Αφηρημένο

θηλώδες καρκίνο του θυρεοειδούς (PTC) είναι μια ετερογενής και πολύπλοκη ασθένεια? ευαισθησία σε PTC επηρεάζεται από τις κοινές επιπτώσεις των πολλαπλών κοινών, γονίδια χαμηλής διεισδυτικότητας, αν και σχετικά λίγοι έχουν εντοπιστεί μέχρι σήμερα. Εδώ εφαρμόζεται μια αυστηρή συνδυασμένη προσέγγιση για να εκτιμήσει τόσο την ατομική και επιστατικές συνεισφορές των γενετικών παραγόντων στην ευαισθησία PTC, βασίζεται σε μία από τις μεγαλύτερες σειρές των περιπτώσεων καρκίνου του θυρεοειδούς περιγραφεί μέχρι σήμερα. Εκτός από τον προσδιορισμό της συμμετοχής των

TSHR

παραλλαγή στο κλασικό PTC, πρωτοπόρος μελέτη μας επίστασης αποκάλυψε μια σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ των παραλλαγών στο

STK17B

και

PAX8

. Η αλληλεπίδραση ανιχνεύθηκε με MD-MBR (ρ = 0,00010) και επιβεβαιώθηκε από άλλες μεθόδους, και στη συνέχεια αντιγράφεται σε ένα δεύτερο ανεξάρτητο σειρά ασθενών (MD-MBR p = 0,017). Επιπλέον, έχουμε καταδείξει μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του

PAX8

και

STK17B

σε ένα σύνολο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ανθρώπινα καρκινώματα του θυρεοειδούς. Συνολικά, το έργο μας ρίχνει επιπλέον φως στη γενετική βάση της ευαισθησίας στον καρκίνο του θυρεοειδούς, και προτείνει μια νέα κατεύθυνση για την εξερεύνηση της κληρονομική γενετική συμβολή στην ασθένεια, χρησιμοποιώντας μελέτες συσχέτισης

Παράθεση:. Landa Ι, Boullosa C, Inglada L -Pérez, Sastre-Perona Α, Pastor S, Βελάσκεθ A, et al. (2013) Μια επιστατικές αλληλεπίδραση μεταξύ του

PAX8

και

STK17B

γονίδια στο θηλώδες καρκίνο του θυρεοειδούς Ευαισθησία. PLoS ONE 8 (9): e74765. doi: 10.1371 /journal.pone.0074765

Επιμέλεια: Xiaoping Miao, MOE Βασικά Εργαστήριο Περιβάλλοντος και Υγείας, τη Σχολή Δημόσιας Υγείας, Tongji Medical College, Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας, η Κίνα

Ελήφθη: 9 Ιούλη 2013? Αποδεκτές: 5 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Landa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το έργο Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) PI11 /01359 (για να MR), ο Ερυθρός Temática de Investigación Cooperativa en καρκίνο, το Instituto de Salud Carlos III, RD12 /0030/0060 (σε PS), RD12 /0036/0050 (στο NM) και S2011 /BMD-2328 TIRONET από την Comunidad de Madrid (σε MR και PS), και το Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης. IL υποστηρίζεται από επιχορήγηση FIS FI07 /00326? CB υποστηρίζεται από τα BES-2008-006332 επιχορήγηση FPI? LI-P υποστηρίζεται από Centro de Investigación Biomedica en Red de Enfermedades Raras, και AS-P είναι ένα predoctoral υποτρόφων του προγράμματος FPU (MICINN) αντίστοιχα. SR-LL είναι μεταδιδακτορικός υπότροφος του FIS (σύμβαση # CD05-0055). RDU υποστηρίζεται από BIO2009-12458 έργου από το ισπανικό Υπουργείο Οικονομίας και Καινοτομίας. RM, SP και AV υποστηρίζονται από την Generalitat de Catalunya, CIRIT (2009SGR-725). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Θυλακιώδες-κυττάρων που προέρχονται από καρκινώματα του θυρεοειδούς είναι η πιο κοινή ενδοκρινική κακοήθειες και η συχνότητά τους έχει εντυπωσιακά αυξηθεί τα τελευταία χρόνια [1], [2]. Μεταξύ αυτών, θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (PTC, 80-85% των περιπτώσεων), και θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (FTC, 5-10%) είναι οι πιο συχνές υπότυποι [3]. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι θυλακιώδη-κυττάρων που προέρχονται από καρκίνο του θυρεοειδούς συμπεριφέρεται ως μια σύνθετη ασθένεια, όπου πολλαπλές γενετικές παραλλαγές, που βρίσκεται σε γονίδια χαμηλής διεισδυτικότητα (LPG), αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και με το περιβάλλον, διαμορφώνοντας έτσι την ατομική ευαισθησία [4] – . [6]

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν με τη σύνδεση της

FOXE1

γονίδιο με την ευαισθησία PTC [7], ένα αποτέλεσμα που έχει εκτενώς αναπαραχθεί [8] – [10]. Μέχρι τώρα, οι περισσότερες μελέτες συσχέτισης έχουν επικεντρωθεί στην κύρια αποτελέσματα και προσδιόρισε μόνο μία, ή ένα πολύ περιορισμένο αριθμό, γονίδια που εμπλέκονται στην παθογένεια PTC. Παραλλαγές σε αυτά τα γονίδια εξηγούν ένα σχετικά μικρό ποσοστό των περιπτώσεων. Ενώ επιπλέον γονίδια χαμηλής διεισδυτικότητας μπορούν να ταυτοποιηθούν με μελλοντικές μελέτες των κύριων επιδράσεων, είναι επίσης πιθανό ότι η κοινή παραλλαγές σε διαφορετικά

