Αφηρημένο

Η γονιδιακή θεραπεία αποτελεί μια ελκυστική στρατηγική για τη μη επεμβατική θεραπεία του καρκίνου του προστάτη, όπου οι τρέχουσες κλινικές παρεμβάσεις δείχνουν περιορισμένη αποτελεσματικότητα. Εδώ, θα αξιολογήσει τη χρήση του ιού εντόμου, βακιλοϊό (BV), ως νέο φορέα για γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου του ανθρώπινου προστάτη. Δεδομένου ότι οι όγκοι του προστάτη αντιπροσωπεύουν ένα ετερογενές περιβάλλον, μία θεραπευτική προσέγγιση που επιτυγχάνει μακροχρόνια υποστροφή πρέπει να είναι ικανά να στοχεύουν πολλαπλούς μετασχηματισμένων κυτταρικών πληθυσμών. Εξάλλου, οι διακρίσεις στη στόχευση των κακοήθων σε σύγκριση με μη κακοήθη κύτταρα θα έχουν αξία στην ελαχιστοποίηση των παρενεργειών. Χρησιμοποιήσαμε μια σειρά από μοντέλα καρκίνου του προστάτη για να αναλύσει τις δυνατότητες για BV για την επίτευξη των στόχων αυτών.

In vitro

, οι δύο παραδοσιακές κυττάρων του προστάτη γραμμές όπως και τα πρωτογενή επιθηλιακά ή στρωματικά κύτταρα που προέρχονται από βιοψίες του προστάτη ασθενή, σε δύο ή τριών διαστάσεων πολιτισμούς, χρησιμοποιήθηκαν. Αξιολογήσαμε επίσης BV

in vivo

σε μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου του προστάτη ποντικού. BV ήταν ικανή προνομιακά μεταγωγής επεμβατική κακοήθεις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με πρώιμους καρκίνους στάδιο και μη κακοήθεις δείγματα, περιορισμό που δεν ήταν συνάρτηση της πυρηνικής εισαγωγής. Μεγαλύτερης κλινικής συνάφειας, τα πρωτογενή κύτταρα καρκίνου προστάτη ασθενούς προερχόμενα επίσης αποτελεσματικά μεταγωγή από BV, με ισχυρή ποσοστά παρατηρούνται σε επιθηλιακά κύτταρα της βασικής φαινοτύπου, η οποία εξέφρασε BV-κωδικοποιείται διαγονίδια γρηγορότερα από τα επιθηλιακά κύτταρα ενός πιο διαφοροποιημένη, του αυλού φαινότυπο. Η μέγιστη χωρητικότητα μεταγωγής παρατηρήθηκε σε στρωματικά κύτταρα. BV ήταν σε θέση να διεισδύσουν μέσα από τρισδιάστατες δομές, συμπεριλαμβανομένων των

in vitro

σφαιροειδή και

in vivo

ορθοτοπική ξενομοσχεύματα. φορείς BV που περιέχουν ένα διαγονίδιο νιτρορεδουκτάση σε ένα ένζυμο προσέγγιση θεραπεία προ-φαρμάκου γονίδιο-κατευθυνόμενη ήταν ικανά αποτελεσματικά θανάτωση κακοήθων στόχους του προστάτη μετά από χορήγηση του προ-φαρμάκου, CB1954. Έτσι, BV είναι ικανό να μεταγάγει ένα μεγάλο ποσοστό των κυττάρων του προστάτη τύπων εντός ενός ετερογενούς 3-D όγκου του προστάτη, μπορούν να διευκολύνουν τον κυτταρικό θάνατο χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση προ-φαρμάκου, και δείχνει υπόσχεση ως φορέας για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Παράθεση: Swift SL, Rivera GC, Dussupt V, Leadley RM, Hudson LC, ΜΑ de Ridder C, et al. (2013) Αξιολόγηση ραβδοϊού ως φορέας για Ανθρώπινου Προστάτη Cancer Gene Therapy. PLoS ONE 8 (6): e65557. doi: 10.1371 /journal.pone.0065557

Επιμέλεια: Rui Medeiros, IPO, Inst Λιμάνι Ογκολογίας, Πορτογαλία

Ελήφθη: 1 Φεβ του 2013? Αποδεκτές: 26 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 του Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Swift et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο πραγματοποιήθηκε υπό έργα χρηματοδοτούμενα από την ΕΕ συνεργατικής: προστάτη Πρωτοβουλία για την «ΧΟΙΡΩΝ» Gene Therapy (5ο ΠΠ), Baculogenes (FP6) και Gene Therapy: Μια ολοκληρωμένη προσέγγιση της «γίγαντας» Νεοπλασματική Θεραπεία (6ο ΠΠ), με πρόσθετη στήριξη από το Yorkshire Cancer Research . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στο Ηνωμένο Βασίλειο, πάνω από 40.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο και 11.000 ασθενείς πεθαίνουν ως άμεσο αποτέλεσμα αυτής της ασθένειας (Πηγή: Εθνική Στατιστική Υπηρεσία). Το ανθρώπινο αδένας του προστάτη είναι ένα ετερογενές περιβάλλον, που αποτελείται κυρίως από επιθηλιακών και στρωματικών κυτταρικών τύπων. Το επιθηλιακό διαμέρισμα αποτελείται από ένα διπλής στιβάδας των κυττάρων: συνεχές στρώμα βασικά μη διαφοροποιημένων κυττάρων τα οποία είναι σε επαφή με την βασική μεμβράνη, επιστρωμένα με διαφοροποιημένα εκκριτικά κύτταρα του αυλού [1]. Η βασική επιθηλιακό στρώμα αντιπροσωπεύει την πιο πολλαπλασιαστική διαμέρισμα [2]. Ενώ το μεγαλύτερο μέρος των πιο όγκων του προστάτη περιλαμβάνει κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης [3], πολλαπλούς τύπους κυττάρων έχουν την ικανότητα να συμβάλλουν στην κακοήθεια, και πρέπει να εξαλειφθεί, προκειμένου να επιτευχθεί μια αποτελεσματική κλινική έκβαση.

