Αφηρημένο

Ιστορικό

Έχει αποδειχθεί ότι η πρωτεΐνη σελήνιο δέσμευσης 1 (SBP1) είναι σημαντικά προς τα κάτω σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνους. ρύθμιση και η λειτουργία του δεν έχουν ακόμη καθοριστεί.

Μεθοδολογία και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Θα δείξουμε ότι ο προαγωγός SBP1 είναι υπερμεθυλίωση σε ιστούς του καρκίνου του παχέος εντέρου και ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Η θεραπεία με 5′-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη οδηγεί στην απομεθυλίωση του υποκινητή SBP1 και σε αύξηση της δραστηριότητας προαγωγού SBP1, διασώζει SBP1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Επιπλέον, η υπερέκφραση του SBP1 ευαισθητοποιεί κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου σε H

2O

2-επαγόμενη απόπτωση, αναστέλλει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων in vitro και αναστέλλει την ανάπτυξη όγκου σε γυμνά ποντίκια.

Συμπέρασμα και Σημασία

Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι SBP1 διαθέτει λειτουργίες ογκοκατασταλτικό που αναστέλλονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της επιγενετικής αποσιώπηση

Παράθεση:. Pohl NM, Tong C, Fang W, Bi Χ, Li Τ, Yang W (2009) Μεταγραφική κανονισμού και Βιολογικές Λειτουργίες των Σελήνιο-Binding Protein 1 στον Καρκίνο του παχέος εντέρου in vitro και in ξενομοσχεύματα γυμνού ποντικιού. PLoS ONE 4 (11): e7774. doi: 10.1371 /journal.pone.0007774

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 21 Ιουλίου του 2009? Αποδεκτές: 16 Οκτωβρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 16, Νοεμ του 2009

Copyright: © 2009 Pohl et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από την επιχορήγηση του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (CA112081) και το αμερικανικό Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο επιχορήγηση (05A121). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πρωτεΐνη που δεσμεύεται με σελήνιο 1 (SBP1) είναι μια πρωτεΐνη 56-KDa που εκφράζεται σε διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της καρδιάς, του ήπατος, των νεφρών, των πνευμόνων και του εντέρου. Ανθρώπινα SBP1 κλωνοποιήθηκε αρχικά το 1997 [1] και έχει προταθεί ότι μεσολαβεί η ενδοκυτταρική μεταφορά του σεληνίου [2]. SBP1 έχει επίσης προταθεί να χρησιμεύσει ως δείκτης σε κολονική κυτταρική διαφοροποίηση και πρόσφατα, SBP1 έχει δειχθεί ότι είναι ένας στόχος της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα-1 άλφα (HIF1α) [3] και να αλληλεπιδρούν άμεσα με νοη Hippel-Lindau πρωτεΐνη (pVHL), η οποία μπορεί να παίξει ρόλο στην οδό αποδόμησης του πρωτεασώματος κατά τρόπο που εξαρτάται από σελήνιο [4]. SBP1 έχει αποδειχθεί ότι είναι μειωμένη σε διάφορους επιθηλιακούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη [5], το στομάχι [6], οι ωοθήκες [7], τους πνεύμονες [8] και του παχέος εντέρου [9], [10]. Επιπλέον, χαμηλά επίπεδα έκφρασης του SBP1 σε καρκίνο του παχέος εντέρου συνδέθηκαν με φτωχή πρόγνωση [9], [10]. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν παρατηρηθεί σε πνεύμονα αδενοκαρκινώματα [8] και του υπεζωκότα μεσοθηλίωμα [11]. Με βάση αυτές τις μελέτες έχει προταθεί ότι SBP1 μπορεί να παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης και της εξέλιξης του καρκίνου. Ωστόσο, ο ρόλος των SBP1 σε αυτά τα μονοπάτια δεν έχει διευκρινιστεί.

