Αφηρημένο

αντιαποπτωτικού Bcl-2 οικογενειακό μέλος Mcl-1 είναι ένα PEST πρωτεΐνη (που περιέχουν αλληλουχίες εμπλουτισμένο σε προλίνη, γλουταμινικό οξύ, σερίνη, και θρεονίνη) και υπόκειται σε ταχεία αποδόμηση μέσω πολλαπλών οδών. Διαταραγμένη αποδόμηση οδηγεί στη διατήρηση του Mcl-1 έκφρασης είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της ανθεκτικότητας στα φάρμακα στον καρκίνο. Η φωσφορυλίωση στο Thr 163 στην περιοχή PEST, διεγείρεται από 12-Ο-δεκατετρανοϋλοφορβόλης οξικό οξύ (ΤΡΑ) επαγόμενη ενεργοποίηση εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη (ERK), συνδέεται με Mcl-1 σταθεροποίηση σε κύτταρα λεμφώματος Burkitt BL41-3. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την παρατήρηση ότι η Thr 163 φωσφορυλίωση σε φυσιολογικούς ινοβλάστες πριμοδοτεί την κινάση συνθάση γλυκογόνου (GSK3) επαγόμενη φωσφορυλίωση σε Ser 159, παράγοντας ένα phosphodegron που στοχεύει Mcl-1 για την αποικοδόμηση. Στις παρούσες μελέτες παρακολούθησης σε BL41-3 κύτταρα, Mcl-1 αποικοδόμηση βρέθηκε να είναι ανεξάρτητη από τη GSK3 μεσολάβηση οδό, παρέχοντας ένα παράλληλο προς τις αναδυόμενες ευρήματα δείχνουν ότι Mcl-1 αποικοδόμηση μέσω αυτής της οδού έχει χαθεί σε πολλούς διαφορετικούς τύπους του καρκίνου. Διαπιστώσεις Mcl-1-επιμολυσμένα κύτταρα CHO ενισχύεται εκείνα σε κύτταρα BL41-3 κατά το ότι η GSK3 στόχευση phosphodegron δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στην Mcl-1 αποικοδόμηση, και ένα phosphomimetic μετάλλαξη T163E οδήγησε σε σήμανση Mcl-1 σταθεροποίησης. Κατεργασμένα με ΤΡΑ BL41-3 κύτταρα, εκτός από εμφανίζουν Thr 163 φωσφορυλίωση και Mcl-1 σταθεροποίηση, επέδειξε μια ~ 10-φορές αύξηση στην αντίσταση σε πολλαπλούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένου του Ara-C, ετοποσίδη, βινμπλαστίνη, ή σισπλατίνη. Σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα στα οποία Mcl-1 αποικοδόμηση δεν εξαρτάται από το /phosphodegron στόχευση μονοπάτι, η ενεργοποίηση ERK GSK3 και Thr 163 φωσφορυλίωση συνδέονται με έντονη Mcl-1 σταθεροποίησης και της αντίστασης στα φάρμακα – επιδράσεις που μπορεί να κατασταλεί με αναστολή της ενεργοποίησης ERK .

Παράθεση: Nifoussi SK, Βρανά JA, Domina AM, De Biasio Α, Gui J, Gregory MA, et al. (2012) Thr 163 φωσφορυλίωση Προκαλεί Mcl-1 Σταθεροποίηση όταν Υποβάθμιση είναι ανεξάρτητη από την παρακείμενη GSK3-Στοχευμένες Phosphodegron, Προώθηση της αντίστασης στα φάρμακα για τον καρκίνο. PLoS ONE 7 (10): e47060. doi: 10.1371 /journal.pone.0047060

Συντάκτης: Justin L. Mott, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Ιουν 2012? Δεκτές: 7 Σεπτεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 9 Οκτωβρίου, 2012

Copyright: © Nifoussi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (R01 CA 057.359 σε RWC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

η αυξημένη έκφραση του Mcl-1, διεγείρονται από παράγοντες ανάπτυξης και άλλα περιβαλλοντικά σήματα, προωθεί τη βιωσιμότητα και επιτρέπει την ενίσχυση και τη λειτουργία των κυτταρικών τύπων και καταγωγές που απαιτούνται από τον οργανισμό [1] – [4]. Mcl-1 ρύθμιση προς τα κάτω, με τη σειρά του, κράσπεδα αυτές τις διεργασίες και επάγει το θάνατο σε βλάβη, μη λειτουργική ή γηρασμένα κύτταρα [1], [5] – [7]. Συντήρηση αυξημένη έκφραση Mcl-1 σχετίζεται με αντίσταση στο φάρμακο και φτωχή πρόγνωση σε ποικιλία καρκίνων [8] – [15]. Παράγοντες που επάγουν τον κύκλο εργασιών Mcl-1 και αναστολείς σχεδιασμένα να στοχεύουν την πρωτεΐνη, μπορεί να προωθήσει καρκινικών κυττάρων θάνατο [16] – [20].

Mcl-1 ταυτοποιήθηκε με βάση την αυξημένη μεταγραφή στην ML-1 ανθρώπινου μυελοβλαστική κύτταρα λευχαιμίας επάγονται να διαφοροποιηθούν κατά την έκθεση σε ΤΡΑ [21], [22]. Mcl-1 ρυθμίζεται επίσης μετα-μεταφραστικά (Εικ. 1Α), όπως παρατηρήθηκε στην κυτταρική σειρά λεμφώματος Burkitt BL41-3 στην οποία η ενδογενής Mcl-1 ενισχύεται και υπερεκφράζεται [1], [23], [24]. Mcl-1 είναι μια πρωτεΐνη των παρασίτων και είναι συνήθως υπόκειται σε ταχεία κύκλου εργασιών. Ωστόσο, η έκθεση των κυττάρων σε ΤΡΑ BL41-3 οδηγεί σε ενεργοποίηση του ERK κινάση που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνης (ΜΑΡ), μαζί με ένα ΕΚΚ-εξαρτώμενη αύξηση σε Mcl-1 φωσφορυλίωση σε Thr 163 και αξιοσημείωτα επιβραδύνθηκε αποικοδόμηση της πρωτεΐνης Mcl-1 [25], [26].