τόπους

αλληλεπιδρούν για να τροποποιήσει την ευαισθησία. Όταν γενετικές παραλλαγές επηρεάζουν τον φαινότυπο από κοινού σε ένα μη-προσθέτου τρόπο, αυτή η αλληλεπίδραση γονιδίου-γονιδίου που είναι γνωστό ως επίστασης. Η ανίχνευση των επιστατικές αλληλεπιδράσεις αντιπροσωπεύει όχι μόνο στατιστικές, αλλά και υπολογιστικές προκλήσεις [11], [12]. Αυτά μπορούν να ξεπεραστούν με την εστίαση μελέτες συσχέτισης σε γονίδια που

a priori

θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο μαζί, είτε επειδή βρίσκονται στα ίδια μονοπάτια, ή επειδή εκφράζονται διαφορικά σε όγκους του θυρεοειδούς. Ο σχετικός κίνδυνος του καρκίνου του θυρεοειδούς για συγγενείς πρώτου βαθμού probands είναι υψηλότερο από ότι για οποιοδήποτε άλλο μη Μέντελ νεοπλασία [13] – [15], υποδηλώνοντας μια ισχυρότερη γενετική συνιστώσα για την αιτιολογία της και ως εκ τούτου μια πιθανώς μεγαλύτερη πιθανότητα εντοπισμού γονίδιο-γονίδιο αλληλεπιδράσεις.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αποκτήσουν μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα της γενετικής βάσης της PTC με, αφενός την περαιτέρω αξιολόγηση της επιπτώσεις των κοινών παραλλαγών στην υποψήφια γονίδια, και από την άλλη δοκιμών για επιστατικές αμφίδρομη αλληλεπιδράσεις μεταξύ αυτών των παραλλαγών. Για το σκοπό αυτό, μια προσέγγιση ένωση δύο σταδίων, που βασίζεται σε μία από τις μεγαλύτερες διαφοροποιημένων θυρεοειδούς σειρά καρκινοπαθή που περιγράφηκαν μέχρι τώρα. Περιλάμβανε μια ανακάλυψη που από 609 περιπτώσεις και 525 μάρτυρες (σειρά Ι), και δύο ανεξάρτητες σειρές αντιγραφής, η οποία περιλαμβάνει 969 περιπτώσεις και 1040 ελέγχους (σειρά II και III). Εντοπίσαμε και να αναπαραχθεί μια αλληλεπίδραση μεταξύ των παραλλαγών στο

PAX8

και

STK17B

, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να είναι οι νέοι παίκτες της ευαισθησίας του καρκίνου του θυρεοειδούς. Λειτουργικές δοκιμασίες επιβεβαίωσαν ότι η έκφραση αυτών των γονιδίων είναι αντιστρόφως ανάλογη, αν και ο υποκείμενος μηχανισμός που οδηγεί στην ανάπτυξη του καρκίνου δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί.

Αποτελέσματα

Διευρυμένη Σειρά αναπαραγωγής επιβεβαιωθεί περαιτέρω η συμμετοχή των

FOXE1

σε PTC Ευαισθησία

Εμείς περαιτέρω ανεξάρτητα αναπαραχθεί το προηγουμένως αναφερθεί συσχέτιση με κοινή διακύμανση του

FOXE1

γονίδιο [7]. Στο δεύτερο μας, συλλέγονται πιο πρόσφατα ισπανική σειρά ασθενών-μαρτύρων (σειρά III), το οποίο περιλαμβάνει 451 περιπτώσεις PTC και 540 έλεγχοι, επιβεβαιώσαμε την εξαιρετικά σημαντική συσχέτιση για τα λειτουργικά rs1867277 παραλλαγή στο

FOXE1

περιοχή του υποκινητή, σύμφωνα με την ίδια πολλαπλασιαστικό μοντέλο, με ένα OR (ανά αλληλόμορφο) 1,44 (95% CI = 1,19 – 1,74?

P

= 2,0 × 10

-4). Συνολικά, με βάση ένα συνδυασμένο σύνολο των 1358 υποθέσεων PTC και 1551 ελέγχους των λευκών ευρωπαϊκής προέλευσης από την Ισπανία και την Ιταλία, ένας ανά αλληλόμορφο Ή 1,45 εκτιμήθηκε (95% CI = 1,30 – 1,61? P = 4.7 × 10

– 12).

η διαστρωμάτωση των ασθενών παρουσιάζει πιθανό υπότυπο ειδικά Σύλλογοι μεταξύ Ατομική SNPs και καρκίνο του θυρεοειδούς Κίνδυνος

Μετά τον προσδιορισμό του γονότυπου περιπτώσεις και τους ελέγχους στο στάδιο της ανακάλυψης, επιλέξαμε 9 παραλλαγές που βρίσκονται σε 9 διαφορετικά γονίδια για συμπερίληψη στο στάδιο αντιγραφής. Κάθε SNP ήταν είτε η πιο σημαντική tagSNP σε μια δεδομένη

locus

, ή ήταν με συνέπεια προβλέπεται ότι είναι λειτουργικά, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1.

Η

Η πιο σημαντική συσχέτιση στο στάδιο ανακάλυψη ελήφθη για SNP rs2284734 στο

TSHR

γονίδιο (υπολειπόμενο OR = 2,64? 95% CI = 1,69 – 4,13?

P

= 1.8 × 10

-5), γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή της ως παράγοντας κινδύνου ειδικά για την ανάπτυξη του κλασικού PTC. Παρατηρήσαμε επίσης αποδεικτικά στοιχεία ενός υποτύπου-συγκεκριμένο αποτέλεσμα για rs2687834 στο

TG

γονίδιο (υπολειπόμενο OR = 2,28? 95% CI = 1,50 – 3,46?

