Αφηρημένο

Σε μη-καρκινικά κύτταρα, φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες υπάρχουν παροδικά, όλο και παροπλισμού, φωσφορυλιώνονται με ειδικές φωσφατάσες που τερματίζουν διάδοση των οδών σηματοδότησης. Σε καρκίνους, συμβαίνουν σε κίνδυνο δραστικότητα φωσφατάσης και /ή έκφραση και συμβάλλουν στην φαινότυπο όγκου. Η φωσφατάση μη-υποδοχέα, PTPN13, έχει πρόσφατα ονομαστεί ένα υποθετικό ογκοκατασταλτικό. Μειώθηκε έκφραση σε καρκίνο του μαστού συσχετίζεται με μειωμένη συνολική επιβίωση. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι PTPN13 ρυθμίζει ένα νέο συγκρότημα σηματοδότησης στον καρκίνο του μαστού που αποτελείται από ErbB2, Src και EphrinB1. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτό το συγκρότημα σηματοδότησης δεν έχει περιγραφεί προηγουμένως. μελέτες συνανοσοκαθίζησης και τον εντοπισμό αποδεικνύουν ότι EphrinB1, ένα υπόστρωμα PTPN13, αλληλεπιδρά με ErbB2. Επιπλέον, το ογκογόνο μετάλλαξη V660E ErbB2 ενισχύει αυτή την αλληλεπίδραση, ενώ Src κινάση μεσολαβεί φωσφορυλίωση EphrinB1 και την επακόλουθη σηματοδότηση ΜΑΡ κινάσης. Μειωμένη λειτουργία PTPN13 περαιτέρω ενισχύει σηματοδότησης. Η ένωση του ογκογονιδίου κινασών (ErbB2, Src), ένας συνδετήρας διαμεμβρανική σηματοδότηση (EphrinB1) και ένα ογκοκατασταλτικό φωσφατάση (PTPN13) δείχνουν ότι EphrinB1 μπορεί να είναι μια σχετική θεραπευτικός στόχος σε καρκίνους του μαστού που φέρουν μεταλλάξεις ErbB2-ενεργοποίηση και μειωμένη έκφραση PTPN13.

Παράθεση: Vermeer PD, Bell Μ, Lee K, Vermeer DW, Wieking BG, Bilal E, et al. (2012) ErbB2, EphrinB1, Src κινάσης και PTPN13 Σηματοδοσίας Complex Ρυθμίζει ΜΑΡ κινάσης Σηματοδοσίας σε ανθρώπινους καρκίνους. PLoS ONE 7 (1): e30447. doi: 10.1371 /journal.pone.0030447

Επιμέλεια: Χριστίνα Lynn Addison, Οτάβα Νοσοκομείο Ίδρυμα Ερευνών, Καναδάς

Ελήφθη: τέταρτης Αυγούστου του 2011? Αποδεκτές: 16 Δεκέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιαν, 2012

Copyright: © 2012 Vermeer et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από 7R01DE018386-03 από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας /Εθνικό Ινστιτούτο Οδοντιατρικής και Κρανιοπροσωπικής Έρευνας και του κράτους της Νότιας Ντακότα Translational Cancer υπο-βραβείο 3SB161. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ErbB2 (Her2) ενίσχυση /υπερέκφραση συμβαίνει σε 20-30% των καρκίνων του μαστού με αποτέλεσμα την επιθετική συμπεριφορά όγκου και κακή πρόγνωση [1], [2]. ενεργοποίηση ErbB2 μέσω ετερο-διμερισμού με άλλα μέλη της οικογένειας ή ομο-διμερισμό με τον εαυτό της (όταν εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα) εκκινεί ενδοκυτταρικά σήματα που καταλήγουν στη μεταγραφή πολλών γονιδίων που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, τη διαφοροποίηση, την εισβολή και τη μετάσταση. Με τον τρόπο αυτό, ErbB2 διαδραματίζει βασικό ρόλο στην ενορχήστρωση επιθετικό φαινότυπο του καρκίνου του μαστού [3]. Η πρόοδος της στοχευμένες θεραπείες όπως trastuzumab, ένα εξανθρωπισμένο αντίσωμα αντι-ΕτοΒ2, βελτιώνει την επιβίωση των ασθενών Her2 καρκίνο του μαστού [4], [5]. Ωστόσο, οι περισσότεροι ασθενείς δεν ανταποκρίνονται στην τραστουζουμάμπη (62-74%), υπόθαλψη

de novo

αντίσταση? εκείνες που ανταποκρίνονται ωφεληθεί σε μεγάλο βαθμό με την αυξημένη πιθανότητα επιβίωσης άνω των πέντε ετών ή να παραμείνουν χωρίς όγκο. Δυστυχώς, το 25% αυτών που ανταποκρίθηκαν αρχικά ασθενείς αργότερα αποτύχει θεραπεία [6] – [9]. Όπως

de novo

αντίσταση, τα μονοπάτια που οδηγούν στην επίκτητη αντοχή trastuzumab παραμένουν ασαφείς [10], [11]. Ενώ σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στην κατανόηση του ρόλου του ErbB2 στην έναρξη του καρκίνου του μαστού και της προόδου, η συντριπτική αντίσταση στη θεραπεία trastuzumab υποδηλώνει ότι επιπλέον σηματοδοτικά μονοπάτια υπάρχουν ότι ο αποκλεισμός αντισωμάτων με τη μεσολάβηση παρακάμψουν ErbB2. Χαρακτηρισμό αυτών των οδών και, το πιο σημαντικό, οι πρωτεΐνες που τους κινεί, θα καθορίσει νέους στόχους για θεραπευτική παρέμβαση που μπορεί εκ νέου να ευαισθητοποιήσει τους ασθενείς Her2 στην τραστουζουμάμπη και να βελτιώσει την επιβίωση.

Εκτός από την ενίσχυση /υπερέκφραση, πολυμορφισμοί σε ErbB2 στο κωδικόνιο 655 (εντός του πεδίου διαμεμβράνης) συσχετίζονται με αυξημένη ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού σε ορισμένους πληθυσμούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι αλλαγές στην αλληλουχία κωδικοποίησης ErbB2 μπορεί επίσης να έχει λειτουργικές συνέπειες που σχετίζονται με τον καρκίνο [12] – [14]. ErbB2 ακολουθίες κωδικοποίησης ενδέχεται να επηρεάσουν τις ενώσεις με πρωτεΐνες συνεργάτης και στη συνέχεια να αλλάξει ErbB2 μεσολάβηση ενδοκυτταρική σηματοδότηση. Έτσι, όπως και η αντίσταση trastuzumab, προσδιορίζοντας αυτά τα μονοπάτια θα είναι κρίσιμη για τον καθορισμό θεραπείες που μπλοκάρουν ή να παρακάμψουν τους, τη βελτίωση της επιβίωσης.

Ενώ η κυρίαρχη φιλο-ογκογόνο λειτουργίες όπως αυτές που περιγράφονται για την κινάσης ErbB2 στον καρκίνο του μαστού συμβαίνουν συχνά σε στερεά όγκων, μεταβολές στη φωσφατάσες επίσης συμβαίνουν και λειτουργούν ως καταστολείς όγκων. Για παράδειγμα, ο μη-υποδοχέα φωσφατάση τυροσίνης πρωτεΐνης, PTPN13 (επίσης γνωστή ως FAP1, PTPL1, PTPLE, PTPBAS, PTP1E? PTP-BL είναι το ομόλογο ποντικού) [15] – [17] έχει πρόσφατα ονομάστηκε μια υποθετική ογκοκατασταλτικό. PTPN13 είναι ένα πολυ-λειτουργική μονάδα που περιέχει φωσφατάση. πέντε PDZ domains αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης του μεσολαβούν ενώσεις με πολλές κυτταρικές πρωτεΐνες και, ως εκ τούτου, υποδεικνύουν ότι PTPN13 μεταλλάξεις μπορεί να τροποποιήσει μια ποικιλία διαφορετικών κυτταρικών λειτουργιών [18], [19]. PTPN13 μεταλλάξεις έχουν, στην πραγματικότητα, έχουν ταυτοποιηθεί σε ορθοκολικό [16], κεφαλής και λαιμού [20] και καρκίνων του ήπατος [17], [21]. Σημαντικά, μειωμένη έκφραση PTPN13 στον καρκίνο του μαστού συσχετίζεται με μειωμένη συνολική επιβίωση [22]. Επιπλέον, έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι μειωμένη έκφραση PTPN13 συνεργεί με ένα ενεργοποιημένο ErbB2 διαμεμβρανική μετάλλαξη (mNeuNT) ενίσχυση της ανάπτυξης του όγκου και εισβολή

in vivo

[23]. Ενώ σε ανθρώπους ενίσχυση /υπερέκφραση του ErbB2 είναι ογκογόνο, στα ζώα ενεργοποίηση μεταλλάξεων διαμεμβρανική ErbB2 απαιτούνται για την ανάπτυξη του όγκου. Έτσι,

in vivo μελέτες

ποντίκι μας απαιτεί τη χρήση mNeuNT, μιας συστατικώς δραστικής μετάλλαξη διαμεμβρανική ErbB2. Ωστόσο, η διαπίστωση ότι η ανθρώπινη πολυμορφισμοί ErbB2 μπορεί να επηρεάσει επικράτηση του καρκίνου του μαστού υποδεικνύει ότι η μελέτη των διαμεμβρανικών ενεργοποίησης ErbB2 μεταλλάξεις σε ζώα (σε απουσία ενίσχυσης /υπερέκφρασης) μπορεί να αποδειχθεί ευεργετική στο πλαίσιο της ανθρώπινης ασθένειας. Ενώ μια μελέτη από τον Zhu

et al.

Υποδηλώνει ότι PTPN13 ρυθμίζει τη λειτουργία ErbB2 άμεσα από απο-φωσφορυλίωση της περιοχής σήματος ErbB2 [24], δεν έχουμε βρει ότι στο σύστημά μας γεγονός που υποδηλώνει ότι PTPN13 και ενεργοποιημένα ErbB2 μόνη της δεν μπορεί λογαριασμό για την ενισχυμένη κατάντη σηματοδότησης, την ανάπτυξη του όγκου, και εισβολή εμφανής σε δημοσιευμένες μελέτες μας [23]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η πρόσθετη τροποποιητές λειτουργούν σε συνέργεια PTPN13 /ErbB2 που παρατηρήθηκε. Εμείς αιτιολογημένη περαιτέρω ότι ένα υπόστρωμα φωσφατάσης PTPN13 με ικανότητες σηματοδότησης μπορεί να είναι ένα τέτοιο υποψήφιο μόριο. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε EphrinB1 [25].

EphrinB1 ανήκει σε μια οικογένεια συνδετών που προσδένονται και ενεργοποιούν Eph υποδοχέων κινασών τυροσίνης. Ephrin συνδέτες είναι μοναδικά, δεσμευτικές και ενεργοποίηση σηματοδότησης από συγγενείς υποδοχείς τους, και οι ίδιοι να γίνουν φωσφορυλιωμένη και την έναρξη τη δική τους καταρράκτες σηματοδότησης. Αυτό εφρίνης ειδικό χαρακτηριστικό που ονομάζεται «αντίστροφη» σηματοδότησης. «Αντίστροφη» σηματοδότησης ακόλουθη δέσμευση υποδοχέα Εφεσ αποτελεί τη συμβατική οδό σηματοδότησης. Ωστόσο, εφρινών είναι επιπόλαιο σε συλλόγους τους και σηματοδότηση συμβαίνει ακόλουθες αλληλεπιδράσεις υποδοχέα μη-Εφεσ [26], [27]. Αυτό το είδος της Ephrin σηματοδότησης είναι μη συμβατική.

Δεδομένου ότι EphrinB1 είναι ένα υπόστρωμα φωσφατάσης του PTPN13, μειωμένη έκφραση PTPN13 ή λειτουργικές μεταλλάξεις PTPN13 (δύο εκ των οποίων εμφανίζονται σε συμπαγείς όγκους) πιθανό αποτέλεσμα την αυξημένη φωσφορυλίωση EphrinB1 και επακόλουθη σηματοδότηση. Στο πλαίσιο του καρκίνου του μαστού, όπου μειωμένη έκφραση PTPN13 συσχετίζεται με κακή επιβίωση, τον καθορισμό των μονοπατιών ενεργοποιούνται απουσία PTPN13 μπορεί να αναγνωρίσει κρίσιμες στόχους για θεραπευτική παρέμβαση και να βελτιώσει την επιβίωση. Έτσι, υποθέσαμε ότι η συνέργεια μεταξύ μείωση PTPN13 και αυξημένη ενεργοποίηση ErbB2 που οδηγεί την ανάπτυξη του όγκου και την εισβολή διαμεσολαβείται μέσω EphrinB1 και, περαιτέρω, ότι EphrinB1 μεσολάβηση σηματοδότηση ενισχύεται σε καρκίνους του μαστού με κίνδυνο έκφραση PTPN13. Εδώ, εμείς περιγράφουμε μία νέα σχέση μεταξύ ErbB2 και EphrinB1. Η έκφραση ενός ενεργοποιημένου μεταλλαγμένου ErbB2 ή υπερ-έκφραση του άγριου τύπου ErbB2 (όπως σε καρκίνους του μαστού Her 2), μαζί με μειωμένη έκφραση ή λειτουργία PTPN13, όχι μόνο ενισχύει το σχηματισμό συμπλόκου, αλλά και οδηγεί σε φωσφορυλίωση EphrinB1 και συναφείς κατάντη σηματοδότησης. Στην έκθεση αυτή, που χαρακτηρίζουν αυτό το συγκρότημα, τα σήματα με τη μεσολάβηση από αυτό, καθώς και τη σημασία της για τον καρκίνο του μαστού. Επιπλέον, δείχνουμε ότι υπάρχει αυτό το συγκρότημα σε άλλα επιθηλιακά κύτταρα και υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση από το συγκρότημα παίζει ένα λειτουργικό ρόλο στην άλλους συμπαγείς όγκους, καθώς και.

Αποτελέσματα

PTPN13 Απώλεια εμφανίζεται σε επιθηλιακούς καρκίνους

μειωμένη έκφραση PTPN13 συσχετίζεται με μειωμένη συνολική επιβίωση στον καρκίνο του μαστού [22]. Έχουμε αναρωτηθεί αν υπήρχε αυτή η σχέση σε όλους τους τύπους των καρκίνων του μαστού ή αν ήταν ειδικά για ένα συγκεκριμένο υπότυπο. Έτσι, αναλύσαμε έναν πίνακα γονιδιακής έκφρασης από 200 καρκίνους του μαστού πρώιμο στάδιο και 7 δείγματα φυσιολογικού μαστού για PTPN13 με ιδιαίτερη προσοχή στην ειδικότητα υποτύπου. Ενώ Her2, αυλού Α, Β αυλού καρκίνοι του μαστού και φυσιολογικά δείγματα στήθους εκφράζουν σχετικά υψηλά επίπεδα PTPN13, βασικοκυτταρικό-όπως (BL) όγκοι εκφράζουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα PTPN13 mRNA (Σχήμα 1Α, ρ = 0,00044 για βασικοκυτταρικό vs. κανονικό). Συγκρίσεις των άλλων υποτύπων με φυσιολογικό μαστό δεν ήταν σημαντικές. Ωστόσο, ενώ τα επίπεδα PTPN13 mRNA σε Her2, αυλού Α και καρκίνων του μαστού αυλού Β δεν είναι διαφορετική από την κανονική του μαστού, τα δεδομένα δεν εξαλειφθεί η πιθανότητα ότι PTPN13 λειτουργικές μεταλλάξεις συμβαίνουν σε αυτούς τους υπότυπους που μπορεί να οδηγήσει σε φαινότυπο παρόμοιο με αυτόν που βρέθηκαν σε του απουσίας.

(A) Σχετική έκφραση PTPN13 mRNA της PTPN13 σε μοριακά χαρακτηρίζεται όγκους του μαστού. Basal-σαν (BL) του καρκίνου του μαστού έκφραση PTPN13 μειώνεται σε σχέση με το φυσιολογικό μαστό (p = 0,00044 για τη βασική vs. κανονικό). (Β) ανάλυση κηλίδας Western των κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού. MDA-ΜΒ231, ΜϋΑ-ΜΒ468, HCC1143, HCC1954 είναι καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού με χαρακτηριστικά καρκίνο BL μαστού. Η κυτταρική σειρά ΒΤ474 έχει Her2 /ErbB2 υπερεκφράζουν χαρακτηριστικά του καρκίνου του μαστού. MCF7 και T47D είναι ο καρκίνος του μαστού κυτταρικές σειρές με αυλού χαρακτηριστικά. ΗΕΚ293 κύτταρα που υπερεκφράζουν PTPN13 χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. καρκινικές κυτταρικές γραμμές (C) BL μαστού, MDA-ΜΒ231 και ΜϋΑ-ΜΒ468, εκφράζουν χαμηλά ή υψηλά PTPN13, αντίστοιχα, αναλύθηκαν με στύπωμα Western. κύτταρα (D) ΗΕΚ293 σταθερά νοκ-κάτω για EphrinB1 (sh EphrinB1) ή ελέγχου αναλύθηκαν με western blot. (Ε) κύτταρα MDA-ΜΒ468 διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδιο στόχευσης shRNA PTPN13 (shPTPN13) ή ένα μη φίμωση κατασκεύασμα shRNA (Μη σίγηση) και αναλύθηκαν με Western Blot για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. κύτταρα (F) HaCaT, μία ανθρώπινη κερατινοκυττάρων κυτταρική γραμμή, και τα κύτταρα UM-SCC84, ένα HPV-αρνητικών κεφαλής και λαιμού πλακώδους κυττάρου γραμμή καρκινώματος, σταθερώς νοκ-κάτω για PTPN13 (sh PTPN13) ή γραμμών ελέγχου αναλύθηκαν με western blot. κύτταρα (G) HaCaT σταθερά νοκ-κάτω για PTPN13 (sh PTPN13) ή υπερ-έκφραση της πρωτεΐνης HPV16 Ε6 (PHV16 Ε6) ή ελέγχου αναλύθηκαν με Western Blot για φωσφορυλιωμένη EphrinB1, φωσφορυλιωμένη Erk1 /2, το σύνολο των Erk1 /2, και GAPDH.