Οι θέσεις φωσφορυλίωσης Thr 163 και Ser 159 στην ανθρώπινη πρωτεΐνη Mcl-1 διαγραμματικά. Thr 163 υπόκειται σε φωσφορυλίωση από κινάσες ΜΑΡ, όπως φαίνεται κατά την επαγόμενη με ΤΡΑ ενεργοποίηση ERK σε BL41-3 κύτταρα. Ser 159 υπόκειται σε φωσφορυλίωση από τη GSK3. Mcl-1 είναι μια πρωτεΐνη PEST υπόκειται σε ταχεία κύκλος εργασιών, ο χρόνος ημιζωής της αποσύνθεσης είναι περίπου 3 ώρες σε BL41-3 κύτταρα (στίξη της μικρότερης σε σχέση με μεγαλύτερη πυκνότητα δείχνει κακή PEST και των δυνητικών ακολουθιών PEST? PESTFIND). Ωστόσο, Mcl-1 εμφανίζει εντυπωσιακή σταθεροποίηση κατόπιν ΤΡΑ-προκαλούμενη ενεργοποίηση ERK και Thr 163 φωσφορυλίωση σε αυτά τα κύτταρα. Mcl-1 υπόκειται επίσης σε μία άλλη μετα-μεταφραστική τροποποίηση που περιλαμβάνει κολόβωση της ακραίας Ν-άκρο ([28] σημειώνονται με βέλος). Αυτό οδηγεί σε μια μικρή απόσταση μεταξύ τους διπλή 42/40 κϋ, όπου η κάτω ζώνη 40 kd δεν έχει τα υπόλοιπα αμινοξέων -16 και είναι το πλέον άφθονο μπάντα παρούσα σε BL41-3 κύτταρα. Η διπλή αναπαριστάται καλύτερα σε μεγάλες τζελ ηλεκτροφόρησης μορφή (Εικ. S1B), αλλά μερικές φορές μπορεί να ανιχνευθεί σε πρότυπο τζελ (Εικ. 1Γ). Όπως Thr 163 φωσφορυλίωση δεν εμποδίζει Ν-τερματική κολόβωση, Mcl-1 σταθεροποίησης στην παρουσία αυτού του φωσφορυλίωσης θεωρείται επιβραδύνεται αποσύνθεση της ζώνης 40 kd. Β: BL41-3 κύτταρα είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή εκτεθεί σε ΤΡΑ (5 ηΜ) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και παρακολουθούνται για έκφραση της Thr 163 φωσφορυλιώθηκαν Mcl-1 (Mcl-1 ρΤ163), συνολικός Mcl-1, φωσφορυλιωμένα ERK (pERK ), και GAPDH (ChemiDoc). Όλα τα δείγματα τρέχουν ταυτόχρονα και υποβλήθηκε στην ίδια αυτοραδιογραφικής έκθεσης, όπου η μαύρη κάθετη γραμμή σε αυτό και τα επόμενα στοιχεία δείχνουν ότι οι λωρίδες έχουν αναδιατάχθηκαν να διευκολύνεται η σύγκριση. Thr 163 φωσφορυλίωση επίσης επάγεται από χαμηλότερες συγκεντρώσεις του ΤΡΑ (π.χ., 1 ηΜ? Εικ. S1c), και αναστάλθηκε από U0126 (Εικ S1D.). m C: BL41-3 κύτταρα είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή εκτεθεί σε ΤΡΑ (1 ηΜ). Μερικά κύτταρα αμέσως εκτέθηκαν σε CHX να παρακολουθεί Mcl-1 αποσύνθεση πρωτεΐνης την ημέρα 0. Οι επιπλέον κύτταρα κατεργασμένα με ΤΡΑ επωάστηκαν για 24 ώρες (Ημέρα 1 μετά ΤΡΑ προσθήκη) και μετά εκτέθηκαν σε CHX, όπου ένα τμήμα αυτών των κυττάρων υποχώρησε με ΤΡΑ αυτή τη στιγμή. Το μη επεξεργασμένο δείγμα κυττάρων (χρόνος 0) είναι πανομοιότυπη για κάθε ζεύγος των Western blots. Η κηλίδα στο κάτω μέρος επιβεβαίωσε ότι pERK μειώθηκε στις 24 ώρες

Η

Mcl-1 είναι επίσης υπόκειται σε φωσφορυλίωση από τη GSK3 [20], [27] – [34].. Στην πραγματικότητα, ΜΑΡ κινάσης που προκαλείται φωσφορυλίωση σε Thr 163 παρέχει μία θέση έναρξης για φωσφορυλίωση GSK3 επαγόμενη σε Ser 159, όπως έχει αποδειχθεί σε φυσιολογικούς ινοβλάστες ποντικού που εκτίθενται σε υπεριώδη (UV) ακτινοβολία [27]. Σε αυτό το σύστημα, η φωσφορυλίωση στη θέση φωσφορυλίωσης κινάσης ΜΑΡ (Thr 163) διεξάγεται με c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK)? επακόλουθη φωσφορυλίωση στη θέση φωσφορυλίωσης GSK3 (Ser 159) έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή ενός phosphodegron που στοχεύει Mcl-1 για αποικοδόμηση από λιγάσες ουβικιτίνης Ε3 περιέχουν πρωτεΐνες F-box [28], [32] – [34]. Mcl-1 μπορεί επίσης να αποικοδομούνται από μια ποικιλία άλλων οδών, όπως μέσω του BH3 περιέχει Ε3 ουβικιτίνης λιγάση MULE (ονομάζεται επίσης ΑΠΦ-BP /Lasu1 /Huwe1 [35], [36]), ο ανάφαση προώθηση συγκρότημα [37 ], και οι μηχανισμοί ουβικιτίνης ανεξάρτητων [38].

Οι αναδυόμενες ευρήματα δείχνουν ότι η μείωση των Mcl-1 αποικοδόμηση μέσω της ανωτέρω GSK3 προκαλούμενη οδό συνεισφέρει στην αντοχή φαρμάκου στον καρκίνο. Για παράδειγμα, GSK3 αδρανοποίηση στον καρκίνο του μαστού δείγματα ασθενών συνδέεται με άφθονη Mcl-1 έκφραση και την κακή έκβαση [20], [32]. Ομοίως, η μειωμένη Mcl-1 αποικοδόμηση μέσω της /μονοπατιού phosphodegron στόχευσης GSK3 έχει ενοχοποιηθεί σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [13], [39], [40]. Μια ποικιλία καρκίνων ανθεκτικών στα φάρμακα εμφανίζουν αδρανοποίηση της πρωτεΐνης F-box FBW7, το οποίο βρίσκεται κατάντη γεγονότων φωσφορυλίωσης, όπως αυτές που προκαλούνται από τη GSK3 [33], [34]. Σε άλλες περιπτώσεις, τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη έκφραση ενός deubiquitinase [41].

