πλύθηκαν και εκλούστηκαν. Ανοσοκαταβυθισμένες ϋΝΑδ καθαριστεί, αντίστροφη-διασταυρώνεται, και καθαρίζεται. PCR και σε πραγματικό χρόνο PCR αποκάλυψε την πρόσληψη ΕΚβ σε μία αλληλουχία στην 5′-ρυθμιστική περιοχή του

HSA-miR765

(εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα S2). Η

0N

υποστηρικτής του ΕΚβ [33] χρησιμοποιήθηκε ως μη ΕΚβ ελέγχου δεσμευτική για αυτό το πείραμα.

Η ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασία

Επιπτώσεις του fulvestrant ή

HSA-miR-765

-mimic θεραπεία για DU145 ή ανάπτυξη των κυττάρων PC3 προσδιορίστηκαν με την Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού CellTiter 96 μη ραδιενεργά κυττάρων (Promega). Για το πείραμα έκτοπη έκφραση HMGA1, πλήρους μήκους του HMGA1 (pCMV6-AC-HMGA1, ΟηΟεηε, Rockville, MD) ή ένα αρνητικό-μάρτυρα (pCMV6-AC) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα DU145. Τα επιμολυσμένα κύτταρα εμπλουτισμένα σε G418-συμπληρωμένο μέσο για μια εβδομάδα. Η σχετική ανάπτυξη των κυττάρων DU145 συν-θεραπεία με fulvestrant για 4 ημέρες και είτε έκφραση HMGA1 ή κενό φορέα σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με αιθανόλη και κενό φορέα συγκρίθηκαν.

αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής

DU145 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με fulvestrant /αιθανόλη ή

HSA-miR-765

μιμούνται /αρνητικού ελέγχου μιμούνται για 2 ημέρες. Τα κατεργασμένα κύτταρα αναλύθηκαν σύμφωνα με δημοσιευμένα πρωτόκολλα [32].

κηλίδος Western αναλύσεις

Πέντε μικρογραμμάρια πρωτείνης από κυτταρολύματος ηλεκτροφορήθηκαν σε 10-12,5% SDS-PAGE και υποβλήθηκε σε στύπωμα Western ανάλυση. Πρωτογενή αντισώματα που απαριθμούνται στον Πίνακα S3 χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των επιπέδων της πρωτεΐνης.

Μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

DU145 ή PC3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με fulvestrant ή

HSA-miR-765

μιμητικό και των αντίστοιχων τους ελέγχους τους για 2 ημέρες. δοκιμασίες επούλωσης πληγών εκτελέστηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [34]. κύτταρα DU145 προκατεργάστηκαν με fulvestrant ή αιθανόλη για 5 ώρες πριν Διεξήχθησαν δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή [34].

Νηματοειδής-ακτίνη (Ρ-ακτίνη) χρώση

F-ακτίνης σε fulvestrant- ή καλλιέργειες DU145 αιθανόλη επεξεργασμένο υποβάλλονται σε μεσολάβηση RNAi knockdown του ΕΚβ,

HSA-miR-765

-mimic επιμόλυνση, ή τον έλεγχο θεραπείας απεικονίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Εν συντομία, οι fulvestrant- και αιθανόλη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου DU145 είτε με ΕΚβ siRNA ή αρνητικού ελέγχου siRNA βάφτηκαν με TRITC-συζευγμένο φαλλοϊδίνη, και οι εικόνες φθορισμού συλλήφθηκαν.

Υπολογιστική πρόβλεψη των στόχων miRNA

Miranda /mirSVR [35] (https://www.microrna.org), r5.2 TargetScan [36] (https://www.targetscan.org), RNAhybrid [37], και EIMMo2 [38 ] χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη των υποθετικών στόχων του

HSA-miR-765

. Γονιδιωματικής ευθυγραμμίσεις, BLAT (https://www.ensembl.org), χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω επικύρωση των προβλεπόμενων θέσεων.