Η

επίσης εξετάσαμε την έκφραση PTPN13 πρωτεΐνης στον καρκίνο του μαστού ορίζεται κυτταρικές σειρές υπο-τύπου [28]. Ενώ η έκφραση PTPN13 ποικίλει μεταξύ των κυτταρικών σειρών, τρεις από τις τέσσερις από τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν εμφάνισαν BL σχεδόν απούσα πρωτεΐνη PTPN13 (Σχήμα 1Β). Οι όγκοι BL περιλαμβάνουν μία ετερογενή ομάδα καρκίνων, αλλά σε γενικές γραμμές, είναι επιθετικοί όγκοι με κακή πρόγνωση [29]. Έτσι, τα ευρήματά μας συνάδουν με εκείνες του Revillion

et al

συσχετισμού μειωμένη έκφραση PTPN13 και την κακή συνολική επιβίωση [22]. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η απώλεια του PTPN13 επιπτώσεων έκφρασης φαινοτύπου του όγκου και δείχνουν ότι PTPN13 διαδραματίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση των επιθηλιακών πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και /ή εισβολή στον καρκίνο του μαστού BL.

PTPN13 αυξήσεις απώλεια φωσφορυλιωθεί EphrinB1 και Erk1 /2

πέντε τομείς ΡΟΖ

PTPN13 που μεσολαβούν ενώσεις με πολλές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων EphrinB1 [19]. Μετά τη δέσμευση, PTPN13 de-φωσφορυλιώνει EphrinB1, κλείνοντας αντίστροφη σηματοδότησης [18], [19]. Για να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα της μειωμένης /χαθεί PTPN13 για φωσφορυλίωση EphrinB1, εξετάσαμε δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού BL: ΜΟΑ-ΜΒ231, εκφράζοντας σχεδόν μη ανιχνεύσιμα πρωτεΐνη PTPN13, και MDA-ΜΒ468, εκφράζουν ενδογενή πρωτεΐνη PTPN13 (Σχήμα 1Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, χαμηλή έκφραση PTPN13 (MDA-ΜΒ231) συσχετίζεται με αυξημένη EphrinB1phosphorylation ενώ ενδογενούς έκφρασης PTPN13 (MDA-ΜΒ468) συσχετίζεται με χαμηλό φωσφο-EphrinB1 (Σχήμα 1 C). Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με EphrinB1 είναι ένα υπόστρωμα PTPN13 φωσφατάση και δείχνουν ότι η μειωμένη έκφραση PTPN13 στον καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές BL αυξάνει τη φωσφορυλίωση της EphrinB1.

Με δεδομένη την ικανότητα EphrinB1 να σηματοδοτήσει, ζητήσαμε περαιτέρω κατά πόσον φωσφορυλιωμένη EphrinB1 συσχετίζεται με αυξημένη κατάντη σηματοδότησης. Μοριακή ανάλυση καρκινωμάτων του μαστού BL δείχνει ότι πολλά προϊόντα γονιδίων του συμπλέγματος BL συνδέονται με την ενεργοποίηση ΜΕΚ /ΕΚΚ, έτσι επιλέξαμε να αναλύσουμε την κατάσταση φωσφορυλίωσης του Erk1 /2 σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές BL [30] – [33]. Βρήκαμε ότι η μειωμένη /απούσα έκφραση PTPN13 (MDA-ΜΒ231) συσχετίζεται με αυξημένη φωσφορυλίωση των ERK1 /2 (Σχήμα 1 C)? ενώ ενδογενούς έκφρασης PTPN13 (MDA-ΜΒ468) συσχετίζεται με μειωμένη Erk1 /2 φωσφορυλίωση. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση EphrinB1 (φωσφορυλίωση) σήματα μέσω της οδού ΜΑΡ κινάσης. Για να ελεγχθεί αυτό, σταθερώς νοκ-κάτω EphrinB1 σε κύτταρα ΗΕΚ293, που επιλέγεται λόγω της ευκολίας τους επιμόλυνσης σε σχέση με κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού. Knock-down των αποτελεσμάτων EphrinB1 σε εμφανή εξασθένηση της φωσφορυλιωμένης Erk1 /2 (Σχήμα 1D) συνάδει με EphrinB1 μεσολάβηση 2 ενεργοποίηση Erk1 /. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία δείχνουν ότι η απουσία PTPN13 αποτέλεσμα αυξημένη ενεργοποίηση EphrinB1 και ταυτόχρονη φωσφορυλίωση Erk1 /2.

Ως περαιτέρω δοκιμή, ενδογενής PTPN13 ήταν παροδικά νοκ-κάτω στα κύτταρα MDA-ΜΒ468 (shRNA μεσολάβηση , shPTPN13). Όπως είχε προβλεφθεί, PTPN13 knock-down αυξημένη φωσφορυλίωση της EphrinB1 συνάδουν με τον κανονισμό PTPN13 της φωσφορυλίωσης EphrinB1 (Σχήμα 1 Ε) [25]. Επιπλέον, η αυξημένη EphrinB1 που σχετίζονται με ErbB2 στα λύματα από τα κύτταρα shPTPN13 γεγονός που υποδηλώνει ότι φωσφορυλιωμένη συνεργάτες EphrinB1 πιο εύκολα με ErbB2 σε σύγκριση με μη φωσφορυλιωμένη EphrinB1. Παραδόξως, PTPN13 knock-down δεν επηρέασε /2 φωσφορυλίωση Erk1, γεγονός που υποδηλώνει ότι είτε EphrinB1 δεν σηματοδοτεί μέσω της οδού ΜΑΡ κινάσης στα κύτταρα MDA-ΜΒ468 ή ότι η σηματοδότηση της διαμορφώνεται σε αυτά τα κύτταρα μέσω πρόσθετων (ακόμη απροσδιόριστη) συστατικά.

Προηγούμενες προσπάθειες από το εργαστήριο μας για να υπερεκφράζουν PTPN13 ηττήθηκαν και η αυξημένη αποτελέσματα έκφρασή του σε κυτταρικό θάνατο, περιορίζοντας έτσι την ικανότητά μας να αναλύσουμε κατάντη αποτελέσματά της [34]. Ως εκ τούτου, δεν μπορέσαμε να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα που υπερεκφράζουν PTPN13 σε MDA-ΜΒ231 κύτταρα τα οποία στερούνται ενδογενούς έκφρασης. Ωστόσο, δεδομένου του επηρεάζει τη φωσφορυλίωση EphrinB1 σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, θα σκεφτεί ότι μια μείωση στην έκφραση ή λειτουργία PTPN13 μπορεί να είναι μια κοινή και, το πιο σημαντικό, ένα βασικό μεταβολή σε άλλους επιθηλιακούς καρκίνους. Για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα, εμείς νοκ-κάτω PTPN13 σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά κερατινοκυττάρων (κύτταρα HaCaT) και αναλύθηκαν του επηρεάζει στη σηματοδότηση. Μειωμένη έκφραση PTPN13 πράγματι ενισχυμένη EphrinB1 και /2 φωσφορυλίωση Erk1 (Σχήμα 1F, HaCaT). Ομοίως, knock-down της PTPN13 στο κεφάλι και το λαιμό από πλακώδες επιθήλιο γραμμή καρκίνωμα, UM-SCC84, οδήγησε σε αύξηση EphrinB1 και /2 φωσφορυλίωση Erk1 (Σχήμα 1F, UM-SCC84). Είναι σημαντικό, προηγούμενες μελέτες επικεντρώθηκαν σε ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) -associated καρκίνους της κεφαλής και του τραχήλου αποδεικνύουν ότι οι ογκοπρωτεΐνη δεσμεύεται HPV16 Ε6 και στοχεύει PTPN13 για την υποβάθμιση [34], [35]. Έτσι, HPV θετικά κύτταρα χρησίμευσαν ως πρόσθετη δοκιμή της λειτουργίας του PTPN13 στην κυτταρική σηματοδότηση, στο πλαίσιο της

ιικά

καρκίνο μεσολάβηση. Έτσι, αναλύσαμε προηγουμένως χαρακτηρίζεται αμυγδαλών ποντίκι επιθηλιακά κύτταρα σταθερά έκφραση HPV16 Ε6 ή εκείνοι σταθερά νοκ-κάτω για PTPN13 [34], [35]. Πράγματι, η ενισχυμένη έκφραση HPV16 Ε6 EphrinB1 και /2 φωσφορυλίωση Erk1, σύμφωνα με μειωμένη /χάσει έκφραση PTPN13. Επιπλέον, knock-down της PTPN13 στο ποντίκι αμυγδαλών επιθηλιακά κύτταρα απέδειξαν ένα παρόμοιο αποτέλεσμα (shPTPN13, Σχήμα 1G). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η μειωμένη έκφραση PTPN13 ενισχύει /2 φωσφορυλίωση EphrinB1 και Erk1 στα επιθηλιακά κύτταρα. Η διαπίστωση ότι οι ιοί HPV υψηλού κινδύνου έχουν εξελιχθεί ένα μηχανισμό για την εξάλειψη των κυτταρικών PTPN13, τονίζει περαιτέρω τη σημασία της PTPN13 ρυθμιστικών λειτουργιών ζωτικής σημασίας σε μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η έκφραση PTPN13 μπορεί να είναι ενδιαφέρον να αξιολογηθεί σε πολλές, αν όχι όλες, συμπαγείς όγκους.

ErbB2 συν-ανοσοκαταβυθίσματα και συν-εντοπίζεται με EphrinB1

Τα παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν ότι η μείωση /έχασε PTPN13 αυξάνει την ενεργοποίηση EphrinB1 που μπορεί στη συνέχεια ρυθμίζουν καθοδικά φωσφορυλίωση των ERK1 /2. Το εργαστήριο μας έχει αποδείξει στο παρελθόν ότι μειώθηκε /χάσει PTPN13 συνεργεί με ErbB2, ενισχυτικά ΜΑΡ κινάσης σηματοδότησης [23]. Έτσι, αναρωτηθήκαμε αν φωσφορυλίωση EphrinB1 και η προκύπτουσα Erk1 /2 σηματοδότησης εμφανίζεται σε ένα ErbB2 μεσολάβηση, μη συμβατικό τρόπο. Ως εκ τούτου, ρωτήσαμε αν συνεργάτες EphrinB1 με ErbB2 και ολοκλήρωσε συν-καθίζηση και μελέτες συν-εντοπισμού. Βρήκαμε ότι EphrinB1 και ErbB2 συν-ίζημα (Σχήμα 2Α) από λύματα που προέρχονται από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού καθώς και κύτταρα HaCaT. Είναι ενδιαφέρον, knock-down της PTPN13 στα κύτταρα HaCaT (shPTPN13) ενισχυμένη pull-down των EphrinB1 με ErbB2, προτείνοντας και πάλι ότι η φωσφορυλιωμένη EphrinB1 συνεργάτες ευκολότερα με ErbB2 από την μη φωσφορυλιωμένη κατάσταση. Επιπλέον, σε όλες τις περιπτώσεις πολλαπλών μορφών EphrinB1 κατεδαφίστηκαν με ErbB2 (Εικόνα 2Α βέλη). Εμείς εικασίες αυτές οι ζώνες αντιπροσωπεύουν διάφορες φωσφορυλιωμένες μορφές, όπως προτείνεται από τον Xu

et al

. Στη μελέτη τους, η μετάλλαξη του EphrinB1 υπολειμμάτων τυροσίνης έχει ως αποτέλεσμα την ειδική απώλεια του EphrinB1 μπάντες που υποδηλώνει ότι οι λωρίδες εμφανείς με κηλίδα western αντιπροσωπεύουν φωσφορυλιωμένες μορφές της πρωτεΐνης [36]. Εναλλακτικά, οι ζώνες μπορεί να αντιπροσωπεύουν μη γλυκοζυλιωμένη ή υποβαθμισμένων EphrinB1 όπως προτείνεται από Makarov

et al

[37]. Ενώ η ταυτότητα αυτών των ζωνών είναι απροσδιόριστη σε αυτή τη μελέτη, διαφορετικά αντισώματα EphrinB1 επαληθευτεί συνανοσοκαθίζησης της με ErbB2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι σημαντικό ότι, ενώ ποικίλες ποσότητες ErbB2 κατεδαφίστηκαν σε όλα τα λύματα δοκιμάστηκαν (σύμφωνα με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης ErbB2), ένα παρόμοιο ποσό των EphrinB1 συνδέθηκε με αυτό. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι υπάρχει ένα όριο στο ποσό των EphrinB1 που συνδέεται με ErbB2? περισσότερο έκφραση ErbB2 δεν έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη συσχέτιση EphrinB1. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αλληλεπίδραση ρυθμίζεται αυστηρά.

(Α) ανάλυση Western blot μιας ανθρώπινης κερατινοκυττάρων κυτταρική γραμμή, κύτταρα HaCaT (έλεγχος καθώς και κύτταρα νοκ-κάτω για PTPN13), και του καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές ( MCF7, ΒΤ474, HCC1953) ανοσοκατακρημνίστηκαν (IP) για ErbB2 και ανοσοστυπώθηκαν (IB) για EphrinB1. Μεμβράνη επανα-διερευνήθηκαν για ErbB2. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β)

En πρόσωπο

συνεστιακή εικόνες των κυττάρων HaCaT immunolocalizing επιφάνεια EphrinB (πράσινο) και το συνολικό ErbB2 (κόκκινο). Πυρήνες είναι αντίθετα με DAPI (μπλε). μπαρ κλίμακα 20 μm. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού: T47D, ΒΤ474 και MCF7. (D) ΗΕΚ293 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με είτε άγριου τύπου PTPN13 ή του μεταλλαγμένου C /S PTPN13 αναλύθηκαν με western blot. (Ε) ΗΕΚ293 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με είτε μόνο του eGFP, ή ένα συνδυασμό EphrinB1, ErbB2 (άγριου τύπου ή mNeuNT), και PTPN13 (άγριου τύπου ή C /S μετάλλαγμα) και αναλύθηκαν με western blot. (F)

En πρόσωπο

συνεστιακή εικόνες των κυττάρων επιμολυσμένων με E επεξεργασία για ανοσοεντοπίσεως της φωσφορυλιωμένη EphrinB (πράσινο) και ErbB2 (κόκκινο). Πυρήνες αντίθετα με DAPI (μπλε). Κλίμακα ράβδου 20 μm.

Η

Co-ανοσοχρώση των ενδογενών ErbB2 και ενδογενείς, επιφάνεια EphrinB σε κύτταρα HaCaT δείχνει ότι ErbB2 και EphrinB συν-εντοπίζεται σε κυττάρου-κυττάρου κόμβων (Σχήμα 2Β). Επιφάνεια EphrinB εντοπίστηκε σε μη σταθεροποιημένα, μη διαπερατά κύτταρα χρησιμοποιώντας EphB1-Fc. EphB1-Fc είναι μια χίμαιρα που αποτελείται από την εξωκυτταρική περιοχή του υποδοχέα EphB1 (α συγγενή υποδοχέα EphrinB) συγχωνευμένο με την ανθρώπινη IgG

1. Έτσι, EphB1-Fc δεσμεύεται σε επιφανειακά εκφραζόμενο συνδετήρες EphrinB. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις στη συνέχεια ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινη IgG-FITC και κύτταρα αναλύονται με συνεστιακή μικροσκοπία. Έτσι, ενώ η χρώση επιφάνεια δεν είναι ειδικά για EphrinB1alone, δεν δείχνουν ότι EphrinB πρωτεΐνες συν-εντοπίζονται με ErbB2. Μαζί με τα δεδομένα ανοσοκαθίζησης, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι EphrinB1 συνεργάτες με ErbB2

Για να εκτιμηθεί η σημασία της ErbB2 /αλληλεπίδραση EphrinB1 στον καρκίνο του μαστού, που αναλύεται: ΒΤ474, ένα Her2 (ErbB2) κυτταρική σειρά?. T47D, ένα αυλού κυτταρική σειρά με υψηλή έκφραση ErbB2? MCF7, μία άλλη κυτταρική γραμμή του αυλού με χαμηλή έκφραση ErbB2 (Εικόνα 1Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο T47D και MCF7 κύτταρα εκφράζουν σχεδόν μη ανιχνεύσιμα PTPN13, ενώ τα κύτταρα ΒΤ474 εκφράζουν ενδογενή PTPN13 (Σχήμα 1Β). Ανοσοκαταβύθιση για ErbB2 που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western για EphrinB1 επιδεικνύει ενισχυμένη EphrinB1 συν-IP σε κύτταρα T47D που συσχετίζεται με υψηλότερα επίπεδα φωσφορυλιωμένου EphrinB1. Το εύρημα αυτό είναι συνεπές με τα προηγούμενα στοιχεία μας υποδηλώνουν ότι φωσφορυλιωμένη συνεργάτες EphrinB1 πιο εύκολα με ErbB2. Επιπλέον, τα κύτταρα T47D επιδεικνύουν ισχυρή φωσφορυλίωση των ERK1 /2, η οποία ήταν ανιχνεύσιμη σε ΒΤ474 και MCF7 κύτταρα (Σχήμα 2C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού με χαμηλή /απούσα έκφραση PTPN13, και υψηλή έκφραση ErbB2, φωσφορυλίωση EphrinB1 ανυψώνεται όπως είναι η σύνδεσή της με ErbB2 και συσχετίζεται με αυξημένη φωσφορυλίωση Erk1 /2. Τα δεδομένα υποδεικνύουν περαιτέρω ότι η έλλειψη αποτελέσματος επί της φωσφορυλίωσης Erk1 /2 σε κύτταρα MDA-shPTPN13 ΜΒ468 (Σχήμα 1 Ε) μπορεί να οφείλεται σε ανεπαρκή έκφραση ErbB2 ή /και σχηματισμού συμπλόκου με EphrinB1.

mNeuNT αυξάνει το σχηματισμό συμπλόκου και σηματοδότηση

Δεδομένου ότι ErbB2 είναι μια κινάση της τυροσίνης και φωσφορυλίωση EphrinB1 ξεκινά αντίστροφη σηματοδότησης, αναρωτηθήκαμε αν ErbB2 φωσφορυλιώνει EphrinB1. Επιπλέον, δεδομένης της επηρεάζει τη φωσφορυλίωση EphrinB1, έχουμε σκεφτεί ότι PTPN13 ρυθμίζει αυτή την ενεργοποίηση. Για να εξεταστεί αυτό, τόσο άγριου τύπου PTPN13 (PTPN13

κβ) καθώς και φωσφατάση null μετάλλαξη (PTPN13

C /S) εξετάστηκαν. Επιπλέον, τα προηγούμενα ευρήματά μας δείχνουν ότι μία ουσιαστικά δραστική ErbB2 διαμεμβρανικό μεταλλαγμένο (V660E, εφεξής mNeuNT) συνεργεί με την απώλεια της PTPN13 και αυξάνει ΜΑΡ σηματοδότησης κινάσης και επεμβατική ανάπτυξη, ενώ άγριου τύπου (ενδογενείς) ErbB2 δεν [23]. Ως εκ τούτου, και οι δύο mNeuNT και άγριου τύπου ErbB2 (wt ErbB2) δοκιμάστηκαν επίσης. Δεδομένων των χαμηλών ενδογενή τους έκφραση PTPN13, ευκολία διαμόλυνση και ισχυρή έκφραση των επιμολυσμένων PTPN13, ΗΕΚ293 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για αυτές τις μελέτες (Σχήμα 2D). Σε αυτά τα πειράματα ΗΕΚ293 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με ErbB2 (είτε άγριου τύπου ή mNeuNT), άγριου τύπου EphrinB1 και PTPN13 (είτε άγριου τύπου ή /S μεταλλαγμένο C) και αναλύθηκαν με western blot.

λύματα Ελέγχου (eGFP) δείχνουν ότι EphrinB1 συν-ανοσοκαταβυθίσματα με ErbB2, αλλά ότι EphrinB1 δεν είναι φωσφορυλιωμένη και Erk1 /2 δεν είναι ενεργοποιημένη (λωρίδα 1, Σχήμα 2Ε). Η έκφραση του φυσικού τύπου ούτε (διαδρομή 2, Εικόνα 2Ε) ούτε C /S PTPN13 (λωρίδα 4, Σχήμα 2Ε) αλλάζει τις παραμέτρους αυτές με την παρουσία του υπερ-εκφράζεται wt ErbB2 και EphrinB1. Σε αντίθεση, η έκφραση του mNeuNT με EphrinB1 όχι μόνο αυξάνει την ποσότητα του EphrinB1 συνδέοντας με αυτό, αλλά επίσης οδηγεί σε EphrinB1 και /2 φωσφορυλίωση Erk1 (λωρίδες 3 και 5, το Σχήμα 2Ε). ΗΕΚ293 κύτταρα εκφράζουν λίγο ενδογενή ErbB2 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)? Επιπλέον, το αντίσωμα αντι-ΕΛΒ2 που χρησιμοποιείται για άνοση καθίζηση αναγνωρίζει τόσο άγριου τύπου ErbB2 και mNeuNT. Έτσι, ενώ οι μελέτες συν-IP δεν μπορούν να διακρίνουν μεταξύ EphrinB1 που σχετίζονται με ενδογενή ErbB2 ή mNeuNT, τα δεδομένα υποστηρίζουν σθεναρά σύνδεσης mNeuNT. Ενώ έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι και μόνο η έκφραση mNeuNT αυξάνει /2 φωσφορυλίωση Erk1 [23], το εύρημά μας ότι η έκφραση του PTPN13

C /S δεν είναι ικανό να μειώσει EphrinB1 και Erk1 /2 phosphoryaltion, υποδηλώνει ότι EphrinB1 μεσολάβηση ανάστροφης σηματοδότηση επίσης συμβάλλει στην Erk1 /2 φωσφορυλίωση (Σχήμα 2Ε, λωρίδα 5, βέλη). Επιπλέον, η έκφραση του άγριου τύπου PTPN13 (διαδρομή 3, Σχήμα 2Ε), αλλά όχι C /S PTPN13 μεταλλαγμένο (λωρίδα 5, Σχήμα 2F), μειώνει την ποσότητα του φωσφορυλιωμένου EphrinB1 και Ρ-Erk -1/2, επίσης συνεπής με φωσφορυλίωση EphrinB1 επηρεάζουν σηματοδότησης ΜΑΡ κινάσης.

Αυτά τα βιοχημικά δεδομένα επιβεβαιώθηκαν με μελέτες ανοσοεντοπισμού από φωσφορυλιωμένη EphrinB (Σχήμα 2F, πράσινο) και ErbB2 (Εικόνα 2F, κόκκινο). Μόνο έκφραση των αποτελεσμάτων mNeuNT στη φωσφορυλιωμένη EphrinB παρόντες στην κυτταρική επιφάνεια (Σχήμα 2F, πάνελ 3 και 4, το κίτρινο υποδεικνύει την έκφραση συν-εντοπισμό των φωσφορυλιωμένων EphrinB και ErbB2). Επιπλέον, μόνο άγριου τύπου PTPN13 μειώνει την ποσότητα του φωσφορυλιωμένου EphrinB στην επιφάνεια των κυττάρων (Σχήμα 2F, συγκρίνετε κίτρινο και πράσινο μεταξύ των πινακίων 3 και 4). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι, 1) mNeuNT συνεργάτες με EphrinB1 και η σύνδεση αυτή ενισχύεται με φωσφορυλίωση EphrinB1, 2) φωσφορυλιωμένη EphrinB1 συσχετίζεται με φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και 3) ότι PTPN13 de-φωσφορυλιώνει EphrinB1 σε αυτό το πλαίσιο.

mNeuNT συν-ανοσοκαταβυθίσματα με και ενεργοποιεί την Src

ErbB2 με τη μεσολάβηση σηματοδότηση συμβαίνει άμεσα μέσω της δραστηριότητας κινάσης του ή από την πρόσληψη της Src σε ένα σύμπλεγμα σηματοδότησης [38]. Επιπλέον, μετά από σύνδεση με τον συγγενή υποδοχέα της Εφεσ, Src φωσφορυλιώνει EphrinB1 [25]. Δεδομένου ότι τόσο άγριου τύπου ErbB2 και mNeuNT περιέχουν ένα πεδίο κινάσης τυροσίνης άγριου τύπου, υποθέσαμε ότι η ενισχυμένη φωσφορυλίωση EphrinB1 και ΜΑΡ κινάσης σηματοδότησης εμφανής στο πλαίσιο της μειώθηκε /χαθεί PTPN13, περιλαμβάνει Src. Έτσι, καθορίζεται για πρώτη φορά να διαπιστωθεί αν Src συνεργάτες με ErbB2, όπως προτείνεται από τη βιβλιογραφία [38]. ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με άγριου τύπου ErbB2 ή mNeuNT και δοκιμάζονται. Ενώ συν-IP του ενεργοποιημένου Src με άγριου τύπου ErbB2 ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμο, ενεργοποιημένα Src που σχετίζεται με mNeuNT (Σχήμα 3Α). Το αντι-ενεργοποιημένο αντίσωμα Src αναγνωρίζει Src τυροσίνης 416 (pSrc-Y416) όταν φωσφορυλιωμένο, ένα site που προωθεί δραστηριότητα Src [39], [40]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι mNeuNT συνεργάτες με ενεργό Src.

(Α) ΗΕΚ293 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με είτε άγριου τύπου ErbB2 ή mNeuNT και αναλύθηκαν με western blot. (Β) ΗΕΚ293 κύτταρα παροδικά διαμολυσμένα με ένα συνδυασμό EphrinB1, mNeuNT, και PTPN13 (άγριου τύπου ή C /S μεταλλαγμένο) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ΡΡ2 και αναλύθηκαν με western blot. κύτταρα (C) μη επιμολυσμένα ΗΕΚ293 αγωγή με αυξανόμενες δόσεις saracatinib και αναλύθηκαν με western blot για την έκφραση των ενδογενών ενεργοποιηθεί Src, συνολικής Src, φωσφορυλιωμένη EphrinB1 και ανοσοκατακρημνίσθηκαν EphrinB1.

Η

Src μεσολαβεί φωσφορυλίωση EphrinB1

Τόσο mNeuNT και Src είναι κινάσες, είτε από τα οποία μπορεί να φωσφορυλιώνει EphrinB1. Επιπλέον, mNeuNT συσχετίζει κατά προτίμηση με ενεργοποιημένο Src (Σχήμα 3Α). Ως εκ τούτου, ελέγξαμε εάν ενεργοποιηθεί Src (αντί mNeuNT) μεσολαβεί φωσφορυλίωση EphrinB1. ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με mNeuNT, EphrinB1 και είτε άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο (C /S) PTPN13 και αναλύθηκαν με western blot. Σε συμφωνία με τα παραπάνω δεδομένα, mNeuNT συν-IPs με ενεργοποιημένο Src και EphrinB1 φωσφορυλιώνεται (Σχήμα 3Β, λωρίδα 1)? PTPN13

C /S ενισχύει τη φωσφορυλίωση EphrinB1 (Σχήμα 3Β, λωρίδα 3). Για να ελεγχθεί ο ρόλος της Src στην φωσφορυλίωση EphrinB1, επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΡΡ2, έναν ισχυρό αναστολέα της Src. Xu

et al

αποδειχθεί στο παρελθόν ότι η θεραπεία με 1 μΜ ΔΜΠ2 αποτελεσματικά μπλοκ μεσολαβεί η Src φωσφορυλίωση EphrinB1 ενώ η θεραπεία με 25 μΜ αποτελέσματα ΔΜΠ2 στο κελί αποκόλληση [36]. Έτσι, σε αυτή τη μελέτη για να εξασφαλιστεί η αποτελεσματική αναστολή των Src, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ ΡΡ2 για ένα μικρό χρονικό διάστημα (4 ώρες). Σε mNeuNT, EphrinB1 και άγριου τύπου PTPN13 επιμολυσμένα προϊόντα λύσης, η θεραπεία ΡΡ2 μείωσε την ποσότητα του ενεργοποιημένου Src που σχετίζεται με mNeuNT και εξασθενεί φωσφορυλίωση EphrinB1 (Σχήμα 3Β, λωρίδα 2). Τα υλικά λύσεως της mNeuNT, EphrinB1 και PTPN13

C /S επιμολυσμένα κύτταρα επηρεάζεται παρομοίως από ΔΜΠ2 γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση EphrinB1 εντός του συγκροτήματος mNeuNT, Src, PTPN13 διαμεσολαβείται μέσω της Src. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η Src, αντί mNeuNT, φωσφορυλιώνει EphrinB1 και την περαιτέρω υποστηρίζει τη δημοσιευμένη βιβλιογραφία και τις δικές μας διαπιστώσεις που PTPN13 είναι υπεύθυνη για την απο-φωσφορυλίωσης EphrinB1 σε αυτό το συγκρότημα.

ΔΜΠ2 είναι μια Src-οικογένειας αναστολέα κινάσης, το κλείδωμα ενεργοποίηση των Lck, Fyn, Src Hck και. Επιπλέον, τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ΡΡ2 χρησιμοποιηθούν κύτταρα ΗΕΚ293 που υπερεκφράζουν PTPN13, ErbB2 και EphrinB1. Έτσι, για να αναστέλλουν πιο επιλεκτικά Src και ο έλεγχος της λειτουργίας της για τη φωσφορυλίωση του ενδογενούς EphrinB1, αναλύσαμε επίσης saracatinib (AZD-0530, επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές [41] – [44]) στην μη-επιμολυσμένα κύτταρα. ΗΕΚ293 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με saracatinib (0, 0.25 μΜ ή 1.0 μΜ) και αναλύθηκαν με western blot. θεραπεία Saracatinib ανέστειλε επιτυχώς ενεργοποίηση Src και μία απόκριση δόσης ήταν εμφανής. Επιπλέον, στην υψηλότερη δόση, υπήρχε μια μείωση στην ποσότητα της φωσφορυλίωσης EphrinB1 (Σχήμα 3C) σύμφωνο με ένα ρόλο για Src στη διαμεσολάβηση φωσφορυλίωση EphrinB1.

EphrinB1 ανοσοϊζήματα με ErbB2 με τρόπο που δεν απαιτεί το εξωκυτταρικό ή C-τερματικό ΡΟΖ μοτίβο

τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ρύθμιση του συμπλέγματος ErbB2 /EphrinB1 μπορεί να μεσολαβήσει σήματα σημαντικά στον καρκίνο του μαστού. Δεδομένου ότι ErbB2 και EphrinB1 αλληλεπιδρούν, λογική σχεδίαση αναστολέων μικρών μορίων για να εμποδίσει την ένωσή τους μπορεί να έχει θεραπευτική αξία. Έτσι, ErbB2 και EphrinB1 μεταλλάξεις δημιουργήθηκαν για να καθορίζουν τις περιοχές αναγκαίες και επαρκείς για την ένωσή τους.

ErbB2 περιέχει δύο μεγάλες εξωκυτταρικές περιοχές που έχουμε ορίσει τους τομείς 1 και 2. ErbB2 εξωκυτταρικό μεταλλάγματα σύνδεσης συνδετήρα διαγραφεί είτε πεδίο σύνδεσης συνδετήρα 1 (Δ 1-174 LBD1) ή και τα δύο τομείς 1 και 2 (Δ 1 έως 487 LBD2) δημιουργήθηκαν. περιοχή PDZ δέσμευσης ErbB2 διαγράφηκε σε τρίτη μεταλλαγμένο (Δ 1251-1255 PDZBD) (Σχήμα 4Α). Όλα τα μεταλλάγματα ErbB2, συμπεριλαμβανομένης της πλήρους πρωτεΐνης άγριου τύπου μήκους, ήταν ΗΑ ετικέτα στο Ν-άκρο. Τα κατασκευάσματα επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293 και αναλύονται για την απώλεια του συν-IP με ενδογενή EphrinB1.