επιγενετικές διαταραχές προκαλούν αδρανοποίηση των γονιδίων, οδηγώντας σε απώλεια της γονιδιακής έκφρασης και λειτουργίας. Δύο κοινά μηχανισμοί έχουν παρατηρηθεί: ιστόνης τροποποίηση και μεθυλίωσης του DNA. Το τελευταίο συμβαίνει σε υπολείμματα κυτοσίνης σε κυτοσίνης-γουανίνης αλληλουχίες (CpG). Η μεθυλίωση των CpG νησίδων σε υποκινητής είναι συχνά ένα πρώιμο συμβάν στην πρόοδο του όγκου και είναι ένας κοινός μηχανισμός γονιδιακής σίγησης σε καρκίνους, συμβαίνουν σε περισσότερο από το 60% των καταστολείς όγκων [12] – [14].

SBP1 έχει εντοπιστεί να έχουν 2 CpG νησίδες στην 5′-αμετάφραστη περιοχή του, ένα από τα οποία είναι αρκετά κοντά για να έχουν επιπτώσεις για τη ρύθμιση SBP1 υποκινητή (-402 έως -613). Συνεπώς, είναι πιθανό ότι ο υποκινητής SBP1, σε όγκους με χαμηλά επίπεδα έκφρασης του SBP1, μπορεί να μεθυλιωθεί. Πράγματι, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ο προαγωγός SBP1 είναι υπερμεθυλίωση σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου και σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά HCT116, αλλά ένα γενικό παράγοντα απομεθυλίωσης 5′-Aza-2′-δεοξυκυτιδίνη (ή 5′-αζα-Decitabine, DAC) αποκαθιστά SBP1 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης δι’απομεθυλιώσεως την περιοχή του υποκινητή SBP1 και αυξανόμενη δραστηριότητα υποκινητή SBP1. Εμείς επιπλέον παρέχει την πρώτη απόδειξη για να δείξει ότι SBP1 διαθέτει λειτουργίες κατά του καρκίνου – υπερέκφραση SBP1 στα κύτταρα HCT116 προκαλεί H

2O

2 μεσολάβηση απόπτωση, αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων

in vitro

και αναστέλλει όγκων ανάπτυξη σε γυμνά ποντίκια.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture, Human Colon Cancer ιστοί και Αντιδραστήρια

ανθρώπινου κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου HCT116 καλλιεργήθηκε σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10 % FBS, 1% anitbiotic-antimyocytic (GIBCO) και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές LS174T, Caco2, ΗΤ29 και SW480 διατηρήθηκαν σε Ελάχιστο Ουσιώδες Μέσο (ΜΕΜ) και διατηρούνται υπό τους ίδιους όρους όπως κύτταρα HCT116. Οι Ανθρώπινοι ιστοί καρκίνο του παχέος εντέρου και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς έχουν χρησιμοποιηθεί από το εργαστήριο μας πρόσφατα [10]. Για H

2O

2 θεραπεία, τα κύτταρα σε 80% συρροή υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0.3 mM H

2O

2 για 24 ώρες. Για μελέτες απομεθυλίωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 και 30 μΜ 5′-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (DAC) για 72 ή 96 ώρες (Sigma, St. Louis, ΜΟ).

