Αφηρημένο

CDA-2 (διαφοροποίηση παράγοντας κυττάρων 2), ένα ουροποιητικού προετοιμασία, έχει ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστικές και προ-αποπτωτικών ιδιότητες στα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, οι μηχανισμοί της ανασταλτικής δράσης του όγκου του CDA-2 δεν είναι καθόλου σαφές, και ειδικότερα δεν υπήρχε έκθεση για τον καρκίνο του πνεύμονα. Εδώ αποδεικνύουμε ότι CDA-2 και κύριο συστατικό του φαινυλακετυλογλουταμίνης (PG) μειώνουν την μεταστατική ανάπτυξη όγκου πνεύμονα, και αυξάνει το χρόνο επιβίωσης μετά τον εμβολιασμό με κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Lewis (LLC) σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε ποντίκια C57BL6. Πολλαπλασιαστικές ανάλυση πρόγραμμα σε καρκινικά κύτταρα αποκάλυψαν μια θεμελιώδη επίδραση του CDA-2 και PG στον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, συμπεριλαμβανομένων των Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, Survivin, PCNA, Ki-67 πρωτεΐνες και προσδιορισμούς TUNEL. CDA-2 και PG μείωσε σημαντικά δραστικότητα ΝΡ-κΒ δέσμευσης DNA στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και στα κυψελιδικά μακροφάγα ποντικών που φέρουν όγκους και ειδικά μείωσε την απελευθέρωση φλεγμονωδών παραγόντων συμπεριλαμβανομένων TNFa, IL-6, και KC. Επιπλέον, CDA-2 και PG μειώνουν τις εκφράσεις του TLR2, TLR6, και CD14, αλλά όχι TLR1, TLR3, TLR4, και TLR9 σε μακροφάγα μυελού των οστών που προέρχεται από (BMDM) ποντικών που διεγείρονται από LLC-ρυθμισμένο μέσο (LLC-CM ). Υπερεκφράζουν TLR2 σε BMDM εμπόδισε CDA-2 και PG από την αναστολή της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ, όπως επίσης και την επαγωγή του TNFa και IL-6. TLR2: σύμπλοκα TLR6 διαμεσολαβούν την επίδραση του ΝΡ-κΒ απενεργοποίηση από CDA-2. Συμπερασματικά, CDA-2 αναστέλλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη όγκων του πνεύμονα από αναγωγή της φλεγμονής στον πνεύμονα μέσω της καταστολής της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ σε μυελοειδή κύτταρα, συσχετίζοντας με διαμόρφωση του TLR2 σηματοδότησης

Παράθεση:. Wang Χ, Jiang CM, wan ΗΥ, Wu JL, Quan WQ, Bals R, et al. (2012) CDA-2, ένα ουροποιητικού Παρασκευή, Αναστέλλει πνεύμονα ανάπτυξης του καρκίνου μέσω της καταστολής της NF-κΒ ενεργοποίησης σε μυελοειδή Cell. PLoS ONE 7 (12): e52117. doi: 10.1371 /journal.pone.0052117

Επιμέλεια: Hiroshi Shiku, Mie Πανεπιστημίου Graduate School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 26η Απριλίου, 2012? Αποδεκτές: 9 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Δεκ, 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το πρόγραμμα έρευνας της Επιτροπής Επιστήμης και Τεχνολογίας του Putuo District, Shanghai (PTKW09-B02). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο στον κόσμο, με αποτέλεσμα πάνω από ένα εκατομμύριο θανάτους παγκοσμίως [1]. Παρά τις προόδους στην έγκαιρη ανίχνευση και την τυπική θεραπεία, ο καρκίνος του πνεύμονα συχνά διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο και έχει φτωχή πρόγνωση. Ως εκ τούτου, η πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα είναι το επίκεντρο της εντατικής τρέχουσας έρευνας [2].