Ανοσοβαφή HMGA1 και AR

Κατεψυγμένα τμήματα (5 μm) του προστάτη δείγματα από ασθενείς που έλαβαν ή δεν έλαβαν θεραπεία με fulvestrant πριν από προστατεκτομή σταθεροποιήθηκαν σε 3% φορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια με μεθανόλη στους -20 ° C. HMGA1 και AR ήταν ανοσοανιχνεύτηκε με 1:100 αντι-HMGA1 αντίσωμα (sc 8982, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) και αντι-AR αντίστοιχα (sc 816, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) σύμφωνα με τα δημοσιευμένα πρωτόκολλα [39 ]. Ανοσοθετικότητα προσδιορίστηκε από το ποσοστό των θετικών σήματος (πυρηνική ή κυτταροπλασματική) σε Gleason βαθμού 3/4 εστίες.

Αποτελέσματα

Α. Το fulvestrant αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, η μετανάστευση, και εισβολή σε ένα ΕΡβ τρόπο εξαρτώμενο

Το fulvestrant ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων DU145 κατά 40% και PC-3 κύτταρα κατά 30% μέσω ΕΡβ εξαρτώμενη οδό (Σχήμα 1Α, το Σχήμα S1A) και συνέλαβε την κυτταρική διαίρεση στο G2 /M φάση, όπως υποδεικνύεται από μία σημαντική μείωση στον πληθυσμό των κυττάρων G0 /G1 και μία συσσώρευση G2 /M κυττάρων (Σχήμα 1Β). Η διάσπαση σε εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου συνοδεύτηκε από αυξημένη έκφραση του G2 /M δείκτες κυκλίνης Α (G2), κυκλίνη Β (Μ), και φωσφορυλιωμένη cdc2 (G2), αλλά όχι από τους δείκτες S-φάση κυκλίνη Ε και cdc25C (Εικόνα 1C).

(Α) Το fulvestrant επάγει την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων DU145 μέσω ενός ΕΡβ εξαρτώμενη μηχανισμού. Η ανάπτυξη των fulvestrant επεξεργασμένου DU145 κύτταρα με ή χωρίς ΕΡβ siRNA knockdown για 4 ημέρες σε σχέση με τα επεξεργασμένα με αιθανόλη κύτταρα ελέγχου με siRNA αρνητικού ελέγχου παρουσιάζονται και συγκρίνονται (n = 8). έκφραση ΕΚβ επίσης χτυπηθεί κάτω από ένα άλλο siRNA (siRNA # 2) και τα παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν (Σχήμα S5). (Β) Το fulvestrant επάγει DU145 διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G2 /M φάση. Αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα DNA του 48 ώρες fulvestrant -ή αιθανολ- (έλεγχος) κατεργασμένων κυττάρων και το ποσοστό κατανομές των κυττάρων σε G0 /G1 και G2 /M φάσεις (n = 3) παρουσιάζονται και συγκρίνονται. (Γ) Το fulvestrant επάγει την έκφραση του G2 δεικτών /M. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με fulvestrant ή αιθανόλη για 2 ημέρες (έλεγχος) και δείκτες κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. Δύο ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάστηκε ένας εκπρόσωπος σύνολο δεδομένων. (Δ) Το fulvestrant καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση. Μία δοκιμασία για επούλωση της πληγής διεξήχθη στις fulvestrant- και αιθανόλης (EtOH) κύτταρα κατεργασμένα DU145 (n = 3). Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα των fulvestrant- και αιθανόλης επεξεργασμένο κυτταρικές καλλιέργειες με γρατσουνιές στους 0 ώρες και μετά από 16 ώρες παρουσιάζεται. Η πληγή χαρακτηρίζεται από διακεκομμένες γραμμές. (Ε) Το fulvestrant αναστέλλει transwell μετανάστευση (αριστερό πάνελ) και εισβολή (δεξί πάνελ) σε κύτταρα DU145 (n = 3) μετά από 5 ώρες της θεραπείας fulvestrant. (F) Μειώσεις των filopodial κύτταρα και τα κύτταρα με έντονη ίνες στρες από fulvestrant (επεξεργασία με 48 ώρες) μέσω ενός ΕΚβ-εξαρτώμενο μηχανισμό. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα και τα ποσοστά των κυττάρων με έντονη ίνες στρες και τα filopodial κύτταρα (n = 3) παρουσιάζονται. Student t-test για να προσδιοριστεί σημασία με μια ρ τιμή αποκοπής 0,05. ** P & lt? 0,01? bars = SD

