Αφηρημένο

σηματοδότησης θανάτου που παρέχονται από τον παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF) φύσης που συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) μπορεί να προκαλέσει θάνατο σε καρκινικά κύτταρα με μικρή κυτταροτοξικότητα σε φυσιολογικά κύτταρα? αυτό κυτταρικού θανάτου έχει σκεφτεί να εμπλέξει κασπάση-εξαρτώμενη απόπτωση. Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) είναι επίσης μεσολαβητές που επάγουν κυτταρικό θάνατο, αλλά τους ρόλους τους στην TRAIL-επαγώμενη απόπτωση δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε ROS και κασπασών σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος που υποβάλλονται σε δύο διαφορετικούς τύπους TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, απόπτωση και necroptosis. θεραπεία TRAIL αυξημένη ROS σε δύο TRAIL-ευαίσθητο καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές, MiaPaCa-2 και BxPC-3, αλλά ROS συμμετείχαν σε TRAIL απόπτωση μόνο σε κύτταρα MiaPaCa-2. Απροσδόκητα, η αναστολή της ROS είτε με

Ν

-ακετυλ-L-κυστεΐνη (NAC), ένας αναστολέας υπεροξείδιο, ή Tempol, ένας αναστολέας υπεροξειδίου, αύξησε την αννεξίνης V- /ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ)

+ νωρίς νεκρωτικά πληθυσμός σε κύτταρα TRAIL-θεραπεία. Επιπλέον, και οι δύο necrostatin-1, ένας αναστολέας του υποδοχέα που αλληλεπιδρούν πρωτεϊνική κινάση 1 (RIP1), και siRNA μεσολάβηση knockdown του RIP3 μείωσε την αννεξίνη V

– /ΡΙ

+ νωρίς νεκρωτικές πληθυσμού μετά τη θεραπεία TRAIL. Επιπλέον, μια αύξηση στην πρώιμη απόπτωση προκλήθηκε σε TRAIL-αγωγή καρκινικών κυττάρων υπό αναστολή είτε κασπάσης-2 ή -9. Η κασπάση-2 λειτούργησε ανάντη της κασπάσης-9, και δεν παρατηρήθηκε στιχομυθία μεταξύ ROS και κασπάσης-2 /-9 σε κύτταρα TRAIL-θεραπεία. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ROS συμβάλλουν στην TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα MiaPaCa-2, και ότι ROS παίζουν ανασταλτικό ρόλο στην TRAIL-επαγόμενης necroptosis του MiaPaCa-2 και τα κύτταρα BxPC-3, με κασπάση-2 και -9 παίζουν ρυθμιστικών ρόλους σε αυτή τη διαδικασία

Παράθεση:. Zhang Μ, Harashima Ν, Moritani T, Huang W, Harada Μ (2015) οι ρόλοι των ROS και κασπάσες στο TRAIL απόπτωση και Necroptosis σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 10 (5): e0127386. doi: 10.1371 /journal.pone.0127386

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ajay Pratap Singh, Πανεπιστήμιο της Νότιας Αλαμπάμα Mitchell Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 23, Ιανουαρίου, 2015? Αποδεκτές: 15 Απριλίου 2015? Δημοσιεύθηκε: May 22, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:.. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης, Αθλητισμού, Πολιτισμού και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (δεν 25.430.150 σε ΝΗ, και αρ. 24501331 για να ΜΗ) και από το Πρόγραμμα Πανεπιστήμιο Σιμάνε «SUIGANN». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα μέλη της οικογένειας κυτοκινών παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF), όπως TNFa και συνδέτη Fas (FasL), παίζουν σημαντικό ρόλο στη φλεγμονή και ανοσία [1]. Αν και TNF που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) είναι ένα μέλος αυτής της οικογένειας, το μόριο αυτό μπορεί να προκαλέσει θάνατο των καρκινικών κυττάρων ενώ προκαλούν σχεδόν καμία κυτταροτοξικότητα με τα φυσιολογικά κύτταρα [2]. Υπάρχουν θετικά και αρνητικά υποδοχείς? υποδοχέα θανάτου (DR) 4 και DR5 παρέχει προ-αποπτωτική σηματοδότηση, ενώ δολωμάτων υποδοχέα (DCR) 1 και DcR2 αναστέλλουν αποπτωτική σηματοδότηση [3]. Τα φυσιολογικά κύτταρα αναφερθεί να δείξει TRAIL-αντίσταση με την προτιμησιακή έκφραση τους από DCRS [4]. Ως εκ τούτου, TRAIL και DR του αναμένεται να είναι χρήσιμα μόρια και οι στόχοι αντικαρκινικών και έχουν χρησιμοποιηθεί και στοχευμένη σε αρκετές κλινικές μελέτες [5, 6]. Η δέσμευση του TRAIL να DR επί καρκινικών κυττάρων παρέχει κασπάσης-8-εξαρτώμενη σηματοδότηση θανάτου και ενεργοποιεί την «εξωγενή» αποπτωτικό μονοπάτι [7]. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-8 μετατρέπει Bid να tBid, προάγοντας έτσι την μιτοχόνδρια μεσολάβηση κασπάσης-9-εξαρτώμενη «εγγενής» αποπτωτικό μονοπάτι [8]. Εναλλακτικά, ROS (αντιδραστικά είδη οξυγόνου) παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό θάνατο και τη σηματοδότηση [9]. ROS επάγουν απόπτωση εγγενή πυροδοτώντας βλάβη του DNA [10]. Αντιστρόφως, βλάβη του DNA επάγει παραγωγή ROS [11]. βλάβη του DNA και /ή την παραγωγή ROS μπορεί να ενεργοποιήσει κασπάση-9-εξαρτώμενη απόπτωση. Επιπλέον, ορισμένες εκθέσεις πρότειναν ότι ROS εμπλέκεται στην απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα TRAIL-αγωγή [12-14]. Ωστόσο, οι ρόλοι των ROS σε TRAIL-επαγόμενης θάνατο των καρκινικών κυττάρων δεν έχουν ακόμη διερευνηθεί πλήρως.

Εκτός από την απόπτωση, necroptosis αναγνωρίζεται πλέον ως μια άλλη μορφή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου [15, 16]. Necroptosis είναι προγραμματισμένο νέκρωση που μπορεί να ενεργοποιηθεί κατά τη διέγερση με TNFa, FasL ή TRAIL. Οι ρόλοι και οι μηχανισμοί της απόπτωσης και νέκρωσης έχουν καθιερωθεί, ενώ εκείνες των necroptosis υπήρξαν το επίκεντρο των πρόσφατων ερευνών [16-18]. Necroptosis έχει λάβει πολλή προσοχή ως ένα είδος κυτταρικού θανάτου που επάγει φλεγμονή [17]. Σύμφωνα με κασπάση-8 αναστολής, του υποδοχέα που αλληλεπιδρά με την κινάση πρωτεΐνης 1 (RIP1) και RIP3 σχηματίζουν ένα σύμπλοκο και σκανδάλη necroptosis [19, 20]? επιπλέον πρόσφατες αναφορές έχουν αποκαλύψει ότι RIP3 παίζει κεντρικό ρόλο στη διαδικασία [18, 21]. Παρά το γεγονός ότι κάποιες αναφορές υποδηλώνουν ότι το TRAIL μπορεί να προκαλέσει necroptosis στα καρκινικά κύτταρα [22-24], οι μηχανισμοί δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως.

Αυτή η μελέτη ερεύνησε τους ρόλους των ROS και κασπασών σε TRAIL επαγόμενη απόπτωση και necroptosis της ανθρώπινης παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Μεταξύ τέσσερα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, τα επίπεδα ROS ήταν αυξημένα μόνο σε δύο TRAIL-ευαίσθητες σειρές: MiaPaCa-2 και BxPC-3. Ωστόσο, ROS έπαιξε ένα προ-αποπτωτικό ρόλο μόνο σε κύτταρα MiaPaCa-2, αλλά όχι σε BxPC-3 κύτταρα. Σε αυτά τα πειράματα, βρήκαμε ότι η θεραπεία TRAIL υπό αναστολή ROS αύξησε τον πληθυσμό της αννεξίνης V

– /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ)

+ νωρίς νεκρωτικά κύτταρα σε MiaPaCa-2 και BxPC-3 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι ROS έπαιξε ένα ανασταλτικό ρόλο στην TRAIL-επαγόμενης necroptosis στις δύο κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, necrostatin-1 (ένας αναστολέας RIP1) μείωσε τη αννεξίνη V

– /ΡΙ

+ πληθυσμό σε αυτά τα κύτταρα TRAIL-θεραπεία, και siRNA μεσολάβηση knockdown του RIP3 έδειξε παρόμοια αποτελέσματα BxPC-3 κύτταρα, υπονοώντας ότι ο κυτταρικός θάνατος που παρατηρήθηκε προκλήθηκε από necroptosis. Τέλος, necroptosis προήχθη από κατεργασία TRAIL υπό την αναστολή είτε κασπάσης-9 ή -2, με το τελευταίο θεωρείται «ορφανό» κασπάσης των οποίων η ρόλους σε κυτταρικό θάνατο δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως [25, 26]. Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ROS είναι αυξημένα σε MiaPaCa-2 και BxPC-3 κύτταρα TRAIL-ευαίσθητα, αλλά ότι ROS εμπλέκονται στην απόπτωση μόνο σε κύτταρα TRAIL-αγωγή MiaPaCa-2. Τα ευρήματά μας έδειξαν επίσης ότι οι ROS και κασπάσης-9 /-2 παίζουν ρυθμιστικό ρόλο στην TRAIL επαγόμενη necroptosis των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Δύο ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (AsPC-1 και BxPC-3) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Δύο άλλες ανθρώπινες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (MiaPaCa-2 και Panc-1) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. Κ Takenaga (Σιμάνε Πανεπιστήμιο Ιατρική Σχολή) [27]. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) και 20 μg /ml γενταμυκίνη (Sigma-Aldrich). PrEC είναι μια φυσιολογική κυτταρική σειρά επιθηλιακών προστάτη αγοράστηκε από την Lonza (Walkersville, MD, USA) και διατηρήθηκε σε PrEBM (Lonza).

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το WST- 8 δοκιμασία (Nacalai Tesque, Κιότο, Ιαπωνία). Στο τέλος της περιόδου επώασης, 10 μΐ διαλύματος WST-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν για επιπλέον 3 ώρες. Η απορρόφηση σε κάθε φρεάτιο μετρήθηκε στα 560 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

Αντιδραστήρια

Για προσδιορισμούς αναστολής, οι ακόλουθες αναστολείς προστέθηκαν 1 ώρα πριν από την προσθήκη TRAIL: παν-κασπάσης αναστολέα Z-VAD-FMK (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), κασπάσης-8 αναστολέα Ζ-IETD-FMK (R ROS, ιδιαίτερα υπεροξειδίου, μπορεί να προκαλέσει αυτοφαγία [26, 38, 39], και αυτοφαγία μπορεί να λειτουργήσει cytoprotectively [40]. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι autophagy διαδραματίζει αντι-αποπτωτικό ρόλο σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα TRAIL-αγωγή [29]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε αν αυτοφαγία προκλήθηκε σε BxPC-3 κύτταρα και το Tempol αναστολέας υπεροξειδίου κατέστειλε ROS προκαλούμενη αυτοφαγία, με αποτέλεσμα την προαγωγή της απόπτωσης. Αξιολογήσαμε το επίπεδο της αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα με την εξέταση της έκφρασης της LC3. Ως αποτέλεσμα, η αυτοφαγία έντονα επάγεται σε BxPC 3-κυττάρων σε σύγκριση με τις άλλες παγκρεατικό καρκίνο κυτταρικές σειρές, ενώ Tempol απέτυχαν να αναστείλουν την έκφραση του LC3 τύπου II, ως δείκτης της autophagy [41], σε BxPC-3 κύτταρα » S1 σχήμα «. Autophagy δεν συμβάλλει στην ROS μεσολάβηση προστασίας σε TRAIL-επεξεργασμένα κύτταρα BxPC-3. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για να διευκρινίσουν τον ακριβή μηχανισμό.

Ορισμένοι συνδέτες, συμπεριλαμβανομένων των TNFα, FasL και TRAIL, μπορεί να προκαλέσει τόσο απόπτωση και necroptosis [1]. Οι μηχανισμοί που υπαγορεύουν την κυτταρική απόφαση να υποβληθούν σε απόπτωση ή necroptosis έχουν διερευνηθεί εντατικά. Στην απόπτωση, κασπάσες είναι οι εκτελεστές της απόπτωσης? Ωστόσο, αυτές οι πρωτεάσες έχουν κανένα θετικό ρόλο στην necroptosis [15]. ROS προτείνεται να είναι εκτελεστές necroptosis [42], και ορισμένοι τύποι κυττάρων, όπως L929 ποντικού και εμβρυϊκών ινοβλαστών, παράγουν ROS σε απόκριση σε ΤΝΡα και δείχνουν necroptosis [43, 44]. Επιπλέον, η θεραπεία με αντιοξειδωτικά αναστέλλει necroptosis σε ορισμένους τύπους κυττάρων [44]. Ωστόσο, ROS δεν απαιτούνται για necroptosis σε όλους τους τύπους κυττάρων και αντιοξειδωτικά δεν είναι σε θέση να προστατεύσουν κάποιες κυτταρικές σειρές από αυτόν τον τύπο κυτταρικού θανάτου [45, 46]. Αυτές οι γραμμές απόδειξης προτείνουν ότι ROS μεσολάβηση necroptosis είναι πιθανόν ένας τύπος που εξαρτάται φαινόμενο κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η προσθήκη NAC να αναστέλλουν υπεροξείδιο προωθείται necroptosis κατά τη διέγερση TRAIL σε δύο ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 3Α). Η αύξηση αυτή μειώθηκε κατά necrostatin-1, ένας αναστολέας RIP1 [30] (Σχ 3Β και 3C), και siRNA μεσολάβηση RIP3 knockdown μειώθηκε necroptosis σε BxPC-3 κύτταρα TRAIL-επεξεργασία υπό αναστολή των ROS (υπεροξείδιο και δισμουτάση) (Σχ 4D και 4Ε). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ROS παίζουν ανασταλτικό ρόλο στην TRAIL-επαγόμενης necroptosis σε BxPC-3 κύτταρα. Εναλλακτικά, MiaPaCa-2 κύτταρα ήταν αρνητικά για RIP3 (Σχήμα 4), υποδεικνύοντας ότι RIP3 ήταν απαραίτητη για την necroptosis σε κύτταρα TRAIL-αγωγή MiaPaCa-2.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι υπάρχει προφανής αλληλοπαρεμβολές μεταξύ ROS και κασπάσης-2 /κασπάσης-9 υφίσταται στο πειραματικό σύστημα. Παραμένει άλυτο το πώς ένα πρώιμο νεκρωτικό πληθυσμός προκλήθηκε με αγωγή TRAIL υπό αναστολή της κασπάσης-2 ή -9. Η αναστολή της κασπάσης-8 προάγει το σχηματισμό συμπλόκου RIP1 /RIP3, με αποτέλεσμα το θάνατο σηματοδότηση που προκαλείται necroptosis [19, 20]. Ωστόσο, αυτό δεν φαίνεται να είναι η περίπτωση σε αυτά τα πειράματα, όπου η αναστολή της κασπάσης-8 είχαν μικρότερη επίδραση από ό, τι η αναστολή της κασπάσης-2 ή -9 (Σχήμα 5Β και 5D). Επιπλέον, ο αναστολέας παν-κασπάσης Ζ-VAD είχε καμία επίδραση στην TRAIL-επαγόμενης necroptosis παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

κασπάση-2 έχει αναφέρεται ως «ορφανό» κασπάσης [25], και ο ρόλος του στην TRAIL απόπτωση των καρκινικών κυττάρων δεν έχει τεκμηριωθεί πλήρως. Έχει αναφερθεί ότι η κασπάση-2 είναι απαραίτητη για τη βέλτιστη TRAIL-μεσολαβούμενη διάσπαση της προσφοράς σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [47]. Επιπλέον, η κασπάση-2 πριμοδοτεί τα καρκινικά κύτταρα για TRAIL απόπτωση που επάγεται από την επεξεργασία procaspase-8 [48]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η αναστολή της κασπάσης-2 κατέστειλε απόπτωση σε TRAIL-αγωγή καρκινικών κυττάρων. Εναλλακτικά, ROS ενεργοποιούν κασπάσης-2, και βλάβη του DNA επάγει επίσης διάσπαση του [49]. Έχουμε αναφερθεί πρόσφατα ότι βλάβη ROS σκανδάλη του DNA, οδηγώντας έτσι σε ενεργοποίηση της κασπάσης-2 σε νεφρική γραμμές καρκινώματος [50]. ενεργοποίηση της κασπάσης-2 σε απόκριση σε βλάβη του DNA παρέχει ένα σημαντικό σύνδεσμο μεταξύ της ζημίας αυτής και της εμπλοκής του αποπτωτικό μονοπάτι [50, 51]. Επιπλέον, ROS ενεργοποιείται κασπάσης-2 ενεργοποίηση και απόπτωση που επάγεται σε ένα ανθρώπινα λευχαιμικά Τ κυτταρική γραμμή [51]. Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη, δεν βρήκαμε στιχομυθία μεταξύ ROS και κασπάσες (Σχήμα 6).

Η έκφραση είτε DR4 ή DR5 είναι προαπαιτούμενο για TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Οι πέντε κυτταρικές σειρές μελετών ήταν θετικό για DR5, αλλά όχι για DR4 (Σχήμα 1Β).