Λόγω της σημασίας του Mcl-1 σε καρκίνο, μελετήσαμε περαιτέρω την σταθεροποίηση Mcl-1 που λαμβάνει χώρα κατά την επαγόμενη με ΤΡΑ ενεργοποίηση ΕΚΚ BL41-3 κύτταρα. Σκοπός μας ήταν να κατανοήσουμε καλύτερα το εύρημα ότι Thr 163 φωσφορυλίωση σχετίζεται με Mcl-1 σταθεροποίησης σε αυτές και άλλα καρκινικά κύτταρα [42], αλλά πριμοδοτεί Mcl-1 για GSK3 /phosphodegron στοχευμένη αποικοδόμηση σε φυσιολογικούς ινοβλάστες [27]. Παρά το γεγονός ότι η φωσφορυλίωση σε επιπλέον θέσεις θα μπορούσε να εμπλέκεται (π.χ., Thr 92 [20]), αυτή η δεν φαίνεται να είναι η περίπτωση σε BL41-3 κύτταρα [25]. Τα αποτελέσματα των μελετών μας έδειξαν ότι η GSK3 μεσολάβηση οδού δεν παίζει σημαντικό ρόλο στην Mcl-1 αποικοδόμηση σε BL41-3 κύτταρα. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με ό, τι παρατηρείται σε φυσιολογικούς ινοβλάστες, αλλά παραλληλίζει τις αναδυόμενες ευρήματα δείχνουν ότι Mcl-1 αποικοδόμηση μέσω αυτής της οδού είναι συχνά μειωμένη σε καρκίνο. Η ένωση της Thr 163 φωσφορυλίωσης με Mcl-1 σταθεροποίησης σε αυτή την κατάσταση ανακεφαλαιωθούν στο επιμολυσμένα κύτταρα CHO, όπου Mcl-1 υποβάθμιση δεν επηρεάστηκε από μη φωσφορυλιώσιμη μετάλλαξη T163A, αλλά ήταν σχεδόν πλήρως αποκλεισμένη από phosphomimetic μετάλλαξη T163E. Μαζί με την ενεργοποίηση ERK, Thr 163 φωσφορυλίωση, και Mcl-1 σταθεροποίηση, κατεργασμένα με ΤΡΑ κύτταρα BL41-3 επέδειξαν σημαντικά αυξημένη αντοχή σε απόπτωση επαγωγή κατά την έκθεση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Ωστόσο, η ευαισθησία φαρμάκου μέρει αποκατασταθεί με έναν αναστολέα της ενεργοποίησης ERK. Σε αντίθεση με τα κανονικά κύτταρα όπου Thr 163 φωσφορυλίωση μπορεί να προωθήσει GSK3 /Ser 159 phosphodegron στοχευμένη Mcl-1 αποικοδόμηση και τον θάνατο, σε καρκινικά κύτταρα στα οποία Mcl-1 δεν αποικοδομείται μέσω αυτής της οδού, η ενεργοποίηση ERK και Thr 163 φωσφορυλίωση συνδέονται με μειωμένη Mcl-1 υποβάθμιση και εντυπωσιακή ανθεκτικότητα στα φάρμακα. Αναστολή της ενεργοποίησης ERK /Thr 163 φωσφορυλίωση αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την προώθηση Mcl-1 υποβάθμιση και την ευαισθησία των ναρκωτικών σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα.

Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και θεραπείες

BL41 -3 κύτταρα προέρχονται ως υποσειρά των κυττάρων του λεμφώματος Burkitt BL41 όπως περιγράφεται [23], και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 7.5% FBS. Τα παράγωγα 5Α-HSmyc CHO κυττάρου [43], [44] διατηρήθηκαν σε μέσο alphaMEM που περιέχει 5% FBS. Το AKR-2B γραμμή εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού ήταν από Μ J. Getz (Mayo Foundation, Rochester, ΜΝ) [45], και αναπτύχθηκε σε μέσο 5Α του McCoy που περιέχει 5% FBS. ΤΡΑ ήταν από την Alexis Biochemicals, LiCl, κυκλοεξιμίδιο, LY294002, ετοποσίδη, βινμπλαστίνη, cis-διαμινοδιχλωρολευκόχρυσος (II) (σισπλατίνη), βορτμαννίνη, και κυτοσίνη αραβινοσίδη (Ara-C) ήταν από την Sigma, U0126 ήταν από EMD Chemicals, και NaCl από την Fisher επιστημονικά.

Mcl-1 μορφώματα και διαμόλυνση

Mcl-1 κατασκευάσματα έκφρασης ήταν στο 3,1 φορέα pcDNA [25] περιέχει ένα νέο δείκτη αντοχής. Το WT-Mcl-1, Mcl-1-T163A, και Mcl-1-T162A έχουν κατασκευάσματα έχουν περιγραφεί, και Mcl-1-T163E και Mcl-1-S159A παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τις ίδιες μεθόδους [25], με τους ακόλουθους εκκινητές . Για MCL-1-T163E (ανώτερος εκκινητής) 5′- GGTCACTACCCTCGGAGCCGCCGCCAGCAG-3 ‘και (κατώτερο εκκινητή) 5′-CTGCTGGCGGCGGCTCCGAGGGTAGTGACC-3′, καθώς και για MCL-1-S159A (ανώτερος εκκινητής) 5’-CGGACGGGGCACTACCCTCGACGCCGCCGC-3 ‘και ( κατώτερο εκκινητή) 5’-GCGGCGGCGTCGAGGGTAGTGCCCCGTCCG-3 ‘. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με Effectene (Qiagen) ή Lipofectectamine 2000 (Invitrogen), χρησιμοποιώντας κύτταρα επιστρώθηκαν την προηγούμενη ημέρα.

Ανάλυση Western

κηλίδωση Western συνθήκες που ανιχνεύουν την ανθρώπινη πρωτεΐνη Mcl-1, έχουν έχουν περιγραφεί [25], [43], όπου παρατηρείται καμία διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με πρωτεΐνη του κινέζικου χάμστερ. τζελ τυπικό μέγεθος ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιήθηκαν εκτός των όσων αναφέρονται όπου χρησιμοποιούνται μεγάλες τζελ μορφή που διαχωρίζουν τη διπλή Mcl-1. Για την παρακολούθηση Mcl-1 αποσύνθεση σε κύτταρα CHO, τα κύτταρα απλώνονται εκ νέου σε φρέσκο ​​μέσο την ημέρα μετά την επιμόλυνση και εκτέθηκαν σε CHX (20-25 μικρογραμμάρια /ml) 24 ώρες αργότερα [30]. Για BL41-3 κύτταρα μια συγκέντρωση 2.5 μg /ml CHX χρησιμοποιήθηκε [25]. Ένα ChemiDoc σύστημα Μοριακής Απεικόνισης (BioRad) έγιναν διαθέσιμες και χρησιμοποιήθηκε για κάποια πειράματα, η οποία επέτρεψε για την εκτίμηση των αλλαγών στην Mcl-1 έκφρασης. Οι αλλαγές αυτές υπολογίστηκαν ως μια μείωση στην Mcl-1 έκφρασης σε σχέση με παράλληλη μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Ενώ ένα χρήσιμο αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι Mcl-1 phosphoThr 163 δεν είναι διαθέσιμο στο εμπόριο, μια μικρή ποσότητα του αντισώματος που περιγράφηκε προηγουμένως ήταν διαθέσιμος [46].

Pulse /εκδίωξης

35S-Met Labeling

Προηγουμένως περιγραφείσες μεθόδους [24] – [26]. Εν συντομία, μία ημέρα μετά την επίστρωση, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με και επωάζονται σε ελεύθερο μεθειονίνης μέσου RPMI που περιέχει 5% FBS σε διαπίδυση και 25 mM ρυθμιστικό HEPES. Τα κύτταρα επισημάνθηκαν παλμικά με μετά-

35S-Met για 2 ώρες, και στη συνέχεια εκδιώχθηκε με μέσον alphaMEM που περιέχει 5% FBS και ένα επιπλέον 15 mg /ml L-μεθειονίνη. Μετά τη συγκομιδή και την πλύση δύο φορές με PBS επί πάγου, το ίζημα σε λύση με πέρασμα διαμέσου μιας σύριγγας σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (142.5 mM KCl, 5 mM MgCl

2, 1 mM EGTA σε 20 mM Tris-Cl, ρΗ 7,4 ) που περιέχει 0.2% Nonidet Ρ-40 και Sigma πρωτεάσης και φωσφατάσης αναστολέα κοκτέιλ]. Το σφαιρίδιο επωάστηκε όλη την νύκτα εν ψυχρώ με antiMcl-1 αντίσωμα (Santa Cruz S-19) συζευγμένο με Dynabeads (Dynal, Norway), πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης, και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS. Η γέλη σταθεροποιήθηκε σε 10% οξικό οξύ:. 30% μεθανόλη, εμποτισμένο με NAAMP 100 Amplify (Amersham Biosciences, UK), ξηραίνεται, και εκτίθεται σε φιλμ ακτίνων-Χ και μια οθόνη PhosphorImager, με το τελευταίο να αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageQuant

κυτταρομετρίας ροής

η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός FITC-συζευγμένο antiMcl-1 αντισώματος με το Fix Caltag & amp?. kit Perm (10,000 κύτταρα αναλύθηκαν για κάθε δείγμα)

κυτταρικού θανάτου δοκιμασίες

κύτταρα αποπτωτικά όπως αρχικά οριστεί μορφολογικά βαθμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Giemsa Ράιτ βάφονται κυτταροπεριστροφής (Shandon) τα παρασκευάσματα διαφάνεια [17], [47], [48]. διάσπαση PARP αναλύθηκε με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας το σύνολο PARP αντίσωμα (ΟβΙΙ Signaling) και χημειοφωταύγειας σάρωση των μεμβρανών χρησιμοποιώντας το σύστημα ChemiDoc. εντάσεις Band ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Φίτζι (ΝΙΗ ImageJ).

Στατιστική Ανάλυση

Ο χρόνος ημίσειας ζωής της αποσύνθεσης των Mcl-1 πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται (αναλύθηκε με χρήση του συστήματος ChemiDoc) εκτιμήθηκε από μη γραμμικές παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας Prism 5 (GraphPad Software). Άλλες στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SigmaStat.

Αποτελέσματα

ΕΚΚ ενεργοποίησης, Thr 163 φωσφορυλίωση, και σταθεροποίηση του ενδογενούς Mcl-1 πρωτεΐνης εμφανίζονται νωρίς μετά την έκθεση της BL41-3 κύτταρα σε ΤΡΑ και ακολούθως ρυθμίζεται προς τα κάτω

BL41-3 κύτταρα εμφανίζουν άφθονα συστατική έκφραση του ενδογενούς Mcl-1 (~ 5 φορές υψηλότερη από ό, τι ML-1 κύτταρα διεγερμένα με ΤΡΑ [23]), και έχουν αποδειχθεί πολύ χρήσιμα για μελέτες μετα-μεταφραστική ρύθμιση της. Αποτελέσματα ΤΡΑ-προκαλούμενη ενεργοποίηση ERK σε λίγο περαιτέρω αύξηση Mcl-1 έκφραση σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. S1A, Β), σε αντίθεση με ML-1 και άλλων κυττάρων [17], [21], [22], [25], [26]. BL41-3 κύτταρα είναι έτσι ιδιαιτέρως χρήσιμες για μελέτες ΤΡΑ /ERK που επάγεται Thr 163 φωσφορυλίωση [24], επειδή επιπτώσεις στην σταθερότητα της πρωτεΐνης μπορεί να εξεταστεί με την απουσία ουσιαστικής επαγωγή Mcl-1.

τα αρχικά μας πειράματα που χαρακτηρίζεται περαιτέρω το χρονισμό των αποτελεσμάτων που προκαλούνται από ΤΡΑ, αφού η ενεργοποίηση ERK είναι συχνά παροδική [17], [49]. ενεργοποίηση ERK και αυξημένη Thr 163 φωσφορυλίωση ήταν ανιχνεύσιμα εντός 0,5 ωρών μετά ΤΡΑ προσθήκη [24], [25] και διατηρήθηκε για περίπου 6 ώρες, στη συνέχεια μειώνεται καθώς παρακολουθήθηκαν για έως και 24 ώρες (Σχ. Σχ. 1Β και S1 Α). Για να καθοριστεί αν η μείωση στην ενεργοποίηση της ERK και Thr 163 φωσφορυλίωση δει μετά από παρατεταμένη έκθεση σε ΤΡΑ θα αντανακλάται σε μια μείωση των Mcl-1 σταθεροποίησης, θα παρακολουθείται Mcl-1 φθορά τόσο αμέσως μετά την προσθήκη ΤΡΑ και 24 ώρες αργότερα. Όταν CHX εφαρμόστηκε για την αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης, Mcl-1 αποικοδόμηση ήταν σχεδόν πλήρης μέσα σε 7 ώρες (Σχ. 1C, πάνω αριστερά), αλλά επιβραδύνθηκε κατά την ταυτόχρονη εφαρμογή ΤΡΑ (Σχ. 1 C, άνω δεξιά), όπως και σε προηγούμενες μελέτες [ ,,,0],25]. Ωστόσο, όταν CHX εφαρμόσθηκε 24 ώρες μετά την ΤΡΑ, Mcl-1 σταθεροποίηση εξασθένησε (Εικ. 1 C, κάτω αριστερά), αν και θα μπορούσε να αποκατασταθεί με την εφαρμογή των πρόσθετων ΤΡΑ αυτή τη στιγμή (Σχ. 1 C, κάτω δεξιά). Εν ολίγοις, η ενεργοποίηση ERK, Thr 163 φωσφορυλίωση, και Mcl-1 σταθεροποίηση προκύψει ως πρώιμα γεγονότα μετά την έκθεση των κυττάρων BL41-3 να ΤΡΑ, και είναι όλα στη συνέχεια ρυθμίζεται προς τα κάτω. Αυτά τα αποτελέσματα ενισχυμένο προηγούμενα ευρήματα, η οποία είχε προτείνει μια στενή συσχέτιση μεταξύ αυτών των ΤΡΑ-προκαλούμενη αποτελέσματα σε ότι όλοι ανεστάλησαν από την U0126 αναστολέα ERK παθολογικής οδού ([25] και το Σχ. S1D).

Mcl-1 Αποδόμηση στη BL41-3 κύτταρα είναι LiCl-insensitive

Mcl-1 μπορεί να στοχεύονται για αποικοδόμηση από GSK3, και έκθεση σε ΤΡΑ οδηγεί σε αδρανοποίηση GSK3 σε μερικά κύτταρα [29], [31], [32], [50 ], [51]. Συνεπώς, φαίνεται ότι είναι δυνατόν ότι ΤΡΑ-προκαλούμενη αδρανοποίηση GSK3 και η αναστολή της Mcl-1 αποικοδόμηση μέσω αυτής της οδού θα μπορούσε να ευθύνεται για τη σταθεροποίηση φαίνεται στο BL41-3 κύτταρα. Ως μέσο για την εξέταση αυτής της δυνατότητας, έχουμε ανιχνεύθηκαν για επίδραση της ΤΡΑ επί της εκφράσεως του στόχου GSK3 β-κατενίνης. Η επίδραση του αναστολέα GSK3 LiCl παρακολουθήθηκε παράλληλα. Ο τελευταίος παράγοντας χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος ικανή να προκαλέσει μια αύξηση στην έκφραση β-κατενίνης (Εικ. 2Α διαδρομή 3, μεσαία φωτογραφία). Σκοπός μας ήταν να προσδιοριστεί κατά πόσο ΤΡΑ μιμείται την επίδραση της LiCl να παράγει μια αύξηση στην έκφραση β-κατενίνης, καθώς αυτό θα ήταν ενδεικτικό μιας επίδρασης επί της GSK3. . Ωστόσο, ΤΡΑ δεν φάνηκε να έχει ένα τέτοιο αποτέλεσμα υπό την έννοια ότι δεν αυξάνουν την έκφραση βήτα-κατενίνης απουσία LiCl (Εικ. 2Α λωρίδα 2, μεσαία φωτογραφία)

Α: BL41-3 κύτταρα είτε αφεθεί χωρίς θεραπεία ή εκτεθεί σε ΤΡΑ (20 ηΜ) ή /και LiCl (20 mM, ή NaCl ως έλεγχο). Μετά από 18 ώρες, η έκφραση του Mcl-1, β-κατενίνης, και GAPDH και αναλύθηκε με κηλίδωση Western. Συγκρίσιμα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ΤΡΑ επί 30 λεπτά αντί για 18 ώρες (δεν φαίνεται). Β: BL41-3 κύτταρα εκτέθηκαν στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις LiCI (ή KCl ή NaCl ως έλεγχοι), και προσδιορίστηκαν για έκφραση του Mcl-1 και βήτα-κατενίνης μετά από 24 ώρες. Μια μεγάλη μορφή τζελ που χωρίζει τις ζώνες διπλή Mcl-1 χρησιμοποιήθηκε. Ελαφρά αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε 10-20 mM ϋΟΙ (13 και 27%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με το 5% με 20 mM NaCl). Αποτελέσματα παρόμοια με αυτά που δείχνονται ελήφθησαν με χρόνο έκθεσης 12 ωρών ή συγκέντρωση LiCl 40 mM (δεν φαίνεται). C: BL41-3 κύτταρα επωάστηκαν απουσία ή παρουσία του LiCI (20 mM) για 0,5 ώρες, χρόνος κατά τον οποίο εφαρμόστηκε CHX. Η έκφραση του Mcl-1, β-κατενίνης, και GAPDH προσδιορίστηκε μετά τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Καμία ουσιαστική διαφορά παρατηρήθηκε σε παράλληλο κύτταρα που εκτίθενται σε NaCl (20 mM, που δεν έχει δειχθεί) αντί LiCl.

