Αφηρημένο

Η παρούσα μελέτη εξέτασε κατά πόσον ο συνδυασμός μετφορμίνης και ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) θα δείχνουν ενισχυμένη επιδράσεις κατά του όγκου σε ραδιοανθεκτικά ρ53 ανεπάρκεια ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα, με έμφαση στην οδούς επιδιόρθωσης για IR προκαλούμενη βλάβη του DNA. Η μετφορμίνη προκάλεσε μεγαλύτερη μείωση στην κλωνογονική επιβίωση, καθώς και μεγαλύτερη ραδιοευαισθητοποίηση και την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου της ρ53

– /- από της ρ53

+ /+ ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα και ξενομοσχεύματα. Η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR επαγόμενη συσσώρευση των καρκινικών κυττάρων στο G2 /M φάση και καθυστέρησαν την επισκευή του IR-επαγόμενης βλάβης του DNA. Επιπλέον, αυτός ο συνδυασμός μείωσε σημαντικά τα επίπεδα του ρ53 που σχετίζονται με ομόλογο ανασυνδυασμό (HR) επισκευή σε σύγκριση με IR και μόνο, ειδικά σε ρ53

– /- καρκίνο του παχέος εντέρου και κυττάρων όγκων. Εν κατακλείδι, η μετφορμίνη ενισχυμένη ραδιοευαισθησία επάγοντας G2 /M σύλληψης και μειώνοντας την έκφραση των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA, ακόμη και σε ραδιοανθεκτικά HCT116 ρ53

– /- με ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα και όγκους. Η μελέτη μας παρέχει μια επιστημονική λογική για την κλινική χρήση της μετφορμίνης ως ραδιοευαισθητοποιητής σε ασθενείς με ορθοκολικό όγκους p53-ανεπαρκή, οι οποίες συχνά είναι ανθεκτικοί στην ακτινοθεραπεία

Παράθεση:. Jeong YK, Kim MS, Lee JY, Κιμ EH , Ha Η (2015) μετφορμίνη Radiosensitizes ρ53-ελλειπή κύτταρα ορθοκολικού καρκίνου μέσω της επαγωγής της G2 /M σύλληψης και αναστολή των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA. PLoS ONE 10 (11): e0143596. doi: 10.1371 /journal.pone.0143596

Επιμέλεια: Kerstin Borgmann, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 3, Απρίλη του 2015? Αποδεκτές: 6 Νοεμ 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 Νοέμβρη του 2015

Copyright: © 2015 Jeong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το έργο υποστηρίχθηκε από το ακόλουθο κείμενο: 1. MSK: επιχορήγησης (50.541 – 2.014) από το Υπουργείο Επιστημών, των ΤΠΕ και μελλοντικό σχεδιασμό, τη Δημοκρατία της Κορέας (http: //www.msip.go.kr)? και 2. HH: επιχορηγήσεις Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών (2012R1A2A1A0300692) που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας της Κορέας. (https://www.nrf.re.kr)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ακτινοθεραπεία χρησιμοποιείται ευρέως για την οριστική και επικουρική θεραπεία πολλών μορφών καρκίνου [1]. Ωστόσο, η αντίσταση στην ακτινοθεραπεία εξακολουθεί να αποτελεί σημαντικό μέλημα [2]. Διάφοροι παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων ρ53 μετάλλαξη [3], η υπερέκφραση των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA [4-6], και μικροπεριβάλλον του όγκου [7, 8] έχουν προταθεί να παίζουν ρόλους στην ραδιοαντοχή. Μεταξύ των ραδιο-ανθεκτικών παραγόντων, μετάλλαξη ρ53 θεωρείται ως καλός υποψήφιος για δείκτες ραδιοαντοχή [9].

ογκοκατασταλτικό παράγοντα p53, η οποία παίζει έναν κεντρικό ρόλο στις κυτταρικές αποκρίσεις σε βλάβες του DNA, προωθεί την επιβίωση των κυττάρων (σε κύτταρα διακοπή κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA, και autophagy) σε χαμηλά επίπεδα βλάβης του DNA, ενώ επάγει κυτταρικό θάνατο σε υψηλά επίπεδα. Η μετάλλαξη της ρ53 εμφανίζεται σε περισσότερο από το 50% των ανθρώπινων καρκίνων, η οποία αυξάνει σημαντικά την κυτταρική αντίσταση σε γ ακτινοβολία [10]. Επιπλέον, η μετάλλαξη ρ53 συσχετίζεται με υψηλά επίπεδα πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA, συμπεριλαμβανομένων Rad51, το οποίο παίζει καθοριστικό ρόλο στην οδό επιδιόρθωσης του DNA ομόλογου ανασυνδυασμού (HR). Επιπλέον, Rad51 είναι επάνω ρυθμισμένη σε πολλές μορφές καρκίνου, ειδικά υψηλής ποιότητας όγκων ραδιοανθεκτικά [11]. Το οδού επιδιόρθωσης HR διαμορφώνεται από ρ53 προκαλούμενη μεταγραφική καταστολή του

Rad51

γονιδίου και κατάργηση του πολυμερισμού Rad51 στο DNA [12]. Για το λόγο αυτό, ραδιοαντοχή συσχετίζεται με την υπερέκφραση του Rad51 [13], ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του αυξάνει αντιστρόφως ραδιοευαισθησία [14]. Ως εκ τούτου, μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της ακτινοθεραπείας σε ασθενείς με καρκίνους ρ53 μεταλλαγμένη είναι η ανακάλυψη και η χρήση των αναστολέων επιδιόρθωσης του DNA ως ραδιοευαισθητοποιητές.