Η

Το fulvestrant ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση στην δοκιμασία επούλωση της πληγής (Εικόνα 1 D), και μετανάστευση transwell (Σχήμα 1Ε, αριστερό πάνελ) και κυττάρων διεισδυτικότητα στην δοκιμασία transwell εισβολή (Σχήμα 1Ε, δεξιά panel) κατά -40% (

ρ

& lt? 0,01, η = 3) σε κύτταρα DU145 (Σχήμα 1 Ε), καθώς και σε PC-3 κύτταρα (Σχήμα S2). Η θεραπεία με fulvestrant μείωσε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων από filopodial 90,1% έως 55,9% (

ρ

& lt? 0.005, η = 5) και των κυττάρων με έντονο στρες ίνα από 96,4% σε 64,2% (

p

& lt? 0.001, η = 5) (Σχήμα 1 F). Μεσολάβηση RNAi knockdown του ΕΚβ αντιστραφεί αποτελεσματικά την φουλβεστράντη επαγόμενη αναστολή (Σχήμα 1 F).

Β. Fulvestrant ρυθμίζει προς τα πάνω

HSA-miR-765

έκφραση στα κύτταρα του προστάτη

Μεταξύ των 211 ανιχνεύσιμη miRNAs, 6 εξαιρετικά πλούσια miRNAs συμπεριλαμβανομένων HSA-miR-185, HSA-ας-7b, HSA-ΜΙΚ 765, HSA-ας-7α, HSA-miR-601 και HSA-miR-768-5p (& gt? 300 σχετική κανονικοποιημένη ένταση του σήματος) ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω μετά fulvestrant-θεραπεία (& gt? 2 φορές?

p

& lt? 0.005) (Σχήμα 2Α).

HSA-miR-765

ήταν ένας από τους Mirs που επέδειξαν τη μεγαλύτερη σχετική αύξηση (3,8 φορές) και μεγαλύτερη απόλυτο επίπεδο της έκφρασης σε κύτταρα DU145 fulvestrant-αγωγή (Πίνακας S1). Το fulvestrant επάγεται επίσης σημαντική αύξηση στην έκφραση αυτού του miR σε κύτταρα PC3 σε ΕΡβ-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β, εικόνα S1B).

(Α)

HSA-miR-765

είναι εντόνως εκφρασμένο σε κύτταρα DU145 fulvestrant επεξεργασία. Ολικά RNA από επεξεργασμένα κύτταρα σημάνθηκαν άμεσα και μαζεύτηκαν στο nCode Ανθρώπινα miRNA Microarray. Οι Διάμε- και γραμμικά στοιχεία παλινδρόμησης κανονικοποιημένη παρουσιάζονται σε ένα διάγραμμα διασποράς. (Β)

HSA-miR-765

επάγεται από fulvestrant σε καρκινικές κυτταρικές σειρές δύο προστάτη. Η HSA-miR-765 στο fulvestrant- και αιθανόλη επεξεργασμένο DU145 μάρτυρα και PC-3 κύτταρα ποσοτικοποιήθηκε με ανάλυση miRNA qRT-PCR. Σχετικές μεταβολές φορές μεταξύ της έκφρασης του

HSA-miR-765

στα κύτταρα fulvestrant επεξεργασμένα και ελέγχου παρουσιάζονται. Student t-test για να προσδιοριστεί η σημασία τους χρησιμοποιώντας μια ρ τιμή αποκοπής 0,05 (n = 3). ** P & lt? 0,01? μπάρες = Τ.Α.