Η

Mcl-1 έκφραση επίσης παρακολουθείται στο παραπάνω πείραμα, και δεν βρέθηκε να αυξηθεί με την παρουσία του LiCI (Σχ. 2Α, άνω φωτογραφία). Στην πραγματικότητα, καμία αλλαγή στην Mcl-1 έκφραση παρατηρήθηκε ακόμα και σε συγκεντρώσεις LiCl που προκάλεσε μια μέγιστη αύξηση στην έκφραση β-κατενίνης και κατά την εξέταση χρησιμοποιώντας μεγάλες γελών μορφή (Σχ. 2Β). Αυτή η παρατήρηση ήταν ενδιαφέρον ως LiCl σταθεροποιεί Mcl-1 σε μία ποικιλία κυττάρων και είχαμε αρχικά θεωρηθεί ότι μια GSK3 μεσολάβηση, LiCI ευαίσθητα μονοπάτι μπορεί να εμπλέκεται σε BL41-3 κύτταρα. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω παρατηρήσεις ήταν επίσης συνεπής με την έλλειψη ενός ρόλου προς αυτήν την οδό σε Mcl-1 αποικοδόμηση σε κύτταρα BL41-3. Έτσι, η έκθεση αυτών των κυττάρων σε βορτμαννίνη ή LY294002, αναστολείς ΡΙ3Κ που μπορεί να αποτρέψει την ανασταλτική φωσφορυλίωση της GSK3 και έτσι να ενισχύσει την υποβάθμιση των στόχων της, δεν επηρέασε σημαντικά την έκφραση του Mcl-1, ενώ η μείωση αυτή των βήτα-κατενίνης (Εικ. S2A ). Επιπλέον, LiCI δεν βρέθηκε να επηρεάζει Mcl-1 αποικοδόμηση παρουσία CHX (Σχ. 2C). Εν ολίγοις, η Mcl-1 αποικοδόμηση σε κύτταρα BL41-3 φάνηκε να είναι σε μεγάλο βαθμό LiCl-αναίσθητη, και ΤΡΑ δεν δρουν με τη μίμηση της επίδρασης αυτού του αναστολέα GSK3. Αυτά τα αποτελέσματα, λαμβανόμενα μαζί με προηγούμενα ευρήματα (Σχ. 1 και [25]) πρότεινε ότι Thr 163 φωσφορυλίωση μπορεί να συνδέεται με Mcl-1 σταθεροποίηση σε κύτταρα στα οποία αποδόμηση GSK3 στόχευσης δεν παίζει σημαντικό ρόλο. Το σημείο αυτό εξετάζεται κατωτέρω, χρησιμοποιώντας το επιμολυνθούν σύστημα κυττάρων CHO στο οποίο θα μπορούσαν να εξεταστούν μεταλλάξεις θέση φωσφορυλίωσης.

Mcl-1 Η υποβάθμιση δεν εξαρτάται από την GSK3 στοχευμένες Phosphodegron και είναι σαφώς επιβραδύνθηκε κατά ένα T163E Μετάλλαξη στο Επιμολυσμένα CHO κύτταρα

κύτταρα

CHO παρέχουν ένα ευκόλως να επιμολυνθούν σύστημα χρήσιμο για τη μελέτη μεταλλάξεων σε θέσεις βρέθηκε να υφίσταται μετα-μεταφραστική τροποποίηση ενδογενώς σε BL41-3 κύτταρα [24], [25], [30], [43] . CHO κύτταρα περιέχουν βασικά ενεργοποιημένη ERK σε αντίθεση με BL41-3 κύτταρα. Κατά συνέπεια, Thr 163 φωσφορυλίωση λαμβάνει χώρα μετά από διαμόλυνση με WT-Mcl-1, και δεν αυξάνεται περαιτέρω με την προσθήκη ΤΡΑ [25]. Ως εκ τούτου, έθεσε ως στόχο να εξετάσει την επίδραση ενός μη φωσφορυλιώσιμη μετάλλαξη T163A, καθώς και μια μετάλλαξη phosphomimetic T163E, μετά την επιμόλυνση του μεταλλαγμένου κατασκευασμάτων σε κύτταρα CHO. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα προκαταρκτικά αποτελέσματα έδειξαν ότι LiCl δεν επηρέασε την έκφραση ή υποβάθμιση των WT-Mcl-1 σε κύτταρα CHO, αν και η έκφραση β-κατενίνης ήταν αυξημένη (Εικ. 3Α και το σχ. S2B). Αυτό έδωσε παράλληλα με τα πορίσματα που εκφράζουν ενδογενώς BL41-3 κύτταρα (Εικ. 2C), και πρότεινε ότι Mcl-1 υποβάθμιση μπορεί να μην επίσης να προκαλούνται μέσω της GSK3 σε επιμολυσμένα κύτταρα CHO. Σε αυτήν την περίπτωση, μια μετάλλαξη T163A δεν θα αναμενόταν να επηρεάσει Mcl-1 αποικοδόμηση. Αυτό θα διαφέρει από ό, τι φαίνεται σε φυσιολογικούς ινοβλάστες, όπου μια μετάλλαξη T163A επιβραδύνει Mcl-1 υποβάθμιση λόγω Thr 163 φωσφορυλίωση primes GSK3 που προκαλείται από Ser 159 φωσφορυλίωση και την υποβάθμιση [27]. Πράγματι, η Mcl-1-T163A-κωδικοποιημένη πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε ταχεία αποικοδόμηση κατά την έκθεση των επιμολυσμένων κυττάρων CHO σε CHX (Σχ. 3Β), όπως έκανε το WT-Mcl-1-, Mcl-1-S162A- και Mcl-1-S159A που κωδικοποιείται πρωτεΐνες (Εικ. 3Β, C). Mcl-1-δ162Α αντιπροσωπεύει ένα επιπλέον έλεγχο όπως φωσφορυλίωση δεν έχει παρατηρηθεί σε αυτό το site [25]. Σημειώνουμε ότι, όπως και στις προηγούμενες εκθέσεις [27], μια S159A /T163A διπλά μεταλλαγμένο δεν εξετάστηκε, επειδή μια σχεδόν πλήρη απώλεια της Mcl-1 φωσφορυλίωση παρατηρείται με την μετάλλαξη T163A σε κύτταρα CHO [25] και η παρούσα μετάλλαξη θέση έναρξης αποτρέπει Ser 159 φωσφορυλίωση σε ινοβλάστες [27]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα με μη φωσφορυλιώσιμη μεταλλάξεις καθώς και LiCl υποδηλώνουν ότι η GSK3 στόχευση phosphodegron δεν παίζει σημαντικό ρόλο στην Mcl-1 αποικοδόμηση σε επιμολυσμένα κύτταρα CHO. Σε αυτήν την περίπτωση, η Mcl-1-T163E κωδικοποιημένη πρωτεΐνη παρουσίασαν εντυπωσιακή σταθεροποίηση [Σχ. 3Β (βλέπε αναπτήρας έκθεσης το οποίο περιλαμβάνεται στο κάτω λόγω της εκτεταμένης σταθεροποίηση παρατηρείται με αυτό το κατασκεύασμα) και το Σχ. 3C]. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα AKR-2B (Σχήμα 3D).