Η μετφορμίνη, ένα από του στόματος διγουανίδιο αντι-υπεργλυκαιμικό παράγοντα, ενισχύει φέρεται απαντήσεις σε ακτινοβολία ενεργοποιώντας αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ) -αδενοσίνη μονοφωσφορική κινάση (ΑΜΡΚ) -ρ53 /ρ21

Cip1, η οποία οδηγεί σε απόπτωση και αναστολή των κλωνογόνων επιβίωσης [15, 16], σε ορισμένους καρκίνους. Επιπλέον, ο συνδυασμός μετφορμίνης και ιονίζουσας ακτινοβολίας (IR) ενίσχυσε τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του IR σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές ηπατώματος, η οποία εμπόδισε τη G2 /M φάση και μειωμένη επιδιόρθωση του DNA με τη μείωση τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) παραγωγή [17]. Είναι ενδιαφέρον, Buzzai

et al

. [18] ανέφεραν ότι η μετφορμίνη επιλεκτικά εξασθενημένη κυτταρική ανάπτυξη σε κύτταρα όγκου ρ53-ανεπαρκή με αναστολή αυτοφαγία, αλλά ενεργοποιούνται αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα άγριου τύπου ρ53. Επιπλέον, διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι η μετφορμίνη αυξάνει ραδιοευαισθησία σε ρ53-μεταλλαγμένο ή ρ53 καρκινικά κύτταρα άγριου τύπου. Μελέτες έχουν επίσης αναφερθεί ότι η μετφορμίνη ενίσχυσε την ραδιοευαισθησία του p53-μεταλλαγμένο [19] και ρ53 καρκινικά κύτταρα άγριου τύπου. Επιπλέον, μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η μετφορμίνη προκάλεσε μία μέτρια ακτινοπροστασίας [20]. Ωστόσο, δεν υπάρχει σαφής κατανόηση των διαφορικών αποτελεσμάτων της μετφορμίνης σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία σε ρ53-ελλειπή και p53 καρκίνος άγριου τύπου κύτταρα.

Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη διερεύνησε κατά πόσο η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR θα ενισχύσει τα αποτελέσματα κατά του όγκου σε ραδιοανθεκτικά ρ53 ανεπάρκεια ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Επιπλέον, εστιάσαμε σχετικά με την πιθανή εμπλοκή των οδών επισκευής για IR που προκαλείται από βλάβη του DNA. Πιστεύουμε ότι τα δεδομένα μας μπορεί να συμβάλει στην παροχή επιστημονικής σκεπτικό για την κλινική χρήση της μετφορμίνης ως ραδιοευαισθητοποιητής στο ακτινοανθεκτικά καρκίνους.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Η μετφορμίνη (1- (diaminomethylidene) -3, 3-dimethylguanidine), κρυσταλλικό ιώδες, και ιωδιούχο προπίδιο ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich Chemical Corp., (St. Louis, ΜΟ, USA). Anti-Rad51, αντι-RAD52, ομάδα επισκευή αντι-εκτομή εγκάρσιας συμπληρώσεως 1 (ERCC1), κατά του καρκίνου του μαστού 2, πρώιμη έναρξη (BRCA2), και αντι-φωσφορυλιωμένες-ιστόνης Η3 (Ser10) αντισωμάτων αγοράστηκαν από Abcam (Cambridge , MA, USA). Αντι-μειωτικό ανασυνδυασμό 11 (MRE11), αντι-Rad50, αντι-p95 /Nijmegen θραύση σύνδρομο πρωτεΐνη 1 (NBS1), αντι-BRCA1, αντι-cyclinB1, αντι-φωσφο- κυτταρική διαίρεση πρωτεΐνη κύκλου 2 ομόλογο (cdc2, Tyr15), και αντι-φωσφο οδοφράγματος κινάση 2 (Chk2, Thr68) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA). Anti-p53, αντι-Chk2, αντι

β

ακτίνη, και υπεροξειδάση (HRP) αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού IgG αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, ΗΠΑ). Αντι Η2Α οικογένεια των ιστονών, μέλος Χ (H2AX, Ser139) που παρέχονται από την Millipore (Billerica, ΜΑ, USA). Alexa Fluor 488 αντι-ποντικού κατσίκας IgG (H + L) και Alexa Fluor 594 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (H + L) δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). μέσο στερέωσης φθορισμός λήφθηκε από Dako (Glostrup, Δανία). Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 μέσο, ​​ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και αντιβιοτικά (πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη) ελήφθησαν από την Lonza (Walkersville, MD, USA).

Κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

HCT116 p53

+ /+ ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα ελήφθησαν από την κορεατική Γραμμή Τράπεζας κυττάρων (Σεούλ, Νότια Κορέα) και HCT116 p53

– /- ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα ευγενώς από τον Dr. B. Vogelstein του Πανεπιστημίου Johns Hopkins. HCT116 ρ53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη και επωάστηκαν σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C.

η ακτινοβολία

Για

in vitro

πειράματα, τα κύτταρα ακτινοβολούνται με μια πηγή

137Cs γ-ray (Ατομικής Ενέργειας Canada, Ltd., Chalk River, Ontario, Canada) σε ρυθμό δόσης 2.67 Ογ /λεπτό. Για

in vivo πειράματα

, τα ποντίκια ακτινοβολήθηκαν χρησιμοποιώντας μια πηγή

60Co γ-ray (Theratron 780, Atomic Energy of Canada, Chalk River, Ontario, Canada) με μία εφ ‘άπαξ διάμετρο 0,5 cm από ιστό ισοδύναμο υλικό να καταστεί δυνατή η συσσώρευση δόσης. Μια μολύβδου φράγμα χρησιμοποιήθηκε για να θωρακίσει φυσιολογικούς ιστούς όπου είναι δυνατόν.