Η

C.

HSA-miR-765

αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, τη μετανάστευση και την εισβολή

Ένα

HSA-miR-765

μιμούνται ή ένα αρνητικό έλεγχο εκφράστηκε στην κύτταρα DU145 που φέρουν το λουσιφεράσης φορέα αναφοράς

pMIR-miR-765

. Η έκτοπη έκφραση του

HSA-miR-765

μιμούνται, αλλά όχι την αρνητική ελέγχου, αποτελεσματικά καταστέλλεται δραστικότητα λουσιφεράσης με & gt? 70% σε κύτταρα DU145 (Σχήμα 3Α). Υπερέκφραση του

HSA-miR-765

μιμούνται σε κύτταρα DU145 επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (40%? Σχήμα 3Β) και διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G2 /M (Ο0 /Ο1 προς G2 /M αναλογία μειώθηκε από 3,5 ± 0,26 2,7 ± να 0.10,

σ

= 0.0074) (Σχήμα 3C) και ρυθμίζεται προς τα πάνω την έκφραση της κυκλίνης Α, κυκλίνη Β, και φωσφορυλιωμένη-cdc2, αλλά όχι κυκλίνης Ε ή cdc25C (Σχήμα 3D). Τέλος, μειώθηκε μετανάστευση των κυττάρων και διεισδυτικότητα (~ 80%? Σχήμα 3Ε), και το σχηματισμό filopodia /έντονου ινών στρες (Σχήμα 3F) σε επίπεδα μεγαλύτερα από ή συγκρίσιμες με εκείνες που προκαλούνται από fulvestrant (βλέπε Σχήματα 1C & amp? 1D). Συνολικά, οι ενέργειες του

HSA-miR-765

στα κύτταρα DU145 είναι πολύ παρόμοια με εκείνα του fulvestrant. Εκτός από τα κύτταρα DU145, τα ανασταλτικά αποτελέσματα του έχει-miR-765 μιμητικό παρατηρήθηκαν επίσης σε κύτταρα PC-3 (Σχήμα S3).

(Α)

HSA-miR-765

μιμητικό αναγνωρίζει την αποτελεσματική δημοσιογράφος με συμπληρωματική αλληλουχία του

HSA-miR-765

στα κύτταρα DU145. Fold αλλαγές λουσιφεράσης δραστηριότητες του

HSA-miR-765

μιμούνται κατεργασμένα κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα που κατεργάστηκαν με τον αρνητικό έλεγχο μιμούνται παρουσιάζονται (n = 3). αντιδραστήρια επιμόλυνσης χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. (Β)

HSA-miR-765

μιμούνται μειώνει την ανάπτυξη των κυττάρων DU145. δοκιμασία MTS διεξήχθη στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με

HSA-miR-765

μιμούνται ή αρνητικού ελέγχου μιμούνται ή ελέγχου επιμόλυνσης για 4 ημέρες (n = 8). (C)

HSA-miR-765

μιμούνται σημαντική μειώνει G0 /G1 G2 αναλογία Η /Μ στο DU145 να. Αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα DNA (η = 3) παρουσιάζονται. (D)

HSA-miR-765

μιμούνται κατεργασία προκαλεί αυξητική ρύθμιση του κυκλίνη Α, κυκλίνη Β, και φωσφορυλιωμένη-cdc2 έκφραση σε κύτταρα DU145. επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης των πρωτεϊνών ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Δύο ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάστηκε ένας εκπρόσωπος σύνολο δεδομένων. (Ε)

HSA-miR-765

μιμούνται καταστέλλει μετανάστευση DU145 κυττάρων και εισβολή, όπως φαίνεται στο Transwell δοκιμασία μετανάστευσης (επάνω αριστερά) και δοκιμασία εισβολής (επάνω δεξιά), αντιστοίχως. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα των κυττάρων μετά από τη μετανάστευση φρεατίων (επάνω αριστερά) ή δοκιμασία εισβολής (επάνω δεξιά) παρουσιάζονται. Διπλώστε τις αλλαγές της μετανάστευσης (κάτω αριστερά) και εισβολή (κάτω δεξιά) του DU145 κυττάρων είτε με