Τυπικά, το στάδιο της ασθένειας του προστάτη και την ανταπόκριση του όγκου σε ανδρογόνα είναι οι δύο βασικοί παράγοντες ότι οι στρατηγικές άμεσης θεραπείας. Ενώ εντοπισμένους όγκους του προστάτη μπορεί να εκτομή χειρουργικά μέσω ριζική προστατεκτομή, αυτό συνοδεύεται συχνά από ανεπιθύμητες παρενέργειες. Μια εναλλακτική προσέγγιση, η θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων, αφαιρεί την παροχή των ανδρογόνων που πολλοί όγκοι του προστάτη εξαρτώνται για την ανάπτυξη και την επιβίωση? Ωστόσο, η επανάληψη της πιο επιθετική ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) είναι ένα κοινό αποτέλεσμα. Δεδομένου CRPC είναι τελικά ανθεκτικά στην ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία, τα νέα στρατηγικές είναι απαραίτητη για να παρέχει βελτιωμένη έκβαση για ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Η γονιδιακή θεραπεία είναι μια πιθανή λύση, και θα ήταν ιδανικό να τοποθετηθεί για τη στόχευση των δύο πρωτογενείς και δευτερογενείς όγκους του προστάτη μετά από συστηματική χορήγηση.

Αν και έχουν πολλούς διαφορετικούς φορείς έχουν αξιολογηθεί για την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα σε δοκιμές γονιδιακής θεραπείας [4], η χρήση μη-ανθρώπινο, μη-παθογόνοι ιοί, όπως ο βακουλοϊός,

Autographa californica

Πολλαπλές NucleoPolyHedrovirus (

Ac

MNPV), είναι μια σχετικά μελετημένο χώρο. BV είναι ένας ιός δίκλωνου DNA που μολύνει φυσικά ξενιστές εντόμων, και παρόλο που BV μπορούν να μετάγουν αποδοτικά κύτταρα θηλαστικών, παραγωγική αντιγραφή δεν είναι δυνατή λόγω της απαίτησης για κυψελοειδή μηχανήματα ειδική για έντομα [5], [6]. Ως φορέας γονιδιακής θεραπείας, BV έχει αρκετά εγγενή πλεονεκτήματα. Το μεγαλύτερο μέρος του ανθρώπινου πληθυσμού δεν έχει προηγούμενη έκθεση σε BV και είναι επομένως ανοσολογικά παρθένος. Το καψίδιο BV είναι ικανή να επεκτείνεται για να φιλοξενήσει μεγάλα ενθέματα διαγονιδίου, και η φυσική τροπισμός του βακουλοϊού τροποποιείται εύκολα. BV είναι σε θέση να μετάγει τόσο ενεργά διαιρούμενα και εν ηρεμία κύτταρα θηλαστικών, ένα χαρακτηριστικό που έχει ιδιαίτερη σημασία για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη, ένα αργά αναπτυσσόμενο όγκο [7]. Η παρουσία του βακουλοϊού, ακόμη και σε υψηλή πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ), δεν είναι τοξικό και δεν επηρεάζει την κυτταρική ανάπτυξη και το δυναμικό διαφοροποίησης [8], [9]. Τέλος, εκτεταμένες μελέτες για την ασφάλεια μακροπρόθεσμα, ανέλαβε τη δεκαετία του 1960, όταν baculovirus αναδειχθεί ως μια σημαντική προοπτική ως βιολογικό εντομοκτόνο, έχουν αποδειχθεί baculovirus ακίνδυνο για τον άνθρωπο [10].

Η ικανότητα της BV να παραδώσει λειτουργικά βιώσιμη διαγονιδίου έκφραση σε κύτταρα θηλαστικών αποδείχθηκε για πρώτη φορά το 1995 [11]. Από τότε,

Ac

MNPV έχει αποδειχθεί ικανό να μεταγάγει ένα ευρύ φάσμα τύπων κυττάρων θηλαστικών, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων πρωτογενείς νευρώνες [12], το ήπαρ [11], τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα [13] και τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα [9] . Ενώ οι πρώτες προσπάθειες για την επίτευξη BV διαμεσολαβούμενη μεταφορά γονιδίου

in vivo

απέτυχε λόγω της αδρανοποίησης διάνυσμα από συστατικά ορού, όπως συμπλήρωμα [14], αποδοτική μεταγωγή βακουλοϊού μπορεί να επιτευχθεί με την παρουσία του στα χημικά ή σε πρωτεΐνες αναστολείς συμπληρώματος βάση, είτε ως συν-εμβόλια [15], [16], [17] ή συσσωματώσεων εντός της πρωτεΐνης περιβλήματος BV [17], [18], [19]. BV έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς ως φορέας γονιδιακής θεραπείας προκλινικές

in vivo

[12], [20], [21], [22], [23], και στο πλαίσιο του καρκίνου έχει θεραπευτεί επιτυχώς γαστρικό ποντικού ξενομοσχεύματα [24].

Εδώ, αξιολογούμε BV ως φορέας γονιδιακής θεραπείας για τη θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. Περιγράφουμε τη χρήση της BV να προνομιακά μεταγάγει και να παραδώσει τα δύο ρεπόρτερ και κυττάρου-θανατηφόρα γονίδια σε κακοήθη δείγματα προστάτη από κυτταρικής γραμμής και την προέλευση των ασθενών, εκτός από την τρισδιάστατη καλλιέργειες και

in vivo

ποντικού όγκων, με υψηλά αποδοτικότητα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική γραμμή εντόμου Συντήρηση

Sf21 και Sf9 (Invitrogen) κυτταρικές γραμμές (που απομονώνεται από το ωοθηκικό ιστό του Fall στρατού σκουλήκι,

Spodoptera frugiperda

) διατηρήθηκαν σε spinner κρέμονται φιάλες ράβδο ανάδευσης στους 27 ° C σε μέσο Grace συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (ΡΑΑ Laboratories) και 0,1% (ν /ν) Pluronic® F-68 (Invitrogen). καλλιέργειες μονοστιβάδας διατηρήθηκαν εν απουσία Pluronic.