CDA-2 (διαφοροποίηση παράγοντα 2 των κυττάρων) είναι ένα παρασκεύασμα του ουροποιητικού ότι απομονωμένα από υγιείς ανθρώπινα ούρα στην Κίνα. Είναι ένα νέο πολυλειτουργικό φάρμακο που είναι χρήσιμο τόσο για την πρόληψη και τη θεραπεία διαφόρων όγκων, συμπεριλαμβανομένης της λευχαιμίας, του καρκίνου του μαστού, καρκίνο του ήπατος, και φαιοχρωμοκύττωμα, σε προκλινικές έρευνες [3] – [5]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί της ανασταλτικής δράσης του όγκου του CDA-2 δεν είναι καθόλου σαφές, και ειδικότερα δεν υπήρχε έκθεση για τον καρκίνο του πνεύμονα. CDA-2 περιέχει πολλαπλά δραστικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων φαινυλακετυλογλουταμίνης (PG) (41%), βενζοϋλιο γλυκοκόλη (35%), πεπτίδια (ΜΒ 400 έως 2800) (17%), 4-ΟΗ-φαινυλοξικό οξύ (6%), και 5 ΟΗ-ινδολοξικό οξύ (1%), η οποία με διαφορετικούς μηχανισμούς των αντικαρκινικών [5]. Αν και η αναστολή του όγκου μπορεί να αποδοθεί σε αυτά τα συστατικά, το PG είναι πιθανό να είναι ένα κύριο συστατικό ανασταλτική του όγκου [3]. Φάση Ι /ΙΙ /ΙΙΙ έχουν κλινικές δοκιμές του CDA-2 έχουν ολοκληρωθεί στην Κίνα το 2003. Τον Αύγουστο του 2004, το κράτος Drug Administration (SDA) της Κίνας ενέκρινε τη χρήση της CDA-2 ως αντικαρκινικό φάρμακο σε συμπαγείς όγκους. Αν και CDA-2 προτάθηκε να συμβάλλει στην αναστολή όγκου μέσω του πάνω ρύθμιση ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα γ (ΡΡΑΚ-γ) και στην καταστολή των ΡΙ3 /Akt μονοπάτι σε κύτταρα όγκου σηματοδότησης, η επίδραση αναστολής όγκου του CDA-2 ήταν μέχρι σήμερα καταδειχθεί κυρίως σε καρκινικά κύτταρα και η δράση της σε μικροπεριβάλλοντα του όγκου, ειδικά στο ανοσοποιητικό /φλεγμονώδη κύτταρα σε στρώματος του όγκου, δεν έχει αξιολογηθεί κριτικά [6], [7].

ΝΡ-κΒ είναι βασικός συντονιστής φλεγμονωδών και ανοσολογική απάντηση και έχει πρόσφατα βρέθηκε να παίζει κεντρικό ρόλο στην καρκινογένεση ενός αριθμού καρκίνων συμπεριλαμβανομένων του πνεύμονα ή καρκινώματος κόλου [8], [9]. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα προ-φλεγμονωδών κυτοκινών και χημειοκινών έχουν συνδεθεί με καρκινογόνες διαδικασίες σε ανθρώπους και ποντίκια, και ρυθμίζονται από μονοπατιού ΝΡ-κΒ. Για παράδειγμα, ο ΝΡ-κΒ με γνώμονα την παραγωγή κυτοκίνης από μυελοειδή κύτταρα (π.χ., ώριμα μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, και ουδετερόφιλα) όπως TNF-α και IL-6 είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη του όγκου του πνεύμονα [9]. Σε ένα μοντέλο ποντικού της κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο (CAC), ΙΚΚβ διεγράφη σε μυελοειδή κύτταρα (που οδηγεί σε μειωμένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ), το μέγεθος του όγκου ήταν σημαντικά μικρότερο σε σύγκριση με τους ελέγχους και την έκφραση των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, όπως TNFa, IL -6, και IL-1, επίσης μειώθηκε αισθητά [10]. Έτσι σε μυελοειδή κύτταρα, η ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ προάγει την ανάπτυξη του όγκου. Αυτό το αποτέλεσμα οφείλεται κυρίως στην αυξημένη πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μέσω της παραγωγής του TNFa, IL-6, και άλλες κυτοκίνες που ρυθμίζονται από την οδό ΝΡ-κΒ σε μυελοειδή κύτταρα [10], [11].