P

= 1,1 × 10

-4), υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι η διαστρωμάτωση του όγκου φαίνεται να είναι ένα σημαντικό στοιχείο για να εξεταστεί σε μελέτες σύνδεσης. Αυτό δεικνύεται γραφικά στο σχήμα S1. Η ένωση του

TSHR

-rs2284734 με cPTC ήταν οριακά στατιστικά σημαντική στο στάδιο της αναπαραγωγής (υπολειπόμενο OR = 1,42?

P

= 0,058, Πίνακας 1). Οι ενώσεις για τις υπόλοιπες 8 SNPs δεν είχαν αναπαραχθεί.

επιστατικές αλληλεπίδραση μεταξύ

STK17B

και

PAX8

στον καρκίνο του θυρεοειδούς Ευαισθησία

Ανάμεσα σε όλες τις περιπτώσεις PTC, ένα παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση με συνέπεια σε αναλύσεις από τις τρεις μεθόδους? επίστασης μεταξύ των rs721992 και rs6554198 SNP ζεύγους, που βρίσκεται στο

CCDC6

και

KIT

γονίδια, αντίστοιχα, εντοπίστηκε από MDR, SNPHarvester και ΜΒ-MDR (Πίνακας 2). Ωστόσο, αυτή η αλληλεπίδραση δεν έχει αναπαραχθεί σε σειρά ΙΙ και ΙΙΙ (p = 0,13).

Η

Κατά την εξέταση μόνο ασθενείς που διαγιγνώσκονται με cPTC, μία αλληλεπίδραση ανιχνεύεται με τέσσερις από τις πέντε μεθόδους που εφαρμόζονται. Αυτή η αλληλεπίδραση, με τη συμμετοχή SNPs rs4848323 και rs1378624, βρίσκεται στο

PAX8

και

STK17B

γονίδια, αντίστοιχα, παρουσίασαν μια σχετιζόμενη τιμή p από MB-MDR 0.00010 στο στάδιο ανακάλυψη και 0,017 στη φάση αντιγραφής (Πίνακας 3, Σχήμα 1). Η αντίστοιχη τιμή p από την συνδυασμένη ανάλυση των δεδομένων από τα δύο στάδια ήταν 0.00002, εκτιμάται από 100.000 παραλλαγές. Αυτή η αλληλεπίδραση παρατηρήθηκε με συνέπεια από MB-MDR όταν ολόκληρο το PTC περίπτωση σειράς (συμπεριλαμβανομένων όλων των υποτύπων) θεωρήθηκε (p-value = 0,026 και 0,045 για την ανακάλυψη και την αναπαραγωγή στάδια, αντίστοιχα).

Σχετική συχνότητες οι εννέα συνδυασμοί γονότυπου των αναπαραγόμενων αλληλεπίδρασης (

PAX8

–

STK17B

) εμφανίζονται για τις περιπτώσεις και τους ελέγχους (κόκκινο και μπλε στήλες, αντίστοιχα). Το κύτταρο που περιέχει το συνδυασμό γονότυπο υψηλού κινδύνου επισημαίνεται με κόκκινο φως, εκείνοι με συνδυασμούς χαμηλού κινδύνου σε γαλάζιο, και εκείνοι με ουδέτερο συνδυασμοί είναι άχρωμα. Figure1a – με βάση το στάδιο ανακάλυψης (σειρά Ι)? Σχήμα 1β – με βάση το στάδιο αντιγραφής (σειρά II και III)? Σχήμα 1γ -. Βασίζεται σε δύο στάδια σε συνδυασμό (σειρά Ι, ΙΙ και ΙΙΙ)

Η

Για να αποκτήσουν λειτουργικές γνώσεις σχετικά με την αλληλεπίδραση PAX8-STK17B, αξιολογήσαμε για πρώτη φορά την έκφραση αυτών των γονιδίων χρησιμοποιώντας δεδομένα από μια προηγούμενη σειρά που βασίζεται σε μελέτη των 63 όγκων του θυρεοειδούς [16] και παρατηρείται μια αντίστροφη συσχέτιση (r = -0,77? p = 8,65 × 10

-14? Εικόνα S2). Εμείς στη συνέχεια παρατηρείται μια συνεπή αποτέλεσμα σε μια σειρά από καρκίνο του θυρεοειδούς κυτταρικών γραμμών από διαφορετικούς ανθρώπινους όγκους? υψηλή έκφραση STK17B παρατηρήθηκε στις πιο αδιαφοροποίητων ανθρώπινων αναπλαστικό κύτταρα του θυρεοειδούς (8505c, Hth7 και Hth83), οι οποίες χαρακτηρίζονται από πολύ χαμηλή ή μηδενική επίπεδα PAX8 (Σχήμα 2).

Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των δύο γονίδια ήταν καθορίζεται από qRT-PCR και εκπροσωπούνται ως σχετικές μονάδες. Το όνομα της κυτταρικής γραμμής και την προέλευσή του (των ωοθυλακίων, θηλώδες ή αναπλαστικό) ενδείκνυται.

Η

Για να διερευνήσουν τη σχέση μεταξύ PAX8 και STK17B στον καρκίνο του θυρεοειδούς, τα κύτταρα του θυρεοειδούς αρουραίου PAX8-φιμώνονται και η STK17B έκφραση αναλύθηκαν. Μετά από μία ημέρα παροδικών αποσιώπηση PAX8, τα επίπεδα mRNA του PAX8 μειώθηκαν κατά περίπου 70% σε σχέση με τον άγριο τύπο ή στα siScamble επιμολυσμένα κύτταρα. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε μεταβολή στα επίπεδα mRNA του STK17B. επίπεδα πρωτεΐνης PAX8 ήταν επίσης χαμηλότερα στους σιγήσει κύτταρα ενώ τα επίπεδα STK17b παρέμειναν αμετάβλητες σε σχέση με τα siScamble επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 3Α). Για να καθοριστεί εάν η έλλειψη συσχέτισης οφείλεται στην βραχυπρόθεσμη φύση της σίγασης, ένας siPax8-σταθερή κυτταρική γραμμή δημιουργήθηκε και τα επίπεδα της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε 7, 14 και 21 ημέρες μετά την επιμόλυνση. Και πάλι, μια μείωση στα επίπεδα PAX8 βρέθηκε χωρίς ουσιαστική μεταβολή στα επίπεδα STK17B. (Σχ. 3Β).