Ανθρώπινου Προστάτη Κυτταρικής Γραμμής Συντήρηση

LNCaP (ανδρογόνο-ευαίσθητη, καλά διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη κύτταρα που προέρχονται από μετάσταση λεμφαδένα) και PC-3 (ανδρογόνο-ανεξάρτητες, κακώς διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη κύτταρα προέρχονται από ένα μετάσταση στα οστά) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, USA). PC346C (ανδρογόνα-ευαίσθητο, καλά διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη κύτταρα που προέρχονται από πρωτοπαθή όγκο του προστάτη) ιδρύθηκαν το Ιατρικό Κέντρο Erasmus στην Ολλανδία [25]. P4E6 (επιθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από ένα καλά διαφοροποιημένο πρωτογενούς όγκου του προστάτη αθανατοποιηθούν με διαμόλυνση με HPV Ε6), PNT1A και PNT2C2 (μη κακοήθη κύτταρα του προστάτη από διαφορετικούς ασθενείς, αντίστοιχα, αθανατοποιηθούν με διαμόλυνση με SV40) καθιερώθηκαν στο εργαστήριο μας [26] , [27]. Όλα τα κύτταρα διακινούνται υπό συνθήκες ορθής εργαστηριακής πρακτικής σε καθορισμένα παράθυρα πέρασμα, οι μηνιαίες πιστοποιηθεί χωρίς μυκόπλασμα και ο γονότυπος (χρησιμοποιώντας την ATCC-εγκεκριμένο σύστημα Powerplex 1.2, Promega) για να διασφαλιστεί η αυθεντικότητα. Τα κύτταρα συνήθως περάστηκαν κάτω από συνθήκες που περιγράφηκαν προηγουμένως [28].

Πρωτοβάθμια Πολιτισμού τηλέφωνα

Ο ασθενής προστατικό ιστό λήφθηκε με ενημέρωση και έγγραφη συγκατάθεση και έγκριση από την επιτροπή Υόρκη Έρευνας Ηθικής από ασθενείς που υποβάλλονται σε διουρηθρική εκτομή του προστάτη, κυστεκτομή ή ριζική προστατεκτομή. Τα επιθηλιακά κύτταρα απομονώθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [29] και επιλέγονται για α

2β

1

hi έκφρασης χρησιμοποιώντας ταχεία υιοθέτηση κολλαγόνου τύπου Ι-επικαλυμμένες πλάκες (BD Biosciences). Τα κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν επί κολλαγόνου Ι plasticware με ακτινοβολημένα STO τροφοδοτικά κύτταρα ποντικού μέχρι ανάπτυξης εδραιωθεί, σε KSFM συμπληρωμένο με 5 ng /ml EGF, 50 μg /ml βόειας εκχύλισμα υπόφυσης και 2 mM L-γλουταμίνη (KSFMsup). Για την επαγωγή της διαφοροποίησης, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 50:50 (ν /ν) μίγμα DMEM και του Ham F12, συμπληρωμένο με 10% FCS, 10 ηΜ DHT και 2 mM L-γλουταμίνη (DH10) για 4-6 ημέρες. Απομονωμένα στρωματικά κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε φιάλες Τ25 σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FCS και 2 mM L-Γλουταμίνη.

Baculovirus Παρασκευή

Ανασυνδυασμένοι φορείς βακουλοϊού κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ BacVector 1000 (Novagen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με την παραγγελία pBAC64: CMV-EGFPCAT, pBAC64: CMV-ΕΟΡΡ ή pBAC64: πλασμίδια μεταφοράς CMV-NTR-EGFP. Αυτά τα πλασμίδια έχουν την ραχοκοκαλιά της pBAC4X-1 (Novagen) με ενθέσεις του

Polh

υποκινητή και

αρ64

γονίδιο που κωδικοποιεί αλληλουχίες από pBACsurf-1 (Novagen) και ο κυτταρομεγαλοϊός (CMV) προαγωγό μεταγραφής του EGFP, μια πρωτεΐνη σύντηξης EGFPCAT (BD Biosciences Clontech) ή mNitroreductase (NTR) οδήγηση -IRES-EGFP κασέτες έκφρασης. Ανασυνδυασμένοι ιοί υποβλήθηκαν σε τρεις γύρους καθαρισμού πλάκας και μεγάλα αποθέματα τίτλος αναπτύχθηκαν με μόλυνση κυττάρων εντόμου Sf21 σε ΜΟΙ = 0.1 μονάδες σχηματισμού πλάκας (PFU) ανά κύτταρο και τον ιό της συγκομιδής υπερκείμενο μετά από 5 ημέρες. Virus περιέχει κυτταρικό υπερκείμενο συμπυκνώθηκε με υπερφυγοκέντρηση σε 24.000 RPM για 90 λεπτά στους 4 ° C χρησιμοποιώντας έναν ρότορα Beckman SW28 και καθαρίζεται περαιτέρω με υπερφυγοκέντρηση μέσω βαθμίδας σακχαρόζης σε 24.000 RPM σε ένα δρομέα Beckman SW41. Τα σωματίδια του ιού πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS (περίπου 1/500 όγκος έναρξης) και τιτλοδοτήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία πλακών σε κύτταρα Sf9. Το σωματίδιο: αναλογία PFU ήταν γενικά εντός του εύρους των 100-300 [30], [31], [32]. Για μεταγωγή των κυττάρων του προστάτη, ο ιός αραιώθηκε σε κατάλληλο μέσο ελεύθερο ορού για κάθε κυτταρικό τύπο, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Ομοεστιακή Μικροσκοπίας Ανάλυση μονοστιβάδες και Bilayers

