Αφηρημένο

Ιστορικό

διαφορικά μετουσιωμένο περιοχές (αιτήσεις συντήρησης δεδομένων) συνδέονται με πολλές αποτυπωμένα γονίδια. Στα ποντίκια μεθυλίωση σε DMR πριν από το

H19

γονιδίου που είναι γνωστό ως η περιοχή Αποτύπωμα Ελέγχου (IC1) αποκτάται στο αρσενικό βλαστική και επηρεάζει την κατάσταση μεθυλίωσης αιτήσεις συντήρησης δεδομένων 100 kb μακριά στο διπλανό ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα 2 (

IGF2)

γονιδίου μέσω αλληλεπιδράσεων μεγάλου βεληνεκούς. Στους ανθρώπους, βλαστικής σειράς που προέρχονται από ή μετα-ζυγωτικά αποκτήσει την αποτύπωση ελαττώματα στο IC1 σχετίζονται με ανώμαλη ενεργοποίηση ή καταστολή του

IGF2

, με αποτέλεσμα οι συγγενείς διαταραχές της ανάπτυξης Beckwith-Wiedemann (BWS) και Silver-Russell (SRS) σύνδρομα, αντίστοιχα. Σε όγκο Wilms και καρκίνο του παχέος εντέρου, διαλληλικών έκφραση του

IGF2

έχει παρατηρηθεί σε συνδυασμό με την απώλεια της μεθυλίωσης σε DMR σε ποσοστό

IGF2.

Αυτό DMR, γνωστή ως DMR0, έχει αποδειχθεί ότι είναι μεθυλιωμένα στο σιωπηλό της μητέρας

IGF2

αλληλόμορφο πιθανώς με ένα ρόλο στην καταστολή. Η επίδραση του

IGF2

DMR0 αλλαγές μεθυλίωσης στην αιτιολογία της BWS ή SRS είναι άγνωστη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Έχουμε αναλύσει την κατάσταση μεθυλίωσης του DMR0 στην BWS, ασθενείς με όγκο SRS και Wilms με συμβατικές όξινου θειώδους αλληλουχίας και Pyrosequencing. Δείχνουμε εδώ ότι, σε αντίθεση με τις προηγούμενες εκθέσεις, η

IGF2

DMR0 είναι στην πραγματικότητα μεθυλιωμένη στην ενεργό πατρικό αλληλόμορφο στο περιφερικό αίμα και τα νεφρά. Αυτό είναι παρόμοιο με το καθεστώς IC1 μεθυλίωσης και έρχεται σε αντίθεση με την προτεινόμενη λειτουργία αποσιώπηση της μητέρας

IGF2

αλληλόμορφο. Beckwith-Wiedemann και Silver-Russell ασθενείς με ελαττώματα μεθυλίωση IC1 έχουν παρόμοια ελαττώματα μεθυλίωση στο

IGF2

DMR0, σύμφωνα με IC1 ρύθμιση μεθυλίωση σε

IGF2

στο

cis

. Σε όγκο Wilms, ωστόσο, προφίλ μεθυλίωση του IC1 και

IGF2

DMR0 είναι ενδεικτικά των αλλαγών που συμβαίνουν μεθυλίωσης στις δύο γονική αλληλόμορφα και όχι σε

cis

.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ένα μοντέλο στο οποίο DMR0 και IC1 έχουν αντίθετες ευαισθησίες στην παγκόσμια υπερ και υπομεθυλίωση κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης ανεξάρτητα από τη μητρική της αποτύπωμα προέλευσης. Αντίθετα, κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης DMR0 είναι μεθυλιωμένα ή απομεθυλιώνεται σύμφωνα με το αποτύπωμα βλαστικής σειράς μεθυλίωση στο IC1, υποδεικνύοντας διαφορετικούς μηχανισμούς απώλεια αποτύπωσης σε νεοπλασματικά και μη νεοπλασματικά κύτταρα

Παράθεση:. Murrell Α, Ito Y, G Verde , Huddleston J, K Woodfine, Silengo MC, et al. (2008) σαφείς αλλαγές μεθυλίωσης στο

IGF2-H19

Locus σε συγγενείς διαταραχές της ανάπτυξης και του καρκίνου. PLoS ONE 3 (3): e1849. doi: 10.1371 /journal.pone.0001849

Επιμέλεια: Suzannah Rutherford, Έρευνας Καρκίνου Fred Hutchinson Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14η Δεκεμβρίου, 2007? Αποδεκτές: 19, Φεβρουαρίου, 2008? Δημοσιεύθηκε: 26 Μάρ 2008

Copyright: © 2008 Murrell et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από CRUK Senior Cancer Research Fellowship (AM) και Società Italiana di Cancerologia και Fondazione Pezcoller υποτροφία (FC) και επιχορηγήσεις από AICR (ΑΜ), MIUR ΠΡΙΝ 2005 (AR), Istituto Superiore di Sanità (AR), Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AR και DP), Telethon-Italia Grant Νο GGP04072 (AR), και η Associazione Bianca Garavaglia, Busto Arsizio, Varese, Ιταλία (DP)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνίζονται υπάρχουν συμφέροντα.