πλασμίδια Κατασκευή

Ανθρώπινο SBP1 cDNA ενισχύθηκε και υποκλωνοποιήθηκε σε pIRES2 φορείς (Clontech, Mountain View, CA) (pIRES2-SBP1) χρησιμοποιώντας θέσεις ενζύμου περιορισμού XhoI και BamHI. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: προς τα εμπρός: 5′-ATCTCGAGCTATGGCTACGAAATGTGGGAAT-3 ‘και αντίστροφος: 5′-ATGGATCCTCAAATCCAGATGTCAGAGCTAC-3’. Για τη δημιουργία HA-SBP1 πλασμίδιο, ανθρώπινα SBP1 cDNA ενισχύθηκε και υποκλωνοποιήθηκε σε ΗΑ-tagged φορέα pcDNA3.1 (ρΗΑ) (Invitrogen, Carlsbad, CA) χρησιμοποιώντας θέσεις περιορισμού XbaI και XhoI. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: προς τα εμπρός: 5′-ATCTCGAGATGGCTAC GAAATGTGGGAATT-3 ‘και αντίστροφος: 5′-ATTCTAGATCAAATCCA GATGTCAGAGCTAC-3’. Για λουσιφεράση δοκιμασίες όλο το μήκος του υποκινητή SBP1 (-2.572 να + 1) (pGL4-SBP1) κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pGL4 (Promega Corporation, Madison, WI) με τη χρήση θέσεων περιορισμού ΧΗοΙ και HindIII. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: 5′-διαβιβάσει ATCTCGAGCCCATACATACCA AGCAA -3 ‘και αντίστροφη 5’-TCAAGCTTCGGGTTTGCTGTGCTGGTGTC-3. Ακρίβεια όλων των πλασμιδίων επιβεβαιώθηκε μέσω αλληλουχίας.

Η επιμόλυνση

Η παροδική επιμόλυνση των HCT116 κυττάρων με ρΗΑ-SBP1 ή φορέα ελέγχου ρΗΑ εκτελέστηκε μέσω Λιποφεκταμίνης 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). 24-48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υπόκεινται σε διαφορετικούς προσδιορισμούς. Για σταθερή επιμόλυνση, τα κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με pIRES2-SBP1 ή pIRES2 (κενός φορέας) μόνο μέσω Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα επελέγησαν με G418.

ανοσοαποτύπωσης

Για ανοσοστύπωση, κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την αγωγή. Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό 1xRIPA (Upstate Biotechnology, Lake Placid, ΝΥ) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma, St. Louis, ΜΟ). Μετά τη λύση των κυττάρων, 30 μα πρωτεΐνης φορτώθηκε σε 10% SDS γέλη ακολουθούμενη από μεταφορά σε μεμβράνη PVDF. Το μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι SBP1 αγοράστηκε από MBL

International Corporation (Watertown, ΜΑ? 1:1000)., Το αντίσωμα έναντι β-ακτίνης αγοράστηκε από (Sigma, St. Louis, ΜΟ? 1:10000). Δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA? 1:3000). Τα ανιχνευόμενα σήματα απεικονίστηκαν με ένα ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας αντίδραση, όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή (ECL-Plus, Amersham, Piscataway, NJ).

ειδική της μεθυλίωσης PCR (MS-PCR)

κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς DAC για 96 ώρες ακολουθούμενη από καθαρισμό του DNA (DNeasy, Qiagen, Valencia, CA). Το καθαρισμένο ϋΝΑ στη συνέχεια μετατρέπεται με τη χρήση της EZ-DNA bisulifide κιτ μετατροπής από Zymo Research (Orange, CA), το οποίο μετατρέπει τα υπολείμματα κυτοσίνης σε ουρακίλη, αλλά δεν επηρεάζει την 5-μεθυλκυτοσίνη, επιτρέποντας έτσι μία για τον εντοπισμό μεθυλιωμένες αλληλουχίες στο DNA με επακόλουθη MS -PCR. Για MS-PCR, μεθυλίωση και unmethylation ειδικούς εναρκτήρες (σχεδιασμένο από το λογισμικό αναγνώρισης μεθυλίωσης) [15] συμπληρωματική προς την CpG νησίδα που εκτείνεται -463 έως -673 του αμετάφραστη περιοχή 5 ‘χρησιμοποιήθηκαν. PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ίσες ποσότητες DNA και το iTaq

TM DNA ploymerase (Bio-Rad, Hercules, CA) υπό τις ακόλουθες συνθήκες: ενεργοποίηση αρχική πολυμεράση στους 95 ° C για 5 λεπτά, 95 ° C για 45 δευτερόλεπτα, 53 ° C (μεθυλιωμένο προϊόν) ή 50 ° C (μη μεθυλιωμένο προϊόν) για 45 δευτερόλεπτα που ακολουθείται από επιμήκυνση στους 72 ° C για 45 λεπτά. Μετά από 35 κύκλους, η αντίδραση επιπλέον επωάστηκε στους 72 ° C για 10 λεπτά. Το συνολικό προϊόν PCR ακολούθως σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Ακρίβεια προϊόντος προσδιορίστηκε μέσω προσδιορισμού αλληλουχίας.