Για αμφότερες μονόστρωμα και διπλή στιβάδα συνεστιακή πειράματα , τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλακίδια θαλάμου 8 φρεάτων με μια βάση καλυπτρίδα (Lab-Tek) σε αρχική πυκνότητα 2-5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο (προ-επικαλυμμένα με 0.1 mg /ml πολυ-L-λυσίνη για τα κύτταρα LNCaP). Για να δημιουργήσετε μία διπλή στιβάδα, το μέσο αλλάχθηκε κάθε 2 ημέρες μέχρι να επιτευχθεί ένα διπλού στρώματος των επιθηλιακών ανάπτυξης. BV- [CMV-EGFPCAT] ή BV- [CMV-EGFP] σωματίδια προστέθηκαν σε 500 ΡΡυ /κύτταρο για ένα καθορισμένο χρονικό διάστημα μετά το οποίο τα κύτταρα πλύθηκαν για απομάκρυνση αδέσμευτου ιού και καθορίζονται αμέσως σε 4% (w /v) παραφορμαλδεϋδη . Τα κύτταρα διαπερατά σε 0.5% (ν /ν) Triton-X 100 (Sigma) ή 70% EtOH και, στη συνέχεια αποκλείστηκε σε 10% ορό. Η πρωτεΐνη καψιδίου BV, vp39, ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα (P10C6), ευγενική προσφορά του Dr. L.E. Volkman, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Μπέρκλεϊ, ΗΠΑ [33] και ένα αντι-ποντικού Alexa Fluor 568 δευτερογενές αντίσωμα κατσίκας (Invitrogen). Σε πειράματα διπλοστοιβάδα, αραιώσεις αντισώματος παρασκευάστηκαν σε 0.1% (w /v) Κλάσμα V BSA (Sigma) για να βοηθήσει την διείσδυση στην βασική στρώματα, ενώ στο πειράματα μονοστιβάδα, αραιώσεις αντισώματος παρασκευάστηκαν σε PBS. Για την ανάλυση των πρωτογενών κυτταρική διαφοροποίηση, HMWCK (Dako) αντίσωμα προστέθηκε με την επακόλουθη εφαρμογή ενός Alexa 568 αντίσωμα δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού (Invitrogen). Ένα δεύτερο πρωτεύον αντίσωμα (CK18-FITC (Sigma)) εφαρμόστηκε στη συνέχεια. Vectashield που περιέχει DAPI (Vector Lab) προστέθηκε πριν την οπτικοποίηση κυττάρων υπό φθορισμό χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 510 meta ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Κυτταρομετρίας Ροής

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 0,2-1 χ 10

5 ανά φρεάτιο ενός 48 φρεατίων και επωάζονται στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε PBS πριν από την προσθήκη του ιού αραιωμένο σε κατάλληλο μέσο ελεύθερο ορού για κάθε κυτταρικό τύπο. Μετά το επιθυμητό χρονικό διάστημα, ο ιός αναρροφήθηκε, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε μέσο χωρίς ορό και επιστρώθηκαν σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει ορό. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας θρυψίνη:. EDTA και επαναιωρήθηκαν σε 0.02% (β /ο) ΕϋΤΑ, με ένα ελάχιστο 10,000 απλή γεγονότα απαριθμήθηκαν χρησιμοποιώντας ADP κυανό ™ κυτταρόμετρο ροής

PC346C σφαιροειδές Transduction

Αυθόρμητα σχηματίζονται σφαιροειδή συλλέχθηκαν από την επιφάνεια μιας φιάλης Τ25 περιέχει κύτταρα PC346C και επωάζονται για 10 λεπτά στους 37 ° C σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει πλήρη BV- [CMV-EGFP] σε συγκέντρωση 8.6 × 10

9 PFU /ml . Τα σφαιροειδή αραιώθηκαν σε 2,5 ml μέσου και επανα-επιστρώθηκαν σε μία φιάλη T12.5. Φθορίζουσες εικόνες συλλήφθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου Nikon Eclipse TE300 σε τρεις ημέρες μετά την μόλυνση.

ορθοτοπική Ξενομοσχεύματα

Οι όγκοι συστάθηκε με ένεση 1 × 10

6 PC346C κύτταρα ορθοτοπικώς στο dorsolateral προστάτη των αθυμικών γυμνών ποντικών (NMRI nu /nu, Taconic Μ & amp? BA /S, Ry, Δανία) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34], σύμφωνα με τις ηθικές διαδικασίες και υπό την έγκριση από την επιτροπή δεοντολογίας του Erasmus Πειραματικό Κέντρο ζώων. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με διορθικό υπερηχογράφημα χρησιμοποιώντας μία προσαρμοσμένη ενδοαγγειακή σύστημα υπερήχων [35]. Σε μεγέθη όγκων μεταξύ 80 και 120 mg, δύο δόσεις (3 × 10

7 ή 1 × 10

8 pfu) του BV- [CMV-EGFP] χορηγήθηκαν στον όγκο υπό αναισθησία. Τα ζώα θυσιάστηκαν 3 ημέρες αργότερα, οι όγκοι συλλέχθηκαν, σταθερό για 2 ώρες σε 2% (w /v) παραφορμαλδεϋδη σε PBS, κομμένη σε ένα vibratome (Campden Instruments, Loughborough, UK) σε 70 μm πάχους τομές και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες σε Vectashield (Vector Lab). έκφραση EGFP οπτικοποιήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία (Carl Zeiss, Benelux).

Αξιολόγηση των βιωσιμότητος των κυττάρων δια Δοκιμασία MTS

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μια πλάκα 96 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για μία νύχτα. BV- [CMV-NTR-EGFP] προστέθηκε σε τριπλές εκβαθύνσεις σε ΜΟΙ = 500 για 4 ώρες, πλύθηκαν και επωάστηκαν για άλλες 20 ώρες πριν από την προσθήκη του CB1954 (20 μΜ για όλες βασικά δείγματα και κυτταρικές γραμμές εκτός από τα PC-3, για την οποία χρησιμοποιήθηκε 40 μΜ). Μετά από περαιτέρω 48 ώρες για κυτταρικές σειρές ή 30 ώρες για πρωτογενή κύτταρα, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το CellTiter 96® Υδατική Αντιδραστήριο Προσδιορισμού (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες και τα πιάτα του κατασκευαστή διαβάζεται χρησιμοποιώντας μία συσκευή ανάγνωσης πλάκας BMG Labtech Polarstar OPTIMA. Η αναλογία των νεκρών κυττάρων υπολογίστηκε με σύγκριση προς βιώσιμα κύτταρα σε ένα μη μεταδιηγερμένα καλά. Μια διπλή ομάδα φρεατίων χρησιμοποιήθηκαν για κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται παραπάνω για να προσδιοριστεί η συχνότητα των θετικά μετατραπέντα κύτταρα.

Αποτελέσματα

BV Transduction είναι η αποτελεσματικότερη σε κακοήθεις κυτταρικές γραμμές του προστάτη σε σύγκριση με μη κακοήθη Έλεγχοι

προκειμένου να καθοριστεί η ικανότητα του BV για τη μεταγωγή διαφορικά κακοήθεις έναντι μη κακοήθεις στόχους του προστάτη, αξιολογήσαμε την ευαισθησία ενός πάνελ καθιερωμένων κυτταρικών γραμμών ανθρώπινου προστάτη στην BV μεταγωγή. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ανασυνδυασμένο φορέα BV τροποποιηθεί για να φέρουν ένα διαγονίδιο EGFPCAT (BV- [CMV-EGFPCAT]) με τη χρήση ενός σταθερού ΜΟΙ 500 και ένα χρόνο επώασης 48 h. Κακοήθεις κυτταρικές σειρές με υψηλό μεταστατικό δυναμικό, συμπεριλαμβανομένων των LNCaP, PC3 και PC346C, ήταν ιδιαίτερα σε μεταγωγή (~ 80% EGFP-θετικά κύτταρα), ενώ μη-κακοήθεις κυτταρικές σειρές PNT1A και PNT2C2 ήταν τουλάχιστον σε μεταγωγή (μέχρι 10% EGFP-θετικά κύτταρα) (Σχήμα 1Α). P4E6, μια κυτταρική σειρά που προέρχεται από ένα αναληφθούν αλλά πρώιμο στάδιο του όγκου, ήταν στο ενδιάμεσο φάσμα, με περίπου 20% των κυττάρων EGFP θετικών (Σχήμα 1Α). Έτσι, η συχνότητα των κυττάρων θετικά μεταγωγή από BV συσχετίζονται με κακοήθεια και μεταστατικό δυναμικό.

(Α) Ποσοστό EGFP-θετικών κυττάρων μετά τη μεταγωγή μιας ομάδας υψηλού βαθμού κακοήθη (κόκκινο), χαμηλής ποιότητας κακοήθης (μαύρο ) ή μη-κακοήθη (κυτταρικές γραμμές μπλε) του προστάτη με BV- [CMV-EGFPCAT] σε ΜΟΙ = 500 για 48 ώρες. Οι μπάρες σφάλματος απεικονίζουν – /+ μία τυπική απόκλιση. (Β) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του EGFP εξής μεταγωγή με BV- [CMV-EGFPCAT] σε κορεσμό ΜΟΙ (500 για LNCaP, PC3 και PNT1A, 1000 για PNT2C2). Το ποσοστό των EGFP-θετικών κυττάρων κανονικοποιήθηκε με τα επίπεδα που επιτυγχάνονται μετά από 48 ώρες επώαση παρουσία του ιού για κάθε κυτταρικό τύπο (σετ προς 1). Κακοήθεις κυτταρικές σειρές: PC3 (▴), LNCaP (▪)? Μη-κακοήθεις κυτταρικές γραμμές: PNT2C2 (♦), PNT1A (▾). Οι μπάρες σφάλματος απεικονίζουν – /+ μία τυπική απόκλιση. (C) Ομοεστιακή εικόνες μικροσκοπίας (μόνο φέτα ή Z-stack) του BV-μετάγονται LNCaP, PC3 ή PNT1A κύτταρα σε 8 ώρες μετά την μεταγωγή (ΜΟΙ = 500). Κόκκινο φθορισμού δείχνει καψιδίου BV (αντι-vp39), πυρηνική χρώση με μπλε (DAPI) και BV με γνώμονα έκφρασης EGFP σε πράσινο.

Η

Για να διερευνηθούν οι βέλτιστες συνθήκες μεταγωγής για εξαιρετικά ευαίσθητα (LNCaP, PC- 3) έναντι PNT2C2) κυτταρικές σειρές προστάτη λιγότερο ευαίσθητα (PNT1A και, αναλύσαμε τόσο η ΜΟΙ απαιτείται για την επίτευξη κορεσμού μεταγωγή και την κινητική της μεταγωγής σε αυτό το ΜΟΙ. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα με την παρουσία αυξανόμενων δόσεων BV- [CMV-EGFPCAT], και η αναλογία των EGFP-θετικών κυττάρων αναλύθηκε μετά από 24 ώρες. Το ΜΟΙ που απαιτείται για να επιτευχθεί η μέγιστη συχνότητα των μετατραπέντων κυττάρων ήταν 500 pfu ανά κύτταρο για LNCaP, PC3 και PNT1A, και 1000 PFU ανά κύτταρο για PNT2C2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Χρησιμοποιώντας αυτές κορεσμού ΜΟΙ, η κινητική της μεταγωγής διερευνήθηκαν πάροδο του χρόνου. Κακοήθεις κυτταρικές σειρές προστάτη (LNCaP και PC-3) έδειξε την ταχεία και αποτελεσματική απορρόφηση των BV- [CMV-EGFPCAT], απαιτώντας μόνο μικρούς χρόνους επώασης (-45 ή -90 λεπτά, αντίστοιχα) για να φθάσει το 50% των επιπέδων που καταγράφονται στα 48 h (Σχήμα 1Β). Αντίστροφα, μη-κακοήθεις κυτταρικές σειρές προστάτη (PNT1A και PNT2C2) που απαιτούνται εκτεταμένους χρόνους επώασης (~ 10 h ή ~ 8 h, αντίστοιχα) για να επιτευχθεί το 50% των επιπέδων στις 48 ώρες (Εικόνα 1Β).

Ένας ερμηνεία αυτών των διαφορών στη μεταγωγή είναι ότι η πυρηνική εισαγωγή του καψιδίου BV είναι ελαττωματικό σε ορισμένους τύπους κυττάρων (επανεξετάζονται από [36]). Για να αξιολογηθεί αυτή η υπόθεση σε μοντέλα κυτταρική σειρά προστάτη μας, η υποκυτταρική εντόπιση της BV καψιδίων διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία σε 8 ώρες μετά την μεταγωγή στα ιδιαίτερα ευαίσθητες κυτταρικές σειρές κακοήθων LNCaP και PC-3 και λιγότερο ευπαθή μη-κακοήθη PNT1A κυτταρική σειρά . BV καψίδια παρατηρήθηκαν στον πυρήνα όλων των τριών τύπων κυττάρων (Σχήμα 1C), και οπτική ανάλυση των πολλαπλών οπτικών πεδίων δεν αποκάλυψε διαφορές στα επίπεδα του εντοπισμού πυρηνικών καψιδίου. Ωστόσο, PC-3 κύτταρα είχαν ένα υψηλότερο επίπεδο επιφάνεια δεσμευμένου BV, ενώ τα κύτταρα PNT1A είχε ένα υψηλότερο επίπεδο BV στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 1C).