Α:. Κύτταρα CHO επιμολύνθηκαν με WT-Mcl-1 και επωάστηκαν σε παρουσία LiCI (+ LiCl? 20 mM) ή σε του απουσία (-LiCl) όπου 20 mM NaCl προστέθηκε στην τελευταία περίπτωση. Μετά από 10 ώρες, CHX εφαρμόστηκε και έκφραση του εισαχθέντος γονιδιακού προϊόντος WT-Mcl-1, και ενδογενή β-κατενίνης και της GAPDH, προσδιορίστηκε μετά τους ενδεδειγμένους χρόνους (ChemiDoc). Ο χρόνος ημίσειας ζωής του Mcl-1 αποσύνθεση εκτιμήθηκε να είναι ~ 4 ώρες σε κύτταρα που εκτίθενται σε LiCl, και 3,7 ώρα στους ελέγχους που εκτίθενται σε NaCl. Καμία ουσιαστική διαφορά παρατηρήθηκε σε παράλληλη κύτταρα δεν εκτίθενται σε NaCl ή LiCl. Η κηλίδα εμφανίζεται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β-Γ: κύτταρα CHO επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα μορφώματα, ανακαλλιεργήθηκαν την επόμενη ημέρα, και επωάζονται για μια περίοδο 24 ωρών για να επιτραπεί η έκφραση. CHX προστέθηκε στη συνέχεια και η έκφραση του εισαχθέντος γονιδιακού προϊόντος Mcl-1 και των ενδογενών β-τουμπουλίνης ελέγχθηκε μετά χρόνους που υποδεικνύονται με κηλίδωση Western. Στον πίνακα Β, η μείωση των Mcl-1 έκφραση σε 3 ώρες σε 2 ανεξάρτητα πειράματα κυμαίνονταν από 53-66% με WT-Mcl-1, 25-54% με Mcl-1-δ162Α, και 25-50% με Mcl- 1-T163A. Αν και η μείωση της έκφρασης με WT-Mcl-1 φάνηκε να είναι ελαφρώς μεγαλύτερη από εκείνη που παρατηρείται με Mcl-1-T163A, αυτό δεν ήταν ένα σταθερό εύρημα. Μια σύντομη αυτοραδιογραφική έκθεση παρουσιάζεται επίσης επειδή επιπλέον ζώνες ανιχνεύθηκαν στα υψηλά επίπεδα έκφρασης που επιτυγχάνονται με Mcl-1-T163E. Στο τέλος της περιόδου παρατήρησης 12 ωρών, η έκφραση του Mcl-1-T163E μειώθηκε κατά -15% στον Πίνακα Β και ~27% στον Πίνακα C, όπως εκτιμάται από σύντομο αυτοραδιογραφικές εκθέσεις. D: κύτταρα AKR-2B επιμολυσμένα με τα υποδεικνυόμενα κατασκευάσματα ανακαλλιεργήθηκαν την επόμενη ημέρα, κατά την οποία η βιωσιμότητα χρόνος κυττάρων (trypan μπλε χρωστική αποκλεισμού) ήταν 88-92% σε μη επιμολυσμένα καθώς και επιμολυσμένα καλλιέργειες. Μία ημέρα αργότερα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 25 μικρογραμμάρια /ml CHX και προσδιορίστηκαν μετά χρόνους που υποδεικνύονται για την έκφραση του εισαχθέντος γονιδιακού προϊόντος Mcl-1 ή ενδογενή ακτίνης με κηλίδωση Western. Οι διπλούν πλάκες εμφανίζονται σε παρακείμενες λωρίδες.

Η

Mcl-1-T163E Εκθέματα Αυξημένα Συσσώρευση και εμποδίζει την έκφυση Σταθερό G418-ανθεκτικά Οι επιμολύνσεις

Στο παραπάνω πείραμα, Mcl-1- T163E παρουσίασαν αυξημένη συσσώρευση κατά την περίοδο έκφρασης πριν από την εφαρμογή του CHX (Σχ. 3Β, χρόνος 0). Εξέταση της χρονικής πορείας της συσσώρευσης επιβεβαίωσε ότι μια δραματική αύξηση σημειώθηκε μετά από επιμόλυνση με Mcl-1-T163E σε σύγκριση με WT-Mcl-1 (Σχ. 4Α, λωρίδες 4-5 έναντι λωρίδες 1-2).

Α: κύτταρα CHO διαμολύνθηκαν ταυτόχρονα με είτε WT-Mcl-1 ή Mcl-1-T163E μαζί με pEGFP, και προσδιορίστηκαν στους ενδεδειγμένους χρόνους για την έκφραση του εισαχθέντος γονιδιακού προϊόντος Mcl-1 και EGFP με κηλίδωση Western. Ο ρυθμός αύξησης της πρωτείνης Mcl-1-T163E εκτιμήθηκε ότι είναι τουλάχιστον 10 φορές μεγαλύτερη από εκείνη του WT-Mcl-1. Περίπου ισοδύναμη έκφραση της EGFP σε WT-Mcl-1 και Mcl-1-T163E-επιμολυσμένα καλλιέργειες παρατηρήθηκε επίσης μετά από δοκιμασία με κυτταρομετρία ροής (δεν φαίνεται). Β: κύτταρα CHO επιμολύνθηκαν με WT-Mcl-1 ή Mcl-1-T163E και υποβάλλονται σε έκθεση παλμών 2 ωρών σε

35SMet, στον οποίο χρόνο συλλέχθηκε ένα δείγμα «χρόνος μηδέν». Μια καταδίωξη με μέσο που περιέχει μη ραδιενεργή μεθειονίνη στη συνέχεια διεξήχθη και τα

35SMet- επισημασμένων πρωτεϊνών Mcl-1 προσδιορίστηκαν μετά τους υποδεικνυόμενους χρόνους (άνω φωτογραφία). Ένα μη-ειδική ζώνη του ~32 kd περιλαμβάνεται στο σχήμα (*) για συγκριτικούς σκοπούς και ένα ξεχωριστό κλάσμα από κάθε δείγμα αναλύθηκε για ολική Mcl-1 έκφραση από κηλίδωση Western (κάτω φωτογραφία). Ο χρόνος ημίσειας ζωής της φθοράς εκτιμήθηκε με phosphorimager να είναι, 2,5 φορές περισσότερο με

35S-Met- Mcl-1-T163E από ότι με

35S-Met-WT-Mcl-1.