Λουσιφεράσης Δοκιμασία

κύτταρα HCT116 επιμολύνθηκαν με ένα άδειο φορέα pGL4 ή pGL4-SBP1 πλασμίδιο το οποίο περιέχει τον υποκινητή πλήρους μήκους SBP1. Renilla συν-επιμολύνθηκαν ως ένας εσωτερικός έλεγχος. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS ή 5′-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη για 72 ώρες. Το κιτ δραστικότητα διπλής λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI) χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με ένα φωτόμετρο για τη μέτρηση της λουσιφεράσης δραστηριότητα των κατεργασμένων κυττάρων σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών.

Ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση και Μετανάστευσης Ανάλυση

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε με δοκιμασία MTS σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Για την ανίχνευση απόπτωσης, σταθερά επιμολυσμένα HCT116-SBP1 ή φορέα ελέγχου κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με αιθανόλη 70% που ακολουθείται από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Τα κύτταρα μετά μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACScan, BD Biosciences, San Jose, CA). Η μετανάστευση των κυττάρων ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας μία πλάκα transwell (Corning, Lowell, ΜΑ) ακολουθούμενο από χρώση ϋΑΡΙ.

Ξενομοσχεύματα

1 × 10

6 κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά pIRES2-SBP1 ή pIRES2 διάνυσμα χορηγήθηκαν με ένεση υποδορίως στο πλευρό του ΝΙΗ-III γυμνούς ποντικούς (

ΝΙΗ-Lyst

bgFoxn1

nuBtk

xid

) (Charles River Laboratory, Νέα Υόρκη) (5 ποντικοί ανά ομάδα). Τα ζώα διατηρήθηκαν σε εγκατάσταση φράγμα παθογόνο-ελεύθερο στο Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο Biological Laboratory Πόρων και παρακολουθείται στενά από το προσωπικό της εγκατάστασης των ζώων. Τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση, οι όγκοι απομονώθηκαν και το βάρος (gm) και όγκο (mm

3) της προσδιορίστηκαν όγκων. Ολικό RNA απομονώθηκε από τον όγκο, ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR διεξήχθησαν, όπως περιγράφεται στην πρόσφατη έκθεση μας [10], για να επικυρώσει SBP1 συστατική έκφραση στα ξενομοσχεύματα. Όλες οι διαδικασίες έγιναν σύμφωνα με την κατευθυντήρια γραμμή φροντίδας των ζώων και τη χρήση και εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο επιτροπής Animal Care.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

SBP1 Ανάδοχος ήταν ιδιαίτερα Methylated στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου Οι ιστοί

πρόσφατα αναφέρθηκε ότι SBP1 πρωτεΐνη και mRNA έκφραση μειώθηκε δραματικά σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου [10], καθώς και σε άλλους τύπους καρκίνου. Για να αποσαφηνιστεί η αιτία της μείωσης της γονιδιακής έκφρασης, απομονώσαμε στοχευμένες ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου και συμφωνημένα φυσιολογικό εντερικό βλεννογόνο από ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο με χαμηλή πρωτεΐνη και mRNA έκφραση ογκο-SBP1 [10] για την ανάλυση μεθυλίωσης SBP1 υποκινητή. Αναπάντεχα, βρήκαμε πράγματι ότι ο υποκινητής SBP1 ήταν υψηλότερη μεθυλιωμένα σε αυτούς τους όγκους συγκριτικά με φυσιολογικό γειτονικό βλεννογόνο τους (Εικ. 1Α). Αν και οι υψηλότερους όγκους δείγματος προκειμένου να δηλώσουν τα αποτελέσματα αυτά, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν σαφώς ότι η μεθυλίωση προαγωγού SBP1 μπορεί να είναι ένας από τους μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την προς τα κάτω ρύθμιση SBP1 σε ανθρώπινους καρκίνους του κόλου.