HSA-miR-765

μιμούνται ή αρνητικό έλεγχο μιμούνται σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου με αρνητικό έλεγχο μιμούνται παρουσιάζονται (n = 3). (F)

HSA-miR-765

μιμούνται μειώνει σημαντικά ίνες στρες και σχηματισμούς τΊΙοροάίβ στα κύτταρα DU145. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα και τα ποσοστά των κυττάρων με έντονη ίνες στρες και τα filopodial κύτταρα (n = 3) παρουσιάζονται. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις με μια ρ τιμή αποκοπής 0,05. ** P & lt? 0,01? bar = Τ.Α.

Η

Δ. Fulvestrant προκαλεί ρύθμιση προς τα άνω του

HSA-miR-765

έκφραση μέσω της πρόσληψης του ΕΚβ σε ένα υποτιθέμενο ρυθμιστικό στοιχείο

κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε siRNAs μεσολάβηση νοκ ντάουν του ΕΚβ επεξεργασία πριν fulvestrant. SiRNA χτυπηθεί αποτελεσματικά τα κάτω την έκφραση ΕΚβ (Σχήμα S4). Αυτό νοκ ντάουν μπλοκαριστεί εντελώς fulvestrant που προκαλείται από την ενίσχυση του

HSA-miR-765

έκφρασης (Εικόνα 4Α) και κατάργησε τις δραστηριότητες διενεργοποίηση του fulvestrant σε 5′-ρυθμιστική αλληλουχία του

HSA-miR-765

(μεταξύ -3208 και 100? 3,3 kb) (Σχήμα 4Β). Σειριακή ανάλυση διαγραφής εντόπισε μια ακολουθία 141 bp (μεταξύ -236 και -95) εντός του 3.3-kb 5′-ρυθμιστική αλληλουχία ως απαραίτητη στη διαμεσολάβηση τη διεγερτική δράση του fulvestrant στο

HSA-miR-765

μεταγραφή. δοκιμασίες ChIP κατέδειξε περαιτέρω την πρόσληψη του ΕΚβ σε αυτή την σύντομη ακολουθία μετά από fulvestrant διέγερση (Σχήμα 4D). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ένα ρόλο ΕΚβ στη διαμεσολάβηση fulvestrant που προκαλείται

HSA-miR-765

ρύθμιση προς τα πάνω.

(Α) ΕΚβ siRNA μπλοκ νοκ ντάουν fulvestrant που προκαλείται από τα πάνω ρύθμιση

HSA-ΜΙΚ 765

έκφραση στα κύτταρα DU145. Τα επίπεδα έκφρασης του

HSA-miR-765

προσδιορίζεται με ανάλυση qRT-PCR των fulvestrant-κατεργασμένα κύτταρα με ΕΚβ-siRNA (siERβ) ή περιπλέκουν αρνητικού ελέγχου (siNeg) συγκρίθηκαν (n = 3). (Β) siRNA νοκ ντάουν του μπλοκ ΕΚβ fulvestrant που προκαλείται από μετενεργοποίηση ανοδική ρυθμιστική περιοχή 5 ‘του

HSA-miR-765

στα κύτταρα DU145. 5 ‘ανοδική ρυθμιστική περιοχή του

HSA-miR-765

κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα λουσιφεράσης. Οι δραστηριότητες δημοσιογράφος με ΕΚβ-νοκ ντάουν (siERβ) ή αγωνίζομαι αρνητικού ελέγχου (siNeg) με την παρουσία του fulvestrant συγκρίθηκαν (n = 3). (Γ) Κατάργηση ανάλυση χαρτογράφησης καθορίζει ένα fulvestrant-απόκρισης τμήμα στο