Κατά την παλμός /κυνηγητό μεταβολική σήμανση,

35S-Met-Mcl-1-T163E και

35S-Met-WT-Mcl-1 αποδεικνύεται ισοδύναμη σύνθεση κατά την αρχική παλμό (Σχ. 4Β, χρόνο 0 ). Μετά την καταδίωξη, η φθορά του

35S-Met-Mcl-1-T163E επιβραδύνθηκε σε σύγκριση με εκείνη του

35S-Met-WT-Mcl-1 (Σχ. 4Β), αν και η επιβράδυνση εδώ δεν ήταν τόσο επισημαίνονται όπως είχε παρατηρηθεί κατά την παρακολούθηση της συνολικής πρωτεΐνης Mcl-1-T163E με κηλίδωση Western (Σχ. 3Β). Αυτό θα μπορούσε να αντανακλά το γεγονός ότι η σήμανση παλμού /εκδίωξης προσδιορισμούς την νεοσυντιθέμενη πρωτεΐνη (γενικά ένα κλάσμα του συνόλου), ή άλλες διαφορές μεταξύ αυτών των μεθόδων [52], [53]. Στο σύνολό τους, οι παραπάνω διαπιστώσεις ενισχυθεί και να επεκταθεί και σε εκείνους BL41-3 κύτταρα, δείχνοντας ότι η μετάλλαξη T163E οδήγησε σε Mcl-1 σταθεροποίησης σε κύτταρα CHO, όπου η υποβάθμιση ήταν σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητη από την GSK3 στοχευμένες phosphodegron σε S

159LPST

163P.

Η εκτεταμένη σταθερότητα και αυξημένη συσσώρευση που παρατηρείται με Mcl-1-T163E μπορεί να σχετίζεται με μια επιπλέον παρατήρηση, η οποία ήταν ότι ήμασταν σε θέση να αντλήσει σταθερά επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών με αυτό το κατασκεύασμα. Αυτή η παρατήρηση ήταν αρχικά κάπως απροσδόκητο, επειδή αυξάνεται συνεχώς επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές είχαν προηγουμένως ληφθεί με WT-Mcl-1 κατόπιν επιλογής με G418 (λόγω των neo

R δείκτης [43]) και θα μπορούσε επίσης να ληφθεί με Mcl-1- T163A. Mcl-1 έκφραση σε αυτά τα σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές ήταν στην περιοχή παρατηρείται σε κύτταρα που εκφράζουν Mcl-1 ενδογενώς, όπως BL41-3 κύτταρα και κατεργασμένα με ΤΡΑ κύτταρα ML-1 ([43] και το άνω φύλλο και υπόμνημα).

ενόψει των ανωτέρω παρατηρήσεων, εξετάσαμε Mcl-1-T163E επιμολυσμένων καλλιεργειών σε πρώιμους χρόνους μετά τη διαμόλυνση και επιλογή με G418. Αμέσως μετά την επιμόλυνση, ένα φάσμα των επιπέδων έκφρασης Mcl-1 παρατηρήθηκε (Σχ. S3A κάτω πίνακας). Όταν G418 στη συνέχεια εφαρμόστηκε για την εξάλειψη των μη επιμολυσμένα κύτταρα, τα βιώσιμα κύτταρα δεν αναπτύσσονται έξω από Mcl-1-T163E-επιμολυσμένα καλλιέργειες, σε αντίθεση με ό, τι συνέβη με WT-Mcl-1 [Σχ. S3b (γεμάτα σύμβολα στο δεξί έναντι μεσαίο πλαίσιο), όπου τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε απουσία G418 και στις δύο περιπτώσεις αλλά έχασε Mcl-1 έκφρασης (ανοικτά σύμβολα)]. Τα ανθεκτικά στο G418 κύτταρα που αναπτύχθηκαν με WT-Mcl-1 εμφάνισαν πολύ χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης από το αρχικό όγκο επιμολυσμένα πληθυσμό (Σχ. S3C, λωρίδες 10-12). Σε αντίθεση, άφθονη έκφραση διατηρήθηκε σε Mcl-1-T163E επιμολυσμένων καλλιεργειών (Σχ. S3C, λωρίδες 16-18). Συνολικά, επιλογή με G418 ως αποτέλεσμα την έκφυση των γραμμών επιμόλυνσης που εμφανίζουν έκφραση της ενδογενούς σειράς με WT-Mcl-1, καθώς και Mcl-1-T163A, αλλά όχι με Mcl-1-T163E

.

Εκτός να αντιαποπτωτικό αποτέλεσμα, Mcl-1 έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ορισμένα συστήματα [54], [55]. Αυτό το αποτέλεσμα δεν παρατηρήθηκε σε σταθερές επιμολύνσεις που εκφράζουν την πρωτεΐνη σε επίπεδα ενδογενούς εύρος [56]. Ωστόσο, η αναστολή του πολλαπλασιασμού έχει παρατηρηθεί μετά από παροδική επιμόλυνση ή άλλες προσεγγίσεις σε θέση να παράγουν υψηλά επίπεδα έκφρασης. Το γεγονός ότι οι WT-Mcl-1-επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές CHO παρουσίασαν έκφραση στο ενδογενές εύρος (Εικ. S3A άνω πάνελ) υποδηλώνει ότι τέτοια κύτταρα μπορεί να είχε μια πλεονέκτημα ανάπτυξης έναντι εκείνων με υψηλότερα επίπεδα έκφρασης. Σταθερά επιμολυσμένα με μια άλλη γραμμή παραλήπτη εμφάνισαν παρομοίως έκφραση στο ενδογενές εύρος, αλλά όχι υψηλότερο [56]. Συνολικά, ενώ WT-Mcl-1 προάγει τη βιωσιμότητα σε σταθερά επιμολυσμένων κλώνων που εκφράζουν τα επίπεδα στο ενδογενές εύρος, μένει να καθοριστεί αν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης να οδηγήσει σε επιπρόσθετες επιδράσεις όπως παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Εν όψει της τα ανωτέρω, δεν είναι ίσως έκπληξη το γεγονός ότι σταθερά επιμολυσμένα γραμμές δεν ελήφθησαν με Mcl-1-T163E. Σημειώνουμε ότι η έκφραση του ενδογενούς τουμπουλίνης μειώθηκε σε καλλιέργειες που επιμολύνθηκαν με αυτό το κατασκεύασμα (Εικ. S3C), η οποία θα μπορούσε να αφορά αυξημένη έκφραση του διαμολυσμένου πρωτεΐνης ή /και την παρουσία του μη αφαιρούμενα Glu μετάλλαξη. Σημειώνουμε επίσης ότι ορισμένα κύτταρα εντός του αρχικού χύμα Mcl-1-T163E-επιμολυσμένα πληθυσμού εμφάνισαν χαμηλότερη έκφραση (Εικ. S3A κάτω πίνακας).