Αφηρημένο

3-διαστάσεων (3D) μοντέλα πολιτισμού έχουν τη δυνατότητα να γεφυρώσει το χάσμα μεταξύ μονοστρωματική καλλιέργεια κυττάρων και

in vivo

μελέτες. Για να επωφεληθείτε αντικαρκινικές ανακάλυψη φαρμάκων από 3D μοντέλα, οι νέες τεχνικές που απαιτούνται που επιτρέπουν τη χρήση τους σε υψηλής απόδοσης (HT) διαλογή επιδέχονται μορφές. Έχουμε αναπτύξει μεθόδους καλλιέργειας μικρογραφία 3D αρκετά ισχυρή για την αυτοματοποιημένη οθόνες ΗΤ. Έχουμε εφαρμόσει αυτές τις μεθόδους για να αξιολογηθεί η ευαισθησία των φυσιολογικών και ογκογονικών κυτταρικών σειρών επιθηλιακών μαστού έναντι μιας ομάδας φαρμάκων ογκολογίας όταν καλλιεργούνται ως μονοστοιβάδες (2D) και σφαιροειδή (3D). Έχουμε εντοπίσει δύο κατηγορίες ενώσεων που εμφανίζουν προτιμησιακή κυτταροτοξικότητα κατά των καρκινικών κυττάρων επί φυσιολογικών κυττάρων όταν καλλιεργούνται ως 3D σφαιροειδή: παράγοντες μικροσωληνίσκων-στόχευσης και αναστολείς (EGFR), τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα. Περαιτέρω βελτίωση επάνω 3D μοντέλο μας, ανώτερη διαφοροποίηση των τιμών EC50 στις οθόνες απόδειξη της έννοιας λήφθηκε με συν-καλλιέργεια των κυττάρων καρκίνου του μαστού με φυσιολογικό ανθρώπινο ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα. Περαιτέρω, η επιλεκτική ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων προς χημειοθεραπευτικά παρατηρήθηκε σε 3D συνθήκες συν-καλλιέργειας, παρά ως 2D μονοστιβάδες συν-καλλιέργεια, τονίζοντας τη σημασία της 3D πολιτισμών. Τέλος, εξετάσαμε την υποθετική μηχανισμούς που οδηγούν τη διαφορετική δραστικότητα που εμφανίζεται από αναστολείς EGFR. Συνοπτικά, οι μελέτες μας δημιουργήσει ισχυρές 3D μοντέλα καλλιέργεια ανθρώπινων κυττάρων για την αξιολόγηση HT παραγόντων όγκου των κυττάρων-επιλεκτική. Η μεθοδολογία αυτή αναμένεται να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη των βιολογικών διαφορών μέσα σε συνθήκες καλλιέργειας 2D και 3D σε μορφή ΗΤ, και μια σημαντική πλατφόρμα για τα νέα ανακάλυψη αντικαρκινικών φαρμάκων

Παράθεση:. Howes AL, Richardson RD , Finlay D, Vuori Κ Systems (2014) 3-διαστάσεων Πολιτισμού για Αντικαρκινική Ένωση Profiling και High-Throughput Screening Αποκαλύπτουν Αυξήσεις στα EGFR αναστολέα κυτταροτοξικότητα σύγκριση με τα συστήματα μονόφυλλο Πολιτισμού. PLoS ONE 9 (9): e108283. doi: 10.1371 /journal.pone.0108283

Επιμέλεια: Χρύσω Κάνθου, Πανεπιστήμιο του Σέφιλντ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 1 Νοεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 27 Αύγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 Σεπτέμβρη 2014

Copyright: © 2014 Howes et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση ARRA (1 RC1 EB011780-01) «High διαλογή σε ανθρώπινη 3D σφαιροειδή επιθηλιακών, ενδοθηλιακών, και στρωματικά κύτταρα» (Vuori, ΡΙ) από HHS-εθνικά Ινστιτούτα Υγείας-Εθνικό Ινστιτούτο bioimaging and Bioengineering. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς σημειώνουν ότι μία ή περισσότερες από τις συγγραφείς απασχολούνται σήμερα από μια εμπορική εταιρεία (Tanabe Research Laboratories). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η ανάπτυξη και αξιοποίηση των συστημάτων μοντέλο που ανακεφαλαιώνουν την ανθρώπινη σταθερή αρχιτεκτονική του όγκου και της βιολογίας είναι απαραίτητα για την καλύτερη κατανοήσουν την παθοφυσιολογία των καρκινικών κυττάρων, και για να βοηθήσουν στην ανακάλυψη νέων αντικαρκινικών θεραπειών. Ως αποτέλεσμα, έχουν αναπτυχθεί υποδείγματα ώστε να αντικατοπτρίζει το μικροπεριβάλλον των συμπαγών όγκων. 3D καλλιέργειες σφαιροειδές μπορεί ανακεφαλαίωση αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου, τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-μήτρας, κλίσεις θρεπτικών συστατικών και του οξυγόνου, και η κυτταρική πολικότητα που λείπει στην παραδοσιακή καλλιέργεια 2D μονοστοιβάδας [1], [2]. 3D καλλιέργειες περιέχουν επίσης ετερογενών ζωνών πολλαπλασιαζόμενων, ηρεμίας, και πεθαίνουν τα κύτταρα, τα οποία βρίσκονται επίσης σε ανθρώπινο ιστό όγκου και εκθεσιακό διαφορετικές ευαισθησίες σε θεραπείες κατά των όγκων [1], [3]. Έτσι, 3D μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας φέρει σημαντική αξία στην ανακάλυψη φαρμάκων και την αναπτυξιακή διαδικασία ως μια πιθανή πρακτική γέφυρα μεταξύ των παραδοσιακών

in vitro

μονοστρωματικές καλλιέργειες και ακριβά

in vivo

ζωικές μελέτες [4], [ ,,,0],5], [6].

Η τρέχουσα θεραπεία για τους περισσότερους καρκίνους του ανθρώπου περιλαμβάνει χημειοθεραπευτικούς παράγοντες που είναι τοξικές έναντι διαιρούμενα κύτταρα, συχνά με αποτέλεσμα πολυάριθμες παρενέργειες. Η έγκριση των μοριακά στοχευμένες θεραπείες, όπως το imatinib αναστολείς της πρωτεϊνικής κινάσης, gefitinib, και λαπατινίμπη, έχουν ληφθεί από την υπόσχεση ότι παράγοντες που στοχεύουν ειδικά τα καρκινικά κύτταρα και όχι όλα τα διαιρούμενα κύτταρα να οδηγήσει σε λιγότερες παρενέργειες.