Υδατοδιαλυτό τετραζολίου (WST-1) δοκιμασία

Για την δοκιμασία κυτταροτοξικότητας, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλαστικά καλλιέργεια πλάκες 96 φρεατίων σε μια πυκνότητα 1 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο. Η μετφορμίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις (0-10 mM) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες ακολουθούμενη από την εφαρμογή του υδατο-διαλυτού τετραζολίου (WST) -1 αντιδραστήριο δοκιμασία κυτταροτοξικότητας (Roche Diagnostics, Laval, Quebec, Canada) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με προσδιορισμό της Α450 nm του μέσου κυτταρικής καλλιέργειας μετά την προσθήκη του WST-1 για 2 ώρες. Τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως ποσοστό της οπτικής πυκνότητας των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου, η οποία ορίζεται ως 100% βιωσιμότητα των κυττάρων. Ποσοστό κυτταροτοξικότητας υπολογίστηκε ως εξής: (1-Aexp /Acon) × 100? όπου Aexp και Acontrol είναι οι τιμές απορρόφησης των πειραματικών φαρμάκων επεξεργασία και έλεγχο των Ηνωμένων Εθνών-επεξεργασμένα κύτταρα, αντίστοιχα.

Κλωνογόνος

δοκιμασία

HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα επεξεργάστηκαν με μετφορμίνη σε 1-10 mM για 48 ώρες ή 2.5 mM για 24 ώρες που ακολουθείται από IR, και στη συνέχεια επωάστηκαν περαιτέρω για 24 ώρες. Η κλωνογονική δοκιμασία στη συνέχεια διεξάγεται όπως περιγράφεται προηγουμένως [17].

ξενομοσχεύματα όγκου σε αθυμικούς ποντικούς

αθυμικούς Balb /c γυμνά ποντίκια (4-εβδομάδων αρσενικοί) ελήφθησαν από Nara Biotech Co . (Σεούλ, Κορέα) και διατηρήθηκε σε θάλαμο νηματικής ροής αέρα κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων. HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- ξενομοσχεύματος μοντέλα ποντικών καθορίστηκαν με υποδόριο εμβολιασμό των 3 × 10

6 HCT116 p53

+ /+ ή p53

– /- κύτταρα σε το δεξί πίσω πόδι. Μετά την εμφύτευση του όγκου, θα παρακολουθείται η κατάσταση των ζώων μία φορά την ημέρα και παρασκευάζονται αναλγητικά για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία των ζώων. Όταν ο όγκος έφτασε σε όγκο περίπου 100 mm

3, οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (η = 5), συμπεριλαμβανομένων (α) ελέγχου, (β) μετφορμίνη, (γ) IR, και (δ) συνδυασμός των μετφορμίνη και IR. Οι ομάδες μετφορμίνη φάρμακο (b και d) ενέθηκαν (ενδοπεριτοναϊκά) μία φορά την ημέρα με 250 mg /kg.

Όταν ο όγκος του όγκου της ομάδας ελέγχου επιτυγχάνονται 200 ​​mm

3, ο IR επεξεργασμένο ομάδες (C και d) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα μόνο 5 Gy κλάσμα των τοπικών-περιφερειακών ακτινοβολία χρησιμοποιώντας ένα

60Co ακτινοβολίας. Ο όγκος του όγκου (V) υπολογίστηκε με τον κανονικό τύπο: V (mm

3) = π /6 × (μικρότερη διάμετρο)

2 × (μεγαλύτερης διαμέτρου). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με διοξείδιο του άνθρακα (CO

2) εισπνοής, όταν ο μέσος όγκος του όγκου της ομάδας ελέγχου ήταν 1.000 mm

3.

κυτταρικού κύκλου ανάλυσης

Μετά τη μετφορμίνη (2,5 mM) έκθεση για 24 ώρες, τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν, επωάστηκαν για 24 ώρες ή 48 ώρες, συλλέχθηκαν, υπέστησαν χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (1 mg /ml) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACScan κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Ένα ελάχιστο 10000 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε ανάλυση δείγματος και δεδομένων έγινε χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest.