Εισαγωγή

η ανώμαλη αποτύπωση της ινσουλίνης αυξητικού παράγοντα 2 (

IGF2

) γονίδιο παίζει ρόλο στην παθογένεση της διαταραχής υπερανάπτυξης σύνδρομο Beckwith-Wiedemann (BWS, ΟΜΙΜ # 130650), η κατάσταση της ανάπτυξης περιορισμός σύνδρομο Silver-Russell (SRS, ΟΜΙΜ # 180860), καθώς και διάφορους ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου όγκο Wilms, ραβδομυοσάρκωμα, ηπατοβλάστωμα, του παχέος εντέρου και των καρκινωμάτων του μαστού [1] – [6] .

οι μοντέλα ποντίκι έχουν χρησιμοποιηθεί για να αποδείξει ότι η αποτυπωθεί έκφραση της συνδέεται στενά με

IGF2

και

H19

γονιδίων ελέγχεται από ειδικό διαφορικά μετουσιωμένο περιοχές (αιτήσεις συντήρησης δεδομένων) [7 ] – [10]. Μία από αυτές τις αιτήσεις συντήρησης δεδομένων (η

Η19

DMR) βρίσκεται 5 ‘από το

H19

υποκινητής είναι μεθυλιωμένη στο πατρικό χρωμόσωμα και είναι γνωστό ως το IC1 περιοχή ελέγχου αποτύπωση, διότι λειτουργεί ως μονωτής διαμεσολαβείται από τον παράγοντα δέσμευσης CCCTC (CTCF) [11] – [14]. Η διαγραφή των μητρικών IC1 αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του κανονικά σιωπηρού μητρικό

IGF2

αλληλόμορφο και σε ρύθμιση προς τα κάτω του

Η19

[9]. Επιπλέον, μια ιεραρχική σχέση μεταξύ της μεθυλίωσης στο IC1 και

IGF2

υπάρχουν τέτοιες ότι η διαγραφή ή μετάλλαξη εντός του IC1 οδηγεί επίσης σε αλλαγές μεθυλίωσης σε αιτήσεις συντήρησης δεδομένων εντός του

IGF2

γονίδιο [15]. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι IC1 αλληλεπιδρά ουσιαστικά με το

IGF2

αιτήσεις συντήρησης δεδομένων σε μια αμοιβαία αποκλειστική και μητρικής προέλευσης ειδικό τρόπο επηρεάζονται από δεσμευτικές CTCF και μεθυλίωσης του DNA [16], [17]. Η εφαρμογή αυτού του μοντέλου για το ανθρώπινο έχει παρεμποδιστεί από τις διαφορές στην γενωμική οργάνωση του

IGF2

αιτήσεις συντήρησης δεδομένων σε ποντικού και ανθρώπου. Συγκεκριμένα,

IGF2

DMR0, που βρίσκεται 5 ‘ως προς την κύρια

IGF2

υποκινητές είναι μεθυλιωμένη στο μητρικό αλληλόμορφο μόνο στον πλακούντα στον ποντικό [18], αλλά έχει απόκλιση μεθυλίωση σε όλους τους ιστούς σε ανθρώπους [19]. Η μεθυλίωση του DMR0 στο μητρικό

IGF2

αλληλόμορφο συναχθεί χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές που προέρχονται από έναν ασθενή με BWS πατρική μονογονεϊκή δισωμία στο 11ρ15.5 loci (UPD) [19] και σε ασθενείς με νεφρική νόσο Wilms όγκου με απώλεια της ετεροζυγωτίας του μητρικό αλληλόμορφο [20]. ανάλυση μεθυλίωση του

IGF2

DMR0 έχει πραγματοποιηθεί σε πολλές μελέτες του καρκίνου μετά την απόδειξη ότι υπομεθυλίωση του παρόντος DMR συνδέεται με την απώλεια της αποτύπωσης σε Wilms όγκου [20] και του παχέος εντέρου [21]. Η τρέχουσα ερμηνεία αυτών των αποτελεσμάτων είναι ότι η απώλεια της μεθυλίωσης κατά τη

IGF2

DMR0 παίζει ρόλο στην επανενεργοποίηση της σιωπηλής μητρικό αλληλόμορφο [21].

Η μοριακή βάση της BWS είναι ετερογενής με 5 % των ασθενών που εμφανίζουν αύξηση της μεθυλίωσης στο IC1 με διαλληλικούς ενεργοποίηση του

IGF2

και διαλληλικών αποσιώπηση του

H19.

άλλη ομάδα ασθενών BWS έχει τη συνήθη IC1 μεθυλίωση αλλά μη φυσιολογική μεθυλίωση σε IC2, μια μητέρα μεθυλιωμένο αποτυπώνοντας την περιοχή ελέγχου εντός του

KCNQ1

και

KCNQ1OT1

σύμπλεγμα γονιδίων που φαίνεται να λειτουργούν ανεξάρτητα από

IGF2

και

H19

[2]. ασθενείς BWS με IC1 ελαττώματα έχουν ιδιαίτερα υψηλό προδιάθεση στην ανάπτυξη όγκου Wilms, ενώ οι ασθενείς με IC2 ελαττώματα είναι προφανώς περισσότερο σε κίνδυνο για άλλους όγκους [2], [22]. Υπερμεθυλίωση στο IC1 είναι επίσης ένα συχνό χαρακτηριστικό στις μη συνδρομικού ασθενών όγκου Wilms που μαζί με τα διακριτά προφίλ προδιάθεση του όγκου σε ασθενείς BWS δείχνουν ότι παρόμοια επιγενετικών ελαττώματα να οδηγήσει σε Soma-μεγάλη υπερανάπτυξη και τον καρκίνο. SRS έχει επίσης ένα πολύπλοκο ετερογενές μοριακή αιτιολογία και ένα υποσύνολο των ατόμων έχει η απώλεια της μεθυλίωσης στο IC1 με διαλληλικούς αποσιώπηση των

IGF2

και διαλληλικών ενεργοποίηση του

H19

[6].

Μέχρι σήμερα δεν έχουν υπάρξει αναφορές σχετικά με την κατάσταση μεθυλίωσης του

IGF2

περιοχή DMR0 στην BWS και SRS ασθενείς και δεν είναι γνωστό σε ποιο βαθμό η προτεινόμενη φίμωση λειτουργία αυτής της DMR συμβάλλει στην αιτιολογία της BWS και SRS. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε μητρική μεθυλίωσης προέλευσης στο DMR0 σε διάφορους υποτύπους του BWS και SRS ασθενείς και επίσης σε μία ομάδα από δείγματα όγκου Wilms. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η δραστική πατρική

IGF2

αλληλόμορφο είναι μεθυλιωμένη στο DMR0 στο

cis

με

H19

μεθυλίωση σε φυσιολογικά άτομα και ότι το SRS και BWS την DMR0 και IC1 έχουν παρόμοιες ανωμαλίες μεθυλίωσης. Αντίθετα, σε δείγματα όγκων Wilms DMR0 μεθυλίωσης συσχετίζεται αρνητικά με IC1 μεθυλίωσης. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν

IGF2

αποτύπωση ελαττώματα εκ γενετής διαταραχές της ανάπτυξης και των όγκων Wilms προκύπτουν μέσω διαφορετικών επιγενετικών μηχανισμών.

Αποτελέσματα

IGF2 DMR0 κατάσταση μεθυλίωσης σε BWS και SRS ασθενείς

Εξετάσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του DMR0 στο περιφερικό DNA λευκοκυττάρων αίματος που προέρχονται από ασθενείς BWS με IC1 υπερμεθυλίωση (n = 7), IC2 υπομεθυλίωση (n = 37) ή κανονικό μεθυλίωση τόσο σε IC1 και IC2 (n = 27) και SRS ασθενείς με IC1 υπομεθυλίωσης (n = 2), με τη χρήση όξινου θειώδους και Pyrosequencing ανάλυση. Η περιοχή αναλύεται δείχνεται στο σχήμα 1Α. Προς έκπληξή μας, 6/7 ασθενείς BWS με υπερμεθυλίωση στο IC1 είχε επίσης υπερμεθυλίωση στο DMR0 (Median μεθυλίωση 69,2%, διατεταρτημοριακό εύρος (IQR) 60,5%? 75,1%) και 2/2 SRS με IC1 υπομεθυλίωση είχαν επίσης DMR0 υπομεθυλίωσης (28,2% και 36,28%). Ασθενείς με φυσιολογική μεθυλίωση σε IC1 ή υπομεθυλίωση στο IC2 είχαν φυσιολογικά επίπεδα μεθυλίωσης σε DMR0 (Median μεθυλίωση 53%? IQR 48,2%, 57,1%). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι είτε μεθυλίωση αλλαγές στην BWS και SRS συνέβαιναν στο

trans

ή ότι η μεθυλίωση στο DMR0 είναι στο πατρικό αλληλόμορφο.

Α. Θέση του DMR0 εντός του

IGF2

γονίδιο σε σχέση με το πατρικά μεθυλιωμένο περιοχή IC1 έλεγχος αποτύπωσης η οποία είναι ανοδικά του

H19.

Pyrosequencing χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση μεθυλίωσης σε έξι CpGs εντός της περιοχής DMR0 (NCBI 36 : 11, 2.125.904 με 2.126.160, που περιέχει SNP rs3741210). Όξινου θειώδους (BSQ) και Pyrosequencing (PSQ) θέσεις εκκινητή είναι όπως υποδεικνύεται. Αυτή η περιοχή περιέχει τα CpGs (αριθμημένες 15,16,17) με γκρίζο που έχουν προηγουμένως δημοσιευθεί να μεθυλιωμένος στον καρκίνο του παχέος εντέρου [21]. Οι κάθετες γραμμές δείχνουν

Msp

I /

Ηρα

sites II στο DMR0. Β Box οικόπεδο δείχνει διαμέσους, IQR, max. και λεπτά. τιμές για το

IGF2

επίπεδα μεθυλίωσης DMR0 όπως μετράται από Pyrosequencing του όξινου θειώδους μετατραπεί DNA που λαμβάνεται από δείγματα περιφερικού αίματος από BWS και SRS ασθενείς. ποσοστά μεθυλίωση αντανακλούν την αναλογία της όξινου θειώδους μετατραπεί κυτοσίνες στα CpGs μετράται στη δοκιμασία. Φυσιολογικά επίπεδα μεθυλίωσης για αποτυπωθεί αιτήσεις συντήρησης δεδομένων είναι 45-55% (βλέπε C). Κατηγορίες των ασθενών BWS περιλαμβάνονται εκείνοι με: χωρίς ελάττωμα αποτύπωση στο IC1 περιοχή και το IC2 περιοχή (NM)? χαμηλή μεθυλίωσης (LM) στο IC2 (IC2-LM)? αυξημένη πατρική 11p15 μέσω της πατρικής η αντιγραφή ή η μονογονεϊκή δισωμία (pUPD)? και υπερμεθυλίωση στο IC1 (IC1-HM). ασθενείς SRS περιλαμβάνονται δύο καθένα από τα μητρικά επικάλυψη των 11p15 (Mat Dup) και υπομεθυλίωση στο IC1 (IC1-LM). BWS με υπερμεθυλίωση στο IC1, έχουν επίσης υπερμεθυλίωση στο DMR0, ενώ SRS με υπομεθυλίωση IC1 έχουν υπομεθυλίωση σε DMR0. Γ Μητρικής προέλευσης συγκεκριμένων μεθυλίωσης σε κανονική, BWS και οι ασθενείς SRS. Οι ασθενείς BWS και SRS έχουν αποτύπωση ελαττώματα στο IC1. Όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA ενισχύθηκε με αλληλόμορφο-ειδικών εκκινητών για τον πολυμορφισμό rs3741210 σε

IGF2

DMR0 πριν Pyrosequencing για μεθυλίωση. Το αλληλόμορφο Τ φαίνεται από πλατείες και C αλληλόμορφα φαίνεται από τα τρίγωνα στα οικόπεδα. Κύκλοι δείχνουν το ποσοστό του συνολικού μεθυλίωση των CpGs δοκιμάστηκαν. Το πατρικό αλληλόμορφο είναι μεθυλιωμένο σε DMR0 από το μητρικό αλληλόμορφο. Και τα δύο αλληλόμορφα υπερμεθυλίωση στο BWS και τα δύο αλληλόμορφα μεθυλιωμένος εις SRS.

Η

Για να γίνει διάκριση μεταξύ αυτών των δυνατοτήτων, εξετάσαμε 13 ασθενείς BWS με περίσσεια αντίγραφα της πατρικής 11ρ15.5 (12 ασθενείς είχαν πατρική UPD και ένα ασθενής είχε μια επικάλυψη 11ρ15.5) και δύο SRS ασθενείς με μητέρας επαναλήψεις 11ρ15.5. Μπορούμε επίσης να προσδιορίζεται άμεσα την γονική προέλευση της μεθυλίωσης στο

IGF2

DMR0 σε ορισμένες από BWS μας και των ασθενών SRS και 6 άτομα ελέγχου, προκειμένου να επιβεβαιώσουν τα ευρήματά μας. Οι ασθενείς με τη μητρική επικάλυψη είχαν μειωμένα επίπεδα μεθυλίωσης (44%), ενώ όλη η πατρική UPD και οι ασθενείς πατρική επικάλυψη είχε υπερμεθυλίωση ((διάμεση μεθυλίωση 60,2%? IQR 56,1%, 64,3%), Σχήμα 1Β.). Σε όλες τις ενημερωτικές οικογένειες ήμασταν σε θέση να επιβεβαιώσει ότι το πατρικό αλληλόμορφο προτίμηση μεθυλιώνεται στην DMR0 (ιδιαίτερα οι CpGs 15-17) στο

cis

με μεθυλίωση στο IC1 (Εικ. 1C και Εικ. S1). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση στο IC1 επιρροές μεθυλίωση στο

IGF2

DMR0. BWS και SRS περιπτώσεις με ελαττώματα μεθυλίωση στο IC1 αποκτήσει την ίδια μεθυλίωση ελάττωμα στο DMR0 στα βλαστικά κύτταρα ή νωρίς την ανάπτυξη του εμβρύου, έτσι ώστε το μητρικό

αλληλόμορφο κέρδη IGF2

μεθυλίωση και ενεργοποιείται (BWS) ή το πατρικό αλληλόμορφο αποτύχει για να γίνει μετουσιωμένο και σιωπήσει (SRS). Αυτά αλληλόμορφο ειδικές αλλαγές μεθυλίωσης έχουν την επίδραση ενός διακόπτη αποτύπωμα έτσι ώστε οι δύο αλληλόμορφα μοιάζουν είτε μια πατρική αλληλόμορφο (BWS) ή ένα μητρικό αλληλόμορφο (SRS). αποτελέσματα Pyrosequencing επαληθεύτηκαν με όξινο θειώδες αλληλουχίας (Εικ. S1).

ανάλυση IGF2 μεθυλίωσης σε δείγματα Wilms όγκου

Αναλύσαμε DMR0 μεθυλίωση σε δύο ασθενείς με όγκο Wilms που είχαν προκύψει σε άτομα που πλήττονται από BWS και μια σειρά από μη-συνδρομικής ασθενείς με όγκο Wilms. Ένας από τους ασθενείς BWS είχαν συνταγματική υπερμεθυλίωση στο IC1, ο άλλος είχε πατρική UPD. Τα μη συνδρομικού ασθενείς Wilms όγκου που αποτελείται από άτομα που είχαν ογκοειδικό IC1 υπερμεθυλίωση (n = 10), 11ρ15.5 LOH με απώλεια του μητρικό αλληλόμορφο (n = 13) ή κανονικό μεθυλίωση (n = 10) στην IC1. Αξίζει να σημειωθεί ότι, όλοι οι όγκοι με υπερμεθυλίωση στο IC1 και οι περισσότεροι από αυτούς με ΑΕ, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που προέκυψαν σε άτομα που πλήττονται από BWS, έδειξαν μειωμένη μεθυλίωση σε DMR0 (Median μεθυλίωση 24,8%, IQR 16,52, 34,9), ενώ τα άτομα με φυσιολογικό IC1 μεθυλίωση είχε φυσιολογική μεθυλίωση DMR0 (διάμεση μεθυλίωση 45,1%, IQR 34,2? 52,3) (Σχήμα 2Α-Β.). Πράγματι, μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση (Pearson r = 0,7118, CI -8718 – 0,4146) θα μπορούσε να αποδειχθεί μεταξύ DMR0 και IC1 επίπεδα μεθυλίωσης στο Wilms ασθενή όγκου (Σχ. 2C). Όπως και σε λευκοκύτταρα αίμα, παρακείμενο μη καρκινικό ιστό έδειξε κυρίαρχη μεθυλίωση του πατρικού αλληλίου (Εικ. 2D και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ξεχωριστές επιγενετικές αλλαγές στην Wilms όγκου σε σύγκριση με συγγενείς διαταραχές της ανάπτυξης.