Όταν οι μελέτες κυτταροτοξικότητα κατά των καρκινικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε, τα κύτταρα συνήθως καλλιεργούνται ως μονοστιβάδα, όπου οι επαφές κυττάρου-κυττάρου και τα σήματα μικροπεριβάλλον λείπουν και οι συνθήκες καλλιέργειας μπορεί επομένως δεν αντανακλούν την

in vivo

κατάσταση για κυτταροτοξικότητα και /ή αντοχής φαρμάκου. Για να παρακαμφθούν αυτά τα τεχνικά προβλήματα, τα 3D καλλιέργειες σχηματίζονται και αναλύονται σε μια ποικιλία από ενδιαφέρουσες μορφές [7], [8], [9], και οι συν-καλλιέργειες αναγνωρίζεται ως πολύτιμος συστήματα για την πρόβλεψη αποκρίσεων φάρμακο

in vivo

για έναν αριθμό διαφορετικών ασθενειών [10], [11], [12]. Μια πρόσκληση για πολύπλοκα μοντέλα 3D πολιτισμό ειδικά για τον καρκίνο του μαστού [13] υπογραμμίζει τη σημασία του έργου από Reid

et al.

Για τη μέτρηση της μεταγραφικής αλλαγές σε καλλιέργειες μονοτυπικό 3D χρησιμοποιώντας υψηλή περιεκτικότητα απεικόνισης [14], καθώς και της μελέτης μας εδώ όπου έχουμε μέτρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας σε υψηλής απόδοσης (ΗΤ) επιδεκτικοί 3D συν-καλλιέργειες που αποδεικνύουν την χρησιμότητα του 3D συν-καλλιέργειες για την ταυτοποίηση παραγόντων κατά του όγκου με ισχυρή εκλεκτικότητα για κύτταρα όγκου πάνω από τα φυσιολογικά κύτταρα.

Εδώ, έχουμε χρησιμοποιηθεί μία τροποποιημένη έκδοση του πολυ-κυτταρικό σφαιροειδές «κρέμεται drop» τεχνική [15] και έχουν βελτιστοποιηθεί υψηλής πυκνότητας τρυβλία με στρογγυλό πυθμένα που έχουν υποστεί επεξεργασία με υδρογέλες να αναστέλλουν προσκόλληση κυττάρου, επιτρέποντας το σχηματισμό του ενιαία σφαιροειδή αναπαραγώγιμη μέγεθος διαμέσου αρκετούς διαφορετικούς τύπους ανθρώπινου κυττάρου. Η ανάγκη για HT-επιδεκτική μοντέλα για την έρευνα του καρκίνου έχει επισκοπηθεί πρόσφατα [16]. Από τους πέντε σημαντικότερους μεθόδους για την παραγωγή ομοιόμορφου μεγέθους σφαιροειδή? ότι είναι, χιτοζάνη υδρογέλη συν-καλλιέργεια, PDMS V-κάτω μικροβυθίσματα, μικρορροϊκές συσκευές, δύο στρωμάτων εμβρυοειδή σώματα, και η πολυ-καλά κρέμεται πτώση (αναθεωρηθούν [3] και [17]), εμείς αιτιολογημένη ότι η multi-καλά κρέμονται μοντέλο πτώση είναι η πιο HT-δεκτικά λόγω του κόστους, που πληρούν τις απαιτήσεις χειρισμού υγρών, και ως αποτέλεσμα σε λιγότερο διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με χορηγούμενες ενώσεις. Στις μελέτες μας, έχουμε δημιουργούνται 3D καλλιέργειες φυσιολογικών και ογκογονικών κυττάρων μαστικού επιθηλίου κατάλληλα για εύρωστη ενδείξεις κυτταρικής βιωσιμότητας σε πρωτογενείς και δευτερογενείς οθόνες επιβεβαίωση χτύπημα. Τα σφαιροειδή βρέθηκαν επίσης να είναι δεκτικά σε παραδοσιακές βιοχημικές και κυτταρικές βιολογικές τεχνικές (π.χ. ανοσοαποτύπωσης και ανοσοχρώση), επιτρέποντας μηχανιστικές μελέτες. Έτσι, χρησιμοποιώντας την ίδια πειραματική μορφή, είμαστε τώρα σε θέση να συγκρίνουν άμεσα τα φυσιολογικά κύτταρα σε καρκινικά κύτταρα σε 3D πολιτισμό.

Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε την ευαισθησία των φυσιολογικών και καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων του μαστού γραμμές για την 89 κλινικά σημαντικές ενώσεις του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (NCI) Εγκρίθηκε ογκολογία Drug Collection (ADC) [18]. Όπως αναμενόταν, παρατηρήσαμε σημαντική κυτταροτοξικότητα προς τις δύο φυσιολογικών και καρκινικών κυτταρικών σειρών με έναν αριθμό φαρμάκων, αλλά επίσης και προσδιορίζονται παράγοντες μικροσωληνίσκων στόχευσης και αναστολείς του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), ως κύριες κατηγορίες ενώσεων που επιδεικνύουν επιλεκτική κυτταροτοξικότητα έναντι κυττάρων όγκου πέρα φυσιολογικά κύτταρα όταν καλλιεργείται σε 3D. Δημιουργήσαμε επίσης 3D συν-καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων ανθρώπινου όγκου του μαστού με στρωματικά και ενδοθηλιακά κύτταρα και σε σύγκριση εκείνων σε 3D συν-καλλιέργειες των στρωματικών και ενδοθηλιακά κύτταρα. Η βιβλιοθήκη ADC και πάλι σε διαλογή με τη χρήση αυτών των συν-καλλιέργειες, αυτή τη φορά πάνω από τέσσερις συγκεντρώσεις και με ενισχυμένη ευρωστία της δοκιμασίας. Τα αποτελέσματα από αυτές τις οθόνες απόδειξη της έννοιας έδειξε ότι 3D καλλιέργειες και συν-καλλιέργειες μπορεί να είναι πολύτιμα εργαλεία για την ταυτοποίηση κλινικά χρήσιμα φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων των μοριακώς στόχευση παράγοντες με επιλεκτικότητα για κύτταρα όγκου πάνω από τα φυσιολογικά κύτταρα που έχουν τη δυνατότητα να μειώσουν δηλητηριώδη πλευρά -effects παρατηρούνται συχνά με κυτταροτοξικών παραγόντων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ενώσεις και αντιδραστήρια

Η Εγκρίθηκε ογκολογία Φαρμάκων Collection (ADC) ελήφθη από την Developmental Therapeutics Program του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου . Η συλλογή περιλαμβάνει 89 φάρμακα, όλα διατηρήθηκε σε 10 mM σε 100% DMSO. Για περισσότερες πληροφορίες, δείτε: https://dtp.nci.nih.gov/branches/dscb/oncology_drugset_explanation.html [18]. Hoechst 33342 αγοράστηκε από την Invitrogen (H3570), βινβλαστίνη και βινορελβίνη από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ), και λαπατινίμπη, gefitinib, dasatinib και Tyrphostin AG1478 από LC Labs (Woburn, ΜΑ).

κύτταρα και αντισώματα

κύτταρα ΜΟΡ-10Α, ΒΤ-474 κύτταρα, και ινοβλάστες ανθρώπινης ακροποσθίας (Hs.58) ελήφθησαν από την ATCC. κύτταρα ΜΟΡ-10Α καλλιεργήθηκαν σε 50/50 DMEM /F12, 5% FHS, 1 μg /mL υδροκορτιζόνη, 5 μg /ml ινσουλίνη, 5 ng /mL rhEGF, και πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη και γλουταμίνη (PSG) συμπληρώματα. ΒΤ-474 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI με 10% FCS και ανθρώπινων ινοβλαστών (HFS) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FCS και PSG. Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) ελήφθησαν από την Lonza (Walkersville, MD) και καλλιεργήθηκαν σε της Lonza Ενδοθηλιακών Κυττάρων Basal Medium (ΕΒΜ-2) συμπληρωμένο με EGM-2 singlequots (CC-3124). Το CD31 αντίσωμα (κλώνος JC70A) ελήφθη από την Dako North America, Inc. (Carpinteria, CA) (# M0823) και χρησιμοποιήθηκε σε μια αραίωση 1:50, το αντίσωμα βιμεντίνη (V2122-11E) από το US Biological (1:200 αραίωση ), το αντίσωμα β-ακτίνης (κλώνος AC-40) από την Sigma (1:5000 αραίωσης για ΙΒ) και το αντίσωμα HER2 (554.299) από την BD Biosciences (1:1000 αραίωση). Το αντίσωμα φωσφο-HER2 (κλώνος 6B12) (1:100 αραίωσης για IF, 1:1000 για IB), φωσφο-EGFR αντίσωμα (κλώνος D7A5) (1:100 αραίωσης για IF, 1:1000 για IB), και το συνολικό EGFR αντίσωμα (κλώνος C74B9) (1:1000 για ΙΒ) ήταν όλοι αγοράζονται από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ).

συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων σε 2D ή 3D

MCF-10Α, BT- 474, ανθρώπινους ινοβλάστες ή HUVECs διατηρήθηκαν ως μονοστρωματικές καλλιέργειες στα μέσα που περιγράφονται παραπάνω. Για να δημιουργηθούν καλλιέργειες μικρογραφία 3D για HTS, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε έναν αριθμό κυττάρων παρατηρήθηκε με συνέπεια να σχηματιστεί μια ενιαία, ομοιόμορφη γύρο σφαιροειδές. ΒΤ-474 κύτταρα σπάρθηκαν στα 3000 κύτταρα /φρεάτιο (σε RPMI + 10% FBS + μέσο PSG) και τα κύτταρα ΜΟΡ-10Α στα 1000 κύτταρα ανά φρεάτιο (σε 50/50 DMEM /F12, 5% FHS, 1 μg /mL υδροκορτιζόνη, 5 μg /ml ινσουλίνη, 5 ng /mL rhEGF, PSG) σε ultralow πλάκες 96-φρεατίων με στρογγυλό πυθμένα προσάρτησης (Corning # 7007). Κατά τη διάρκεια μιας περίοδος των σαράντα-οκτώ ώρα σφαιροειδή αυτο-συναρμολογούνται από τα σπαρμένα κύτταρα, ένας σφαιροειδές (από -250 μικρά σε διάμετρο) ανά φρεάτιο. Τα σφαιροειδή που υπερβαίνει τα 200 μικρά σε διάμετρο βρέθηκαν να έχουν τα κύτταρα υποξική που βρίσκεται στο εσωτερικό του σφαιροειδούς [χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ανίχνευσης hypoxyprobe, ΝΡΙ Inc. (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)]. Η βιωσιμότητα των κυττάρων που συνθέτουν τα σφαιροειδή ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ΑΤΡ σαν ανάγνωση και κύτταρα βρέθηκαν να διατηρηθεί η βιωσιμότητα για τουλάχιστον πέντε ημέρες μετά την επιμετάλλωση, χωρίς να χρειάζεται να αλλάξει το μέσο ή προσθέστε τα συμπληρώματα. Για HTS πολιτισμούς σε 2D, με επίπεδο πυθμένα πλάκες 96 φρεατίων καλλιέργειας επικαλυμμένα με κοινή ιστού (Corning # 3595) χρησιμοποιήθηκαν για να αναπτυχθούν τα κύτταρα, τα ίδια μέσα ενημέρωσης και σε ίδιες συγκεντρώσεις κυττάρων όπως σημειώνεται παραπάνω.

Για συν-καλλιέργειες σε 3D, θρυψίνη κύτταρα μετρήθηκαν και αναμειγνύονται μαζί για να σπείρονται σε 96-φρεατίων με στρογγυλό πυθμένα ultralow πλάκες στερεώσεως (Corning # 7007). Όπως υποδεικνύεται στις λεζάντες, είτε ο συνολικός αριθμός των κυττάρων πραγματοποιήθηκε στα 3000 κύτταρα ανά φρεάτιο, ή 3000 ΒΤ-474 κύτταρα σπάρθηκαν μαζί με 1.500 HFS και /ή HUVECs. Όπως παρατηρήθηκε με τα μονοτυπικό σφαιροειδή, οι συν-καλλιέργειες επίσης σχηματίστηκε αυθόρμητα ένας σφαιροειδής ανά φρεάτιο κατά την διάρκεια της περιόδου επώασης των 48 ωρών. Με ανάλυση των επιπέδων ΑΤΡ, τα σφαιροειδή συγκαλλιέργεια ήταν βιώσιμα για 5 ημέρες χωρίς αλλαγή μέσου ή προσθήκη συμπληρωμάτων. Όλοι οι συν-καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε ένα μείγμα 1:01:01 από RPMI: DMEM: EGM-2 πλήρες μέσο. Τα 2D συν-καλλιέργειες απλώθηκαν στην ίδια αναλογία των κυττάρων στο ίδιο μικτό μέσο, ​​αλλά σε επίπεδο πυθμένα πλάκες καλλιέργειας ιστού των 96 φρεατίων (Corning # 3595). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα 2D ή 3D χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας, διαλογή ή ανοσοχρώση όπως περιγράφεται στις επόμενες ενότητες Μέθοδοι.

κυτταροτοξικότητας δοκιμασία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται για 2D ή 3D καλλιέργεια, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ενώσεις στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση για 48 ώρες. Για την ποσοτικοποίηση κυτταρική ΑΤΡ ως ένα μέτρο της βιωσιμότητας, 50 μL του αντιδραστηρίου CellTiter GLO (Promega) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες ανακινήθηκε κυκλικά για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να διευκολυνθεί η λύση. Επιπλέον, σφαιροειδή κονιοποιήθηκαν έξι φορές για να προωθήσουν την πλήρη λύση. Καλά περιεχόμενα μεταφέρθηκαν σε μία πλάκα λευκό πυθμένα 96 φρεατίων και αναγνώστηκαν σε αναγνώστη πλακός φωταύγειας Bio-Tek.

Ανάλυση ανοσοφθορισμού της σφαιροειδούς τμημάτων

Τα σφαιροειδή σταθεροποιήθηκαν για 1 ώρα σε φορμόλη ψευδαργύρου , πλύθηκαν σε PBS, και στη συνέχεια καταψύχονται σε OCT (Takeda) για κρυοστάτη τομές. Δέκα micron τομές τοποθετήθηκαν επάνω σε πλάκες και χρωματίζονται με κατάλληλη πρωτοταγή αντισώματα για 1 ώρα στους 37 ° C. Μετά από τρεις πλύσεις διεξοδική σε 1Χ TBS + 0.2% Tween-20, τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι-ποντικού Alexa 488 (Invitrogen) σε αραίωση 1:500, αντι-κουνελιού Alexa 594 (Invitrogen) σε 1:750 αραίωση και Hoechst 33342 σε μια αραίωση 1:10,000 για 1 ώρα στους 37 ° C. Οι πλάκες πλένονται και τοποθετούνται με Vectashield (Vector Laboratories).

Μικροσκοπίας και 3D καθιστώντας

φωτεινού ή φθορίζουσες εικόνες (10Χ) ελήφθησαν από ένα μικροσκόπιο AI Παρατηρητής Zeiss με Φωτομετρικά Coolsnap HQ

2camera. Ομοεστιακή (BD CARVII) οπτική τομή έγινε σε z-σειρά δεν σταματούν σε 4 βήματα micron, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε 3D αποσυνέλιξη μέσω Autoquant (Media Cybernetics), το λογισμικό, και οπτικοποιούνται στο 4D θεατή Metamorph του (MDS Αναλυτική Tech).

πρωτόκολλα διαλογής

Η Εγκρίθηκε ογκολογία Φαρμάκων συλλογή που λαμβάνεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου χρησιμοποιήθηκε στις οθόνες. Για ενιαίο σημείο συγκέντρωσης πρωτογενή οθόνες, τα κύτταρα ΒΤ-474 σπάρθηκαν στα 3000 κύτταρα /φρεάτιο (σε RPMI + 10% FBS μέσο PSG +) και τα κύτταρα ΜΟΡ-10Α στα 1000 κύτταρα ανά φρεάτιο (σε 50/50 DMEM /F12, 5% FHS, 0,5 μg /mL υδροκορτιζόνη, 5 μg /ml ινσουλίνη, 5 ng /mL rhEGF, PSG) σε 96-φρεατίων Corning # 3595 (για 2D) ή Corning # 7007 (για 3D) πλακών. πλάκες αραίωσης έγιναν με αραίωση των ενώσεων 1:01 με 50% μέσο /50% DMSO για να δώσει τελική συγκέντρωση 5 μΜ ανά φρεάτιο. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη βιβλιοθήκη ενώσεων. Μετά από 48 ώρες ένωσης επώασης, τα κύτταρα λύθηκαν με 50 μι CellTiterGLO (Promega) αντιδραστήριο με 15 λεπτά περιστροφική ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου. 75 μι διαλύματος μεταφέρθηκε σε πλάκες Greiner Lumitrac και αναγνώστηκαν σε αναγνώστη πλακός BioTek φωταύγειας.

Για τις οθόνες συν-καλλιέργεια, χρησιμοποιήθηκε σειριακή αραίωση έλεγχο. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 1500 HF + 1.500 κύτταρα HUVEC ανά φρεάτιο για την ανθρώπινη ινοβλάστη και ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων (HF + HE) συν-καλλιέργειες (σε EGM-2 πλήρες μέσο), ή 750 HF + 750 HUVEC + 1500 BT-474 για τα ΒΤ-474 + HF + HE συν-καλλιέργειες (στο 1:01 RPMI + 10% FBS + PSG: EGM-2 πλήρες μέσο). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε Corning # 7007 στρογγυλό πυθμένα, εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στήριξης διαμορφώνεται ένα ενιαίο σφαιροειδές 3D ανά καλά, ενώ κύτταρα καλλιεργούνται σε Corning # 3595 επίπεδο πυθμένα, τρυβλία καλλιέργειας επεξεργασμένα ιστού που επισυνάπτεται ως μια μονοστοιβάδα 2D. Μετά από 48 ώρες επώασης για να επιτραπεί ο σχηματισμός σφαιροειδές ή προσκόλληση των κυττάρων, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χρήση υγρού χειριστή STAR με 1 μL της ένωσης. Εδώ, ο εγκεκριμένος ογκολογία Drug Collection χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή κύριες πλάκες μέσω αραίωσης με DMSO χρησιμοποιώντας ένα χειριστή υγρού STAR έως 10 mM, 1 mM, 100 μΜ, και 10 μΜ πλάκες αποθέματος για την αγωγή των κυττάρων με τέσσερις διαφορετικές τελικές συγκεντρώσεις (100 μΜ, 10 μΜ, 1 μΜ και 0,1 μΜ). Λαπατινίμπη προστέθηκαν σε κάθε πλάκα αραίωσης για θετικό έλεγχο, για να δώσει τελικές συγκεντρώσεις σε φρεατίων 10 μΜ, 1 μΜ, 0,1 μΜ και 0,01 μΜ. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, 50 μι CellTiterGLO (Promega) αντιδραστήριο προστέθηκε σε κάθε πηγάδι χρησιμοποιώντας Multidrop Combi. Οι πλάκες ανακινήθηκαν επί 15 λεπτά για να ενθαρρύνει την κυτταρική λύση. Σφαιροειδές λύσης περαιτέρω βοήθεια με ανάμιξη 100 μΙ όγκου χρησιμοποιώντας το χειριστή υγρού STAR, και στη συνέχεια 75 μΙ μεταφέρθηκε σε ένα 96-φρεατίων πλάκα Greiner Lumitrac για την ανάγνωση φωταύγειας επί αναγνώστη πλάκας Envision ΡΕ. Για τις πλάκες μονοστρωματική, 75 μλ μεταφέρθηκαν στις πλάκες Greiner Lumitrac ανά καλά, και επίσης να διαβάσετε για το PE οραματιζόμαστε.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Προβολή της 3D πολιτισμούς αποκαλύπτει επιλεκτικότητα των κυττάρων του όγκου για ορισμένες κατηγορίες φαρμάκων

για να καθοριστεί εάν τα ανθρώπινα κύτταρα που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια 3D προσέφερε ένα πλεονέκτημα σε σχέση με 2D καλλιέργειες για την ταυτοποίηση ενώσεων κατά του όγκου με μεγαλύτερη επιλεκτικότητα για καρκινικά κύτταρα από τα φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα, θα βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες να αναπτυχθούν και επιθηλιακών μαστού οθόνη κύτταρα σε δύο διαφορετικές μορφές πολλαπλών φρεατίων. Για το σχηματισμό 3D σφαιροειδή, χρησιμοποιήθηκαν 96 φρεατίων U πυθμένα εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως. Αυτό ενθάρρυνε τα κύτταρα προστίθενται σε κάθε φρεάτιο για να συσσωματώνονται μαζί και σχηματίζουν ένα ενιαίο σφαιροειδές επειδή δεν μπορούν να προσκολλώνται στις επιφάνειες καλά (Σχήμα 1Α). 2D μονοστοιβάδες αναπτύχθηκαν σε επίπεδο πυθμένα πλάκες των 96 φρεατίων τυπικό ιστοκαλλιέργειας φάρμακο (Σχήμα 1Β). Σημαντικά, τα επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου του μαστού (ΒΤ-474) και μη-μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (MCF-10Α) αντιμετωπίστηκαν και που με τον ίδιο τρόπο και στις δύο διαφορετικές μορφές πολλαπλών φρεατίων, ελαχιστοποιώντας άλλες μεταβλητές που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ισχύ του φαρμάκου. Τα κύτταρα απλώνονται, σε επεξεργασία 48 ώρες αργότερα, με τελική συγκέντρωση 5 μΜ της ένωσης (από εγκεκριμένες ογκολογία Drug βιβλιοθήκη Συλλογή του NCI), και προσδιορίστηκαν για περιεχόμενο ΑΤΡ άλλες 48 ώρες αργότερα (Εικόνα 1 C). Το 48 h χρονικό σημείο μετά την επίστρωση επιλέχθηκε με βάση το χρόνο που απαιτείται για τα σφαιροειδή προς σχηματισμό και επιτυγχάνονται αναπαραγώγιμα συμπαγές (με βάση σφαιροειδείς διάμετρο) σε κάθε φρεάτιο. Το 48 σημείο μίας ώρας μετά την αγωγή του φαρμάκου προσδιορίστηκε ως το βέλτιστο χρόνο για να παρατηρούν κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από φάρμακα, όπως αλλαγές μέσου προσθέτουν επιπλέον δαπάνη για προσδιορισμούς ΗΤ και πλέον επωάσεις είχαν ως αποτέλεσμα μη επεξεργασμένα κύτταρα που εμφανίζουν κυτταρικό θάνατο λόγω της εξάντλησης του μέσου θρεπτικών ουσιών και συσσώρευση αποβλήτων προϊόντων.

Α, ένα σφαιροειδές ανά φρεάτιο σχηματίστηκε σε 96 φρεατίων στρογγυλού πυθμένα εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως. Οι μικρογραφίες φωτεινού τυπικών σφαιροειδή BT-474 και MCF-10Α φαίνεται 48 ώρες μετά την επίστρωση,

μπαρ,

200 μικρά. Β, οι καλλιέργειες μονοστιβάδας 2D ορίστηκαν χρησιμοποιώντας τον ίδιο αριθμό κυττάρων όπως στα τρυβλία με στρογγυλό πυθμένα (3000 κύτταρα /φρεάτιο για BT-474 ή 1000 κύτταρα /φρεάτιο για ΜΟΡ-10Α) σε επίπεδου πυθμένα, Tissue Culture επικαλυμμένα τρυβλία 96 φρεατίων . Οι εικόνες φθορισμού δείχνονται τυπικές μονοστοιβάδες 48 ώρες μετά την επίστρωση, βάφτηκαν για ακτίνη (κόκκινο) και DNA (μπλε) ΒΤ-474 και MCF-10Α,

bar

, 200 μικρά. C, σχηματικό της σχεδίασης της οθόνης.

Η

Τα πρώτα αποτελέσματα από αυτή την οθόνη proof-of-concept αναλύθηκαν με τη σύγκριση των ενώσεων που παρήγαγαν ένα θετικό «χτύπημα» (που ορίζεται ως μείωση του περιεχομένου ΑΤΡ κατά 50% ή περισσότερο σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν φορέα) στα κύτταρα του όγκου ΒΤ-474 σε σύγκριση με τα κύτταρα ΜΟΡ-10Α. Όπως θα ήταν αναμενόμενο για ενώσεις των γνωστών κυτταροτοξικότητες, το ποσοστό επιτυχίας ήταν υψηλό και για τις δύο κυτταρικές σειρές, με 29% και 25% των ενώσεων που βρίσκονται να είναι χτυπήματα σε κύτταρα ΒΤ-474 και MCF-10Α, αντίστοιχα, σε 2D, 3D ή και τα δύο συνθήκες καλλιέργειας. Συγκρίνοντας τις ενώσεις που ταυτοποιούνται ως χτυπά στις δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές σε τουλάχιστον σε μία από τις συνθήκες καλλιέργειας, υπήρχαν λίγες ενώσεις που φάνηκε να είναι επιλεκτική για τα κύτταρα ΒΤ-474 πάνω από τα κύτταρα ΜΟΡ-10Α (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, καθώς οι συνθήκες καλλιέργειας 3D αναμένεται να αντικατοπτρίζει με μεγαλύτερη ακρίβεια την αρχιτεκτονική του όγκου, εστιάσαμε στην εκείνες τις ενώσεις που είχαν επιτυχίες υπό αμφότερες τις συνθήκες καλλιέργειας 2D και 3D σε κύτταρα όγκου, αλλά μόνο κάτω από συνθήκες καλλιέργειας 2D σε φυσιολογικά κύτταρα, υποδηλώνοντας προτιμησιακή αποτελέσματα επί κυττάρων όγκου σε 3D πολιτισμούς. Αυτές οι επιτυχίες που περιλαμβάνονται μοριακά στοχευμένες ενώσεων έναντι υποδοχέων EGF, όπως gefitinib και λαπατινίμπη, και το dasatinib αναστολέας της κινάσης ευρέος φάσματος.

δόσης πειράματα απάντηση ήταν τότε εκτελείται για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα της πρωτογενούς οθόνης και να προσδιορίσουν τιμές EC50 , η συγκέντρωση στην οποία η ένωση μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων κατά 50%, για τις επιλεγμένες ενώσεις σε κάθε τύπο κυττάρου καλλιεργήθηκαν σε 2D και 3D (Πίνακας 1, Σχήμα 2). Στα κύτταρα ΜΟΡ-10Α, τα αποτελέσματα από την πρωτεύουσα διαλογή επιβεβαιώθηκαν για λαπατινίμπη, gefitinib, και dasatinib (Πίνακας 1, Σχήμα 1Α)? υπό 3D συνθήκες, τα κύτταρα ΜΟΡ-10Α ήταν σχετικά αναίσθητη σε αυτές τις ενώσεις (EC50 & gt? 5 μΜ). Τα κύτταρα MCF-10A που καλλιεργούνται ως 2D μονοστοιβάδες με τη σειρά τους εμφάνισαν τιμές EC50 & lt? 5 μΜ μετά από θεραπεία με λαπατινίμπη ή dasatinib. Όπως και στην πρωτεύουσα διαλογή, τα κύτταρα ΒΤ-474 επέδειξε ευαισθησία (EC50 & lt? 10 μΜ) κάτω από τις δύο συνθήκες καλλιέργειας για αυτές τις ενώσεις (Πίνακας 1, Σχήμα 2Α), και ως εκ τούτου μια επιλεκτικότητα για τα κύτταρα ΒΤ-474 πάνω από τα κύτταρα MCF-10Α παρατηρήθηκε υπό συνθήκες καλλιέργειας 3D, με την τιμή EC50 για λαπατινίμπη & lt? 1 μΜ σε ΒΤ-474 κύτταρα και 9,8 μΜ σε κύτταρα ΜΟΡ-10Α (Πίνακας 1). Οι υπολογισθείσες τιμές EC50 για gefitinib και dasatinib ήταν ελαφρώς πάνω από 5 μΜ (6-8 μΜ), η οποία μπορεί να οφείλεται στη διαφορετική πηγή ενώσεων που χρησιμοποιούνται για τις δοκιμασίες απόκρισης επιβεβαιωτικές δόση συγκριτικά με την πρωτεύουσα διαλογή (βιβλιοθήκη ADC του NCI έναντι LC Labs? μορφή βιβλιοθήκης NCI επιτρέπει ένωση χρήση μόνο πρωτογενή διαλογή).

Α, καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης δημιουργήθηκαν από την BT-474 ή MCF-10Α κύτταρα που και αντιμετωπίζονται εις τριπλούν με λαπατινίμπη, gefitinib, ή dasatinib όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι, και επί τοις εκατό βιωσιμότητα υπολογίστηκε από αναγνώσεις φωταύγειας που αντιπροσωπεύουν το περιεχόμενο ΑΤΡ και ομαλοποιήθηκε ως προς κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα. Β, καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης δημιουργήθηκαν από κύτταρα που και επεξεργασία εις τριπλούν με βινβλαστίνη ή βινορελμπίνη ΒΤ-474 ή ΜΟΡ-10Α. Όλες οι καμπύλες είναι αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τουλάχιστον δύο πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

μικροσωληνίσκων στόχευση βινβλαστίνη και βινορελβίνη πράκτορες »είχε επίσης βαθμολογήθηκε ως θετικό» χτυπήματα «σε πρωτοβάθμια οθόνη μας, αποδεικνύοντας μικρή εκλεκτικότητα για τα κύτταρα ΒΤ-474 πάνω από τα κύτταρα ΜΟΡ-10Α υπό συνθήκες καλλιέργειας 3D. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με βινβλαστίνη και βινορελβίνη εις την πρωτεύουσα διαλογή δεν επιβεβαιώθηκαν άμεσα σε μελέτες δόσης-απόκρισης, ωστόσο (Πίνακας 1, Σχήμα 2Β). Ενώ βινμπλαστίνη έδειξε μεγαλύτερη επιλεκτικότητα για τα κύτταρα ΒΤ-474, ειδικά όταν αναπτύχθηκαν ως 3D καλλιέργειες, οι τιμές EC50 που παρατηρήσαμε ήταν όλοι & gt? 5 μΜ (Πίνακας 1, Σχήμα 2Β, αριστερό πάνελ). Στα πειράματα συγκέντρωσης-απόκρισης, βινορελβίνη ήταν πράγματι ένα χτύπημα στα κύτταρα ΒΤ-474, αλλά όχι στα κύτταρα ΜΟΡ-10Α καλλιεργήθηκαν σε 3D (Πίνακας 1, Σχήμα 2Β, δεξιό πλαίσιο). Ωστόσο, κάτω από συνθήκες καλλιέργειας 2D, παρατηρήσαμε τιμές EC50 & lt? 5 μΜ και για τις δύο κυτταρικές σειρές, ακόμη και αν δεν είχαμε εντοπίσει βινορελβίνη ως ένα «χτύπημα» για τα κύτταρα MCF-10A στην κύρια οθόνη. Για να εξακριβωθεί αν τυχόν ανωμαλίες οφείλονται σε θέματα διαπερατοποίηση έχουμε επίσης επιβεβαίωσε ότι οι μικρές φθορίζοντα μόρια χρωστικής, παρόμοιου μεγέθους με πολλά φάρμακα, μπορεί πράγματι να διεισδύσει στο σφαιροειδή πυρήνα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Στο σύνολό τους, μας μελέτες αποδεικνύουν ότι είναι δυνατόν να προσδιοριστούν με όγκο εκλεκτικές ενώσεις εφαρμόζοντας μια στρατηγική που χρησιμοποιεί πληροφορίες από 2D και κυτταροτοξικότητα οθόνες 3D. Λόγω του γεγονότος ότι η μελέτη μας απόδειξη της έννοιας περιλαμβάνει μια βιβλιοθήκη που αποτελείται από γνωστές βιοδραστικών ενώσεων, οι παρατηρούμενες διαφορές στην ευαισθησία μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων μπορεί να μην είναι αρκετά μεγάλη ώστε να εξασφαλίσει ότι θα ήταν χρήσιμη σε ένα περιβάλλον HTS. Μια αμερόληπτη οθόνη με μια μεγαλύτερη βιβλιοθήκη μικρού μορίου είναι πιθανό να αποφέρει διαφορετικά και δυνητικά πιο κατατοπιστική αποτελέσματα. Επίσης, και όπως αποδεικνύεται από μελέτες παρακολούθησης μας, ένα παραδοσιακό HTS η οποία ελέγχει τις ενώσεις σε μία μόνη συγκέντρωση μπορεί να επιβαρυνθεί με ψευδώς θετικών και ψευδώς αρνητικών και απαιτεί εκτεταμένη παρακολούθηση δοκιμών. Ένα νέο πρότυπο, ποσοτική HTS (qHTS), δημιουργεί καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης για τις ενώσεις δοκιμής σε ένα μόνο πείραμα και κατά πάσα πιθανότητα θα ανακουφίσει αυτά τα θέματα και θα μπορούσε να είναι μια μέθοδος επιλογής για την ταχεία διαλογή νέων ενώσεων κατά του καρκίνου [19].

μοντέλα συν-καλλιέργεια των κανονικών εναντίον καρκινικών κυττάρων εμφανίζουν διαφορετικές ευαισθησίες των ναρκωτικών σε 3D εναντίον 2D

για να βελτιωθεί περαιτέρω με μεθόδους διαλογής μας, επιδιώξαμε να καθοριστεί εάν τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως 3D συνεργασία πολιτισμοί με υποστηρικτικά κύτταρα όπως οι ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα θα μπορούσε να αποδειχθεί πιο χρήσιμο στον προσδιορισμό στοχοθετημένων (και, γενικά, λιγότερο τοξικές) ενώσεις. Υποθέσαμε ότι συν-καλλιέργεια των κυττάρων όγκου με ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα θα μπορούσε να επηρεάσει το μικροπεριβάλλον της καλλιέργειας 3D και έτσι να επηρεάσουν τα ναρκωτικά ευαισθησία. Το μικροπεριβάλλον του όγκου, συμπεριλαμβανομένων παραγόντων στρωματικά όπως ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα, παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου και τον σχηματισμό μετάστασης [20]. Σε φυσιολογικό ιστό, τα επιθηλιακά κύτταρα διαχωρίζονται από το στρώμα με αλληλεπίδραση με τη βασική μεμβράνη. Στις συν-καλλιέργειες που περιγράφονται εδώ, ΒΤ-474 κύτταρα αλληλεπιδρούν άμεσα με ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα, όπως μπορεί να παρατηρηθεί σε προχωρημένους καρκίνους του μαστού, όπως διηθητικού καρκινώματος πόρου [6], και αυτά τα συστήματα καλλιέργειας μπορεί επομένως καλύτερα μιμούνται την μικροπεριβάλλον του όγκου των προηγμένων καρκίνων . Πολλοί ερευνητές χρησιμοποιούν την λαμινίνη πλούσια βασική μεμβράνη που εξάγεται από Engelbreth-Holm-Swarm σάρκωμα ποντικού (Matrigel) για την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων σε 3D [3], [5], ή σε μοντέλα ξενομοσχεύματος, αλλά η δαπάνη αυτού του αντιδραστηρίου θα ήταν απαγορευτικό για μια HT-οθόνη και θα μπορούσαν δυνητικά να επηρεάσει με ορισμένες ενδείξεις δοκιμασία. Έτσι, το μοντέλο μας που χρησιμοποιεί ανθρώπινες ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα για την υποστήριξη της ανάπτυξης των επιθηλιακών κυττάρων του όγκου σε 3D αναπτύχθηκε ως ένα οικονομικά αποδοτική και πρακτική εναλλακτική λύση.

Χρησιμοποιήσαμε σύστημα μοντέλο μας για σύγκριση συν-καλλιέργειες που περιέχουν καρκινικά κυττάρων σε συγκαλλιέργειες στερείται καρκινικών κυττάρων. Η κυτταρική γραμμή ΒΤ-474 συν-καλλιεργήθηκαν σε 2D ή 3D (Σχήμα 3Α, επάνω αριστερά και δεξιά, αντίστοιχα) με φυσιολογικό ανθρώπινο ινοβλάστες και φυσιολογικά ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (ΒΤ-474 + HF + HE). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι κατά τη διάρκεια της συν-καλλιέργεια σε 3D, οι τύποι κυττάρων επανειλημμένα αυτο-συναρμολογούνται σε μια δομή όπου τα καρκινικά κύτταρα ΒΤ-474 που περιβάλλεται έναν πυρήνα των ινοβλαστών και των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτά καρκινικών κυττάρων που περιέχουν συν-καλλιέργειες συγκρίθηκαν με 2D ή 3D (Σχήμα 3Α, κάτω αριστερά και δεξιά, αντίστοιχα) συν-καλλιέργειες που περιέχουν μόνο τις κανονικές ανθρώπινες ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα (HF + HE). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα CD31-θετικά εμφανίστηκε ως σκάφος-όπως σχηματισμούς στις καλλιέργειες HF + HE παρόμοιο με αυτό που έχει αναφερθεί στο παρελθόν σε 3D συγκαλλιέργεια με ινοβλάστες δέρματος και HUVECs [21].

Α, ανοσοφθορισμού εικόνες σταθερό και χρωματίζονται 2D (αριστερά πάνελ) και σταθερές, τεμαχίστηκαν, και χρωματίστηκαν 3D (δεξιά πάνελ) συν-καλλιέργειες χρωματίστηκαν για το CD31 δείκτη ενδοθηλιακών κυττάρων (πράσινο), το ινοβλαστών πλούσια σε πρωτεΐνη βιμεντίνη (κόκκινο), και όλοι οι πυρήνες των κυττάρων (μπλε),

μπαρ,

200 μικρά. Οι πιο πάνω πίνακες είναι το BT-474 + HF + HE συν-καλλιέργειες, εμβολιάστηκε με 1500 BT-474 + 750 + 750 ινοβλάστες ενδοθηλιακά κύτταρα ανά φρεάτιο. Τα κάτω πάνελ είναι το HF + HE συν-καλλιέργειες, σπείρεται με 750 ινοβλάστες + 750 ενδοθηλιακά κύτταρα. Β, σχηματική του πρωτοκόλλου διαλογής τέσσερις-συγκέντρωση στην BT-474 + HF + HE και τα κύτταρα HF + HE καλλιεργήθηκαν σε 3D ή 2D. C, οι τιμές Ζ ‘που παράγεται από μία ή δύο πλάκες 96-φρεατίων που, επωάστηκαν, και ο χειρισμός όπως περιγράφεται για την οθόνη για το 2D ΒΤ-474 + HF + ΗΕ κύτταρα (άνω αριστερό πλαίσιο), κύτταρα 2D HF + HE (επάνω δεξιά πίνακα), 3D BT-474 + HF + HE κύτταρα (κάτω αριστερά πάνελ), κύτταρα 3D HF + HE (κάτω δεξιά πλευρά).

η

η οθόνη του το BT-474 + HF + HE και HF + HE καλλιέργειες εκτελέστηκε επί τέσσερις διαφορετικές συγκεντρώσεις της βιβλιοθήκης ADC του NCI, με αποτέλεσμα τελική σε φρεατίων συγκεντρώσεις 100, 10, 1 και 0,1 μΜ (Σχήμα 3Β). Λόγω του μεγάλου αριθμού των πλακών 96-φρεατίων που απαιτείται για τη διαλογή σε τέσσερις διαφορετικές συγκεντρώσεις, μεγαλύτερη αυτοματοποίηση χρησιμοποιήθηκε σε σχέση με την προηγούμενη οθόνη του μονοτυπικό ΒΤ-474 και κυτταρικές καλλιέργειες MCF-10Α. Για να εξασφαλιστεί ότι η δοκιμασία ήταν αρκετά ισχυρή για ημι-αυτοματοποιημένη διαλογή, οι τιμές Ζ ‘υπολογίστηκαν και για τα δύο συνθήκες συν-καλλιέργεια σε 2D και σε 3D για να ποσοτικοποιηθεί η στατιστική αναπαραγωγιμότητα της δοκιμασίας με βάση τα μέσα της μέγιστης και ελάχιστης σήματα που λαμβάνονται σε κάθε πηγάδι σε πολλαπλές πλάκες. Αυτό το πρότυπο υπολογισμός εκτελείται για να εξασφαλιστεί ότι κάθε φρεάτιο εκλύει ένα παρόμοιο εξόδου (χημιφωταύγεια υποδεικνύοντας περιεχόμενο ΑΤΡ και έτσι η βιωσιμότητα για αυτήν την οθόνη) έτσι ώστε όταν προστίθενται ενώσεις, μία μείωση στην χημειοφωταύγειας είναι πιθανό να είναι αποτέλεσμα της επίδρασης των ενώσεων επί βιωσιμότητα των κυττάρων και όχι μόνο διαφορές μεταξύ των επιμέρους πηγάδια. Παρατηρήσαμε τιμές Z ‘μεγαλύτερο από 0,7 σε όλες τις συνθήκες συν-καλλιέργειας (Σχήμα 3C), καταδεικνύοντας έτσι μια εξαιρετική απόδοση για διαλογή υψηλής απόδοσης.

Τα αποτελέσματα από την οθόνη συν-καλλιέργειας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο κλιμακωτή προσέγγιση. Πρώτον, επιτυχίες ορίζονται ως ενώσεις δίδοντας & lt? 50% βιωσιμότητα σε οποιαδήποτε από τις τέσσερις συγκεντρώσεις δοκιμάστηκαν, σε οποιαδήποτε από τις συνθήκες καλλιέργειας. Με ένα τέτοιο χαμηλό επίπεδο αυστηρότητας, 57 από τις ενώσεις 89 βρέθηκαν ως «χτυπήματα» εις την πρωτεύουσα διαλογή (τα δεδομένα δεν φαίνονται)? πάλι μια κατανοητή αποτέλεσμα με βάση τη φύση της βιβλιοθήκης. Δεύτερον, οι καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης δημιουργήθηκαν για κάθε ένωση σε κάθε κατάσταση καλλιέργεια, και οι τιμές EC50 αποδόθηκαν όπου εφαρμόζεται. Εμείς εξορύσσεται τα δεδομένα EC50 για τον εντοπισμό ενώσεων οι οποίες έδειξαν μεγαλύτερη τοξικότητα προς τα συν-καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων (ΒΤ-474 + HF + HE) από ό, τι τα κανονικά συν-καλλιέργειες κυττάρων (HF + HE) όταν καλλιεργούνται σε 3D, με το σκεπτικό ότι μας Ο μακροπρόθεσμος στόχος είναι να χρησιμοποιήσετε αυτές τις καλλιέργειες για την ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών αντι-όγκου με επιλεκτική τοξικότητα έναντι των ιστών του όγκου, ενώ διαφυλάσσει τον φυσιολογικό ιστό. Δώδεκα ενώσεις εμφάνισαν μεγαλύτερη εκλεκτικότητα για την 3D ΒΤ-474 + HF + ΗΕ κύτταρα από τα κύτταρα 3D HF + HE (Πίνακας 2), συμπεριλαμβανομένων, για άλλη μια φορά, μια σειρά ενώσεων που στοχεύουν κινάσες τυροσίνης υποδοχέα ή μικροσωληνίσκων.

Ακολουθήσαμε την οθόνη πρωτεύον συν-καλλιέργεια με μία δοκιμασία δευτερεύουσα συγκέντρωσης-απόκρισης για την επιβεβαίωση των δώδεκα χτυπήματα που παρατίθενται στον πίνακα 2. Οι ενώσεις κεράσι-διάλεξε από τις κύριες πλάκες βιβλιοθήκη που παρασκευάζεται για την οθόνη, και χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση πειράματα συγκέντρωσης-απόκρισης για την ίδια χρονική πορεία (48 ώρες θεραπείας). [25].