ανοσοφθορισμού

χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη για να προσδιοριστεί η πυρηνική διανομή των γ-Η2ΑΧ και Rad51 σε HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα χρησιμοποιώντας ανάλυση εικόνας στις τρεις (πράσινο κόκκινο /μπλε /) κανάλια φθορισμού. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε θαλαμωτές πλάκες 1 ημέρα πριν την ακτινοβολία ή μετφορμίνη θεραπείες. Μετά μετφορμίνη (2,5 mM) έκθεση για 24 ώρες, τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν και επωάστηκαν για 1 ώρα ή 24 ώρες. Όλες οι θεραπείες διεξήχθησαν ενώ τα κύτταρα παρέμειναν συνδέονται με τις διαφάνειες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν (4% παραφορμαλδεϋδη σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, PBS, 10 λεπτά), κατέστησαν διαπερατά (0,5% Triton Χ-100 σε PBS, 10 λεπτά), και επωάστηκαν με ρυθμιστικό μπλοκαρίσματος (4% FBS σε PBS, 1 h) και έπειτα επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C ή για περισσότερο από 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με πρωτεύοντα αντισώματα (1: 100 το καθένα, αντι-γ-Η2ΑΧ και αντι-Rad51), τότε, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι, με τα κατάλληλα ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -σημασμένου δευτερογενή αντισώματα (1: 500 έκαστο) συμπεριλαμβανομένων Alexa Fluor 488 αντι-ποντικού κατσίκας IgG (H + L) για γ-Η2ΑΧ (πράσινο) και Alexa Fluor 594 αντι-κουνελιού αιγός IgG (H + L) για Rad51 (κόκκινο). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε), και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης φθορισμού. Οι πλάκες Τέλος, εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ένα φακό Carl Zeiss LSM 510 μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ και εικόνες συνελήφθησαν με την κατηγορία σε συνδυασμό κάμερα της συσκευής. Για την ποσοτική ανάλυση, γ-Η2ΑΧ ή Rad51 εστίες-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν σε τουλάχιστον 100 κύτταρα από τυχαία ληφθείσες εικόνες.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα ή ιστούς όγκων λύθηκαν με μία δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης ( RIPA) ρυθμιστικό διάλυμα και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS) πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες στυπώματα φράχθηκαν με 5% (ν /ν) αποβουτυρωμένο γάλα σε PBS με 0,1% Tween 20, επωάζονται με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα (1: 1000) και δευτερογενή αντισώματα (1: 1000), και στη συνέχεια να αναπτυχθεί χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια δυτική κηλίδωση υπόστρωμα (Pierce, Rockford, IL, USA) χρησιμοποιώντας το ImageQuant LAS-4000 mini (GE, Fairfield, CT, USA). Η ένταση του σήματος των ζωνών μετρήθηκε με το πρόγραμμα ImageJ (National Institutes of Health, ΝΙΗ, Bethesda, MD, USA).

Ανοσοϊστοχημεία

για ανοσοϊστοχημική ανάλυση, 4-μm τομών ιστού όγκου από-παραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν διαδοχικά σε μία σειρά από διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις αιθανόλης. Για να μειωθεί η μη ειδική χρώση υποβάθρου λόγω ενδογενούς υπεροξειδάσης, τα πλακίδια μπλοκαρίστηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου επί 10 λεπτά, και πλένεται τέσσερις φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα. Η ERCC1 (1:50) και Rad51 (1: 200) πρωτογενή αντισώματα εφαρμόστηκαν στις πλάκες των ιστών, τα οποία επωάστηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών, και στη συνέχεια πλένονται τέσσερις φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα. Τα πλακίδια επωάστηκαν με ενισχυτή πρωτογενές αντίσωμα για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και πλένεται τέσσερις φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα. Στη συνέχεια, το πολυμερές HRP εφαρμόσθηκε στα πλακίδια και το χρώμα αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα Zymed διαμινοβενζιδίνη (DAB) (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA, USA) που ακολουθείται από αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη. Οι ιστολογικές βαθμολογίες για έκφραση Rad51 και ERCC1 προσδιορίσθηκαν χρησιμοποιώντας δύο ανεξάρτητες μεθόδους:. Ποσοστό θετικών κυττάρων χρώσης και την ένταση της έκφρασης

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια παραμετρική επαναλαμβάνεται μέτρο μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από Tukey ειλικρινής σημαντική διαφορά (HSD) δοκιμή με τη χρήση του στατιστικού πακέτου για τις κοινωνικές επιστήμες (SPSS) λογισμικού (έκδοση 18.0, Chicago, IL, USA ). Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο επίπεδο του

σ

& lt? 0.05.

Ηθική δήλωση

Όλα τα πρωτόκολλα μελέτη σε ζώα και μελέτες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) της Κορέας Ινστιτούτο ραδιολογικής και Ιατρικών Επιστημών (KIRAMS 2013-57) .

Αποτελέσματα

μετφορμίνη διαφορικά μειώθηκε p53-ανεπαρκή και άγριου τύπου επιβίωση κλωνογόνων κυττάρων

Για να αξιολογηθεί η μετφορμίνη-p53-εξαρτώμενη κλωνογονικότητας και κυτταροτοξικότητα σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, εκθέσαμε HCT116 ρ53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα σε διάφορες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. Η μετφορμίνη σε 1, 2,5, 5, και 10 mM έδειξαν 86,7 ± 5,9, 73,2 ± 3,8, 45,5 ± 1,1, και 26,8 ± 2,7% κλωνογονική ποσοστά επιβίωσης για HCT116 ρ53

+ /+ κυττάρων, και 77,2 ± 6,9, 35,5 ± 3.6, 13.1 ± 2.1, και 2.3 ± 0.9% για HCT116 p53

– /- κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 1Α). Κλωνογόνο επιβίωση των HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα διέφεραν σημαντικά σε συγκεντρώσεις μετφορμίνης 2,5-10 mM (

σ

& lt? 0.001), και HCT116 p53

– /- κύτταρα πιο ευαίσθητα στη μετφορμίνη που προκαλείται κλωνογονικού κυτταρικό θάνατο από HCT116 p53

+ /+ κύτταρα. Ωστόσο, η μετφορμίνη δεν είχε σημαντική ή απόκλιση κυτταροτοξικότητα έναντι αμφοτέρων των κυτταρικών σειρών (σχήμα 1Β)

HCT116 ρ53

+ /+ και p53

-. /- Κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1-10 mM μετφορμίνη για 48 ώρες, καλλιεργούνται και χρησιμοποιούνται στο (Α) κλωνογόνο και (Β) WST-1 (κυτταρική βιωσιμότητα) δοκιμασίες? *

σ

& lt? 0,001 για HCT116 p53

+ /+ κύτταρα,

†

σ

& lt? 0,001 για HCT116 p53

– /- κύτταρα.

§

σ

& lt? 0.001, μεταξύ HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα, σε σύγκριση με τον έλεγχο. WST, υδατοδιαλυτό τετραζόλιο.

Η

Η μετφορμίνη που προκαλείται υψηλότερη ραδιοευαισθητοποίηση σε p53-ανεπαρκή από τα κύτταρα άγριου τύπου ρ53

Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα ραδιοευαισθητοποίησης της μετφορμίνης, HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα καρκίνου έλαβαν θεραπεία για 24 ώρες με 2.5 mM που ακολουθείται από IR, και στη συνέχεια απομακρύνεται 24 ώρες μετά την IR. Τα επιζώντα κλάσματα μετά από έκθεση σε μια δόση ακτινοβολίας 2 Gy (SF2) προσδιορίστηκαν να είναι 0,24 και 0,20 για HCT116 ρ53

+ /+ κύτταρα (Σχ 2Α) και 0.58 και 0.43 για HCT116 ρ53

– /- κύτταρα ( Σχήμα 2Β), μετά από θεραπεία με ακτινοβολία μόνο και μετφορμίνη συν ακτινοβολία, αντιστοίχως. Ο συνδυασμός μετφορμίνης και IR αξιοσημείωτα μειωμένη κλωνογονική επιβίωση σε σύγκριση με IR μόνη της σε HCT116 ρ53

– /- (

ρ

& lt? 0,01), αλλά όχι p53

+ /+ κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ραδιοευαισθητοποίηση ήταν υψηλότερη σε HCT116 p53

– /-. σε σχέση με το p53

+ /+ κύτταρα

ραδιοευαισθησία του (Α) HCT116 p53

+ /+ και (Β) p53

– /- κυττάρων με και χωρίς έκθεση σε μετφορμίνη (2,5 mM) μετά από διάφορες δόσεις ακτινοβολίας

60Co γ-ray μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κλωνογονική δοκιμασία. HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- ξενομοσχεύτηκε ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες συμπεριλαμβανομένου και του ελέγχου (Con), μετφορμίνη (Met), ιονίζουσα ακτινοβολία (IR), και ο συνδυασμός μετφορμίνης και IR (Met + IR). Γραφήματα δείχνουν τον όγκο του όγκου σε (C) HCT116 p53

+ /+ και (Δ) p53

– /- ξενομόσχευμα μοντέλο? *

σ

& lt? 0.05.

Η

Η μετφορμίνη ανάπτυξη ανέστειλε όγκου σε p53-ανεπαρκή ξενομοσχευμάτων

Για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της μετφορμίνης σε p53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη ανάπτυξη του όγκου, χρησιμοποιήσαμε σε συνδυασμό ισογονιδιακές ανθρώπινου παχέος ρ53 HCT116

+ /+ και p53

– /- τα καρκινικά κύτταρα. Όταν ο μέσος όρος του όγκου του όγκου της ομάδας ελέγχου επιτυγχάνεται περίπου 1.000 mm

3, οι ξενομοσχεύματα του όγκου του όγκου σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με μετφορμίνη, IR, και ένας συνδυασμός των δύο ήταν 4,5 ± 0,2, 48,3 ± 6,1, και 59,0 ± 5,0% μικρότερο, αντίστοιχα, από εκείνη των ελέγχων στα περίπου 1.000 mm

3 για HCT116 ρ53

+ /+ όγκους (Σχήμα 2C) και 26,5 ± 1,1, 22,8 ± 2,9, και 44,3 ± 5,5%, αντίστοιχα για HCT116 p53

– /- όγκοι (Σχήμα 2D)

Η ανάπτυξη της ρ53 HCT116 ελέγχου

-. /- ξενομοσχεύματα ήταν σημαντικά ταχύτερη από αυτή του p53 HCT116

+ /+ ξενομοσχεύματα ήταν (

σ

& lt? 0,05). Η συνδυασμένη θεραπεία με μετφορμίνη και IR ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και των δύο μοντέλων ξενομοσχεύματος περισσότερο από IR θεραπεία μόνη της έκανε (

ρ

& lt? 0,05). Επιπλέον, η μετφορμίνη ενισχυμένη αντικαρκινική δράση σε p53

– /- (

σ

& lt? 0.05), αλλά όχι p53

+ /+ ξενομοσχεύματα ενώ IR μόνος σημαντικά κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε p53

+ /+ ξενομοσχεύματα (

σ

& lt? 0,05).

μετφορμίνη παρατεταμένη IR-επαγόμενη G2 /M σύλληψης του παχέος κύτταρα p53-ανεπαρκή σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου ρ53

Για να προσδιοριστεί εάν η μετφορμίνη επηρεάζονται συσσώρευση του κυτταρικού κύκλου IR-επάγεται στη φάση G2 /M και η αναλογία του G2 κύτταρα φάσης /M που σχετίζεται με την παρουσία ή απουσία ρ53, αναλύσαμε την κατανομή του κυτταρικού κύκλου φάση του HCT116 ρ53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα. Η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR αύξησε σημαντικά το ποσοστό των G2 κύτταρα φάσης /M σε σύγκριση με IR μόνη της σε HCT116 ρ53

– /- (

ρ

& lt? 0.001), αλλά όχι p53

+ /+ κυττάρων (Σχήμα 3Α και 3Β)