PCCl3 κύτταρα ήταν παροδικά (Α) ή σταθερά (Β) σιγήσει για την PAX8 παράγοντα μεταγραφής (siPax8). Ως έλεγχος, χρησιμοποιήθηκαν άγριου τύπου ή siScramble επιμολυσμένα κύτταρα. Τα επίπεδα έκφρασης αξιολογήθηκαν μέσω qRT-PCR (Α, άνω πάνελ) ή Western Blot (A, κάτω πάνελ, και Β).

Η

Συζήτηση

Αν και ο αριθμός των προσδιορίζονται LPGs για θυλακιώδες-κυττάρων που προέρχονται από καρκίνωμα του θυρεοειδούς έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια, εξακολουθεί να υστερεί σε σχέση με εκείνη των υπόλοιπων πολύπλοκες ασθένειες. Όπως αναθεωρηθεί πρόσφατα, οι ενώσεις έχουν αναπαραχθεί με συνέπεια για μόνο έναν περιορισμένο αριθμό

τόπους

[4], [6], έτσι ένα μεγάλο μέρος της κληρονομικότητας αυτού του πολυπαραγοντική νόσος παραμένει ανεξήγητη.

καρκίνο του θυρεοειδούς έχει μια ισχυρή γενετική συνιστώσα, με τον σχετικό κίνδυνο για τους συγγενείς πρώτου βαθμού των εξεταζομένων είναι το υψηλότερο μεταξύ των νεοπλασιών που δεν αναγράφουν την τακτική Μέντελ κληρονομικότητα [13] – [15]. Η έμφαση στον προσδιορισμό των νέων γονιδίων μέσω της αξιολόγησης της αλληλεπίδρασης γονιδίων-γονίδιο μπορεί συνεπώς να παρουσιάσει τουλάχιστον μέρος αυτής της ανεξήγητης γενετική συνιστώσα. Τα τελευταία χρόνια, ο μεγάλος αριθμός των παραλλαγών ευαισθησίας που προσδιορίζονται για πολύπλοκες ασθένειες έχει οδηγήσει στην ανάγκη να εκτελούν συγκεκριμένες αναλύσεις για την αξιολόγηση των δυνητικών επιστατικές επιπτώσεις τους. Η σημασία των αναλύσεων αυτών έγκειται κυρίως στην αποκάλυψη πως η παρουσία ενός γενετική παραλλαγή επηρεάζει το αποτέλεσμα της άλλης παραλλαγής [17] – [19].

Αυτές οι επιστατικές αναλύσεις, σε αντίθεση με εκείνες των γενετικών κύριες επιπτώσεις, αποτελούν μια υπολογιστική και στατιστικά πρόκληση. Πολλές μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση επίστασης, αλλά όλοι τους έχουν περιορισμούς και τις επιδόσεις τους είναι μεταβλητή. Επιπλέον, ορισμένες από αυτές τις μεθόδους είναι υπολογιστικά ασύμφορη για τα δεδομένα GWAS [20]. Από μελέτη μας εξέτασε μόνο 768 SNPs σε γονίδια επιλέγονται με βάση τους

a priori

υποθετικό ρόλο στην ασθένεια, ήταν δυνατό να εφαρμοστεί αρκετά πιο πολύπλοκους αλγόριθμους που προέρχονται από συμπληρωματικές στρατηγικές, αυξάνοντας έτσι την ευρωστία της ανίχνευσης αλληλεπίδρασης .

Η χρήση του MB-MDR στο δεύτερο στάδιο αναπαραγωγής σιωπηρή πολλά πλεονεκτήματα, συμπεριλαμβανομένης της δυνατότητας να δοκιμάσουν το ακριβές επιστατικές μοντέλο που προσδιορίζονται στο στάδιο της ανακάλυψης, και τη δυνατότητα να προσαρμόσετε για πιθανούς συγχυτικούς παράγοντες, καθώς και οριακή SNP επιδράσεις, ο τελευταίος για να αποφευχθεί η επίδραση στα αποτελέσματα του SNP ζευγών ενεργεί καθαρώς προσθετικό τρόπο. Επιπλέον, μια ρ-τιμή μετάθεση με βάση θα μπορούσε να ληφθεί εύκολα σε λογικό υπολογιστικό κόστος. Το γεγονός ότι ήμασταν σε θέση να αναπαράγουν μία από τις δύο αλληλεπιδράσεις ανιχνεύεται στο στάδιο της ανακάλυψης είναι απόδειξη για την αξιοπιστία των προτεινόμενων αγωγών μας.

Μέχρι σήμερα, ένα πλήθος από μελέτες που πραγματοποιήθηκαν με μοντέλα μαγιά εντόπισαν κατηγορηματική γονίδιο- γονίδιο αλληλεπιδράσεις [21] – [24]. Αντιθέτως, οι προσπάθειες για τον εντοπισμό επιστατικές ή άλλου είδους αλληλεπιδράσεων στην ευαισθησία ανθρώπινων ασθενειών έχουν αρχίσει σχετικά πρόσφατα για να αποδώσει αποτελέσματα [25] – [29]. Παρ ‘όλα αυτά, λίγα, εάν τυχόν έχουν πειστικά αναπαραχθεί. Η παρούσα μελέτη έχει, για πρώτη φορά, εντοπίστηκαν και ανεξάρτητα αναπαραχθεί ένα επιστατικές συνεργασία με cPTC ευαισθησία της κοινής παραλλαγές σε δύο γονίδια. Αυτή η επιτυχία είναι πιθανό να οφείλεται όχι μόνο για να έχει ένα μειωμένο κατάλογο των υποψηφίων γονιδίων, αλλά και στην υψηλή κληρονομικότητα του καρκίνου του θυρεοειδούς, καθώς και η προσεκτική κλινική χαρακτηρισμό της υπόθεσης σειράς για τον εντοπισμό υποτύπους της νόσου με ελάχιστη σφάλμα.