Εδώ , αναφέρουμε τις πρόσφατες εργασίες μας σχετικά με την καταστολή του όγκου και των μοριακών μηχανισμών του CDA-2 και κύριο συστατικό της, PG, τον καρκίνο του πνεύμονα. Χρησιμοποιήσαμε πειραματικά μοντέλα καρκίνου του πνεύμονα ποντικού στην οποία CDA-2 και PG μειώνει την ανάπτυξη του όγκου των πνευμόνων, και απέδειξαν ότι ΝΡ-κΒ αδρανοποίηση σε μυελοειδή κύτταρα είναι υπεύθυνη για CDA-2 που προκαλείται από την υποχώρηση του όγκου. Βρήκαμε ότι η αναστολή της TLR-2 σηματοδότηση είναι ένας βασικός μηχανισμός του CDA-2 επαγόμενη από ΝΡ-κΒ αδρανοποίηση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν μια νέα θεωρία για τη θεραπεία του καρκίνου με CDA-2, με βάση την αναστολή της NF-κΒ σε μυελοειδή κύτταρα του μικροπεριβάλλοντα όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

κύτταρα p το καρκίνωμα πνεύμονος Lewis ποντικού (LLC) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection και καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagles Dulbeccos (ϋΜΕΜ, εργαστήρια Hyclone. Inc, South, Utah, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA), 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 U /mL στρεπτομυκίνη (εργαστήρια Hyclone. Inc, South, Utah, USA). Οι κυτταρικές καλλιέργειες διεξήχθησαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο αέρα με 5% CO

2.

Ζώα

Θηλυκά ποντίκια C57BL /6 ελήφθησαν από το Εθνικό Εργαστήριο τρωκτικό Resource Ζώων (Shanghai Branch , ΛΔΚ) και διατηρείται κάτω από ένα παθογόνο-ελεύθερο Κεντρική μονάδα ζώων του Πανεπιστημίου Tongji. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στις κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την επιτροπή του Πανεπιστημίου Tongji Δεοντολογίας για τη χρήση και τη φροντίδα των ζώων.

Όλα επέμβαση έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Δημιουργία του καρκίνου του πνεύμονα Model σε ποντικούς και θεραπεία του CDA-2 και PG

Ένα μοντέλο μετάστασης του καρκίνου του πνεύμονα σε ποντικούς C57BL /6 δημιουργήθηκε με ενδοφλέβια ένεση κυττάρων LLC. Εν συντομία, συρρέοντα κύτταρα LLC ή κύτταρα Α549 συλλέχθηκαν και διέρχεται από ένα πλέγμα κυττάρων των 40 μm (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ, USA), πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, επαναιωρήθηκαν σε DMEM χωρίς ορό και εγχύθηκε σε μια συγκέντρωση 2 × 10

5 LLC κύτταρα ανά ποντικό στη φλέβα της ουράς. After14 ημέρες, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (ip) με 500 mg /kg, 1000 mg /kg και 2000 mg /kg CDA-2 (ευγενικά παρέχεται από ποτέ τη ζωή Pharmaceutical Co. Ltd. Hefei, Anhui, Κίνα) ή 200 mg /kg, 400 mg /kg, και 800 mg /kg ΡΟ (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) σε PBS ή PBS μόνο μία φορά την ημέρα για 10 ημέρες.

Αξιολόγηση των όγκων στους πνεύμονες

στην οριστεί χρονικά σημεία, οι ποντικοί θανατώθηκαν, και οι πνεύμονες τους αφαιρέθηκαν, ζυγίστηκαν, και ιστολογικά εξετάστηκαν. Μερικά ποντίκια διατηρήθηκαν μέχρις ότου ελήφθησαν δεδομένα θανάτου και επιβίωσης. οζίδια όγκου πνεύμονα μικροτομή χρησιμοποιώντας μια G βελόνης 18 κάτω από ένα μικροσκόπιο για ανάλυση πρωτεΐνης. Tumor πολλαπλότητα και η μέγιστη μεγεθών προσδιορισμό όπως περιγράφεται [9]. