Αφηρημένο

Adrenomedullin (ΑΜ) είναι ένα πεπτίδιο 52 αμινοξέων που αρχικά απομονώθηκε από το ανθρώπινο φαιοχρωμοκύττωμα. AM εκφράζεται σε μία ποικιλία κακοήθεις ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου και δείχθηκε να είναι ένας μιτογόνος παράγοντας ικανός να διεγείρει την ανάπτυξη των διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, ΑΜ είναι ένας παράγοντας επιβίωσης για ορισμένα καρκινικά κύτταρα. Ορισμένα στοιχεία υποδηλώνουν ότι ΑΜ μπορεί να εμπλέκονται στην εξέλιξη της μετάστασης καρκίνου μέσω της αγγειογένεσης και της μετανάστευσης των κυττάρων και τον έλεγχο εισβολή. Η TRPV2 Πιθανές κανάλι Παροδική υποδοχέας είναι γνωστό ότι προάγει σε προστάτη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και διεισδυτικών φαινότυπο και συσχετίζεται με το στάδιο και το βαθμό του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Στην εργασία αυτή δείχνουμε ότι πμ προκαλεί προστάτη και ουροφόρων μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή μέσω TRPV2 μετατόπιση σε πλασματική μεμβράνη και την επακόλουθη αύξηση σε κατάσταση ηρεμίας επίπεδο ασβεστίου

Παράθεση:. Oulidi Α, Bokhobza Α, Γκίκα D, Vanden Abeele F, Lehen’kyi V, Ouafik L, et al. (2013) TRPV2 Μεσολαβεί Adrenomedullin διέγερση του προστάτη και του καρκίνου ουροθηλιακά κυτταρικής προσκόλλησης, τη μετανάστευση και την εισβολή. PLoS ONE 8 (5): e64885. doi: 10.1371 /journal.pone.0064885

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21, Ιανουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 19 Απρίλη 2013? Δημοσιεύθηκε: May 31, 2013

Copyright: © 2013 Oulidi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM), Ligue Nationale Contre Καρκίνου le, Περιφέρεια Nord Pas de Calais και Université Catholique de Lille. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αδρενομεδουλλίνη (ΑΜ) είναι ένα πεπτίδιο 52 αμινοξέων που απομονώθηκε αρχικά από έναν ανθρώπινο φαιοχρωμοκύτωμα [1] που φέρει πολυπαραγοντική ρυθμιστικές ιδιότητες που κυμαίνονται από επαγωγή αγγειοδιαστολή να διαμορφώνουν την κυτταρική ανάπτυξη [2]. Οι λειτουργίες του AM μεσολάβηση ειδικών υποδοχέων περιλαμβάνει τον υποδοχέα της καλσιτονίνης υποδοχέα-όπως (CLR) και μια πρωτεΐνη δραστηριότητα τροποποιητικά του υποδοχέα (RAMP)? όταν συν-εκφράζεται με RAMP2 ή RAMP3, CLR λειτουργεί ως ένα συγκεκριμένο υποδοχέα πμ [3]. AM και των υποδοχέων του είναι εντόνως εκφρασμένα σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές και σε καρκίνους του παγκρέατος, του πνεύμονα, του νεφρού, του μαστού, των ωοθηκών και του προστάτη. Ένας αριθμός μελετών έχουν εμπλέξει ΑΜ (που εκκρίνεται ενδογενώς ή εξωγενώς χορηγούμενου) στην ανάπτυξη του όγκου, την εξέλιξη και τη μετάσταση μέσω επιδράσεις στην αγγειογένεση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και μετανάστευση [4] – [6]. Ωστόσο, μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αυτά τα αποτελέσματα της ΑΜ στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση παραμένουν αντιφατικές και ελάχιστα κατανοητή.

Η μετανάστευση των κυττάρων παίζει κεντρικό ρόλο στην εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Πολλά από τα συστατικά του κυτταρικού μηχανισμού μετανάστευση ρυθμίζονται από το ενδοκυτταρικό ασβέστιο (Ca

2+) συγκέντρωση [7]. Ένα σημαντικό μέρος της ενδοκυτταρικής σήμα Ca

2+ παράγεται από την διαμεμβρανική εισροή εξωκυττάριου Ca

2+ κυρίως συμβαίνει μέσω κατιονικές κανάλια με διακριτικό Ca

2+ επιλεκτικότητα. Σε μη διεγέρσιμα κύτταρα, Ca

καταχώρηση 2+ παρέχεται από τα κανάλια ιόντων τα οποία ενεργοποιούνται από διάφορα χημικά και φυσικά ερεθίσματα. Μερικά από αυτά τα Ca

2 + κανάλια εισόδου είναι μέλη του «δυναμικό παροδική υποδοχέα» (ΤΚΡ) οικογένεια κατιονικές [8] κανάλια. Οι δίαυλοι TRP αναφερθεί ότι εμπλέκονται στην καρκινογένεση [9] – [11], και μεταξύ αυτών κανάλι TRPV2, έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται ειδικά στην εξέλιξη του προστάτη και της ουροδόχου κύστης καρκίνους να πιο επιθετική φαινότυπο. Πράγματι, πρόσφατες μελέτες από το εργαστήριο μας έχουν δείξει δείχνουν ότι TRPV2 εκφράζεται στα πιο επιθετικό καρκίνο του προστάτη κύτταρα και διεγείρει τη μετανάστευση και επεμβατική φαινοτύπου των κυττάρων αυτών [12], [13]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση TRPV2 στην κύστη φαίνεται επίσης να συσχετίζονται με το βαθμό και το στάδιο του καρκίνου [14], αλλά τίποτα δεν είναι γνωστό σχετικά με την πιθανή ρόλο της στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή.

Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε την εμπλοκή TRPV2 στην επίδραση της ΑΜ για την πολυσταδιακή διαδικασία της εισβολής σε δύο ιδιαίτερα επεμβατική κυτταρικές σειρές: τη κυττάρων προστάτη (καρκίνος του προστάτη) PC-3 και τα κύτταρα UC (ουροθηλιακά καρκίνωμα) Τ24 /83. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι μπορεί να αυξήσει AM προσκόλληση, μετανάστευση και εισβολή μέσω Focal Adhesion Kinase (ΡΑΚ) και ιντεγκρίνης ενεργοποίηση β1, και τη διέγερση TRPV2 μετατόπισης προς την μεμβράνη του πλάσματος. Έτσι, τα αποτελέσματά μας παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με το ρόλο των AM και TRPV2 στον προστάτη και της ουροδόχου κύστης κακοήθειες.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Το ανθρώπινο προστάτη κυτταρική γραμμή PC- 3 ελήφθησαν από την ΑΤΟΟ και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια σε RPMI 1640 (Life Technologies) συμπληρωμένο με 10% FCS και 5 mM Ε-γλουταμίνη (Sigma). Ουροφόρων καρκινική κυτταρική γραμμή T24 /83 ελήφθη από την ECACC και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια σε μέσο McCoy 5Α Glutamax® (τεχνολογίες Life) συμπληρωμένο με 10% FCS.

Reverse Transcription-PCR

Συνολική mRNA απομονώθηκε από κύτταρα όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. Οι συνθήκες ενίσχυσης του DNA περιελάμβανε ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης των 7 λεπτών στους 95 ° C? 35 κύκλοι των 30 sec στους 95 ° C, 30 sec στους 60 ° C, και 30 sec στους 72 ° C? και τελικά 7 λεπτά στους 72 ° C. Εκκινητές ακολουθίες και τα μεγέθη των θραυσμάτων ήταν για RAMP2: προς τα εμπρός 5′-CTCAGCCTCTTCCCACCAC-3 ‘, αντίστροφος 5′-TTCCAGCAAAATTGGACAGC-3′, 84 bp? για RAMP3 5’-ATCTCGGTGCAGTTGGTGA-3 ‘και 5′-AAGGTGGACGTCTGGAAGTG-3′, 77 bp? για CLR 5’-CATGGACAAATTATACCCAGTGT-3 ‘και 5′-TCCAATTATGGTCAGGTAAAACAA3′, 86 bp? για ακτίνης 5’-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3 ‘και 5′-GTTGAAGGTCTCAAACATGATC-3’, 209 bp.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA Επιμόλυνση

κύτταρα PC-3 και Τ24 /83 επιμολύνονται με 50 nM μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) έναντι TRPV2 (siTRPV2 αλληλουχία: 5′-UAAGAGUCAACCUCAACUAdT-3 ‘, που συντίθεται από Eurogentec). χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης HiPerFect (Qiagen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή

Πρόσφυση κυττάρων Δοκιμασία

τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σπάρθηκαν σε 3 * 10

4 και 1,5 * 10

4 κύτταρα /φρεάτιο για PC3 και Τ24 /83 αντίστοιχα σε βασικό μέσο συμπληρωμένο ή όχι με ΑΜ (200 nm) σε ινονεκτίνη (10 μg /ml) προ-επικαλυμμένες πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 45 λεπτά επώασης στους 37 ° C, προσκολλημένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν 15 λεπτά σε λουτρό μεθανόλης και χρωματίστηκαν με Hoechst (5 mg /ml σε PBS), οι φωτογραφίες ελήφθησαν σε ένα μικροσκόπιο Leica DMIRE2 (χ 5) και τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας την εικόνα ΝΙΗ λογισμικό ανάλυσης (ImageJ).

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασία

η μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή προσδιορίσθηκε από φρεατίων δοκιμασία. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε κυτταρική καλλιέργεια Transwell ένθετα με μέγεθος πόρων 8 μm (Falcon) σε πυκνότητα 60.000 ανά φρεάτιο για PC-3 και 30.000 για Τ24 /83 (24-φρεατίων) σε μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό. Μετά από 1 ώρα το μόριο που ενδιαφέρει προστέθηκαν και στις δύο πλευρές του φίλτρου Transwell. Για τη δοκιμασία εισβολή, το άνω διαμέρισμα επικαλύφθηκε με 50 μg Matrigel (BD Biosciences) για να σχηματίσει ένα φράγμα μήτρας. Το κάτω διαμέρισμα γεμίστηκε με μέσο που περιέχει 10% FCS ως χημειοπροσελκυστικό. Μετά από 8 ώρες για τη δοκιμασία της μετανάστευσης και 24 ώρες για την εισβολή, μη-μεταναστευτικά κύτταρα απομακρύνθηκαν από την κορυφή του φίλτρου με απόξεση, ενώ τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου των πόρων του φίλτρου στην κάτω επιφάνεια των ενθέτων σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS και χρωματίστηκαν με Hoechst (5 mg /ml σε PBS) και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Leica DMIRB (× 200).

Ca

2 + Μετρήσεις χρησιμοποιώντας Fura-δύο

Πριν από την μετρήσεις φθορισμού, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επιστρώθηκαν πάνω σε γυάλινες ολισθήσεις. Το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε 48 ώρες. Τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν 3 ημέρες μετά την επεξεργασία με θρυψίνη. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε από ένα διάλυμα HBSS που περιέχει 142 mmol /L NaCl, 5,6 mmol /L KCI, 1 mmol /L MgCl2, 2 mmol /L CaCl2, 0,34 mmol /L Na2HPO4, 0,44 mmol /L ΚΗ2ΡΟ4, 10 mmol /L HEPES, και 5,6 mmol /L γλυκόζη. Η ωσμωτικότητα και το ρΗ του διαλύματος αυτού ρυθμίσθηκαν σε 310 mOsm /L και 7,4, αντίστοιχα. Χρώματος φόρτωσης επιτεύχθηκε με μεταφορά των κυττάρων σε ένα πρότυπο διάλυμα HBSS που περιέχει 1 mmol /L Fura-2 ακετοξυμεθυλ εστέρα (Calbiochem) φορτωμένου (45 min) για 40 λεπτά στους 37 ° C. Ακολούθως, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με το ίδιο διάλυμα χρωστικής-free. Η καλυπτρίδα κατόπιν μεταφέρθηκε σε ένα θάλαμο διάχυσης σε ένα μικροσκόπιο της Olympus IX70 εξοπλισμένο για φθορισμό. Ο φθορισμός εναλλακτικά διεγέρθηκε στα 340 και 380 nm με ένα μονοχρωμάτορα και συνελήφθη μετά από διήθηση μέσω ενός φίλτρου μακράς διόδου (510 nm) από ένα MicroMax 5 MHz κάμερα CCD (Princeton Instruments, Evry, Γαλλία). Απόκτηση και ανάλυση έγινε με το λογισμικό Metafluor 7.7.4.0 (Universal Imaging Corp., West Chester, PA). Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση ασβεστίου που προέρχεται από την αναλογία των εντάσεων φθορισμού για κάθε ένα από τα μήκη κύματος διέγερσης (F340 /F380) και από την εξίσωση του Grynkiewicz. Τα κύτταρα διαποτίζεται συνεχώς με διάλυμα HBSS μέσω ενός συστήματος διάχυσης ολόκληρο θαλάμων και χημικά προστέθηκαν μέσω του συστήματος διάχυσης. Ο ρυθμός ροής του όλου συστήματος διάχυσης θάλαμο ορίστηκε σε 1 ml /min και ο όγκος του θαλάμου ήταν 500 μΙ. Όλες οι εγγραφές έγιναν στους 37 ° C.

Βιοτινυλίωση και η κηλίδωση Western

Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [15]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν πολυκλωνικό κουνελιού αντι-VRL-1 (για TRPV2, 1/200, Santa Cruz), αντι-ΡΑΚ (1/500, Abcam), αντι-ΡΑΚ φωσφόρου Y397 (1/1000, Abcam), αντι-ιντεγκρίνης βήτα 1 φωσφο T788 + T789 (1/1000, Abcam), και αντι-ιντεγκρίνης βήτα 1 (1/200, Santa Cruz), και μονοκλωνικό ποντικού αντι-βήτα-ακτίνης (1/2000, Sigma-Aldrich).

δεδομένα Ανάλυση

τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SE. Οικόπεδα παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το Excel. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές. η δείχνει τον αριθμό των κυττάρων ανά πείραμα. Ν υποδεικνύει τον αριθμό των πειραμάτων που έγιναν. Η δοκιμή Τουρκίας-Kramer χρησιμοποιήθηκε για στατιστική σύγκριση μεταξύ των μέσων και των διαφορών, και η P & lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Adrenomedullin Αυξάνει PC-3 και Τ24 /83 κυτταρικής προσκόλλησης, τη μετανάστευση και την εισβολή

πρώτα ελέγχεται με RT-PCR της έκφρασης των υποδοχέων ΑΜ στον προστάτη και ουροφόρων καρκινικές κυτταρικές σειρές PC3 και Τ24 /83. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Α, PC-3 εκφράζει τους δύο υποδοχείς AM, CLR /RAMP2 και CLR /RAMP3, ενώ Τ24 /83 εκφράζει μόνο CLR /RAMP3.

(Α) RT-PCR πείραμα που δείχνει RAMP2, RAMP3 και έκφραση CLR στο PC-3 και τα κύτταρα Τ24 /83. (Β) PC-3 (αριστερό πάνελ) και /83 (δεξιός πίνακας) κύτταρο Τ24 προσκόλληση εξετάστηκε με σπορά 3 * 10

4 και 1,5 * 10

4 κύτταρα αντιστοίχως ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων προ- επικαλυμμένα με ινονηκτίνη, και επωάστηκαν για 45 λεπτά με ή χωρίς ΑΜ (200 ηΜ) (Ν = 3, * Ρ & lt? 0.05 σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου). β1 ιντεγκρίνης φωσφορυλίωση μελετήθηκε με τη δυτική-κηλίδωση επί συνόλου των πρωτεϊνών που προέρχονται από PC-3 και /83 κύτταρα Τ24 σπάρθηκαν σε πλάκες φιμπρονεκτίνης επικαλυμμένες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς ΑΜ. (C) PC-3 και Τ24 /83 κυτταρική μετανάστευση μελετήθηκε με δοκιμασία Transwell μετά από 8 ώρες της θεραπείας (Ν = 3, * Ρ & lt? 0.05 σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου). φωσφορυλίωση FAK μελετήθηκε με τη δυτική-κηλίδωση επί συνόλου των πρωτεϊνών που προέρχονται από PC-3 και Τ24 /83 κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς ΑΜ. (Δ) Για την δοκιμασία εισβολή, transwell μεμβράνη προ-επικαλύφθηκαν με 50 μg Matrigel, και PC-3 και Τ24 /83 κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν για 24 ώρες (Ν = 3, * Ρ & lt? 0.05 σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου).

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την κυτταρική προσκόλληση σε ένα σημαντικό συστατικό της βασικής μεμβράνης, το ινονεκτίνη. Η προσθήκη 200 ηΜ AM αυξήθηκε τόσο PC-3 και τα κύτταρα Τ24 /83 κατά 26% και 34% αντίστοιχα (Εικ. 1Β). Ένα από τα σημαντικότερα μοριακού παίκτες τροποποιώντας προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος είναι η ιντεγκρίνη υπεροικογένεια υποδοχέων, που αποτελούνται από ετεροδιμερή των α- και β- υπομονάδες αναγνωρίζοντας διαφορετικές πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας (ECM). Είναι ενδιαφέρον ότι, β1-ιντεγκρίνης είναι η πλέον άφθονη υπομονάδα εκφράζεται σε κύτταρα προστάτη και είναι ικανό να σχηματίσει ετεροδιμερή σύνδεση ινονεκτίνης [16], ενώ η αυξημένη έκφραση β1-ιντεγκρίνης συσχετίζεται με πιο επεμβατικές και μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης [17]. Η ενεργοποίηση των β1-ιντεγκρίνης οδηγεί σε φωσφορυλίωση του, η οποία μπορεί να εξετασθεί με κηλίδωση Western. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε εάν AM θα ​​μπορούσε να ενεργοποιήσει β1-ιντεγκρίνης με τη μελέτη της φωσφορυλίωσης της επί Thr-788-789 με ένα φωσφο-ειδικό αντίσωμα. Παρατηρήσαμε ότι η κατεργασία AM αύξησε σημαντικά το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης β1-ιντεγκρίνης χωρίς να επηρεάζει την έκφραση της συνολικής μορφής της πρωτεΐνης (Σχήμα 1 Β, κατώτερο πάνελ).

Τροποποίηση της πρόσφυσης μπορεί να προωθήσει τη μετανάστευση και την εισβολή:. Δύο σημαντικές κακοήθεια που σχετίζεται με φαινοτύπους. Έτσι, εξετάσαμε την επίδραση της θεραπείας στις ακόλουθες AM φαινοτύπους χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς transwell. Η προσθήκη 200 ηΜ AM αύξησε τη μετανάστευση των PC-3 κατά 45% και τα κύτταρα Τ24 /83 κατά 40% (Σχ. 1 C). Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι κατά την εμπλοκή με συστατικά του ECM, ιντεγκρίνες συγκεντρωμένα οδηγεί στην ενεργοποίηση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) με αυτοφωσφορυλίωση στο Tyr397. Η ενεργοποίηση του FAK ελέγχει κυτταρικού σχήματος και κινητικότητα [18]. Μελετήσαμε έτσι τη δραστικότητα του ΡΑΚ με western-κηλίδωση με ένα ειδικό αντίσωμα έναντι φωσφο-Tyr397 FAK. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C (κάτω πίνακας), η φωσφορυλιωμένη FAK έχει αυξηθεί σημαντικά με την κατεργασία AM σύνολο FAK ενώ η συνολική έκφραση της FAK παρέμεινε αμετάβλητη.

Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση της AM στο δυναμικό εισβολής των δύο κυτταρικών γραμμές με Transwell δοκιμασία για τον οποίο το φίλτρο transwell επικαλύφθηκε με Matrigel. θεραπεία AM αύξησε την ικανότητα του κυττάρου εισβολής μέσω του Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη κατά 54% σε κύτταρα PC-3 και κατά 61% σε 83 κύτταρα Τ24 /(Σχ. 1D).

TRPV2 Μεσολαβεί Αδρενομεδουλλίνη προαγωγή μετανάστευσης και εισβολή στο PC-3 και Τ24 /83 κύτταρα

δεδομένου ότι, έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι TRPV2 συμμετείχε στη μετανάστευση προστάτη των κυττάρων και εισβολής [12], [13] και από αυτό το κανάλι επίσης ενοχοποιηθεί στην καρκινογένεση της ουροδόχου κύστης [ ,,,0],14], ελέγξαμε εάν TRPV2 εμπλέκεται στην αύξηση της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολή από ΑΜ. Ελέγξαμε πρώτα έκφραση TRPV2 στις δύο κυτταρικές σειρές και downrerulation του από siRNA. ανάλυση Western blot με TRPV2-ειδικό αντίσωμα έχει δείξει ότι η πρωτεΐνη TRPV2 εκφράζεται σε PC3 και κύτταρα Τ24 /83, και ότι η έκφραση της πρωτεΐνης μπορεί να ανασταλεί αποτελεσματικά με επεξεργασία των κυττάρων με siRNA-TRPV2 (50 ηΜ, 48 ώρες, Σχ. 2Α). Αποσιώπηση του TRPV2 με siRNA-TRPV2 δεν μειώθηκε μόνο πρόσφυση της PC-3 και τα κύτταρα Τ24 /83 κατά 35% και 29% αντίστοιχα, αλλά κατάργησε επίσης διεγερτικές επιδράσεις στην προσκόλληση με κατεργασία ΑΜ (200 ηΜ). AM προσθήκη στα κύτταρα σε επεξεργασία με siRNA μάρτυρα ήταν σε θέση να ενισχύσει την προσκόλληση τους στην ινονηκτίνη κατά 29% για PC-3 και 25% για Τ24 /83 κύτταρα (Σχ. 2Β).

(Α) κηλίδωση Western ανάλυση του επιπέδου πρωτεΐνης TRPV2 σε PC-3 και Τ24 /83 κύτταρα κατεργασμένα με είτε siCTL ή siTRPV2 (50 ηΜ, 48 ώρες). Επίδραση της TRPV2 σίγηση (siTRPV2, 50 ηΜ, 48 ώρες) (Β) επί PC-3 και Τ24 /83 προσκόλληση κυττάρου προς fibroncectin επωάστηκαν ή όχι με ΑΜ (200 ηΜ, 45 min) (Ν = 3, * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου?

# P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με AM)? (C) στο PC-3 και Τ24 /83 κυτταρική μετανάστευση εξετάζονται από Transwell δοκιμασία μετά από 8 ώρες επώασης με ή χωρίς ΑΜ (Ν = 3 *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου?

# Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου αντιμετωπίζεται με ΑΜ)? (D) στο PC-3 και Τ24 /83 εισβολή των κυττάρων μέσω της Matrigel (AM 200 nM, 24 ώρες) (Ν = 3. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου?

# P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου αντιμετωπίζεται με ΑΜ).

η

στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση του χτύπημα κάτω των TRPV2 για τη μετανάστευση των κυττάρων από φρεατίων δοκιμασία. Η ελαττωμένη έκφραση της TRPV2 μειώθηκε όχι μόνο την κυτταρική μετανάστευση PC-3, αλλά επίσης και Τ24 /83, κατά 55% και 60% αντίστοιχα. Όπως φαίνεται για την πρόσφυση, η θεραπεία AM σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με siRNA-TRPV2 δεν ήταν πλέον σε θέση να προωθήσει τη μετανάστευση (Εικ. 2C).

Τέλος, εξετάσαμε την εισβολή του PC-3 και Τ24 /83 κύτταρα μέσω του Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη και όπως παρατηρείται για την προσκόλληση και τη μετανάστευση, siRNA-TRPV2 προκάλεσε μία μείωση τόσο του PC-3 και Τ24 /83 εισβολή, κατά 52% και 67%. Επιπλέον ΑΜ δεν θα μπορούσε να αυξήσει την εισβολή των PC-3 και Τ24 83 κύτταρα /αντιμετωπίζονται από siTRPV2 (Σχ. 2D).

AM Προκαλεί Μεταστέγαση TRPV2 στην πλασματική μεμβράνη μέσω ενός ΡΙ3Κ Διαδρομή

Εν όψει της συμμετοχής TRPV2 στην πμ επίδραση στην κυτταρική μετανάστευση, είμαστε δίπλα εξετάζονται από την απεικόνιση του ασβεστίου, αν AM μπορούσε να ενεργοποιήσει TRPV2. Οξεία εφαρμογή της ΑΜ σε PC-3 και T24 /83 δεν προκάλεσε αύξηση του ενδοκυτταρικού Ca

2 + συγκέντρωση ([Ca

2 +]

i) σε σύντομο χρονικό διάστημα κλίμακας (δηλαδή, μέσα σε λίγα λεπτά ), όπως θα περίμενε κανείς από την ενισχυμένη TRPV2 μεσολάβηση Ca

2+ εισόδου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, η παρατεταμένη 45 λεπτά μακρά θεραπεία των δύο κυτταρικών σειρών με ΑΜ προκάλεσε μια αύξηση της βασικής [Ca

2+] ι LEVEL (PC-3: από τιμή ελέγχου 100 ηΜ έως 140 ηΜ με την παρουσία ΑΜ? Τ24 /83:139 ηΜ έως 200 ηΜ? Εικ. 3Α). Η σίγηση του TRPV2 με siRNA (50 ηΜ, 48 ώρες) μείωσε τη βασική [Ca

2 +]

i (PC-3: 70 ηΜ? Τ24 /83: έως 86 ηΜ) υποδεικνύοντας ότι σταθερής κατάστασης TRPV2 μεσολάβηση Ca

εισροή 2+ συμβάλλει στην ηρεμία του κυτταροπλάσματος Ca

2+ συγκέντρωση. Επιπλέον, TRPV2 σίγηση εμπόδισε επίσης την αύξηση των βασικών [Ca

2 +]

I σε απάντηση στην θεραπεία ΑΜ (Σχ. 3Α), σε συνέπεια με την ιδέα ότι η παρατεταμένη επώαση του PC-3 και τα κύτταρα Τ24 /83 προκαλεί έμμεση ενεργοποίηση των TRPV2 από την AM μέσω του μονοπατιού που απαιτεί κάποιο χρόνο για να παράγει τα αποτελέσματά της σηματοδότησης.

(Α) Η επίδραση των ΑΜ (200 nM, 45 λεπτά) και TRPV2 σίγηση (siTRPV2, 50 nM, 48 ώρες ) επί της βασικής κυτοσολικό ασβέστιο από PC-3 και T24-83 κυττάρων μελετήθηκε με απεικόνιση ασβεστίου. (N = 120 κύτταρα, Ν = 4, *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου?

# P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με ΑΜ). (Β) παρουσία TRPV2 στην πλασματική μεμβράνη εξετάστηκε με βιοτινυλίωση επί 83 κύτταρα Τ24 /ή τον έλεγχο είτε κατεργάζεται με ΑΜ (200 ηΜ, 45 min) ή ΑΜ και αναστολέα ΡΙ3Κ LY294.002 (10 μΜ, προστέθηκαν 5 λεπτά πριν AM). (C) Επίδραση της LY294.002 στο PC-3 και Τ24 /83 κυτταρική μετανάστευση εξετάζονται από φρεατίων δοκιμασία μετά από 8 ώρες επώασης με ή χωρίς ΑΜ (Ν = 3. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου?

# P & lt ? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με ΑΜ). (D) Επίδραση της LY294.002 στην ΑΜ-επαγόμενη μετανάστευση των PC-3 και /83 κύτταρα TRPV2-σιγήσει T24 εξετάζεται από φρεατίων δοκιμασία μετά από 8 ώρες επώασης με ή χωρίς ΑΜ (Ν = 3. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο κύτταρα?

# P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με ΑΜ)

η

είναι γνωστό ότι η ΑΜ μπορεί να ενεργοποιήσει PI3K [19] και ότι η ενεργοποίηση της PI3K μπορεί να οδηγήσει στην TRPV2 μετατόπιση προς το πλάσμα μεμβράνη [12]. Έτσι, το επόμενο εξετάστηκε εάν η παρουσία του TRPV2 στην πλασματική μεμβράνη εξαρτάται από την ΑΜ και στην ακεραιότητα των ΡΙ3Κ μονοπατιού σηματοδότησης. Για να γίνει αυτό, Τ24 /83 κύτταρα επεξεργάστηκαν με είτε ΑΜ (200 ηΜ για 45 λεπτά) ή ΑΜ συν αναστολέα ΡΙ3Κ LY294.002 (10 μΜ, προστέθηκαν 5 λεπτά πριν από την ΑΜ), και εντοπισμός μεμβράνης πλάσματος αναλύθηκε με βιοτινυλίωση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Β, AM αυξημένη παρουσία TRPV2 στη μεμβράνη, και αυτό το αποτέλεσμα θα μπορούσε να ανασταλεί από LY294.002, υποδηλώνοντας την εμπλοκή ΡΙ3Κ σηματοδότησης σε AM επίδραση επί TRPV2.

Συνεπώς, μελετήθηκαν από transwell δοκιμασία εάν LY294.002 θα μπορούσε να βλάψει τον υπολογιστή-3 και Τ24 /83 κυτταρική μετανάστευση. Έχουμε δείξει ότι LY294.002 (10 μΜ) απέτρεψε την διεγερτική δράση της ΑΜ στις δύο PC-3 και τα κύτταρα Τ24 /83 ενώ δεν τροποποίησε την βασική μετανάστευση αυτών των κυττάρων (Σχ. 3C). Επιπλέον AM προκαλείται από τη μετανάστευση με την παρουσία του siTRPV2 δεν επηρεάστηκε από την εφαρμογή LY294.002 τόσο σε PC-3 και Τ24 κύτταρα /83 υποστηρίζουν την ιδιαιτερότητα της συμμετοχής PIK3 στην επίδραση πμ στο κανάλι TRPV2.

συζήτηση

am δραστηριότητας στην εξέλιξη του όγκου διέγερσης έχει αποδειχθεί σε πολλές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη, αλλά όχι για καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Μέχρι σήμερα, έχουν δύο πιθανοί μηχανισμοί με τους οποίους AM υποστηρίζει την ανάπτυξη του όγκου προταθεί. Η πρώτη δυνατότητα είναι ότι πμ προάγει την ανάπτυξη του όγκου με διέγερση αγγειογένεσης [5], [6]. Ο δεύτερος πιθανός μηχανισμός είναι ότι πμ προωθεί άμεσα τον πολλαπλασιασμό των όγκων και της επιβίωσης. Μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι πμ ανταγωνιστής ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων που εκφράζουν υποδοχείς AM in vitro [20]? Ωστόσο, καμία επίδραση δεν έχει ποτέ περιγραφεί για τη μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη /εισβολής και καθόλου για καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Στη μελέτη αυτή αναφέρει για πρώτη φορά ότι η κυτταρική γραμμή UC T24 /83, εκφράζουν επίσης υποδοχέα AM (CLR /RAMP3) και ότι η ΑΜ μπορεί να αυξήσει όχι μόνο τον προστάτη κυτταρική γραμμή PC-3 αλλά και η κυτταρική γραμμή UC T24 /83 επεμβατική φαινότυπο με τον ίδιο τρόπο, διεγείροντας την κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση μέσω της β1-ιντεγκρίνης και ενεργοποίηση FAK αντίστοιχα.

το ασβέστιο είναι ένας σημαντικός παράγοντας στη διαδικασία της μετανάστευσης [7]? μελέτες από το εργαστήριο μας δείχνουν ότι το δυναμικό TRPV2 κανάλι Παροδική υποδοχέας εκφράζεται στις μεταστατικές κυτταρικές γραμμές PCa, συμπεριλαμβανομένων PC-3 κύτταρα, και τα επίπεδα trpv2 μεταγραφής είναι 12 φορές υψηλότερη σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο (στάδιο Μ1) σε σύγκριση με το πρωτογενές συμπαγείς όγκους ( στάδια T2a και T2b). Βασική δραστικότητα αυτού του καναλιού, καθώς και επαγόμενη, προάγει τη μετανάστευση των κυττάρων και PCa επεμβατική φαινότυπο [12], [13]. Επιπλέον, η έκφραση TRPV2 είναι επίσης αυξημένη σε υψηλότερο στάδιο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [14]. Έχουμε αποδείξει ότι εδώ αποσιώπηση αυτού του καναλιού και μειώνει δραστικά την μετανάστευση και την εισβολή της κυτταρικής σειράς UC Τ24 /83. Αλλά το πιο σημαντικό εύρημα είναι ότι TRPV2 διαμορφώνει AM διέγερση της κυτταρικής κινητικότητας και την εισβολή, όπως φαίνεται από την απουσία της AM επίδραση στην προσκόλληση, μετανάστευση και εισβολή όταν η έκφραση TRPV2 καταρριφθεί. AM, δρώντας σε TRPV2 μετατόπιση σε μεμβράνη του πλάσματος, αύξησε την ανάπαυση επίπεδο του ασβεστίου και των δύο κυτταρικές σειρές, οι οποίες συνέβαλαν στην επίδρασή του στο PC-3 και Τ24 /83 κυτταρική μετανάστευση.

Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ΑΜ και TRPV2 συσχετισμένη έκφραση μπορεί να συμβάλει στη δημιουργία ιδανικών συνθηκών για τη μεταστατική εξάπλωση σε ασθενείς με προστάτη ή της ουροδόχου κύστης και θα μπορούσε να αποτελέσει υποψήφιο προγνωστικό δείκτη και ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο να αυξήσει το προσδόκιμο ζωής των ασθενών.