HCT116 ρ53

+ /+ και p53

-. /- κύτταρα προκατεργάστηκαν με 2.5 mM μετφορμίνη για 24 ώρες, και στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 6 Gy. κυτταρικού κύκλου μετράται με κυτταρομετρία ροής (Α) 24 και (Β) 48 ώρες μετά την IR. (Γ) έκφραση του G2 /M ρυθμιστές οδοφράγματος συμπεριλαμβανομένων κυκλίνης Β1, φωσφορυλιωμένη cdc2 (Tyr15), φωσφορυλιωμένη ιστόνη Η3 (Ser10), και φωσφορυλιωμένη Chk2 (Thr68) μετρήθηκαν με τη χρήση ανοσοκηλιδώσεως σε HCT116 ρ53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Πυκνομετρική ποσοτικοποίηση ομαλοποιήθηκε στο

β

ακτίνης. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± SEM. από τρία πειράματα, *

σ

& lt? 0.001. IR, ιονίζουσα ακτινοβολία

Η

Για να επιβεβαιώσετε τη συσσώρευση φάση G2 /M, τα επίπεδα έκφρασης των G2 /M ρυθμιστές σημείο ελέγχου, όπως η κυκλίνη Β1, φωσφορυλιωμένη cdc2 (Tyr15), φωσφορυλιωμένη ιστόνης Η3 (Ser10), και φωσφορυλιωμένη Chk2 (Thr68) εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοστύπωση. Ο συνδυασμός μετφορμίνης και IR αύξησε σημαντικά την έκφραση του φωσφορυλιωμένη cdc2 (Tyr15) σε σύγκριση με IR μόνη της σε HCT116 p53

– /- αλλά όχι p53

+ /+ κύτταρα (

σ

& lt? 0,05 ). Επιπλέον, η μετφορμίνη συν IR αύξησε σημαντικά την έκφραση της φωσφορυλιωμένη ιστόνης Η3 (Ser10) και φωσφορυλιωμένη Chk2 (Thr68) σε σύγκριση με IR μόνη της σε HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα. Επιπλέον, η έκφραση του φωσφορυλιωμένου Η3 ιστόνης (Ser10) και φωσφορυλιωμένου Chk2 (Thr68) στην μετφορμίνη συν IR ομάδα αυξήθηκε σημαντικά σε HCT116 ρ53

– /- σε σύγκριση με την ρ53

+ /+ κύτταρα (

σ

& lt? 0.001, Σχ 3C). Συνοπτικά, αποδείξαμε ότι η μετφορμίνη εμπόδισε την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου με παράταση σημαντικά IR επαγόμενη G2 /M συλλήψεως HCT116 ρ53

– /-. Κύτταρα

μετφορμίνη καθυστερημένη επισκευή του IR-επαγόμενης βλάβης του DNA σε ρ53- ελλειμματικά κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα άγριου τύπου ρ53

Αναλύουμε την επίδραση της μετφορμίνης στην κινητική της βλάβης του DNA και επισκευής αξιολογώντας την χρώση ανοσοφθορισμού για γ-Η2ΑΧ, ενός δείκτη για βλάβες του DNA? Rad51, ένας δείκτης της επιδιόρθωσης του DNA? και DAPI-βάφονται πυρηνικό DNA χρησιμοποιώντας ανάλυση εικόνας στις τρεις (πράσινο κόκκινο /μπλε /) κανάλια φθορισμού. Η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR και IR μόνος εμφάνισαν γ-H2AX εστίες σε 6 ώρες μετά IR ενώ η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR διατήρησαν το εστιών γ-Η2ΑΧ για έως και 24 ώρες μετά την IR. Επιπλέον, αυτή η επίδραση ήταν μεγαλύτερη σε HCT116 p53

– /- σε σχέση με το p53

+ /+

κύτταρα (

σ

& lt? 0.001). Ωστόσο, 6 και 24 ώρες μετά την IR, μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR έδειξαν μια σημαντική μείωση στην εστίες Rad51 σύγκριση με IR και μόνο, η οποία έδειξε μια αύξηση στην εστίες Rad51. (Σχήμα 4Α και 4Β). HCT116 p53

– /- κύτταρα πιο ευαίσθητα στη μετφορμίνη από HCT116 p53

+ /+ κύτταρα (

σ

& lt? 0.001). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο συνδυασμός μετφορμίνης και IR καθυστέρησε την επισκευή του IR-επαγόμενης βλάβης του DNA περισσότερο σε HCT116 ρ53

– /-. Σε σχέση με το ρ53

+ /+

κύτταρα

HCT116 ρ53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα προκατεργάστηκαν με 2.5 mM μετφορμίνη για 24 ώρες, και στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 6 Gy. (Α) χρώση ανοσοφθορισμού στις 6 και 24 ώρες μετά την IR, έδειξε γ-Η2ΑΧ, ένα δείκτη για βλάβες του DNA? Rad51, ένας δείκτης της επιδιόρθωσης του DNA? και το πυρηνικό DNA βάφονται με DAPI χρησιμοποιώντας ανάλυση εικόνας στα κανάλια τρεις (/κόκκινο /μπλε πράσινο) φθορισμό. (Β) Για την ποσοτική ανάλυση, γ-Η2ΑΧ ή Rad51 εστίες-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν σε τουλάχιστον 100 κύτταρα από τυχαία ληφθείσες εικόνες. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± S.E.M, *

σ

& lt? 0.001. IR, ιονίζουσα ακτινοβολία? γ-H2AX, γ-Η2Α οικογένεια των ιστονών, μέλος X.