η ανάλυσή μας των επίστασης, εφαρμόζεται σε μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων που βασίζεται σε μια προσέγγιση υποψήφιο γονίδιο [7], έχει εντοπίσει μια αλληλεπίδραση μεταξύ

PAX8

και

STK17B

. Αυτό και το μέλλον ευρήματα επιστατικές γενετικές συσχετίσεις θα μπορούσαν να είναι το πρώτο βήμα προς μια βαθύτερη βιολογικός χαρακτηρισμός του καρκίνου του θυρεοειδούς.

STK17B

κωδικοποιεί DRAK2, μια κινάση σερίνης-θρεονίνης που εμπλέκονται στη ρύθμιση της απόπτωσης. Αρχικά επιλέγεται ως υποψήφιο γονίδιο για μελέτη βασισμένη σε διαφορική έκφραση της σε όγκους PTC σχέση με το φυσιολογικό ιστό του θυρεοειδούς [7], [16].

PAX8

επιλέχθηκε επειδή είναι ένα πολύ γνωστό παράγοντα θυρεοειδούς μεταγραφής, που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση του θυρεοειδούς, τη ρύθμιση των συγκεκριμένων γονιδίων, και να συγγενείς παθήσεις [30] – [33]. Είναι ενδιαφέρον, μια πρόσφατη μελέτη που συνδυάζει μια ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο θέσεων δέσμευσης PAX8 με προφίλ γονιδιακής έκφρασης έχει οριστεί απόπτωση ως μια σημαντική οδός σύμφωνα με τον κανονισμό PAX8 [34]. Αν και οι λειτουργικές δοκιμασίες που εκτελούνται από siRNA δεν εξηγεί το βασικό βιολογικό μηχανισμό, μελέτες γονιδιακής έκφρασης βασίζεται σε δύο ανθρώπινους όγκους και κυτταρικές σειρές έχουν βρει μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ

PAX8

και

STK17B

. Αυτό το τελευταίο εύρημα επιβεβαιώνει τα ευρήματα από τη μελέτη σύνδεσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα δύο

τόπους

πράγματι αλληλεπιδρούν για να επηρεάσουν την ευαισθησία στην cPTC. Έτσι, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι PAX8 θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στη ρύθμιση του

STK17B

έκφρασης, δείχνοντας σε αυτό το τελευταίο, σχετικά άγνωστο γονίδιο ως ένα νέο υποθετικό παίκτη στο μεταβολισμό του θυρεοειδούς.

Τέλος, , τα αποτελέσματά μας για τα επιμέρους παραλλαγές στο

TSHR

και, ενδεχομένως,

TG

, και η επιστατικές επίδραση της SNPs στο

PAX8

και

STK17B

, όλα τα φαινόμενα ισχυρότερη για συγκεκριμένους υποτύπους της νόσου, τονίζουν την πιθανή σημασία του χαρακτηρισμού του όγκου και διαστρωμάτωση σε μελέτες συσχέτισης. Η ένωση των tagSNP rs2284734 στο

TSHR

με κίνδυνο cPTC ήταν η δεύτερη πιο στατιστικά σημαντική (OR = 2,64? 95% CI = 1,69 – 4,13?

P

= 1.8 × 10

-5), με παρατηρείται σταθερά αποτελέσματα στο στάδιο της αναπαραγωγής (OR = 1,42? 95% CI = 0,99 – 2,03?

P

= 0.058). Αρκετές μελέτες έχουν δείξει σύνδεση μεταξύ

TSHR

και την ευαισθησία της ανάπτυξης αυτοάνοσων παθήσεων του θυρεοειδούς αδένα [35] – [38], ένας από αυτούς που έχουν την ίδια tagSNP (rs2284734). Μια ένωση με τη νόσο του Graves έχει επίσης αναφερθεί [39]. Λίγες μελέτες έχουν αξιολογήσει τη συσχέτιση μεταξύ

TSHR

και τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του θυρεοειδούς και εκείνοι που έχουν, έχουν αναφερθεί αρνητικά αποτελέσματα μέχρι στιγμής [40], [41]. Ωστόσο, προηγούμενες μελέτες έχουν αξιολογήσει μόνο έναν περιορισμένο αριθμό εξονικό

TSHR

παραλλαγές. Φαίνεται πρόωρο να αποκλείσει αυτό το

locus

στην ευαισθησία του καρκίνου του θυρεοειδούς. Πρόστιμο-χαρτογράφηση της περιοχής θα πρέπει να γίνεται προκειμένου να προσδιοριστεί μια λειτουργική παραλλαγή, ενδεχομένως εσονικές ή /και ρυθμιστικές, για να εξηγήσει παρατηρήθηκε σχέση μας με cPTC.

Εν ολίγοις, έχουμε προτείνει πρόσθετα γενετικούς παράγοντες που μπορούν να εξηγήσουν μέρος της άλυτο κληρονομικότητα του καρκίνου του θυρεοειδούς. Εκτός από τον εντοπισμό ενός δυνητικού ρόλου των

TSHR

παραλλαγές cPTC κινδύνου, έχουμε εντοπιστεί και ανεξάρτητα αναπαράγεται για πρώτη φορά μια επιστατικές σχέση μεταξύ του

PAX8

και

STK17B

γονιδίων σε ευαισθησίας στον καρκίνο του θυρεοειδούς. Αυτή η αλληλεπίδραση γονιδίου-γονιδίου αποδεικνύει ότι επιστατικές επιδράσεις μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο για τον καρκίνο του θυρεοειδούς, και θα μπορούσε να εξηγήσει την έλλειψη ενός παρατηρούμενης συσχέτισης για κάθε γονίδιο ξεχωριστά. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να προσδιοριστεί αν οι αλληλεπιδράσεις γονίδιο-γονίδιο μπορεί να είναι χρήσιμα ως δείκτες κινδύνου για θυλακιώδη κύτταρα που προέρχονται από καρκίνους του θυρεοειδούς, καθώς και για άλλους όγκους.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες σε πρωτόκολλα σύμφωνα εγκρίθηκε από την «Comité de bioética y Bienestar ζώων del Instituto de Salud Carlos III» και στην επιτροπή δεοντολογίας του ΕΤΠ (Περιφερειακό Κέντρο Καρκίνου), Πάντοβα, Ιταλία, η οποία ενέκρινε τη μελέτη αυτή

Θέματα

Τρεις σειρές των περιπτώσεων καρκίνου του θυρεοειδούς και οι έλεγχοι είχαν προσληφθεί, όπως περιγράφεται παρακάτω:..

Discovery (σειρά Ι)

Θα προσληφθούν 609 ασθενείς με καρκίνο του θυρεοειδούς από το ισπανικό δίκτυο νοσοκομείο. Αυτά περιλαμβάνονται τα κύρια θυλακιώδη-κυττάρων του θυρεοειδούς προέρχεται καρκινώματα: 520 PTC, εκπροσωπούμενη από τους κύριους υπότυπους «κλασικό PTC» (cPTC? N = 304) και «ωοθυλακίων παραλλαγή PTC» (fvPTC? N = 146)? και 69 θυλακιώδη καρκινώματα του θυρεοειδούς (FTC). Μυελοειδές καρκίνωμα του θυρεοειδούς (MTC) δεν συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη.

Μια σειρά από 525 καρκίνου χωρίς ελέγχους είχαν προσληφθεί από τις ίδιες γεωγραφικές περιοχές που καλύπτονται από τα νοσοκομεία που συμμετέχουν στη μελέτη. Τόσο για την περίπτωση και ελέγχει τη μέση ηλικία ήταν 46 ετών και το θηλυκό: αρσενικό αναλογία των φύλων ήταν 4.6:1

Αναπαραγωγή (σειρά ΙΙ και ΙΙΙ συνδυασμένο)

Μια δεύτερη σειρά ασθενών-μαρτύρων.. (σειρά II) αποτελείται 412 PTC και 44 ασθενείς FTC προσλαμβάνεται σε τρία νοσοκομεία που βρίσκονται στην Ιταλία και 500 έλεγχοι από τις ίδιες τρεις γεωγραφικές περιοχές.

λήφθηκαν Μια τρίτη, ανεξάρτητη ομάδα των ασθενών με καρκίνο του θυρεοειδούς Ισπανικά, συμπεριλαμβανομένων 451 PTC και 62 FTC, καθώς και ένα συμπληρωματικό σύνολο 540 ισπανικές ελέγχου (σειρά III).

σε γενικές γραμμές, η μελέτη αντιγραφή περιελάμβανε 969 περιπτώσεις καρκίνου του θυρεοειδούς των λευκών ευρωπαϊκής καταγωγής, συμπεριλαμβανομένων 863 PTC (582 cPTC και 118 fvPTC) και 106 FTC. Η μέση ηλικία τους ήταν 47 ετών και το θηλυκό: αρσενικό αναλογία των φύλων ήταν 4.4:1. Η μέση ηλικία του συνόλου των 1040 ελέγχων ήταν 53 ετών και το θηλυκό: αρσενικό αναλογία των φύλων ήταν 2.4:1

Οι κλινικοί γιατροί από όλα τα συμμετέχοντα κέντρα συμπλήρωσαν ένα λεπτομερές κλινικό ερωτηματολόγιο για κάθε ασθενή που περιλαμβάνονται προσωπικές και κλινικές πληροφορίες, όπως. ως υπότυπος όγκου και το στάδιο, καθώς και λεπτομέρειες της χειρουργικής επέμβασης, της θεραπείας και της ανάπτυξης της μετάστασης τη διάρκεια της παρακολούθησης

Απομόνωση DNA και Ποσοτικοποίηση

τα δείγματα αίματος ή σάλιου ελήφθησαν από όλες τις περιπτώσεις. και ελέγχους. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος με αυτοματοποιημένες μεθόδους σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Magnapure, Roche, Μαδρίτη, Ισπανία), ή με το χέρι, χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους [42]. Το DNA που εξάγεται από το σάλιο χρησιμοποιώντας το Oragene DNA Kit Αυτο-Συλλογή (DNA Genotek, Οτάβα, Καναδάς). συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά σε όλα τα δείγματα πριν από την γονοτύπου με τη χρήση του αντιδραστηρίου Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen, Eugene, OR, USA).

Gene και Επιλογής SNP

Ενενήντα επτά υποψήφιες γονίδια ήταν επιλεγεί σε μια βιολογικά προσανατολισμένο τρόπο και 768 πολυμορφισμούς μονών νουκλεοτιδίων (SNPs) (Πίνακας S1) εντοπίστηκαν σε αυτό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7].

SNP Γονοτυπικές

SNPs γονότυπος στο στάδιο της ανακάλυψης χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Illumina GoldenGate® γονοτυπικός (San Diego, CA, USA) σύστημα, σε μια Sentrix Universal-96 διάταξη μήτρας πολυ-δείγμα format συστοιχία. Γονοτυπική για το στάδιο αντιγραφή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Kaspar SNP γονοτυπική Συστήματος (Kbiosciences, Herts, UK) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7].

Στατιστική Ανάλυση

Αναχώρηση από την ισορροπία Hardy-Weinberg (HWE ) για όλα τα SNPs ελέγχθηκε σε ελέγχους χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. SNP κύρια αποτελέσματα αξιολογήθηκαν από την εκτίμηση γονότυπο-συγκεκριμένες αναλογίες πιθανοτήτων (OR) μέσω της άνευ όρων λογιστικής παλινδρόμησης, χρησιμοποιώντας ομοζυγώτες από τις πιο συχνές αλληλόμορφο σε ελέγχους ως ομάδα αναφοράς. Για κάθε SNP, η καλύτερη προσαρμοστική γενετικό μοντέλο προσδιορίσθηκε, και η αντίστοιχη τιμή ρ υπολογίστηκε με βάση την στατιστική Wald. Όλα τα μοντέλα προσαρμόστηκαν για την υποτιθέμενη συγχυτικούς παράγοντες ηλικία, το φύλο, και, κατά περίπτωση, τη χώρα. Εκτιμήσαμε ετερογένεια στην υπότυπο καρκίνου του θυρεοειδούς ανά αλληλόμορφο ή χρησιμοποιώντας ένα τεστ πιθανότητα-αναλογία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43]. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS για Windows 17.0 και STATA έκδοση 10®, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

μεθόδων για την αξιολόγηση SNP-SNP Αλληλεπιδράσεις

Δοκιμάσαμε για επίστασης χρησιμοποιώντας περιπτώσεις από ομοιογενείς και σθεναρά εκπροσωπούνται νόσο ομάδες, συμπεριλαμβανομένων των PTC συνολικά και cPTC. Εκτιμήσαμε αμφίδρομη αλληλεπίδραση μεταξύ των SNPs χρησιμοποιώντας πέντε διαφορετικές μεθόδους, Πολλαπλά μείωσης της διάστασης (MDR) [44], [45], μέγιστης εντροπίας υπό όρους Μοντελοποίηση Πιθανότητα (MECPM) [46], SNPHarvester [47], MegaSNPHunter [48], και μοντέλο Βασισμένο – Πολλαπλά μείωσης της διάστασης (MB-MDR) [49]? δείτε Μέθοδοι S1). Έχουμε προσαρμοστεί για το φύλο και την ηλικία κατά το στάδιο της ανακάλυψης, όπου επιτρέπεται από το εν λόγω μέθοδο. Επιλέχθηκαν Μόνο αλληλεπιδράσεις (ζεύγη SNP) που προσδιορίζονται από τουλάχιστον τρεις μεθόδους για την αντιγραφή στη σειρά II και III. Χρησιμοποιήσαμε MB-MDR να δοκιμάσει στο στάδιο της αναπαραγωγής του επιστατικές μοντέλο που προσδιορίζονται στο στάδιο της ανακάλυψης (βλέπε Μέθοδοι S1). Την ηλικία, το φύλο και τη χώρα συμπεριλήφθηκαν ως συμπαράγοντες. MB-MDR αναθέτει κάθε μία από τις εννέα πιθανές συνδυασμένες δύο SNP γονοτύπων σε τρεις κατηγορίες κινδύνου (υψηλή, χαμηλή, και ουδέτερο) με χρήση λογιστικής παλινδρόμησης. Εμείς περιλαμβάνονται η ηλικία, το φύλο και τη χώρα ως συμπαράγοντες και υπολογίζεται p-τιμές βασίζονται σε ένα τεστ μετάθεση [44], [45]. Η αναπαραγωγή των αλληλεπιδράσεων αξιολογήθηκε με αναγκάζοντας τους συνδυασμούς γονότυπου στις κατηγορίες κινδύνου που καθορίζονται στο στάδιο της ανακάλυψης. Αλληλεπιδράσεις με μια σχετική τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκαν αναπαραχθεί. Μια παρόμοια στρατηγική εφαρμόζεται σε συνδυασμένα δεδομένα από δύο στάδια για να αναπαραχθεί αλληλεπιδράσεις.

Λειτουργικές δοκιμασίες

καλλιέργειας κυττάρων.

Οι κυτταρικές σειρές ήταν ευγενική δωρεά από τον Δρ Ηεΐάϊη (SW1736, Hth7 και Hth83 [50]), Δρ Fagin (WRO [51]) και ο Δρ Fusco και ο Δρ Santoro (BCPAP [52] και TPC-1 [53]), ή λαμβάνονται από την γερμανική Συλλογή μικροοργανισμών και καλλιέργεια κυττάρων (Cal62, 8505c) και το Ευρωπαϊκό συλλογή της κυτταρικής καλλιέργειας (NthyORI, FTC133). Όλες οι κυτταρικές σειρές γενετικά δακτυλικά αποτυπώματα και επαλήθευσε να είναι μοναδική και του θυρεοειδούς προέλευσης [54].

PCCl3 κύτταρα είναι μια συνεχής γραμμή των κυττάρων του θυρεοειδούς ωοθυλακίων αρουραίων που εκφράζουν το θυρεοειδή ειδικά μεταγραφικοί παράγοντες Νκχ 2.1, FOXE1, και PAX8. Αυτά αναπτύχθηκαν σε τροποποίηση Coon του F-12 μέσο Ham, συμπληρωμένο με 5% ορό μόσχου δότη και ένα μείγμα έξι-ορμόνη [55].

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν προήλθαν από φυσιολογικό θυρεοειδή ιστό ή από θυλακιώδη , θηλώδες ή αναπλαστικό καρκίνωμα θυρεοειδούς. 8505c, WRO και SW1736 κύτταρα, καθώς και κύτταρα ελέγχου NthyORI3.1 αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI, ενώ FTC133, TPC1, BCPAP και τα κύτταρα Cal62 ήταν αύξηση σε μέσο ϋΜΕΜ, και Hth7 και Hth83 κυττάρων σε μέσο ΜΕΜ. Όλα τα μέσα μαζικής ενημέρωσης συμπληρώθηκαν με 5% ορό εμβρύου μόσχου.

Δημιουργία PCCl3-PAX8-σιγήσει θυρεοειδικών κυττάρων.

Η αποσιώπηση της PAX8 πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα PCCl3 είτε παροδικά είτε σταθερά. Παροδική διαμόλυνση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο μορφομετατροπής siRNA DharmaFECT 1 τόσο για κωδικοποιημένα και για

PAX8

συνθήκες siRNA (Dharmacon, Denver, CO). Σταθερό μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) ελήφθη από μόλυνση με pGIPZ λεντοϊού πλασμίδιο που περιέχει την παρεμβολή αλληλουχία πουρομυκίνης ανθεκτικών PAX8 ή ελέγχου (σκαρφάλωμα) (Open Biosystem, Denver, CO).

Το συνολικό RNA ελήφθη από ελέγχου (άγριου τύπου) και από κύτταρα παροδικά-PAX8-σιωπήσει (si

PAX8

ή ομελέτα siRNA) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) ακολουθώντας το συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή? ημιποσοτική RT-PCR στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [56] χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για PAX8 (

μπροστά

CAAGGTGGTGGAGAAGATTG και

αντίστροφη

GAGGTTGAATGGTTGCTG), STK17B (

μπροστά

CCTGAGTTGGCTGAAATG και

αντίστροφη

TCTGTTGCTGTGGTAATGGG) ή βactin (

μπροστά

CACTCTTCCAGCCTTCCTT και

αντίστροφη

CTCGTCATACTCCTGCTTGCT).

Επικύρωση PAX8 αποσιώπησης και της έκφρασης STK17B ελέγχθηκε είτε με RT-PCR ή με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό αντίσωμα PAX8 ποντικού (Biopat, Μιλάνο, Ιταλία) ή ένα ανθρώπινο αντίσωμα STK17B (RD System, Minneapolis, ΜΝ), αντίστοιχα. βactin επίπεδα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρας φόρτωσης μετά από ανοσοαποτύπωση με ένα ειδικό αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, CA).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Δευτερεύων-συγκεκριμένες αναπαραστάσεις οικόπεδο Μανχάταν από τις διαφορές στις αλληλομορφικές συχνότητες μεταξύ ασθενών και μαρτύρων στη σειρά ανακάλυψη. Άνω πίνακα:. Κλασική PTC

vs

ελέγχους? Κάτω πίνακας: ωοθυλακίων παραλλαγή της PTC

vs

ελέγχους.. Υπογράμμισε περιοχές αντιστοιχούν στις παραλλαγές του

TSHR

και

TG

, ειδικά συνδέονται με κάθε μία από τις προαναφερθείσες υποτύπων PTC, αντίστοιχα. Η εισαχθεί πίνακας δείχνει τα αποτελέσματα για τις δύο πρώτες παραλλαγές σε συγκεκριμένους υποτύπους τους, καθώς και ο ανταποκριτής

P

-τιμές που προκύπτουν από τη δοκιμή πιθανότητα αναλογία, αποδεικνύοντας έτσι την υποτύπου-ειδικότητα του

TSHR

και

TG

ενώσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074765.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Ανεξέλεγκτη ομαδοποίηση για PAX8 και STK17B ανιχνευτές στο παρελθόν δημοσίευσε σειρά μας mRNA, συμπεριλαμβανομένων 63 όγκους του θυρεοειδούς (Montero-Conde et al, 2008- διαιτητή. 26). παρατηρείται μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση (r = -0,77? p = 8,65 × 10

-14). Συντομογραφίες: PTC = θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς? FVPTC = ωοθυλακίων παραλλαγή της PTC? FTC = θυρεοειδή θυλακιώδη καρκίνωμα? FA = Θυλακιώδες Adenoma? PDTC = χαμηλής διαφοροποίησης του θυρεοειδούς καρκίνωμα? ATC = αναπλαστικό καρκίνωμα θυρεοειδούς? Ν = Κανονική Θυρεοειδής

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074765.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Πλήρης κατάλογος των SNPs σπούδασε στη σειρά ανακάλυψη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074765.s003

(DOC)

Μέθοδοι S1.

Σύντομη περιγραφή των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση επιστατικές αλληλεπιδράσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074765.s004

(DOC)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Leticia de la Vega για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια, καθώς και ο Javier Maravall, Ignacio Ramos, Víctor ANDIA, Paloma Rodríguez-Poyo, Amparo Meoro, Luis Arribas, Pedro Iglesias, Javier Caballero, Joaquín Serrano, Antonio Pico, Φρανσίσκο Pomares, Gabriel Giménez, Pedro López-Mondéjar και Cristina Álvarez-Escola, ο οποίος συνέβαλε στην πρόσληψη των ασθενών και τη συλλογή των κλινικών πληροφοριών. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω τον Δρ Έρικ Ηεΐάϊη (Rudbeck Εργαστήριο, Ουψάλα, Σουηδία) Δρ James A. Fagin (Memorial Sloan-Kettering, στη Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) και ο Δρ Alfredo Fusco και ο Δρ Maximo Santoro (Universita Federico II di Napoli, Νάπολη, Ιταλία) για την παροχή των γραμμών κυττάρων.