Α, SBP1 προαγωγού υψηλά μεθυλιωμένη στο ανθρώπινο κόλον καρκινικούς ιστούς. Γονιδιωματικό DNA από γειτονικό φυσιολογικό (Ν) και το αδενοκαρκίνωμα (Τ) ιστός απομονώθηκε, μετετράπη και ενισχύθηκαν για ανθρώπινη υποκινητή SBP1 χρησιμοποιώντας MS-PCR. # Ενδείκνυται διαφορετικούς ασθενείς. Μη μεθυλιωμένα (U) και μεθυλιωμένα (Μ) ανιχνεύτηκαν ζώνες με διαχωρισμό του DNA σε πηκτώματα αγαρόζης 2% με βρωμιούχο αιθίδιο. Β, ανάλυση Western blotting έδειξε διάφορες έκφραση SBP1 σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές? HCT116 κυττάρων με σταθερή επιμόλυνση του SBP1 υπερεκφράζουν πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. C, SBP1 προαγωγός υπερμεθυλίωση στα κύτταρα HCT116. Γονιδιωματικό DNA από LS174T, HCT116, SW480, Caco-2 και ΗΤ-29 κόλον καρκινικά κύτταρα απομονώθηκε, μετετράπη και ενισχύεται μέσω του MS-PCR για ανθρώπινο προαγωγέα SBP1 ακολουθούμενη από διαχωρισμό γέλης των συνολικών DNA σε πηκτώματα αγαρόζης 2% (U, μη μεθυλιωμένο DNA ? Μ, μεθυλιωμένο DNA). D, DAC αντιστραφεί μεθυλίωση υποστηρικτής SBP1 στα κύτταρα HCT116. DNA από κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με 30 μΜ του DAC για 96 ώρες απομονώθηκε και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2% μετά από μετατροπή και MS-PCR. Ε, δοκιμασία λουσιφεράσης έδειξαν ότι DAC αυξημένη δραστικότητα λουσιφεράσης υποκινητή SBP1 των κυττάρων HCT116 με επιμόλυνση ενός φορέα που περιέχει το πλήρες μήκος του υποκινητή SBP1 και με μια θεραπεία 30 μΜ DAC ή PBS για 72 ώρες. διάνυσμα pGL4 και Renilla συν-επιμολύνθηκε ως έλεγχοι (* ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με PBS). F, DAC αποκαθίστανται SBP1 έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα HCT116 με θεραπεία DAC για 72 ώρες, αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Γ SBP1 mRNA αποκαταστάθηκε με DAC σε κύτταρα HCT116 (* ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με PBS). Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον 3 φορές.

Η

SBP1 προαγωγός υπερμεθυλίωση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου

Για την επικύρωση της μεθυλίωσης υποστηρικτής SBP1 και την έκφραση του γονιδίου SBP1, ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου ήταν χρησιμοποιούνται. Πρώτον, βρήκαμε διάφορα επίπεδα πρωτεΐνης SBP1 σε αρκετές κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν με κηλίδωση Western (Εικ. 1Β). Στη συνέχεια επιλέχθηκαν αρχικά δύο κυτταρικές σειρές για ανάλυση μεθυλίωσης: κύτταρα LST174T που έχουν υψηλότερο επίπεδο SBP1 και HCT116 κύτταρα τα οποία έχουν μη ανιχνεύσιμο έκφραση της πρωτεΐνης SBP1. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Γ, SBP1 προαγωγός ήταν ιδιαίτερα μεθυλιωμένα σε κύτταρα HCT116, ενώ ήταν ως επί το πλείστον μη μεθυλιωμένη σε κύτταρα LS174T. Μετέπειτα ανάλυση αλληλουχίας του αποκόπηκε μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων ζώνες επιβεβαίωσε ακρίβεια του προτύπου μεθυλίωσης παρατηρείται σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές και δεν προέκυψαν εμφανείς μεταλλάξεις στην περιοχή του υποκινητή του SBP1. Εξετάσαμε επίσης SBP1 κατάσταση μεθυλίωσης προαγωγού σε SW480, Caco-2 και ΗΤ-29 κύτταρα, τα οποία έχουν χαμηλή, μέτρια και υψηλά επίπεδα έκφρασης του SBP1 πρωτεΐνης, αντίστοιχα (Εικ. 1Β). Συνεπής με την έκφραση SBP1 πρωτεΐνης, ο υποκινητής SBP1 ήταν ιδιαίτερα μεθυλιωμένα σε κύτταρα SW480, μετρίως μεθυλιωμένη σε κύτταρα Caco-2 και μεθυλιωμένα σε μικρότερο βαθμό σε κύτταρα ΗΤ-29 (Εικ. 1 C). Είμαστε δίπλα επεξεργασμένα κύτταρα HCT116 με το γενικό παράγοντα απομεθυλίωσης 5′-Aza-2′-δεοξυκυτιδίνη για να καθοριστεί αν η υπερμεθυλιωμένων υποστηρικτής SBP1 θα μπορούσε να απομεθυλιωθεί. Βρήκαμε ότι η επεξεργασία των κυττάρων HCT116 με 30 μΜ του DAC για 96 ώρες μειώθηκε μεθυλίωση προαγωγού SBP1 και αυξημένη unmethylation SBP1 υποκινητή, σε σύγκριση με τον μάρτυρα PBS αγωγή (Σχ. 1D). Αυτό υποδηλώνει ότι ο προαγωγός SBP1 ρυθμίζεται μέσω μεθυλίωσης του εγγύς νησί CpG και ότι η υπερμεθυλίωση προαγωγού σιωπές έκφραση SBP1 σε HCT116 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα.

SBP1 υποστηρικτής απομεθυλίωση Αυξημένη SBP1 Ανάδοχος Δραστηριότητα και Έσωσαν Έκφραση SBP1

τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ο υποκινητής SBP1 είναι υπερμεθυλίωση και ότι ο παράγοντας απομεθυλίωσης DAC θα μπορούσε να αναστρέψει αυτή την περίπτωση. Επομένως, είναι σημαντικό να διευκρινιστεί αν απομεθυλίωση υποκινητής θα μπορούσαν στη συνέχεια να αυξήσει τη δραστηριότητα SBP1 προαγωγού και SBP1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης. Πρώτον, επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 με λουσιφεράση πλασμίδιο που περιέχει την περιοχή υποκινητή πλήρους SBP1 μήκους (pGL4-SBP1) και κατεργάζεται τα κύτταρα με 30 μΜ ΕΑΒ για 72 ώρες για να ελέγξετε αν η δραστηριότητα αυξάνει τη θεραπεία της ΕΑΒ υποστηρικτής, και διαπίστωσε ότι ΕΑΒ πράγματι αυξήθηκε υποστηρικτής SBP1 δραστηριότητα κατά 3 φορές (σχ. 1 Ε). Σταθερά, HCT116 κύτταρα επεξεργασμένα με διαφορετικές συγκεντρώσεις του DAC έδειξαν αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης SBP1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1 F). Επιπλέον, η θεραπεία της ΕΑΒ αυξημένα επίπεδα SBP1 mRNA κατά 50 πτυχώσεις για τη θεραπεία 72 ώρες και 89 πτυχώσεις για 96 ώρες θεραπείας σε κύτταρα HCT116 (Εικ. 1G). Αν και άλλοι μηχανισμοί για τη ρύθμιση των SBP1 δεν μπορεί να αποκλειστεί, αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι η έκφραση SBP1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου είναι σιγήσει εν μέρει από μεθυλίωση προαγωγού της και ότι η έκφραση SBP1 μπορεί να διασωθεί από απομεθυλίωση την περιοχή προαγωγού.