Η

Η μετφορμίνη ενισχυμένη ακτινοευαισθησία με τη μείωση των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA

in vitro

και

in vivo

Η

Για να διερευνήσουν κατά πόσον η μετφορμίνη επηρεάζονται μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA

in vitro

, εξετάσαμε την έκφραση των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης HR p53 που σχετίζονται με συμπεριλαμβανομένης της MRE11-Rad50-P95 /NBS1 συγκρότημα, το BRCA1, BRCA2, Rad51, RAD52, και ERCC1 σε HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα χρησιμοποιώντας ανοσοαποτύπωση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR σημαντικά μειωμένη MRE11, BRCA2, Rad51 και ERCC1 τα επίπεδα πρωτεΐνης σε σύγκριση με IR μόνη της σε HCT116 ρ53

+ /+ και ιδιαίτερα ρ53

– /- κύτταρα (

p

& lt? 0,01). Επιπλέον, η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR μείωσε σημαντικά την έκφραση του Rad50 και BRCA1 σύγκριση με IR μόνη της σε HCT116 ρ53

– /- αλλά όχι p53

+ /+ κύτταρα (

ρ

& lt? 0,01). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε HCT116 ρ53

– /- κύτταρα, IR μόνα σημαντικά αυξημένη BRCA1 και πρωτεΐνη Rad51 επίπεδα σε σύγκριση με τον μάρτυρα (

ρ

& lt? 0,01), ενώ η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR μείωσε σημαντικά την έκφραση του BRCA1 και Rad51 σε σύγκριση με IR μόνο (

σ

& lt? 0,01)

HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 2.5 mM μετφορμίνη για 24 ώρες. , και στη συνέχεια ακτινοβολούνται με 6 Gy. Κύτταρα από τις δύο ομάδες ανοσοστυπώθηκαν με ρ53 που σχετίζονται με πρωτεΐνες επιδιόρθωσης HR όπως MRE11-Rad50-p95 /NBS1 συγκρότημα, BRCA1, BRCA2, Rad51, RAD52, και ERCC1 24 ώρες μετά την ιονίζουσα ακτινοβολία (IR). Πυκνομετρική ποσοτικοποίηση ομαλοποιήθηκε στο

β

ακτίνης. ΥΕ, ομόλογος ανασυνδυασμός? MRE11, μειωτικού ανασυνδυασμού 11? NBSI, Nijmegen θραύση σύνδρομο πρωτεΐνη 1? BRCA, ο καρκίνος του μαστού πρώιμη έναρξη? ERCC 1, επισκευής εκτομή cross-συμπλήρωση ομάδα 1.

Η

Στη συνέχεια, θα αξιολογηθεί κατά πόσον η μετφορμίνη επηρεάζονται μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA

in vivo από

ανοσοϊστοχημικά την εξέταση της έκφρασης των Rad51 και ERCC1 σε δείγματα όγκων . Rad51 και πρωτεΐνη ERCC1 επίπεδα του p53 HCT116

– /- οι όγκοι της ομάδας ελέγχου ήταν υψηλή, αλλά ήταν κάτω από τα όρια ανίχνευσης για την p53 όγκους

+ /+ ομάδα ελέγχου. Η έκφραση του IR-επαγόμενης Rad51 και ERCC1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε HCT116 ρ53

– /- όγκους σε σύγκριση με την ρ53

+ /+ όγκους ενώ η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR μείωσε σημαντικά τα επίπεδα πρωτεΐνης του Rad51 και ERCC1 σε HCT116 ρ53

– /- σε σύγκριση με το p53

+ /+ όγκους (

σ

& lt? 0.05, Σχήμα 6Α και 6Β). Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε την έκφραση της Rad51 και ERCC1 με ανοσοαποτύπωση δείγματα όγκων από το

in vivo

μελέτη. Η έκφραση IR που προκαλείται Rad51 και ERCC1 ήταν πιο σημαντικά αυξημένη σε HCT116 p53

– /- σε σχέση με το p53

+ /+ όγκους (

σ

& lt? 0.05, Σχήμα 6C). Επιπλέον, η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR μείωσε σημαντικά την έκφραση της Rad51 σε HCT116 p53

– /- όγκοι (

σ

& lt? 0,05) σε επίπεδα συγκρίσιμα με εκείνα της p53

+ /+ όγκους ( Σχήμα 6C). Συνοπτικά, αποδείξαμε ότι η μετφορμίνη ενισχυμένη ραδιοευαισθησία του όγκου με τη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης επιδιόρθωσης του DNA, ιδιαίτερα σε HCT116 ρ53

– /-. Κυττάρων και όγκων

In vivo

, επιβεβαίωση των (Α ) Rad51 και (Β) έκφραση ERCC1 σε HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- καρκινικών ιστών που αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία και γραφήματα δείχνουν ιστολογική βαθμολογία για κάθε ομάδα. (C) σε ιστούς όγκων λύθηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με Rad51 και ERCC1. Πυκνομετρική ποσοτικοποίηση ομαλοποιήθηκε στο

β

ακτίνης. Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± S.E.M, *

σ

& lt? 0.05.

Η

Συζήτηση

Μετάλλαξη του παράγοντα καταστολής όγκου ρ53 παίζει σημαντικό ρόλο στην ραδιοαντοχή των καρκινικών κυττάρων [9]. Περισσότερο από το 50% όλων των καρκίνων έχουν λείπει ή είναι κατεστραμμένο γονίδιο p53 και, ως εκ τούτου, έχουν την τάση να γίνει ιδιαίτερα ανθεκτικά στην ακτινοβολία. Επιπλέον, η μετάλλαξη ρ53 συσχετίζεται με υψηλά επίπεδα πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA [10]. Μεταξύ των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA, p53 σχετίζεται με HR με μεταγραφική καταστολή του

Rad51

γονιδίων και την κατάργηση του πολυμερισμού Rad51 στο DNA [12]. Πρόσφατα, η κυτταροτοξική [21-23] και ραδιοευαισθητοποίησης [16, 17, 24, 25] επιδράσεις της μετφορμίνης αναφέρθηκαν σε διάφορα καρκινικά κύτταρα χωρίς να λαμβάνεται υπόψη το καθεστώς ρ53. Ωστόσο, Buzzai

et al

. [18] έδειξε ότι η μετφορμίνη επιλεκτικά εξασθενημένη ρ53

– /- κυττάρων απουσία γλυκόζης ή σε ένα στερεό μικροπεριβάλλον του όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την ικανότητα της μετφορμίνης για την ενίσχυση IR επαγόμενη αποτελέσματα ενάντια στα ραδιοανθεκτικά ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα p53-ανεπαρκή, εστιάζοντας τις οδούς επιδιόρθωσης για IR προκαλούμενη βλάβη του DNA.

Αρχικά, επιβεβαιώσαμε ότι HCT116 p53

– /- ξενομοσχεύματα όχι μόνο αυξήθηκε με ταχύτερο ρυθμό, αλλά και ήταν ακτινοανθεκτικά και πιο ευαίσθητα στη μετφορμίνη από p53

+ /+ ξενομοσχεύματα ήταν. Η μετφορμίνη ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και ξεπερνιέται ραδιοαντοχή σε HCT116 p53

– /- ξενομοσχεύματα. Ενώ προκαλείται από μετφορμίνη εξαρτάται από τη συγκέντρωση κυτταροτοξικότητα και στα δύο HCT116 p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα, αυτή η επίδραση ήταν μεγαλύτερη σε p53

– /- σε σχέση με το p53

+ /+ κύτταρα. προηγούμενη μελέτη μας [24] έδειξε ότι η προκαλούμενη μετφορμίνη απόπτωση σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, αλλά όχι σε φυσιολογικά ηπατοκύτταρα

Στη συνέχεια, μελετήσαμε τους μηχανισμούς ραδιοευαισθητοποίηση της μετφορμίνης σε HCT116 p53

+ /+ και p53

. – /- κύτταρα και ξενομοσχεύματα. Η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι επάγει κυτταροτοξικότητα των κυττάρων ηπατώματος άνω IR μόνος έκανε, με αναστολή επιδιόρθωση του DNA, η οποία διαμεσολαβείται από την συσσώρευση των κυττάρων στο G2 του κυτταρικού κύκλου /Μ φάση και την εξαφάνιση της έκφρασης γ-Η2ΑΧ [17] . Τα παρόντα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR απέτρεψε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με παράταση σημαντικά IR επαγόμενη G2 /M σύλληψης, και επάγεται μεγαλύτερη βλάβη του DNA σε σχέση με IR και μόνο έκανε. Ειδικότερα, η HCT116 ρ53

– /- κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα στη μετφορμίνη από HCT116 ρ53

+ /+ κύτταρα ήταν, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μετφορμίνη καθυστέρησε την επισκευή του IR-επαγόμενης βλάβης του DNA σε HCT116 ρ53

– /- κύτταρα. Συνεπώς, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μετφορμίνη επαγόμενη ραδιοευαισθητοποίηση μπορεί να σχετίζεται με βλάβες στο DNA και επιδιόρθωση οδούς.

Ο όγκος πρωτεΐνη καταστολέας ρ53 ρυθμίζει την έκφραση των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA και πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει ότι οι πρωτεΐνες επιδιόρθωσης του DNA όπως Rad51 [26, 27] και ERCC1 [28] ήταν πολύ δραστική σε καρκινικά κύτταρα τα οποία στερούνται τη λειτουργική πρωτεΐνη ρ53, αλλά λιγότερο δραστικές σε φυσιολογικά κύτταρα και καρκινικές κυτταρικές σειρές με άθικτη λειτουργία ρ53. Σε

in vivo

μελέτες μας, η έκφραση της Rad51 και ERCC1 σε βασικά επίπεδα και μετά από IR ήταν σημαντικά υψηλότερα σε p53

– /- ό, τι ήταν στο p53

+ /+ όγκους (Σχήμα 6 ), η οποία βρίσκεται σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [26-28]. Η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR μείωσε σημαντικά τα επίπεδα πρωτεΐνης του Rad51 και ERCC1 σε ρ53

– /- οι όγκοι σε επίπεδα τα οποία ήταν συγκρίσιμα με αυτά της ρ53

+ /+ όγκους. Επιπλέον,

in vitro

μελέτες μας έδειξαν ότι ο συνδυασμός μετφορμίνης και IR μείωσε σημαντικά την έκφραση του p53-πρωτεϊνών που σχετίζονται με την επισκευή HR όπως MRE11, Rad50, BRCA1, BRCA2, Rad51 και ERCC1 σε σύγκριση με IR μόνη της σε HCT116 p53

+ /+ και ιδιαίτερα p53

– /- κύτταρα. επίπεδα Επιπλέον, IR και μόνο αύξησε σημαντικά BRCA1 και πρωτεΐνη Rad51 σε σύγκριση με έλεγχο στην HCT116 p53

– /- κύτταρα, ενώ η μετφορμίνη σε συνδυασμό με IR μειώθηκε σημαντικά την έκφραση των γονιδίων BRCA1 και Rad51 σε σύγκριση με IR μόνη της σε HCT116 p53

– /- κύτταρα. Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μετφορμίνη ενισχύει ραδιοευαισθησία σε ρ53

– /- κυττάρων και όγκων, τα οποία εκφράζεται υψηλά BRCA1, Rad51, ή πρωτεΐνη ERCC1 στον έλεγχο και μετά από αγωγή IR με μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA.