Abstract

επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) είναι ένας μηχανισμός της επίκτητης αντίστασης σε αναστολείς των κινασών υποδοχέα τυροσίνης παράγοντα ανάπτυξης επιδερμικής (EGFR-ΤΚΙδ) σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Οι ακριβείς μηχανισμοί της ΕΜΤ σχετίζονται επίκτητη ανθεκτικότητα σε EGFR-ΤΚΙδ σε NSCLC παραμένουν ασαφείς. Εμείς παράγεται erlotinib-ανθεκτικά κύτταρα HCC4006 (HCC4006ER) από χρόνια έκθεση του

EGFR

μεταλλαγμένου HCC4006 κύτταρα σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib. κύτταρα HCC4006ER απέκτησε φαινότυπο EMT και ενεργοποίηση του TGF-β /SMAD οδού, ενώ λείπει τόσο Τ790Μ δευτεροβάθμιας

EGFR

μετάλλαξη και

ΚΟΑ

ενίσχυση του γονιδίου. Εμείς που απασχολούνται μικροσυστοιχίες γονιδιακής έκφρασης σε HCC4006 και τα κύτταρα HCC4006ER για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της επίκτητης αντοχής EGFR-ΤΚΙ με EMT. Στο επίπεδο mRNA,

ZEB1 (TCF8)

, ένας γνωστός ρυθμιστής της ΕΜΤ, ήταν & gt? 20 φορές υψηλότερη σε κύτταρα HCC4006ER ό, τι σε HCC4006 κύτταρα και αυξημένη ZEB1 επίπεδο πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε επίσης. Επιπλέον, πολυάριθμες

ZEB1

αποκρίνονται γονίδια, όπως

Cdh1 (Ε-καδερίνης)

,

ST14

, και

βιμεντίνη

, έγιναν συντονισμένα ρυθμίζεται μαζί με αυξημένη

ZEB1

στα κύτταρα HCC4006ER. Εντοπίσαμε επίσης ZEB1 υπερέκφραση και ένα φαινότυπο EMT σε διάφορα κύτταρα NSCLC και ανθρώπινα δείγματα NSCLC με επίκτητη αντοχή EGFR-ΤΚΙ. Short-παρεμβολής RNA κατά

ZEB1

αντιστραφεί το φαινότυπο EMT και, το σημαντικότερο, αποκατέστησε την ευαισθησία erlotinib σε κύτταρα HCC4006ER. Το επίπεδο των μικρο-RNA-200C, το οποίο μπορεί να ρυθμίσει αρνητικά ZEB1, ήταν σημαντικά μειωμένη στα κύτταρα HCC4006ER. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αυξημένη

ZEB1

μπορεί να οδηγήσει EMT που σχετίζονται με επίκτητη ανθεκτικότητα σε EGFR-TKIs σε NSCLC. Θα πρέπει να γίνουν προσπάθειες για να εξερευνήσετε τη στόχευση

ZEB1

να επαναευαισθητοποιήσουν ΤΚΙ-ανθεκτική όγκους

Παράθεση:. Yoshida Τ, Τραγούδι L, Bai Υ, Kinose F, Li J, Ohaegbulam KC, et al. (2016) ZEB1 Μεσολαβεί επίκτητη αντοχή σε αναστολείς του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα-Κινάσης Τυροσίνης σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 11 (1): e0147344. doi: 10.1371 /journal.pone.0147344

Επιμέλεια: Pier Giorgio Petronini, Πανεπιστήμιο της Πάρμα, Ιταλία

Ελήφθη: 23 Μάρτη του 2015? Δεκτές: 1 Ιανουαρίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 20 του Ιανουαρίου του 2016

Copyright: © 2016 Yoshida et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. Το σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών υποβλήθηκε στην έκφραση γονιδίων Omnibus (GEO) με τον αριθμό προσχώρησης GSE71587

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από το SPORE Moffitt Κέντρο Καρκίνου στο Καρκίνο του Πνεύμονα (Ρ50-CA119997), NCI 1R01 CA121182, και το Κολοράντο Καρκίνο του πνεύμονα SPORE NCI-CA58187 (HD, PN, RMG). Το έργο αυτό έχει επίσης υποστηρίζεται εν μέρει από το Μοριακής Βιολογίας και αλληλουχίας πυρήνα, ο πυρήνας των ιστών, και την μικροσυστοιχιών Πυρήνα στο H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, ένα NCI οριστεί Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου (P30-CA076292). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά το πλεονέκτημα των αναστολέων υποδοχέα κινάσης της τυροσίνης του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR-ΤΚΙδ) σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), οι ασθενείς με

EGFR

μετάλλαξη [1], επίκτητη αντοχή στην αυτές οι θεραπείες είναι ένα κρίσιμο κλινικό πρόβλημα. Παρά το γεγονός ότι η Τ790Μ δευτεροβάθμιας

EGFR

μετάλλαξη [2] και

ΚΟΑ

ενίσχυση γονιδίου [3] μπορούν να αντιπροσωπεύουν από κοινού το 70% αυτής της αντίστασης, οι μηχανισμοί για το υπόλοιπο 30% είναι ασαφείς. Η επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) έχει αρνητικά που συνδέονται με την ευαισθησία του EGFR ΤΚΙ σε NSCLC [4-7]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτά, πρόσφατες μελέτες ανέφεραν EMT ως πιθανός μηχανισμός της επίκτητης αντοχής EGFR-ΤΚΙ σε NSCLC μοντέλα κυτταρική σειρά [8,9]. Επιπλέον, EMT παρατηρήθηκε σε ένα υποσύνολο των ασθενών με NSCLC που ανέπτυξαν αντίσταση EGFR-ΤΚΙ [10,11]. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μηχανισμοί ΕΜΤ σχετίζονται επίκτητη ανθεκτικότητα σε EGFR-ΤΚΙδ σε NSCLC, καθώς και τις στρατηγικές για την αντιμετώπισή της, παραμένουν ασαφείς [8,9]. Αρκετές οδοί σηματοδότησης, όπως FGFR [6,12], ΤΟΡ-β [8,9], και WNT [13], καθώς επίσης και παράγοντες μεταγραφής, όπως το δάκτυλο ψευδαργύρου E-box δέσμευσης ομοιοακολουθίας 1 (ZEB1) [ ,,,0],14], έχουν εμπλακεί στη διαδικασία της ΕΜΤ.

Η ΕΜΤ επιτρέπει επιθηλιακά κύτταρα να αποκτήσουν φαινότυπο μεσεγχυματικών σχετίζεται με αυξημένη μετανάστευση (για επισκοπήσεις [15-20]). Είναι ένα απαραίτητο μηχανισμό για την πλαστικότητα κατά την ανάπτυξη και την επισκευή των ιστών. Συμμετέχει στην επούλωση των πληγών, την ίνωση, και βλαστικών κυττάρων της βιολογίας και συμβάλλει στην επιδείνωση της ίνωσης οργάνων και καρκίνο ασθένειες που μοιάζουν. EMT ενεργοποιείται σε καρκινικά κύτταρα και εμπλέκονται στην εισβολή, μετάσταση, ιδιότητες στέλεχος-όπως, και η αντίσταση σε συμβατικά αντινεοπλασματικές θεραπείες [15,21,22]. EMT επάγεται από ΤΟΡβ, άλλους αυξητικούς παράγοντες, και υποξία και περιλαμβάνει παράγοντες μεταγραφής όπως σαλιγκάρι, Twist, ZEB1 /ZEB2, και Ε12 /Ε47 να τροποποιήσει το μεταγραφικό μηχανισμό, αλλοίωση της μετάφρασης και της σταθερότητας της πρωτεΐνης, η έκφραση του μη κωδικοποιητικού RNAs, και εναλλακτικό μάτισμα [16,23,24]. Κλασική χαρακτηριστικά της ΕΜΤ είναι η απώλεια της πρόσφυσης κυττάρου-κυττάρου και κυτταροσκελετικές επαναπρογραμματισμό. Low Ε-καδερίνη και η υψηλή βιμεντίνη και Ν-καδερίνης εκφράσεις είναι κλασική δείκτες EMT. Για τον υποκινητή E-cadherin, τα ιστόνης διμεθυλάση LSD1 συνεργάτες με σαλιγκάρι, τον παράγοντα μεταγραφής εμπλέκονται σε πρώιμα στάδια της επαγωγής EMT, γεγονός που υποδηλώνει επιγενετικές τροποποιήσεις κατά τη διάρκεια της EMT [25,26]. Πράγματι, H3K27 ακετυλίωση μειώθηκε σε ZEB1 επαγόμενη EMT στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα [27]. Πρόσφατα, μοριακά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με EMT ορίστηκαν από μια ολοκληρωμένη προσέγγιση στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και επεσήμανε ότι υπάρχει συσχετισμός μεταξύ του κυτταροσκελετού και πρωτεϊνών πρόσδεσης ακτίνης, το φαινότυπο EMT και επεμβατική ιδιότητες [28]. Είναι ενδιαφέρον, EMT είναι παροδική και αναστρέψιμη, και τα νέα κλινική θεραπευτική στόχευση EMT είναι υπό ανάπτυξη [29].

Εμείς ιδρύθηκε κύτταρα HCC4006ER (erlotinib ανθεκτικό) ως μοντέλο της EMT που σχετίζονται με επίκτητη ανθεκτικότητα σε EGFR-TKIs από η χρόνια έκθεση των ευαίσθητων κυττάρων HCC4006 NSCLC περιέχει ένα

EGFR

μετάλλαξη (εξόνιο 19? L747-A750del INSP) με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib. Εξετάσαμε παγκόσμιες αλλαγές στην έκφραση του γονιδίου για τον εντοπισμό μορίων και τις οδούς που θα μπορούσαν να συμβάλουν στην ΕΜΤ σχετίζονται επίκτητη αντοχή EGFR-ΤΚΙ σε NSCLC. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης των μικρο-RNA-200c (miR-200c) εξετάστηκε με βάση τις εκθέσεις ότι το miR-200c ρυθμίζει αρνητικά ZEB1 και τη διαδικασία EMT [30-32].

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

LBH589, erlotinib, BIBW2992, WZ4002, BEZ235 και AZD6244 αγοράστηκαν από Chemie Tek (Indianapolis, IN). PD173074, LY364947, σαλινομυκίνη, και IWP2 αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). CNTO328 παρεσχέθη από Centocor, Inc. (Horsham, ΡΑ). CL-387785 αγοράστηκε από AXXORA (San Diego, CA). Στοκ διαλύματα αυτών των αντιδραστηρίων σε 100% DMSO αραιώθηκαν απευθείας στα μέσα ενημέρωσης να αναγραφόμενες συγκεντρώσεις. Ανθρώπινη ΤΟΡ-β1 αγοράστηκε από την R &?. D Systems (Minneapolis, ΜΝ)

Κυτταροκαλλιέργεια

HCC4006, H1975 και Η358 κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC (American Type Culture Collection). ταυτότητα των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση STR (ACGT, Inc., Wheeling, IL), και τα κύτταρα επιβεβαιώθηκε ότι είναι αρνητικός μυκόπλασμα με PlasmoTest Mycoplasma Detection (InvivoGen, San Diego, CA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Invitrogen, Carlsbad, CA) στους 37 ° C και

2

Δημιουργία EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα 5% CO.

HCC4006ER κύτταρα (erlotinib ανθεκτικά) δημιουργήθηκαν από την έκθεση της HCC4006 κυττάρων που περιέχουν μια

EGFR

μετάλλαξη (εξόνιο 19? L747-A750del INSP) με βαθμιαία αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib, που αρχίζει στις 3 nM , για 3 μήνες. Μετά την αρχική προσαρμογή, η συγκέντρωση erlotinib αυξήθηκε βαθμιαία έως 4 μm. κύτταρα H1975 BIBW-R και H1975 WZ-R που παράγεται από την έκθεση του H1975 κυττάρων που περιέχουν ένα

EGFR

μετάλλαξη (εξόνιο 21? L858R και εξόνιο 20? Τ790Μ) σταδιακά αυξανόμενες συγκεντρώσεις BIBW2992 (μη αναστρέψιμη EGFR-ΤΚΙ afatinib ) ή WZ4002 (Τ790Μ επιλεκτική EGFR-ΤΚΙ), ξεκινώντας από 3 ηΜ, για 3 μήνες. Μετά την αρχική προσαρμογή, η BIBW2992 ή συγκέντρωση WZ4002 αυξήθηκε βαθμιαία σε 3 μΜ ή 15 μΜ, αντίστοιχα. Ενιαία κυτταρικοί κλώνοι αυτών των κυττάρων ελήφθησαν από τη σπορά σε πολύ χαμηλή πυκνότητα.

Κατάσταση του

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις

Σύνολο γονιδιακό DNA από τη γονική και ανθεκτικά κύτταρα παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη DNeasy Blood & amp? Ιστού Kit (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με το εγχειρίδιο του προϊόντος. Η άμεση αλληλούχιση του DNA χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Εφαρμόσαμε επίσης το PCR-εισβολέα δοκιμασία για να δούμε για ήσσονος σημασίας πληθυσμούς κυττάρων μεταλλαγμένων Τ790Μ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34].

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την CellTiter-Glo

® φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητας Δοκιμασία (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 3×10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μαύρο τοίχο πλάκες 96 φρεατίων (NUNC, Κατάλογος Νο 165.305?. Rochester, ΝΥ) και επωάζονται όλη τη νύκτα σε RPMI με 5% FBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε σειριακές αραιώσεις των αναστολέων για 72 ώρες. Πενήντα μικρολίτρα αντιδραστηρίου Glo κυττάρων Titer προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και η φωταύγεια καταγράφηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός VICTOR (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ). Τα αποτελέσματα μετατράπηκαν σε βιωσιμότητα τοις εκατό των κυττάρων με τη σύγκριση σε επεξεργασία με μη επεξεργασμένο (100% βιώσιμα) καλλιέργειες από τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Δείκτης Συνδυασμού (CI) σε δόση IC50 της θεραπείας συνδυασμού υπολογίστηκε από το λογισμικό CompuSyn (https://www.combosyn.com/? ComboSyn, Paramus, NJ). CI & gt? 1, CI = 1, και CI & lt?. 1 δείχνουν ανταγωνιστική, πρόσθετης ύλης και συνεργιστικά αποτελέσματα, αντίστοιχα [35]

array RTK

HCC4006 και HCC4006ER κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο RPMI με 5 % FBS για 24 ώρες μέχρι ~ 80-90% της κυτταρικής συρροής. επίπεδα φωσφορυλίωση πολλαπλών κινασών τυροσίνης υποδοχέα (RTKs), συμπεριλαμβανομένων εκείνων του EGF, FGF, PDGF, ινσουλίνη, VEGF, EPH, οικογένειες AXL, και MER (μεταξύ άλλων), εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ συστοιχίας Proteome Profiler Human Phospho-RTK ( Ε & amp? D Systems) όπως περιγράφεται προηγουμένως [3]

η έκφραση πρωτεΐνης ανάλυση

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ~ 80-90% συρροή πριν από την συγκομιδή και λύση.. Η ανάλυση στυπώματος Western σε λύματα ολόκληρων κυττάρων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Πυρηνικά εκχυλίσματα για την ανίχνευση των παραγόντων μεταγραφής παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]? 25 μg πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν για κάθε δείγματα. Πρωτογενή αντισώματα σε EGFR (# 2232), ΚΟΑ (# 3127), pY1234/Y1235-MET (# 3129), Y1289-Her3 (# 4791), pT705-STAT3 (# 9131), pS536-ΝΡκΒ-p65 (# 3031) , pS465 /467-SMAD2 (# 3101), Akt (# 9272), pS473-Akt (# 9271), Erk (# 9102), pT202 /T204-ΕΚΚ (# 4377), και PARP (# 9542) ελήφθησαν από Cell Signaling (Beverly, ΜΑ). Πρωτογενή αντισώματα προς pY1068-EGFR (# 44-788G) ελήφθησαν από την Invitrogen. Πρωτογενή αντισώματα προς βιμεντίνης (BDB550513) αγοράστηκαν από την BD Biosciences (San Diego, CA). Πρωτογενή αντισώματα για να ZEB1 (sc25388), ινονεκτίνη (sc29011), Her3 (sc285), Ε-καντερίνη (sc8426), Ν-cadherin (sc7939), PTEN (sc7974), σαλιγκάρι (sc28199), Slug (sc15391), Twist (sc6269 ), και Lamin A /C (sc20681) ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Πρωτογενή αντισώματα σε β-ακτίνη (SigmaA-1978) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Χρένου συζευγμένο με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-ποντικού (ΝΧΑ931) και αντι-κουνελιού (NA934V) δευτερογενή αντισώματα ελήφθησαν από την Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Καθιέρωση HCC4006ER κυττάρων με σταθερή υπερέκφραση Her3

Μια πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) ρετροϊικό πλασμίδιο γενναιόδωρα από τον Dr. Florian Grebien και ο Δρ Όλιβερ Hantschel (Cemm Ινστιτούτο, Βιέννη, Αυστρία). Υποκλωνοποίηση του Her3 σε ρετροϊικό πλασμίδιο και καθιέρωση σταθερών κυτταρικών γραμμών με υπερέκφραση διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36,38]. Εν συντομία, ανθρώπινα Her3 cDNA αγοράστηκε από την Addgene (Cambridge, ΜΑ) και ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τον πρόσθιο εκκινητή 5′-CACCATGAGGGCGAACGACGCTCT-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής 5′-CGTTCTCTGGGCATTAGCCTT-3’. Το Her3 PCR προϊόν εισήχθη εντός φορέα pENTR D-ΤΟΡΟ και στη συνέχεια εισάγεται εντός του φορέα pfMSCV C-Strep-HA IRES GFP-GW με πύλη LR ClonaseTM II Enzyme Mix Kit (Invitrogen). Οι ρετροϊοί συσκευάζονται σε κύτταρα ΗΕΚ293 Φοίνιξ από την ATCC (Manassas, VA) και χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα HCC4006ER. Δύο εβδομάδες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα HCC4006ER GFP-θετικά ταξινομήθηκαν από FACSVantage (BD Biosciences) στην Moffitt κυτταρομετρίας ροής πυρήνα.

Μετανάστευση (Ξυστό) προσδιορισμός και φωτομικροσκοπίας

HCC4006 και τα κύτταρα HCC4006ER απλώθηκαν επάνω σε 6-cm πιάτα και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε μέσο RPMI με 10% FBS για να δημιουργήσει συρρέουσες μονοστοιβάδες. Οι κυτταρικές μονοστιβάδες αποξέστηκαν σε ευθεία γραμμή με ένα ρύγχος πιπέτας 1000 μL και επωάστηκαν για επιπλέον 12 ώρες. εμφάνιση των κυττάρων θεωρήθηκε με την Olympus CKX41 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus, Κέντρο Valley, PA) και φωτογραφήθηκαν με Infinity Μία φωτογραφική μηχανή με Infinity Capture /Αναλύστε λογισμικού (Lumenera Corp., Ottawa, ON).

TGF-β1 ELISA

HCC4006 ή HCC4006ER κύτταρα (5 χ 10

5) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επωάστηκαν για μία νύχτα σε RPMI με 10% FBS. Μέσο αντικαταστάθηκε με RPMI χωρίς ορό με ή χωρίς erlotinib (1 μΜ) και επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν για ELISA για ανθρώπινο ΤΟΡ-β1 (R &? D Systems). Παρακάτω το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή

Πλασμίδια και λιποσώματα γονιδιακή μεταφορά

Ο ρεπόρτερ λουσιφεράσης p3TP-Lux περιέχει τρεις επαναλήψεις του ΤΡΑ-αποκριτικού στοιχείου σε σύντηξη με ένα τμήμα του υποκινητή ΡΑΙ-1 (που παρέχεται από J. Massagué, Sloan Kettering,, New York, ΝΥ). pSBE4-Luc περιέχει τέσσερα αντίγραφα του στοιχείου Smad-δέσμευσης (SBE). Παροδικές επιμολύνσεις έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12] με κάποιες τροποποιήσεις. Εν συντομία, το πλασμίδιο DNA (1.7 μg ενός πλασμιδίου ανταποκριτή λουσιφεράσης) αναμίχθηκε με 10 μL του αντιδραστηρίου Fugene (Roche Diagnostic) και επωάζονται για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την προσθήκη σε κυτταρικές καλλιέργειες ημισυρρεόντων σε δίσκους καλλιέργειας ιστών 60-mm. Τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 5 ng /mL ΤΟΡ-β, 1 μΜ erlotinib, ή και τα δύο. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, η ποσότητα του ενζύμου λουσιφεράση δραστικότητα σε κυτταρικά εκχυλίσματα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega Corporation). Είκοσι μικρολίτρα κυτταρικά εκχυλίσματα προστέθηκαν σε 100 μL του αντιδραστηρίου λουσιφεράσης, και η ποσότητα του φωτός που παράγεται μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Barthold φωτόμετρο (Wallac, Inc., Gaithersburg, MD). Η ποσότητα της πρωτεΐνης που υπάρχει στα κυτταρικά εκχυλίσματα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Bio-Rad Bradford.

απομόνωση RNA και τον καθαρισμό

Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο RPMI με 10% FBS για 48 ώρες στους ~ 80-90% του κυτταρικού συρροή. Ολικό RNA συλλέχθηκε μέσω RNeasy Mini Kit (Qiagen) ακολουθώντας το εγχειρίδιο του προϊόντος. Για να εξασφαλιστεί mRNA υψηλής ποιότητας για μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης, HCC4006 και HCC4006ER συνολικό RNA εξετάστηκε από Bioanalyzer στον ιστό Πυρήνα Moffitt.

Gene μικροσυστοιχιών έκφρασης και βιοπληροφορική ανάλυση

Για κάθε κυτταρική σειρά, το σύνολο των RNA από δείγματα εις τριπλούν παρασκευάστηκε και αναμίχθηκε εξίσου. Δείγματα RNA (10 μg για κάθε κυτταρική σειρά? 500 ng /μL) αναλύθηκαν με Affymetrix Gene χαρακτηρισμού Array τσιπ HG-U133 (Affymetrix, Santa Clara, CA) σε Moffitt Microarray Core. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας MAS5, και οι διαφορές στην πολλαπλή μεταβολή υπολογίστηκαν μεταξύ HCC4006ER και HCC4006 κύτταρα (HCC4006ER /HCC4006). Μια θετική πολλαπλή μεταβολή έδειξε μια υψηλότερη αναλογία σε κύτταρα HCC4006ER, ενώ μια αρνητική πτυχή-μεταβολής υψηλότερη έκφραση σε HCC4006 κύτταρα. Αλλαγές στην έκφραση γονιδίων ± 1,5-φορές θεωρούνται σημαντικές [39]. σετ Gene αναλύθηκαν με MetaCore (https://portal.genego.com? MetaCore, CA) [40]. τα δεδομένα του δικτύου εντάχθηκαν και οπτικοποιούνται με Cytoscape (https://cytoscape.org/) [41]. μικροσυστοιχιών σύνολο δεδομένων μας υποβλήθηκε στην έκφραση γονιδίων Omnibus (GEO), με τον αριθμό προσχώρησης GSE71587.

Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση

Μετά την απομόνωση του RNA όπως παραπάνω, ποσοτική πραγματικού χρόνου RT -PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [14,42]. Έχουν αναφερθεί στο παρελθόν εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για ZEB1, σαλιγκάρι, Slug, E-cadherin, EpCAM, ESRP1, ST14, βιμεντίνη, Ν-cadherin, και FGFR1 [14].

ZEB1 υπερέκφραση σε Η358 κύτταρα

Το γονίδιο ZEB1 κλωνοποιήθηκε σε pcDNA5-FRT-TO και διαμολύνθηκε σε κύτταρα Η358-FlpIn TRex ακολουθούμενη από επιλογή για αντίσταση σε 5 μg /mL βλαστισιδίνη και 100 μg /mL υγρομυκίνη, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. 6-myc-ZEB1 υπερέκφραση προκλήθηκε σε σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας 10 ng /mL δοξυκυκλίνη για 5 ημέρες.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση ZEB1

Η ανοσοϊστοχημική χρώση για ZEB1 διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14] . Εν συντομία, φέτες όγκου εγκλεισμένες σε παραφίνη αποπαραφινοποιήθηκαν σε Histoclear και επανυδατώθηκαν ακολουθούμενη από ανάκτηση αντιγόνου σε βραστό Antigen αποκάλυψης Solution. Τα δείγματα όγκων είχαν συλλεχθεί από χειρουργικά δείγματα, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [10]). ενέκρινε γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις την επιτροπή δεοντολογίας για τη χρήση των δειγμάτων ιστού του όγκου ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς ή από τους νόμιμους κηδεμόνες τους (επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου της εργασίας και του περιβάλλοντος, την Ιαπωνία? IRB αριθμό 08-05). Ενδογενών υπεροξειδασών ανεστάλησαν (0,3% Η

2O

2) και ιστοί διαπερατά με 0,5% Triton (20 λεπτά). Τα πλακίδια αποκλείσθηκαν με 3% ορό BSA /5% κατσίκα, επωάστηκαν για 2 ώρες με πρωτεύον αντίσωμα κουνελιού αντι-ZEB1 (1:50), και πλύθηκαν εκτεταμένα. Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα με βιοτινυλιωμένα αντισώματα αντι-κουνελιού, πλύθηκε και αναπτύχθηκε με Vectastain ABC, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Vector Laboratories, Inc.).

Η ποσοτικοποίηση του miR-200c

Ολικό RNA εξήχθη από ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Η αντίστροφη μεταγραφή για τις ώριμες miR-200c και RNU6B διεξήχθη με 20 ng ολικού RNA με το κιτ TaqMan microRNA αντίστροφης μεταγραφής που περιλαμβάνει ο MuLV αντίστροφη μεταγραφάση (Applied Biosystems, Foster City, CA). Η αντίστοιχη δοκιμασία TaqMan microRNA χρησιμοποιήθηκε για ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου με το σύστημα GeneAmp 7500 (Applied Biosystems). Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό των RNU6B, 100×2

-ΔCt, όπου ΔCt = Ct

miR-200c- Ct

RNU6B.

Η επιμόλυνση της σύντομης παρεμβολής RNA

προ-επικυρωμένες μικρής παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA? Invitrogen, Κατάλογος Νο HSS110549.) χρησιμοποιήθηκαν για την αναστολή της ενδογενούς ZEB1. ON-TARGET καθώς και μη-Στόχευση αρνητικό πισίνες ελέγχου ελήφθησαν από Dharmacon (Lafayette, CO) και χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Επιμόλυνση διεξήχθη με Lipofectamine RNAiMAX από Invitrogen χρησιμοποιώντας τη διαδικασία αντιστροφής της επιμόλυνσης, όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή.

Αποτελέσματα

Η χρόνια έκθεση στην erlotinib της HCC4006 κυττάρων δημιουργεί σταθερές κυτταρικές αυτόνομων αντοχή σε EGFR-TKIs χωρίς Τ790Μ ή

ΚΟΑ

ενίσχυση

Για να δημιουργήσετε EGFR-ΤΚΙ-ανθεκτικών κλώνων από ένα

EGFR

μεταλλαγμένου κυτταρική σειρά NSCLC, εκθέσαμε EGFR-ΤΚΙ-ευαίσθητα κύτταρα HCC4006 με

EGFR

μετάλλαξη (εξόνιο 19? L747-A750del INSP) με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib (έως 4 μΜ) για 3 μήνες. κύτταρα HCC4006ER έγινε ιδιαίτερα ανθεκτικά τόσο erlotinib και τη μη αναστρέψιμη EGFR-ΤΚΙ, CL387,785 (Σχήμα 1Α). Αυτή η αντίσταση ήταν σταθερή, δεδομένου ότι δεν αναστράφηκε με καλλιέργεια κυττάρων HCC4006ER για έως 6 μήνες σε erlotinib μέσο ελεύθερο (S1 Εικ). Ιδρύσαμε επίσης 5 μόνο κύτταρο κλώνους κυττάρων HCC4006ER (HCC4006ER-S1 για να -S5 κύτταρα), τα οποία ήταν το καθένα ξεχωριστά ανθεκτικά στην erlotinib στον ίδιο βαθμό με τον πληθυσμό μεγαλύτερο μέρος HCC4006ER (S2A σχήμα). Έτσι, το ανθεκτικό φαινότυπο ήταν σταθερό και κυττάρων αυτόνομα.

Α, HCC4006 και HCC4006ER κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 72 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib ή CL387,785. Τα δεδομένα που παράγονται με τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (CellTiter-Glo) που εκφράζεται ως ποσοστό της τιμής για τα μη κατεργασμένα κύτταρα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Β, HCC4006 και HCC4006ER κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες σε ~ 80-90% της κυτταρικής συρροής. Ολόκληρο κυτταρικό λύμα από κάθε κυτταρική σειρά συλλέχθηκε και υποβλήθηκε σε Proteome Profiler Human Phospho-RTK Kit Array να εξεταστούν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των πολλαπλών RTKs. ανιχνεύονται φωσφο-RTKs στη συστοιχία κύκλο. Οι κηλίδες στις τέσσερις γωνίες της συστοιχίας RTK είναι θετικοί έλεγχοι. C, HCC4006 και HCC4006ER κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες ± erlotinib (1 μΜ). λύματα κυττάρων υποβλήθηκαν σε ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης με αντισώματα για να pEGFR, EGFR, pMET, ΚΟΑ, pHer3, Her3, PTEN, pAkt, Akt, Perk, Erk, και β-ακτίνη.

Η

Εξετάσαμε το

EGFR

κατάστασης του γονιδίου τόσο ευαίσθητα και ανθεκτικά κύτταρα για τη δευτερογενή μετάλλαξη Τ790Μ στο εξώνιο 20. Αν και τα κύτταρα HCC4006ER διατηρούνται εξόνιο 19 L747-A750del Insp, Τ790Μ δεν ανιχνεύθηκε ακόμη και με την PCR-εισβολέα δοκιμασία [34], η οποία είναι περισσότερο ευαίσθητη από την άμεση αλληλούχιση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, δεν βρήκαμε

KRAS

μεταλλάξεις hotspot (εξόνιο 1 G12V και εξόνιο 2 Q61H? Δεδομένα δεν παρουσιάζονται), η οποία συνδέεται με την πρωτογενή αντοχή EGFR-ΤΚΙ σε NSCLC [43]. Για να διερευνήσουν άλλα ανέφεραν μηχανισμούς αντίστασης EGFR-ΤΚΙ όπως

ΚΟΑ

ενίσχυσης [3], η ενεργοποίηση του IGFR σηματοδότησης [44], ή απώλεια του PTEN πρωτεΐνης [45], εξετάσαμε βασικά μόρια της οδού EGFR από κηλίδα Western και απασχολούσε μια σειρά φωσφο-RTK με την έρευνα για διάφορες ενεργοποιηθεί RTKs. Ωστόσο, παρατηρήσαμε κανένα μηχανισμό που είχαν διαπιστωθεί αντίσταση σε EGFR-ΤΚΙ, συμπεριλαμβανομένων υπερεκφράζεται ΚΟΑ ή δραστηριότητα IGFR (Εικόνα 1Β) ή απώλεια της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης στα κύτταρα HCC4006ER (Σχήμα 1C). Από την άποψη της σηματοδότησης EGFR, η ικανότητα της erlotinib να αναστέλλουν φωσφορυλίωση του EGFR διατηρήθηκε στα δύο κύτταρα HCC4006 και HCC4006ER. Ωστόσο, τα επίπεδα φωσφο-Akt και ERK ήταν ευαίσθητα στην erlotinib μόνο στα γονικά κύτταρα HCC4006, σε αντίθεση με HCC4006ER κύτταρα (Σχ 1C).

Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι Her3 μεσολαβεί ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σηματοδότησης σε gefitinib- ευαίσθητο NSCLC κυτταρικές σειρές [46]. Ωστόσο, κηλίδα Western μας αναλύσεις έδειξαν ότι κύτταρα HCC4006ER χάσει εντελώς την έκφραση της πρωτεΐνης Her3 σε σύγκριση με HCC4006 κύτταρα, εξηγώντας την απώλεια της φωσφορυλίωσης Her3 σε αυτά τα κύτταρα παρατηρείται στη συστοιχία RTK και ανάλυση Western (Σχήμα 1Β και 1Γ). Για να προσδιορίσετε αν η απώλεια HER3 θα μπορούσαν να εξηγήσουν την αντίσταση στην erlotinib σε κύτταρα HCC4006ER, δημιουργήσαμε Her3 υπερεκφράζουν κύτταρα (κύτταρα HCC4006ER-Her3) χρησιμοποιώντας λεντοϊού λοίμωξη να εξετάσει τις επιδράσεις της erlotinib στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την πορεία του EGFR. κύτταρα HCC4006ER-Her3 διατηρείται η αντοχή τους σε erlotinib (Σχήμα 2Α), καθώς και την εμμονή της φωσφο-Ακί και φωσφο-ΕΚΚ (Εικόνα 2Β), παρόμοια με τα αρχικά κύτταρα HCC4006ER και ελέγχου προερχόμενων από φακοϊούς υπερέκφραση GFP (HCC4006ER-GFP). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η απώλεια Her3 δεν οδηγούν erlotinib αντίσταση στα κύτταρα HCC4006ER.

Ένα, HCC4006ER κύτταρα με σταθερή GFP ή Her3 υπερέκφραση (HCC4006ER-GFP και τα κύτταρα HCC4006ER-Her3), καθώς και HCC4006 και τα αρχικά κύτταρα HCC4006ER υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 72 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib. Τα δεδομένα που παράγονται με τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (CellTiter-Glo) που εκφράζεται ως ποσοστό της τιμής για τα μη κατεργασμένα κύτταρα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Β, HCC4006, HCC4006ER, HCC4006ER-GFP, και HCC4006ER-Her3 κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες ± erlotinib (1 μΜ). Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης με αντισώματα σε HER3, pEGFR, EGFR, ΡΤΕΝ, pAkt, Akt, Perk, Erk, και β-ακτίνης. C, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία HCC4006ER για 72 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib μόνο, BEZ235 μόνο, AZD6244 μόνο, ή BEZ235 και AZD6244 σε συνδυασμό. HCC4006 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 72 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της erlotinib για 72 ώρες για να χαράσσεται καμπύλη αναφοράς. Τα δεδομένα που παράγονται με τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (CellTiter-Glo) που εκφράζεται ως ποσοστό της τιμής για τα μη κατεργασμένα κύτταρα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. δείκτης συνδυασμού (CI) σε δόση IC50 του BEZ235 σε συνδυασμό με AZD6244 υπολογίστηκε από το λογισμικό CompuSyn. CI & gt? 1, CI = 1, και CI & lt? 1 δείχνουν ανταγωνιστική, πρόσθετο, και συνεργιστικές επιδράσεις, αντίστοιχα. D, οι δύο HCC4006 και τα κύτταρα HCC4006ER επωάστηκαν για 6 ή 24 ώρες ± erlotinib (1 μΜ), BEZ235 (500 ηΜ), ή AZD6244 (1 μΜ) όπως υποδεικνύεται. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης με αντισώματα σε pEGFR, EGFR, pAkt, Akt, Perk, και Erk (δείγματα από 6 ώρες) ή να PARP μαζί με αντισώματα σε β-ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης (δείγματα των 24 ωρών).

η

με επίμονη φωσφορυλίωση της Akt και ERK σε κύτταρα HCC4006ER, εξετάσαμε τα αποτελέσματα του αναστολέα της PI3K /mTOR, BEZ235 και του αναστολέα ΜΕΚ, AZD6244. Παρατηρήσαμε ότι φωσφο-Akt ενεργοποιείται μέσω της αναστολής φωσφο-ΕΚΚ με AZD6244 και στα δύο κύτταρα HCC4006 και HCC4006ER. Αυτό φωσφο-Ακί ενεργοποίηση που επάγεται από AZD6244 δεν ανεστάλη πλήρως από BEZ235 σε HCC4006 και HCC4006ER κύτταρα (Σχ 2D). Ο συνδυασμός του BEZ235 και AZD6244 δεν αποκατέστησε την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ή διάσπαση PARP σε κύτταρα HCC4006ER επάγεται από την αγωγή erlotinib σε HCC4006 κύτταρα, αν και Δείκτη Συνδυασμού (CI) αυτού του συνδυασμού δείχνει συνεργική δράση (CI & lt? 1) (Σχ 2C και 2D ). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η διπλή αναστολή των Akt και ERK δεν ξεπεραστεί erlotinib αντίσταση σε κύτταρα HCC4006ER, αν και φωσφο-Akt και ERK ήταν συνεχώς ενεργοποιημένο ανεξάρτητο από μονοπάτι EGFR.

κύτταρα HCC4006ER παρουσιάζουν φαινότυπο EMT με την ενεργοποίηση του TGF-β /SMAD οδού

Για να καθοριστεί εάν η αντίσταση στα κύτταρα HCC4006ER συνδέθηκε με μια διαδικασία EMT, ελέγξαμε τη μετανάστευση των κυττάρων χρησιμοποιώντας δοκιμασίες μηδέν. Σε κύτταρα HCC4006ER, το διάκενο ήταν τελείως κλειστός μέσα σε 12 ώρες, ενώ περισσότερο από 12 ώρες που απαιτούνται στα γονικά κύτταρα HCC4006 (Σχήμα 3Α). Βρήκαμε επίσης ότι πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCC4006ER ήταν σημαντικά βραδύτερη από ό, τι τα γονικά κύτταρα (Σχήμα 3Β), σύμφωνα με τις πρόσφατες μελέτες που προτείνουν βραδύτερη ανάπτυξη των κυττάρων ανθεκτικών στα φάρμακα [47]. Αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι η EMT συνδέεται με την πρωτογενή και επίκτητη αντοχή σε EGFR-ΤΚΙ σε NSCLC [4-11]. Η αυξημένη μετανάστευση, την αντίσταση erlotinib και μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCC4006ER ήταν σύμφωνα με μια διαδικασία EMT. Να εξετάσει περαιτέρω τη δυνατότητα αυτή, ψάξαμε για EMT που σχετίζονται με μόρια στα κύτταρα HCC4006 και HCC4006ER. Είναι σημαντικό, βρήκαμε απώλεια Ε-καδερίνης και προς τα πάνω ρύθμιση του Ν-καδερίνης, βιμεντίνη, και ινονεκτίνη σε κύτταρα HCC4006ER, τα οποία δεν επηρεάσθηκαν από κατεργασία erlotinib (Σχήμα 3C). Επιπλέον, βρήκαμε ότι όλοι μόνο κύτταρο-ανθεκτικοί κλώνοι (HCC4006ER-S1 έως -S5) είχαν υποβληθεί σε EMT, καθώς και την απώλεια του Her3 πρωτεΐνη, παρόμοια με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν στα αρχικά κύτταρα HCC4006ER (S2B Εικ). Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η διατήρηση του gefitinib εμπόδισε τη διαδικασία EMT και ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων σε κύτταρα NSCLC gefitinib ανθεκτικά με

ΚΟΑ

-amplification (αλλά χωρίς EMT φαινότυπο) [48]. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης των δεικτών EMT (Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, βιμεντίνη και ινωδονεκτίνης) δεν επηρεάσθηκαν από συνεχίζει έκθεση της erlotinib για 72 ώρες σε κύτταρα HCC4006ER (S3A Εικ). Επιπλέον, η ικανότητα της μετανάστευσης στα κύτταρα HCC4006ER ήταν ακόμη υψηλότερο από εκείνο της HCC4006 κύτταρα ακόμη και επωάζονται με erlotinib (S3b σχήμα). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η EMT φαινότυπο στα κύτταρα HCC4006ER ήταν σταθερή ανεξάρτητα από την παρουσία της erlotinib.

Α, Μονοστιβάδες HCC4006 και τα κύτταρα HCC4006ER αποξέστηκαν σε ευθεία γραμμή με ένα ρύγχος πιπέτας 1000-μι. Μονόφυλλο φωτογραφίες με γρατσουνιές ελήφθησαν μετά από 12 ώρες επώασης. Β, HCC4006 και HCC4006ER κύτταρα απλώθηκαν σε 1×10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε μαύρο τοίχο πλάκες 96-φρεατίων, επωάστηκαν σε RPMI με 10% FBS και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για υποδεικνυόμενη ημέρα. Τα δεδομένα που παράγονται με τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (CellTiter-Glo) που εκφράζεται ως ποσοστό της τιμής για τα μη κατεργασμένα κύτταρα. Οι προσδιορισμοί έγιναν εις τριπλούν. Μπαρ, SEM. * P & lt? 0,0001 για HCC4006 έναντι HCC4006ER (Student

t

test). C, HCC4006 και HCC4006ER κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες ± erlotinib (1 μΜ). Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης με αντισώματα προς Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, βιμεντίνη, ινωδονεκτίνη, και β-ακτίνης. D, HCC4006 και HCC4006ER κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες ± ΤΟΡ-β1 (10 ng /ml) ή ερλοτινίμπη (1 μΜ), όπως υποδεικνύεται. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης με αντισώματα προς pSMAD2 και σε β-ακτίνη. Ε, HCC4006 ή HCC4006ER κύτταρα επωάστηκαν για μία νύχτα. Μέσο αντικαταστάθηκε με RPMI χωρίς ορό με ή χωρίς erlotinib (1 μΜ) και επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ΤΟΡ-β1 ELISA. Οι προσδιορισμοί έγιναν εις τριπλούν. Μπαρ, SEM. *

P

& lt? 0,0001 έναντι HCC4006 κύτταρα με ή χωρίς επεξεργασία erlotinib (Student

t

test). F, ΤΟΡ-β επαγόμενη μεταγραφή αυξάνεται με την ταυτόχρονη αγωγή με ΤΟΡ-β και erlotonib σε παροδικές επιμολύνσεις και με λουσιφεράση κατασκευάσματα ΤΟΡ-β-απόκρισης. HCC4006 και HCC4006ER κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με p3TP-Lux ρεπόρτερ ή pSBE4 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO, 5 ng /mL TGF-β1, 1 μΜ erlotinib, ή ένας συνδυασμός των 5 ng /mL ΤΟΡ-β1 και 1 μΜ erlotinib για 48 ώρες. Μετά από 48 ώρες, η δραστικότητα της λουσιφεράσης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι η οδός του ΤΟΡ-β είναι κρίσιμη για ΕΜΤ σχετίζονται επίκτητη αντοχή EGFR-ΤΚΙ σε NSCLC [8 , 9], βρήκαμε υψηλότερα βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης SMAD2 σε κύτταρα HCC4006ER. Όπως ήταν αναμενόμενο, η φωσφορυλίωση SMAD2 αυξήθηκε περαιτέρω μετά την αγωγή ΤΟΡ-β, και η αύξηση αυτή ήταν ανεξάρτητη της θεραπείας erlotinib (Σχήμα 3D). Επιπλέον, σε σύγκριση με HCC4006 κύτταρα, η ποσότητα του ΤΟΡ-β1 στο μέσο ρυθμίζεται αυξητικά σε κύτταρα HCC4006ER (ανεξάρτητη της θεραπείας erlotinib) (Εικ 3Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι η οδός του ΤΟΡ-β ενεργοποιήθηκε δευτερεύουσα σε αυξημένη έκφραση συνδετήρα. Η ενεργοποίηση του ΤΟΡ-β οδού σε κύτταρα HCC4006ER επιβεβαιώθηκε με επιμόλυνση των πλασμιδίων ΤΟΡ-β-απόκρισης αναφοράς λουσιφεράσης, pSBE4 και p3TPlux, σε δύο κύτταρα HCC4006 και HCC4006ER επεξεργασία με 5 ng /mL ΤΟΡ-β ή /και 1 μΜ ερλοτινίμπη . Όπως μπορεί να φανεί στο σχήμα 3F, ΤΟΡ-β-καθοδηγούμενη μεταγραφή είναι υψηλότερη στα κύτταρα HCC4006ER ό, τι σε γονικά κύτταρα όταν διεγείρονται από τον TGF-β ανεξάρτητα από την παρουσία της erlotinib (Εικ 3F). *

P

& lt? *

P

& lt?