SBP1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αυξάνει απόπτωση και αναστέλλει τον κυτταρικό μετανάστευση

SBP1 έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται στην ενδοκυτταρική μεταφορά του σεληνίου [2] και να χρησιμεύσει ως δείκτης σε κολικό κυτταρική διαφοροποίηση [10]. SBP1 έχει επίσης αποδειχθεί ότι είναι μειωμένη σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνους. Ωστόσο, οι λειτουργίες του σε καρκίνους που δεν έχουν ακόμη οριστεί. Συνεπώς, θέλαμε να προσδιορίσει τις λειτουργίες SBP1 μπορεί να έχουν σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου είναι ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Για να εξεταστεί εάν θα μπορούσαν να επηρεάσουν SBP1 τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τα κύτταρα HCT116 που υπερεκφράζουν SBP1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις H

2O

2 και κυτταρικός πολλαπλασιασμός αναλύθηκε μέσω προσδιορισμού MTS (Promega, Madison, WI). Αν και η θεραπεία των κυττάρων με 0,2 mM H

2O

2 ίδια πολλαπλασιασμό ανέστειλε κυττάρων σε κύτταρα HCT116, μπορεί να εκτιμηθεί ότι SBP1 υπερέκφραση ευαισθητοποιημένα κύτταρα HCT116 να H

2O

2-επαγόμενη αναστολή ανάπτυξης σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (& lt? 0,2 mM), υποδεικνύοντας ότι SBP1 θα μπορούσαν να παίξουν ένα ρόλο στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (σχήμα 2Α).. FACS ανάλυση έδειξε ότι SBP1 υπερέκφραση οδήγησε σε αύξηση του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου (κλάσμα υπο-G1) όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με H

2O

2 (Σχ. 2Β). Επιπλέον, η υπερέκφραση του SBP1 σε κύτταρα HCT116 ανέστειλε ανθρώπινου κόλου μετανάστευση καρκινικών κυττάρων (Σχ. 2C). Αυτά τα πειράματα υποδεικνύουν ότι μπορεί να έχει SBP1 ορισμένες λειτουργίες κατασταλτική του όγκου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Α, κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με ΗΑ-SBP1 είχαν αυξημένη ευαισθησία σε H2O2 από δοκιμασία πολλαπλασιασμού MTS σε σύγκριση με τον κενό φορέα (ΗΑ) . Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Η2Ο2 για 24 ώρες. Β, κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με ΗΑ-SBP1 αυξημένη Η2Ο2-επαγόμενη απόπτωση με ανάλυση κυτομετρίας ροής. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0.3 mM του H

2O

2 για 24 ώρες. Κουτιά δείχνουν αποπτωτικών κυττάρων (sub-G1). C, SBP1 ανέστειλε τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων: κυττάρων μετανάστευση SBP1 κυττάρων που υπερεκφράζουν HCT116 και τα κύτταρα ΗΑ-ελέγχου αξιολογήθηκε μέσω επικοινωνούντα δοχεία. Μετανάστευσαν κύτταρα ανιχνεύθηκαν με χρώση DAPI.

Η

SBP1 εξασθενημένα καρκίνο του παχέος εντέρου ανάπτυξη των κυττάρων σε άτριχα ποντίκια ΝΙΗ-III

Για να ελέγξετε εάν SBP1 έχει δραστηριότητες αντι-όγκου

in vivo

, εκτελέσαμε πειράματα ξενομοσχεύματος σε ΝΙΗ-ΙΙΙ γυμνά ποντίκια χρησιμοποιώντας κύτταρα HCT116 που είτε σταθερώς υπερεκφράζουν SBP1 (pIRES2-SBP1) ή έναν φορέα ελέγχου (pIRES2). Τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων, οι όγκοι απομονώθηκαν και τον όγκο του όγκου και του βάρους προσδιορίστηκε. SBP1 έκφραση σε εξαχθέντα καρκινώματα που προέρχονται από κύτταρα που υπερεκφράζουν SBP1 HCT116 επιβεβαιώθηκε μέσω RT-PCR δείχνει 607-πλάσια αύξηση στο επίπεδο του mRNA. Συνεπής με

in vitro

δεδομένα, τα ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα που υπερεκφράζουν SBP1 HCT116 είχαν σημαντικά μικρότερο όγκο του όγκου (Σχ. 3Α) και το βάρος του όγκου (Σχ. 3Β) από ό, τι τα ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι SBP1 έχει όγκου κατασταλτικά λειτουργίες

in vivo

επίσης.

ΝΙΗ-III γυμνοί ποντικοί εγχύθηκαν με κύτταρα HCT116 που εκφράζουν σταθερά SBP1 (pIRES2-SBP1) ή φορέα (pIRES2) έλεγχος. Τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση, προσδιορίστηκε ο όγκος του όγκου (Α) και το βάρος του όγκου (Β).

Η

Στο σύνολό παραπάνω, παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι SBP1 προαγωγός υπερμεθυλίωση στο ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου, και ότι η απομεθυλίωση μέσω DAC αυξάνει τη δραστηριότητα υποκινητή SBP1 καθώς διάσωση mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης (Εικ. 1). Γονιδιακή σίγηση είναι ένας κοινός μηχανισμός που βρέθηκαν σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους να αναστέλλουν την έκφραση καταστολέα όγκων. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι ο υποκινητής SBP1 είναι εξαιρετικά μεθυλιωμένο σε ιστούς όγκων των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, υποδεικνύοντας ότι η έκφραση SBP1 στον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι εν μέρει ελέγχεται μέσω γονιδιακή σίγηση. Είναι κρίσιμης σημασίας να διερευνήσει κατά πόσον γονίδιο SBP1 σίγηση είναι ένας κοινός μηχανισμός για τη μείωση της έκφρασης SBP1 σε άλλους τύπους καρκίνου στις οποίες SBP1 έχει δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω. Επιπλέον, λόγω της μειωμένης έκφρασης SBP1 σε ανθρώπινους καρκίνους, SBP1 έχει προταθεί να έχει τις δραστηριότητες κατασταλτική του όγκου. Πιστεύουμε ότι είμαστε οι πρώτοι που παρέχει αποδεικτικά στοιχεία ότι αυτό μπορεί πράγματι να είναι αλήθεια, από την άποψη του ότι η υπερέκφραση της SBP1 στα κύτταρα HCT116 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αυξημένη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και μειωμένη κυτταρική μετανάστευση

in vitro

(Εικ . 2), και η ανάπτυξη του όγκου αναστέλλεται

in vivo

(Εικ. 3). Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί ρύθμισης SBP1 και τη δράση κατά του καρκίνου παραμένουν άγνωστες και χρειάζονται περαιτέρω έρευνα. Στην πραγματικότητα, αυτή τη στιγμή διερευνάται στο εργαστήριο μας. Η κατανόηση της ρύθμισης και των μηχανισμών της SBP1 λειτουργίες ογκοκατασταλτικών θα έχει μεγάλο αντίκτυπο στην αποκάλυψη του μοριακού μηχανισμού της καρκινογένεσης και στην ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών χημειοπροφύλαξη και χημειοθεραπείες για ανθρώπινη κακοήθη νοσήματα.