Box οικόπεδο δείχνει διαμέσους, IQR, max. και λεπτά. τιμές για το

IGF2

επίπεδα μεθυλίωσης DMR0 όπως μετράται από Pyrosequencing του περιφερικού αίματος (ανοιχτό κουτί), φυσιολογικό νεφρό (διαγραμμισμένο κουτί) και βιοψίες των όγκων (γκρι πλαίσιο) από ασθενείς Wilms όγκου που δεν έχουν BWS. ποσοστά μεθυλίωση αντανακλούν την αναλογία της όξινου θειώδους μετατραπεί κυτοσίνες στα CpGs μετράται στη δοκιμασία. Φυσιολογικά επίπεδα μεθυλίωσης για αποτυπωθεί αιτήσεις συντήρησης δεδομένων είναι 45-55% (βλέπε Δ). Wilms όγκου δείγματα ασθενών περιλαμβάνουν περιφερικό αίμα και το DNA των όγκων από ασθενείς με φυσιολογική μεθυλίωση σε IC1 σε όγκους τους (NM)? περιφερικού αίματος, φυσιολογικό νεφρό και το DNA του όγκου δειγμάτων από ασθενείς με υπομεθυλίωση του IC1 σε όγκους τους (IC1-HM)? και δείγματα DNA όγκων από ασθενείς με απώλεια της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) σε όγκους τους. Εντυπωσιακά, οι ασθενείς Wilms όγκου με υπερμεθυλίωση στο IC1 έχουν υπομεθυλίωση σε DMR0 σε όγκους τους. επίπεδα Β Μεθυλίωση στο περιφερικό αίμα, ανεπηρέαστο νεφρικό ιστό και όγκο Wilms νεφρικό ιστό από δύο ασθενείς BWS (το ένα με IC1 υπερμεθυλίωση και ένα με pUPD). Και οι δύο ασθενείς έχουν υπομεθυλίωση του

IGF2

DMR0 σε όγκους τους. καμπύλη παλινδρόμησης C Γραμμική δείχνει αντιστρόφως ανάλογη σχέση μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης στο IC1 και DMR0 σε Wilms όγκου. Όγκοι με υπερμεθυλίωση στο IC1 απώλεια της μεθυλίωσης σε DMR0. Δ περιφερικό αίμα και ιστό του νεφρού από έναν ασθενή με Wilms όγκου που δεν έχει υπερμεθυλίωση στο IC1. Το C-αλληλόμορφο υπερμεθυλίωση, ενώ η T-αλληλόμορφο μεθυλιωμένος τόσο το αίμα και τα νεφρά, δείχνοντας παρόμοια μητρική της μεθυλίωσης προέλευσης σε αυτούς τους ιστούς.

Η

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα της γενετικές μελέτες μας δείχνουν ότι DMR0 είναι μεθυλιωμένη στο πατρικό αλληλόμορφο σε αντίθεση με τα συμπεράσματα των δύο προηγούμενων μελετών οι οποίες έχουν αναφέρει ότι DMR0 μεθυλίωση είναι στο μητρικό αλληλόμορφο [19], [20]. Στην πρώτη έκθεση μεθυλίωση ερευνήθηκε για το σύνολο του

IGF2

γονιδίων σε δείγματα όγκων Wilms με και χωρίς απώλεια της αποτύπωσης [20]. Σε αυτή τη μελέτη, η διαφορική μεθυλίωση στην περιοχή DMR0 δείχθηκε σε φυσιολογικό νεφρό και σε όγκους με μο- νοαλληλική έκφραση, ενώ οι όγκοι με απώλεια αποτύπωσης, ήσαν υπο-μεθυλιωμένα [20]. Οι CpGs που αναλύσαμε σε δοκιμασίες μεθυλίωσης μας εξετάστηκαν επίσης από τους συγγραφείς αυτούς, χρησιμοποιώντας

Msp

I

/Ηρα

II περιοριστική ανάλυση (Σχήμα 1) και η περιοχή που καλύπτεται από καθετήρα 9 στα σχήματα 1 και 3 στο [20]. Σε τέσσερις περιπτώσεις με την απώλεια της ετεροζυγωτίας των 11ρ15.5 όπου χάθηκε το μητρικό αλληλόμορφο, το διατήρησε πατρικό αλληλόμορφο βρέθηκε να είναι μη μεθυλιωμένες και έτσι το μητρικό αλλήλιο συναχθεί ότι είναι η κανονικά μεθυλιωμένο αλλήλιο [20]. Εξετάσαμε 13 περιπτώσεις με LOH και έδειξε παρόμοια πρότυπα υπομεθυλίωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα με LOH έχουν την τάση να αλλάζει μεθυλίωση στο DMR0 ως αποτέλεσμα της ύπαρξης όγκων. Η δεύτερη μελέτη να αναφέρουν ότι DMR0 είναι μητέρα μετουσιωμένο χαρακτηρίζεται μυθιστόρημα μεταγραφές του

IGF2

κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Αυτοί οι συγγραφείς εξέτασαν μια κυτταρική γραμμή ιδρύθηκε από pUPD ασθενή και διαπίστωσε ότι η DMR0 ήταν μεθυλιωμένος [19]. Βρήκαμε ότι DMR0 τείνει να απομεθυλιωθεί σε κυτταρικές σειρές υβριδωμάτων με ένα μόνο ανθρώπινο χρωμόσωμα 11, ανεξάρτητα από τη γονική προέλευση (αδημοσίευτη παρατήρηση) και υποθέτουμε ότι αυτό μπορεί να είναι ένα φαινόμενο κυτταρικής καλλιέργειας.

Η λειτουργία του είναι DMR0 ακόμα άγνωστη. Έχει προταθεί ότι ο ρόλος του DMR0 μεθυλίωσης είναι να διατηρήσει την αποσιώπηση στο μητρικό

IGF2

αλληλόμορφο. Ωστόσο, η γνώση ότι η γονική προέλευση του

IGF2

DMR0 μεθυλίωση είναι πατρική εξαλείφει ένα ρόλο στη μεθυλίωση με τη μεσολάβηση καταστολή της μητέρας

IGF2

αλληλόμορφο. Πράγματι, αντί να ενεργούν ως αυτόνομο ρυθμιστής της αποτύπωσης, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μεθυλίωση DMR0 επηρεάζεται από IC1 μεθυλίωση σε μη νεοπλασματικά κύτταρα. Έτσι κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, μητρικής προέλευσης συγκεκριμένα μοτίβα μεθυλίωσης στο ανθρώπινο

IGF2

-.

H19

τόπου είναι εγκατεστημένοι σε

cis

παρόμοια με παρατηρήσεις σε ποντίκια [15]

στα ποντίκια όπου οι περιοχές CTCF έχουν μεταλλαχθεί, ο αποκλεισμός των CTCF από το μητρικό IC1 έχει ως αποτέλεσμα την μεθυλίωση του IC1 [23] και

IGF2

αιτήσεις συντήρησης δεδομένων [16]. Επιπλέον, σε ενήλικες χοριοειδές πλέγμα ποντικού, ένας εγκεφαλικός ιστός στον οποίο

IGF2

εκφράζεται από δύο αλληλόμορφα και

Η19

δεν εκφράζεται, IC1 και το

IGF2

αιτήσεις συντήρησης δεδομένων είναι μεθυλιωμένα και στις δύο γονική χρωμοσώματα [24]. Δείχνουμε εδώ ότι η παρεκκλίνουσα κέρδος ή ζημία της μεθυλίωσης στο IC1 είναι συνδεδεμένη με την ίδια αλλαγή μεθυλίωση σε

IGF2

DMR0. Η κύρια διαφορά είναι ότι τα ποντίκια έχουν μια DMR1 και πλακούντα συγκεκριμένη DMR0, ενώ στον άνθρωπο, DMR1 λείπει και το DMR0 φαίνεται να συμπεριφέρονται πιο παρόμοιο με το ποντίκι DMR1. Το τελικό αποτέλεσμα του IC1 επηρεάζουν

IGF2

μεθυλίωση είναι ότι epimutation του IC1 έχει ως συνέπεια και των δύο γονικών αλληλόμορφα εμφανίζοντας μια πατρική αποτύπωμα στην περίπτωση της BWS ή της μητέρας αποτύπωμα στην περίπτωση του SRS (Εικ. 3).

Σε φυσιολογικά άτομα,

IGF2

έκφραση είναι από το πατρικό αλληλόμορφο και

H19

είναι από το μητρικό αλληλόμορφο. IC1 και DMR0 μεθυλιώνονται στο πατρικό χρωμόσωμα. Σε BWS, το πρότυπο epigenotype και έκφραση του χρωμοσώματος μητέρας μετατρέπονται σε πατρική και SRS, το πρότυπο epigenotype και έκφραση του πατρικού χρωμοσώματος μετατρέπονται σε μητρικά (μεταγωγή αποτύπωμα). Στον όγκο Wilms,

IGF2

ενεργοποίηση και

H19

αποσιώπηση σχετίζονται με διαταραχή των δύο μητρικών και πατρικών αποτυπώματα (σωματικά απώλεια της αποτύπωσης).

Η

Αν καιρό -range αλληλεπιδράσεις μεταξύ αιτήσεις συντήρησης δεδομένων σε αυτό το τόπο είναι παρόμοια σε ποντίκια και ανθρώπους, αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει τα ελαττώματα αποτύπωσης που βρίσκονται στις διαταραχές υπερανάπτυξη BWS και SRS. Ωστόσο, τα ελαττώματα αποτύπωση σε όγκο Wilms είναι δύσκολο να συμφιλιωθεί με τον ανταγωνισμό ενισχυτή και την αλληλεπίδραση DMR μεγάλου βεληνεκούς μοντέλα. Στην ανάλυσή μας αυτής της επιλεγμένης ομάδας ασθενών όγκου Wilms, μεθυλίωση στο DMR0 χάνεται στο πατρικό αλληλόμορφο, ενώ IC1 κέρδη μεθυλίωσης στο μητρικό αλληλόμορφο. επίπεδα μεθυλίωσης DMR0 είναι ιδιαίτερα χαμηλά σε ορισμένες από τις όγκων, υποδηλώνοντας μια σχεδόν πλήρη εξάλειψη της μεθυλίωσης στη θέση αυτή κατά πάσα πιθανότητα από δύο αλληλόμορφα (Σχ. 2Α-C). έτσι Επιγενετικές επαναπρογραμματισμό εμφανίζεται και στις δύο γονική χρωμοσώματα και όχι σε

cis

, υποδεικνύοντας ότι ελέγχουν διαφορετικοί μηχανισμοί

IGF2

αποτύπωση σε νεοπλασματικά και μη νεοπλασματικά κύτταρα (Εικ. 3). Soma-μεγάλη IC1 υπερμεθυλίωση στο BWS προδιαθέτει σε όγκο Wilms και παρόμοια επιγενετικές αλλαγές συμβαίνει στο νεφρό ως προ-νεοπλασματικές γεγονότα στην Wilms ογκογένεση [25]. Είναι πιθανό ότι DMR0 υπομεθυλίωση σχετίζεται με μια πιο παρατεταμένη ενεργοποίηση των

IGF2

σε καρκινικά κύτταρα ως αποτέλεσμα εναλλακτικής υψηλού επιπέδου διαμόρφωση χρωματίνης προωθείται από ογκο-ειδική ενεργοποιητές.

Κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης παγκόσμια υπομεθυλίωση συμβαίνει στις πλούσιες περιοχές επανάληψης, LINE και ΣΙΝΕ στοιχεία, ενώ οι νησίδες CpG που σχετίζονται με τους υποψηφίους υπόκεινται σε υπερμεθυλίωση [26]. Αιτήσεις συντήρησης δεδομένων μεθυλιωμένη εις την σπερματική γραμμή και αιτήσεις συντήρησης δεδομένων μεθυλιωμένα στα σωματικά κύτταρα μπορεί να διαφέρουν ως προς την ικανότητά τους να επαναπρογραμματιστεί κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης. Περαιτέρω σύγκριση των διαφορετικών αιτήσεις συντήρησης δεδομένων από την άποψη της βλαστικής σειράς έναντι σωματικών και τη μητέρα έναντι πατρικά μεθυλιωμένο καθώς και γενετικών και επιγενετικών χαρακτηριστικών θα πρέπει να οδηγήσει σε βαθύτερη κατανόηση των επιγενετικών επαναπρογραμματισμό στον καρκίνο. Πριν από τις μελέτες μας, η απώλεια της μεθυλίωσης είναι το μόνο που περιγράφεται epimutation στο DMR0 σε καρκίνους, ενώ τόσο υπερ και υπομεθυλίωση έχει περιγραφεί στο IC1 [21], [27]. Επιπλέον, δεν είναι όλες οι εκθέσεις δείχνουν μια άμεση συσχέτιση μεταξύ του

IGF2

έκφρασης και DMR0 αλλαγές μεθυλίωσης σε αυτή τη θέση και έχουμε αναφερθεί εξαιρέσεις στον καρκίνο του μαστού (Ito

et al.

Υποβλήθηκαν), ενώ άλλα έχουν αναφερόμενων εξαιρέσεων στον καρκίνο των ωοθηκών και της ουροδόχου κύστης [28], [29]. Οι μελέτες που κάνουν δείχνουν μια σχέση μεταξύ της απώλειας των DMR0 μεθυλίωσης και την απώλεια της αποτύπωσης πρέπει να ερμηνευθεί εκ νέου επειδή η μεθυλίωση στην περιοχή DMR0 χάνεται από την ενεργό πατρικό αλληλόμορφο και όχι από τη σιωπηλή αλληλόμορφο.

Εν ολίγοις, δείχνουμε τρεις διαφορετικές εκδηλώσεις επαναπρογραμματισμό που συμβαίνουν στο

IGF2-H19

τόπου και συνδέονται με την απώλεια αποτύπωση σε BWS, SRS και Wilms όγκου. Στις διαταραχές της ανάπτυξης, βλαστικής σειράς αλληλόμορφο ειδικές αλλαγές μεθυλίωσης έχουν την επίδραση ενός διακόπτη αποτύπωμα έτσι ώστε οι δύο αλληλόμορφα μοιάζουν είτε μια πατρική αλληλόμορφο (BWS) ή ένα μητρικό αλληλόμορφο (SRS), ενώ στον καρκίνο τόσο γονική σήματα χάνονται και να επαναπρογραμματιστούν. Τα ευρήματά μας αποδεικνύουν ότι η απώλεια του

IGF2

αποτύπωση είναι ένα σύνθετο φαινόμενο που εμφανίζεται με διαφορετικούς μηχανισμούς στις ανθρώπινες ασθένειες, πιθανώς αντανακλώντας διαφορετικές μοριακές αιτίες και τις απαντήσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

θέματα

85 BWS και 3 περιπτώσεις SRS είχαν προσληφθεί από διάφορες ιταλικές παιδιατρικά τμήματα και τα κλινικά διαγνωσμένη σύμφωνα με τα κριτήρια που περιγράφονται στην βιβλιογραφία (https://www.geneclinics.org). Στη μελέτη συμμετείχαν επίσης 40 ασθενείς Wilms όγκου εγγραφεί από Μονάδες Παιδιατρικής Ογκολογίας συνδεδεμένες με Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica (AIEOP). Όλες οι όγκοι ιστολογικά διάγνωση.

Ηθικά Έγκριση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από τις επιτροπές δεοντολογίας του Δευτέρου Πανεπιστημίου της Νάπολης και Istituto Nazionale Tumori, INT, Μιλάνο.

Αναγνώριση του IC1 και IC2 μεθυλίωση, UPD, ΑΕ και αντιγράψτε ανωμαλίες αριθμό

Η μεθυλίωση του DNA στα IC1 και IC2 αναλύθηκε με κηλίδωση Southern με ευαίσθητα σε μεθυλίωση ένζυμα περιορισμού ή COBRA, όπως περιγράφεται [2]. Τρία δείγματα με IC1 υπερμεθυλίωση που προέρχονται από ασθενείς BWS επίσης είχε κληρονομήσει μικροδιαγραφές [30], [31]. UPD, ΑΕ και η επικάλυψη στο 11ρ15.5 τόπους προσδιορίστηκαν από μικροδορυφόρων ανάλυση, όπως περιγράφεται [32].

Αναλύσεις DMR0 μεθυλίωσης

Σχεδιάσαμε μια πρότυπη δοκιμασία Pyrosequencing για

IGF2

DMR0 περιοχή (NCBI36: 11,2125904-2126160) η οποία περιελάμβανε έξι CpGs, τρεις εκ των οποίων έχουν αναφερθεί στο παρελθόν να μεθυλιωμένος εις παχέος ασθενείς με LOI σε

IGF2

[21]. Οι CpGs εντός αυτής της περιοχής που περιλαμβάνεται στην περιοχή DMR0 αναλύθηκε με άλλους [19], [20]. 100 ng-2 ug του γονιδιακού DNA ανά δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία διθειώδους χρησιμοποιώντας EZ κιτ μεθυλίωσης DNA (Zymo Research). Διθειώδες αντιμετωπίζονται DNA χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία ενισχυμένων PCR εκμαγεία για Pyrosequencing χρησιμοποιώντας την ακόλουθη πρόσθιο εκκινητή: 5’TGAGGATGGGTTTTTGTTTGGTAT3 ‘και βιοτινυλιωμένο αντίστροφο εκκινητή 5’TCCTCAATCCACCCAAAATAATAT3 ». 10 υί του βιοτινυλιωμένου PCR προϊόντος χρησιμοποιήθηκε για κάθε προσδιορισμό ακολουθίας χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές αλληλούχισης 5’GGGGTGGAGGGTGTA 3 ‘και 5′-AAAAGTTATTGGATATATAGT 3’. Pyrosequencing έγινε στις PSQ HS 96 Σύστημα και Σύστημα PyroMark MD χρησιμοποιώντας κιτ Gold Αντιδραστήριο Pyro (Biotage, Ουψάλα, Σουηδία). Αλληλόμορφων ειδικών Pyrosequencing διεξήχθη με αντικατάσταση του ανωτέρω βιοτινυλιωμένο εκκινητή με αλληλόμορφο-ειδική βιοτινυλιωμένα εναύσματα, 5’CCCAAAATAATATCTATAAAAAAAAAATTCAC3 », ή 5’CCCAAAATAATATCTATAAAAAAAAAATTCAT3» που αναγνώρισε το G ή Α αλληλόμορφο του πολυμορφισμού rs3741210 στην οπίσθια έλικα μετά διθειώδες μετατροπή.

η μεθυλίωση ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Pyro Q-CpG Software (Biotage, Uppsala, Sweden) που υπολογίζει το λόγο των μετατραπεί C (T) για να μη μετατραπείσα Γ σε κάθε CpG και εκφράζει αυτό σε ποσοστό μεθυλίωσης. Μέσο μεθυλίωσης σε όλη την DMR0 για όλες τις 6 CpGs υπολογίστηκαν. Διάμεση και IQR μεθυλίωση για τις διάφορες κατηγορίες των ασθενών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Prism Graphpad.

Επαληθεύσαμε αλληλόμορφο-ειδική μεθυλίωση με συμβατικές αλληλουχίας όξινου θειώδους κλωνοποιημένων προϊόντων PCR σε όλες τις ενημερωτικές περιπτώσεις μας.

Υποστήριξη Πληροφοριών

Εικόνα S1. αλληλουχίας

όξινο θειώδες αναλύσεις IGF2 DMR0 μεθυλίωση σε κανονική, συγγενείς διαταραχές της ανάπτυξης και Wilms όγκου. IGF2 DMR0 μεθυλίωση σε κανονική, συγγενείς διαταραχές της ανάπτυξης και Wilms όγκου. Η μεθυλίωση του 6 CpGs προσδιορίστηκε με όξινο θειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση επί ϋΝΑ που εξάγεται από λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος (Normal, BWS και SRS) ή καρκινικό ιστό (Wilms όγκου) ατόμων κατατοπιστική για τον πολυμορφισμό rs3741210. Μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν μεθυλιωμένα CpGs και οι ανοικτοί κύκλοι μη μεθυλιωμένα CpGs. Το μητρικό (ΜΑΤ) και η πατρική (PAT) αλληλόμορφα της περιοχής IGF2 DMR0 υποδεικνύονται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001849.s001

(1.33 MB ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

ευχαριστούμε τη συμβολή της AIEOP Wilms όγκου επιστημονική επιτροπή και όλους τους ασθενείς και τις οικογένειές τους για τη συμμετοχή τους σε αυτή τη μελέτη.