HSA-miR-765

ρυθμιστική περιοχή στα κύτταρα DU145. ανάντη αλληλουχία DNA 5 ‘του

HSA-miR-765

από nt. -3208 Να +100 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας σύστημα αναφοράς της λουσιφεράσης. Serial διαγραφές από το 5 ‘άκρο της κλωνοποιημένης ακολουθίας στο φορέα διεξήχθησαν. δραστηριότητες Reporter συγκρίθηκαν μεταξύ των κυττάρων fulvestrant φάρμακο (φουλβεστράντη) και ελέγχου (ΕΤΟΗ) για κάθε φορέα αναφοράς (n = 3). (D) Fulvestrant-επάγει την πρόσληψη του ΕΡβ πάνω στο υποτιθέμενο

HSA-miR-765

ρυθμιστική περιοχή. Χρωματίνης-ανοσοκαταβύθιση αποκάλυψε την πρόσληψη ΕΚβ σε μία αλληλουχία στην 5′-ρυθμιστική περιοχή του

HSA-miR765

. Mouse IgG και RNA πολυμεράση II χρησιμεύουν ως αρνητικά και θετικά έλεγχος, αντίστοιχα. Το fulvestrant προκαλούμενη 17 φορές αύξηση στην πρόσληψη Ετβ όταν συγκρίνεται με την περιοχή δέσμευσης μη ΕΚβ (τον υποκινητή 0N του ΕΚβ [33], [41]). t-test του Student πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία των μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιώντας μία ρ τιμή αποκοπής 0,05. ** P & lt? 0,01? bar = Τ.Α.

Η

Ε. HMGA1 είναι ένας στόχος του

HSA-miR-765

Η

Bioinformatic αναλύει με πολλαπλά προγράμματα πρόβλεψης στόχο miRNA πρότεινε HMGA1 ως στόχο του

HSA-miR-765

? μια διατηρημένη θέση αναγνώρισης στο +8982 να +9002 με -22,6 kcal /mol ελάχιστης ελεύθερης ενέργειας είχε προβλεφθεί (σχήμα 5Α, Πίνακας S4). δοκιμασίες δημοσιογράφος απέδειξε ότι η επιμόλυνση του

HSA-miR-765

μιμούνται, αλλά όχι ενός αρνητικού ελέγχου μιμούνται, μειώθηκε σημαντικά

HMGA1 3 ‘UTR

εξαρτώμενη δραστηριότητα της λουσιφεράσης (Σχήμα 5Β)? καμία τέτοια διαφορά δεν παρατηρήθηκε στα κύτταρα DU145 που φέρουν το pMIR-κενό φορέα. Είναι σημαντικό ότι, η επιμόλυνση των

HSA-miR-765

μιμούνται μπλοκάρει πλήρως την έκφραση των πρωτεϊνών HMGA1 (Σχήμα 5C άνω πάνελ), μαζί με μια ελαφρά μείωση στο επίπεδο mRNA (σχήμα 5C, κάτω πάνελ). Ενδιαφέροντος, η θεραπεία με fulvestrant και αποτελεσματικά κλείσει την έκφραση της πρωτεΐνης HMGA1 (Σχήμα 5D). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν μια ανασταλτική ρόλο του

HSA-miR-765

στην έκφραση HMGA1 στο επίπεδο πρωτεΐνης και ένα ρόλο διαμεσολαβητή στη δράση fulvestrant στα κύτταρα του προστάτη. Τέλος, έκτοπη έκφραση της HMGA1 μείωσε αποτελεσματικά την επίδραση αναστολής της ανάπτυξης του fulvestrant στα κύτταρα DU145 (Σχήμα 5Ε), ένα εύρημα σύμφωνο με την αναφερόμενη ογκογόνο δράση του HMGA1 στον προστάτη [40].

(α) το 3 ‘UTR του

HMGA1

8.910 με 8.929 αναμένεται να είναι

HSA-miR-765 το site

δέσμευσης. (Β)

HSA-miR-765

αλληλεπιδρά με 3’UTR του

HMGA1

σε μια δοκιμασία ρεπόρτερ στόχευσης. κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν είτε με pMIR-άδειο ή pMIR-HMGA1-3UTR στην οποία 3 ‘UTR του

HMGA1

(+ 8026- + 9332) κλωνοποιήθηκε στο 3′ άκρο της λουσιφεράσης. δραστηριότητες ρεπόρτερ των pMIR-HMGA1-3UTR επιμολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με

HSA-miR-765

μιμούνται ή αρνητικό έλεγχο μιμούνται συγκρίνονται (n = 3). (C)

HSA-miR-765

μιμούνται μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης HMGA1 στα κύτταρα DU145. Πρωτεΐνη και mRNA επίπεδα HMGA1 στο

HSA-miR-765

mimic- και αρνητικού ελέγχου μιμούνται-επεξεργασμένα κύτταρα προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western (άνω) και ανάλυση σε πραγματικό χρόνο RT-PCR (κατώτερο), αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα από

miR-765

μιμούνται vs αρνητικού ελέγχου μιμούνται συγκρίνονται (n = 3). (Δ) Το fulvestrant μειώνει την έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα HMGA1 DU145. επίπεδο πρωτεΐνης HMGA1 και β-ακτίνης στα κύτταρα fulvestrant θεραπεία και η αιθανόλη επεξεργασμένο ελέγχου (CTL) προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. (Ε) Η έκτοπη έκφραση του μπλοκ HMGA1 fulvestrant επαγόμενη DU145 αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης. Η σχετική ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από 4 ημέρες θεραπείας με fulvestrant ή αιθανόλη μετά από σταθερή επιμόλυνση των

HMGA1

(ή κενό φορέα ελέγχου) για μια εβδομάδα. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του HMGA1 δείχθηκαν στο Σχήμα S6. Η κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων που fulvestrant επεξεργασμένου με HMGA1 υπερέκφραση vs κενό φορέα συγκρίνονται (n = 8). t-test του Student πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιώντας μία ρ τιμή αποκοπής 0,05. ** P & lt? 0,01? bar = Τ.Α.

Η

F.

HSA-miR-765

είναι αυξημένα, αλλά πρωτεΐνης HMGA1 μειώνεται στο fulvestrant επεξεργασμένο προστάτη δείγματα

προστατεκτομή ιστών ελήφθησαν από ασθενείς με εντοπισμένο προστάτη που έλαβαν ή δεν έλαβαν αγωγή με fulvestrant (250 mg, im 28 ημέρες πριν προστατεκτομή). Real time RT-PCR αναλύσεις έδειξαν αυξητική ρύθμιση του

HSA-miR-765

mRNA (2,7-φορές,

σ

& lt? 0.05, n = 7) Στο πλαίσιο της ΣΕΣΣ δείγματα από ασθενείς που έλαβαν fulvestrant σε σχέση με εκείνα από δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής (η = 7) (Σχήμα 6Α). Σε αντίθεση, ανοσοϊστολογικές αναλύσεις αποκάλυψαν σημαντική μείωση HMGA1 ανοσοθετικότητα σε δείγματα από ασθενείς fulvestrant φάρμακο (Σχήμα 6Β). HMGA1 εντοπίστηκε κυρίως στους πυρήνες των κυττάρων PCA σε εστίες καρκίνου, με μόνο ασθενή κυτταροπλασματική χρώση σε στρωματικά κύτταρα. Η ανοσοχρώση ήταν αμελητέα σε δείγματα fulvestrant επεξεργασμένο σε όλες σχεδόν τις εστίες καρκίνου (Σχήμα 6C,

ρ

& lt? 0,01, η = 5). υποδοχέα ανδρογόνων προηγουμένως δείχθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω από fulvestrant σε ένα τρωκτικό [41] και ένα μοντέλο κυττάρου [21]. Εδώ, δείξαμε AR επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά σε κλινική μελέτη μας (Σχήμα 6Β και C).