Cells του Basal (Μη διαφοροποιημένα) Φαινότυπος μετάγονται ευκολότερα από αυλού (διαφοροποιημένες) κύτταρα στην πρωτοβάθμια προστάτη Τα επιθηλιακά πολιτισμών

για να επεκτείνει την αξιολόγησή μας της BV σε μια πιο βιολογικά σχετική κατάσταση, χρησιμοποιήσαμε πρωτογενείς καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη ασθενή βιοψία προέλευσης. Δεδομένου ότι το μεγαλύτερο μέρος των ανθρώπινων όγκων του προστάτη περιλαμβάνει κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης, τόσο με αδιαφοροποίητα (βασική) και καλά διαχωριζόμενες (αυλική) φαινοτύπους παρόν, προσδιορίσαμε αν BV ήταν ικανά να στοχεύουν και τις δύο επιθηλιακών κυτταρικών πληθυσμών σε διάφορα στάδια της διαφοροποίησης. επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη Πρωτοβάθμια προέρχεται από τρεις βιοψίες ασθενών όγκου (Gleason σκορ 6, 7 και 8/9) καλλιεργήθηκαν κάτω από δύο διαφορετικές συνθήκες: σε μέσο KSFMsup να διατηρεί τα κύτταρα σε μια βασική κατάσταση, ή σε μέσο DH10 για να προκαλέσει διαφοροποίηση, με βάση την εργασία από [37]. Αλλαγές στο καθεστώς διαφοροποίησης κάτω από αυτές τις ξεχωριστές συνθήκες καλλιέργειας επιβεβαιώθηκαν από ανοσοφθορισμού ανάλυση των κλασικών δεικτών διαφοροποίησης (βασική δείκτες: κερατίνες (CK) 1, 5, 10 και 14? Αυλού δείκτη: CK18), με βάση την εργασία από [38] (Συμπληρωματική Εικόνα 1). Σε μια βάση ανά-ασθενή, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε KSFMsup ή DH10 επωάστηκαν με BV- [CMV-EGFPCAT] για την αύξηση χρονικά διαστήματα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής στις 48 ώρες. Διαφοροποίησης επιθηλιακών μειωμένες συχνότητες μεταγωγής συνολικό όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με ιό για λιγότερο από 10 ώρες: για παράδειγμα, σε κύτταρα που προέρχονται από ένα Gleason 6 όγκου, τα κύτταρα το μέγιστο επίπεδο της μόλυνσης επιτεύχθηκε στα βασικά (KSFMsup) στους 4 h (45.33 ± 3.55 %) ήταν σημαντικά υψηλότερο από την κορυφή της λοίμωξης σε αυλού (DH10) κύτταρα (21,69 ± 1,78%) σε 8 ώρες (Εικόνα 2Α). Πάνω από μεγαλύτερες περιόδους BV επώασης, η διαφορά στα επίπεδα μεταγωγή μεταξύ KSFMsup- και DH10-καλλιεργημένα κύτταρα ήταν λιγότερο έντονες, αλλά παρέμεινε χαμηλότερη σε διαφοροποιημένα κυτταρικούς πληθυσμούς (DH10) (Σχήμα 2Α).

(Α) Ποσοστό EGFP-θετικών κυττάρων στις 48 ώρες μετά την μεταγωγή με Bv- [CMV-EGFPCAT] σε ΜΟΙ = 500 για την αύξηση της χρονικά διαστήματα σε τρία δείγματα πρωτογενούς κακοήθους επιθηλιακά προστάτη (Gleason 6, 7 ή 8/9), διατηρούνται σε βασική κατάσταση από πολιτισμό σε KSFMsup (▪), ή από καλλιέργεια στη διαφοροποίηση συνθήκες DH10 (▴). Οι μπάρες σφάλματος απεικονίζουν – /+ μία τυπική απόκλιση. (Β) Εντοπισμός BV κοψίδια στην πρωτοβάθμια επιθηλιακά κύτταρα από ένα Gleason 8/9 όγκου καλλιεργούνται σε δύο στρώσεων, είτε 1 ώρα ή 16 ώρες μετά την επώαση με Bv- [CMV-EGFPCAT] σε ΜΟΙ = 250. Κόκκινο φθορισμού δείχνει κοψίδια BV ανιχνεύεται με αντι-vp39, χρώση των πυρηνικών DAPI εμφανίζεται σε μπλε και BV με γνώμονα έκφρασης EGFP στο πράσινο. Ομοεστιακή εικόνες του άνω στρώματος των κυττάρων (αυλού-σαν? Σε μια μέση z-απόσταση 14,58 μm από το κοιλιακό θέση) και κατώτερη στιβάδα (βασικοκυτταρικό-σαν? Σε μια μέση z-απόσταση 6,47 μm από το κοιλιακό θέση) είναι απεικονίζεται. (C) Συχνότητα (ομαλοποιηθούν να κοροϊδεύει = 1%) ή μέση ένταση φθορισμού EGFP-θετικών κυττάρων πρωτογενή στρωματικά που προέρχονται από κακοήθη ή καλοήθη βιοψίες 24 ώρες μετά την μεταγωγή με Bv- [CMV-EGFPCAT] σε ΜΟΙ = 500.

για να διερευνήσει περαιτέρω την ταχεία μεταγωγή των βασικών επιθηλιακών κυττάρων με BV, χρησιμοποιήσαμε ένα

in vitro

κυτταρική διπλοστοιβάδα μοντέλο, το οποίο μιμείται την κυτταρική δομή του αδένα του προστάτη. Η διπλή στιβάδα περιελάμβανε ένα στρώμα συρροής των βασικών επιθηλιακών κυττάρων (CK1 /5/10/14 +) επικαλύπτονται με ένα ατελές ανώτερο στρώμα των κυττάρων με ένα περισσότερο διαφοροποιημένο, του αυλού φαινότυπο (CK18 +) [28], [38]. Πρωτογενή κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη που προέρχεται από ένα Gleason score 7 όγκων αφέθηκαν να σχηματίσουν μία διπλή στιβάδα, στη συνέχεια επωάστηκαν με BV- [CMV-EGFPCAT] για 1 ώρα ή 16 ώρες και κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. Μετά την επώαση με BV για 1 ώρα, καψίδια ιού οπτικοποιήθηκαν στη βασική στοιβάδα σε ένα μοτίβο διάστικτη χρώση, αλλά δεν παρατηρήθηκαν στο στρώμα του αυλού (Σχήμα 2Β). Μετά από μια μακρύτερη περίοδο επώασης (16 ώρες), καψίδια ιού ανιχνεύθηκαν σε τόσο τη βασική όσο και του αυλού στρώματα:. Ωστόσο, αξιοσημείωτη περιοχές στο στρώμα του αυλού παρέμεινε άνευ καψιδίων ιού (Σχήμα 2Β)

BV μπορεί γρήγορα και αποτελεσματικά μεταγωγή Primary προστάτη στρωματικά κύτταρα

τα επιθηλιακά και στρωματικά πληθυσμοί αντιπροσωπεύουν τις δύο κύρια κυτταρικά συστατικά των όγκων του προστάτη. Ενώ επιθηλιακά κύτταρα συνήθως περιλαμβάνουν το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμού των κακοηθών κυττάρων, έχουν τα στρωματικά κύτταρα έχουν εμπλακεί σε ένα αμοιβαίο βρόχο ανάδρασης που υποστηρίζει την ανάπτυξη και τη συντήρηση των κυττάρων του όγκου [39], [40]. Αυτό υποδηλώνει ότι η επιτυχής θεραπεία του καρκίνου του προστάτη θα πρέπει να περιλαμβάνει στοχευμένη εξάλειψη του διαμερίσματος στρωματικών κακοήθεια που σχετίζεται. Συνεπώς ερευνήσαμε την ικανότητα των BV για την μεταγωγή κυττάρων του στρωματικών προέλευσης. Στρωματικά κύτταρα που προέρχονται από κακοήθη ή μη κακοήθη βιοψίες πρωτογενούς προστάτη επωάστηκαν με BV- [CMV-EGFPCAT] για 1, 16 ή 24 ώρες και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Μετά από 1 ώρα, περίπου 30% των κυττάρων είχαν υποστεί μεταγωγή από την BV, ενώ μετά από 16 ώρες επώασης, κάθε κύτταρο στρωματικών θετικά σε μεταγωγή με BV (Σχήμα 2C). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στη συχνότητα των θετικά-μεταδιηγερμένα στρωματικά κύτταρα με βάση την κακοήθεια? Ωστόσο, σε μια βάση ανά κύτταρο, στρωματικά κύτταρα που προέρχονται από κακοήθη δείγματα βιοψίας προστάτη παρουσίασαν μεγαλύτερη μέση ένταση φθορισμού από εκείνα που προέρχονται από καλοήθη δείγματα βιοψίας σε πρώιμα χρονικά σημεία (Σχήμα 2C). Ως εκ τούτου, τα στρωματικά κύτταρα ήταν πολύ ευαίσθητα στην BV μεταγωγή.

BV μπορεί με επιτυχία την μεταγωγή 3-D προστάτη σφαιροειδή και ορθοτοπική Ξενομοσχεύματα

Έχει προταθεί ότι ένας αποτελεσματικός φορέας γονιδιακής θεραπείας πρέπει να είναι ικανό να διεισδύει μέσα διάφορα στρώματα κυττάρων, προκειμένου να επιτευχθεί μια κλινικά σχετική απόκριση στη θεραπεία των στερεών όγκων. Για να χαρακτηριστεί η ικανότητα των BV να μεταναστεύσει διαμέσου κυτταρικά στρώματα, χρησιμοποιήσαμε δύο

in vitro

και

in vivo

τρισδιάστατο καλλιέργειες. Για

in vitro

μοντελοποίηση, κοίλα σφαιροειδή των κακοήθων κυττάρων PC346C του προστάτη, η οποία περιελάμβανε ένα «κέλυφος» των 2-3 κυττάρων στρώματα και αυθόρμητα αποσπώνται από μονοστιβάδες κατά τη διάρκεια της ρουτίνας του πολιτισμού, επωάστηκαν με BV- [CMV-EGFP] . Στις 72 ώρες μετά την επώαση, παρατηρήθηκε ένα πολύ αποδοτικό πρότυπο της μεταγωγής των κυττάρων, με διείσδυση του BV μέσω όλων των στρωμάτων των κυττάρων (Εικόνα 3Α).

(Α) σφαιροειδή PC346C μετάγονται με Bv- [CMV-EGFP] (ή ψευδο σε μεταγωγή) σε 3 ημέρες μετά τη μόλυνση. όγκων (Β) PC346C συλλέγονται από ξενομοσχεύτηκε ποντίκια σε 3 ημέρες μετά τη μόλυνση με BV στα 3 × 10

7 (μία αντιπροσωπευτική εικόνα φαίνεται) ή 1 × 10

8 (δύο αντιπροσωπευτικές εικόνες φαίνεται) pfu ανά εμβολιασμό. Κόκκινο φθορισμού δείχνει πυρήνες των κυττάρων (Hoescht), ενώ BV με γνώμονα έκφρασης EGFP εμφανίζεται με πράσινο χρώμα. Τα βέλη δείχνουν τη θέση της εντός του όγκου ένεση BV.

Η

Για i

n vivo

μοντελοποίησης, μοντέλα ποντικών με καρκίνο του προστάτη ξενομοσχεύματος, που παράγεται μέσω ορθοτοπική ένεση του PC346C κυτταρική γραμμή στην dorsolateral προστάτη αθυμικά γυμνά ποντίκια, με ένεση εντός του όγκου ήταν με BV- [CMV-EGFP] σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις (3 χ 10

7 ή 1 × 10

8 pfu). Στις 72 ώρες, οι όγκοι ανατμήθηκαν και αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. BV παρατηρήθηκε να διεισδύσουν επιτυχώς εντός του όγκου, και μεταναστεύουν μακριά από την αρχική θέση της ένεσης. Αυτό ήταν ιδιαίτερα εμφανές μετά τη χορήγηση της υψηλότερης δόσης του ιού (Σχήμα 3Β). Έτσι, ακόμη και σε τρισδιάστατη πολιτισμούς, BV ήταν ικανή να επιτύχει ένα υψηλό επίπεδο της μεταγωγής των κυττάρων.

Τα κακοήθη κύτταρα του προστάτη μπορεί να Αποδοτικές θανατώνονται με BV Φορείς σε

GDEPT Προσέγγιση νιτρορεδουκτάση-based

προκειμένου να ελεγχθεί η ικανότητα των BV να επιτευχθεί ένα κύτταρο-θανατηφόρο έκβαση, χρησιμοποιήσαμε ένα γονίδιο-κατευθυνόμενη θεραπεία ενζύμου προ-φαρμάκου (GDEPT) προσέγγιση επικεντρώθηκε στην βακτηριακή

νιτρορεδουκτάση

(NTR), η οποία μετατρέπει την προ- φάρμακο CB1954 (5- (αζιριδιν-1-υλ) -2,4-δινιτροβενζαμίδιο) σε ένα παράγοντα διασυνδέσεως ισχυρός DNA [41]. Ως εκ τούτου, κατασκευάσαμε ένα BV φέρει μια κασέτα έκφρασης όπου ο ισχυρός υποκινητής CMV θηλαστικών οδήγησε έκφραση του mNTR-IRES-EGFP (BV- [CMV-NTR-EGFP]). Μια ομάδα από κακοήθεις και μη-κακοήθεις κυτταρικές σειρές προστάτη μετήχθησαν με BV- [CMV-NTR-EGFP], και η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε μετά από χορήγηση του προ-φαρμάκου, CB1954. Το ποσοστό των μη-βιώσιμων κυττάρων, όπως μετρήθηκε με δοκιμασία MTS μετά από 48 ώρες, ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κακοήθη δείγματα με υψηλό μεταστατικό δυναμικό (PC346C, PC3 και LNCaP) σε σύγκριση με μη-κακοήθεις δείγματα (PNT1A και PNT2C2) (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 4Α). Πρώιμα στάδια κακοήθους δείγματα (P4E6) έπεσε στο ενδιάμεσο φάσμα της βιωσιμότητας. Επιπλέον, η κυτταρική βιωσιμότητα μετά τη χορήγηση του προ-φαρμάκου είχε άμεση σχέση με το ρυθμό της BV μεταγωγή (Σχήμα 4Α). Αυτή η ανάλυση επεκτάθηκε σε καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων πρωτογενών που λαμβάνονται από ασθενή. Τρεις κακοήθη και δύο μη κακοήθη δείγματα μεταγωγή με BV- [CMV-NTR-EGFP] και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CB1954. Σε 30 ώρες μετά τη χορήγηση του προ-φαρμάκου, του κυτταρικού θανάτου σε αυτές τις καλλιέργειες κυμαινόταν από 10% έως 50%, ανεξάρτητα από την κατάσταση της νόσου (Εικόνα 4Β).

(Α) Ποσοστό μη βιώσιμα κύτταρα στις 48 ώρες μετά την μεταγωγή με BV- [CMV-NTR-EGFP] (ΜΟΙ = 500) και η θεραπεία με CB1954 σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών προστάτη, φαίνεται σε σχέση με τη συχνότητα των κυττάρων που έχουν υποστεί μεταγωγή και ρυθμίζεται για μη κατεργασμένους ελέγχους. Κακοήθεις κυτταρικές σειρές: PC346C (♦), PC3 (▴), LNCaP (▪), P4E6 (Χ)? Μη-κακοήθεις κυτταρικές σειρές: PNT1A (+), PNT2C2 (•). Στατιστικές αντιπροσωπεύουν t-test μεταξύ PC346C /PC-3 /LNCaP εναντίον PNT1A /PNT2C2. (Β) Ποσοστό μη βιώσιμα κύτταρα σε 30 ώρες μετά την μεταγωγή με BV- [CMV-NTR-EGFP] και κατεργασία με CB1954 σε μεμονωμένα δείγματα των επιθηλιακών κυττάρων πρωτογενούς προστάτη (η = 3 κακοήθεις και η = 2 μη κακοήθη), προσαρμοσμένο για το μη επεξεργασμένο ελέγχους.

η

Συζήτηση

Πολλαπλές μοντέλα της νόσου έχουν δείξει ότι baculovirus έχει μεγάλες δυνατότητες ως νέο φορέα για τη γονιδιακή θεραπεία. Εδώ, ερευνήσαμε χρησιμότητα της για την θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. BV ήταν σε θέση να αποτελεσματικά μεταγωγής μια σειρά από κύτταρα του προστάτη που προέρχονται από πολλές πηγές, συμπεριλαμβανομένων των

in vitro

και

in vivo

μοντέλα. BV απέδειξαν απόκλιση μεταγωγή των κακοήθων σε σύγκριση με μη κακοήθη κύτταρα του προστάτη, μια παρατήρηση που εμφανίστηκε ανεξάρτητα του ρυθμού ανάπτυξης, δεδομένου ότι οι κυτταρικές γραμμές εν λόγω παρουσίασαν παρόμοια πολλαπλασιαστική ικανότητες (χρόνοι διπλασιασμού: PNT2C2 (39 h), LNCaP (34 h) PC- 3 (30-34 h) και PNT1a (30 h) [26], [42], [43]). Αν και ένα πρωτογενές κυτταρικό υποδοχέα θηλαστικού για BV προσάρτηση παραμένει άγνωστος, εμείς εικάζουν ότι η κακοήθεια που σχετίζεται με προς τα πάνω ρύθμιση του θειικής ηπαράνης τροποποιημένων πρωτεογλυκάνες (HSPGs) στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων [44], [45], τα οποία είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην πρόσδεση BV [16], [46], παίζει ένα ρόλο σε αυτό το αποτέλεσμα.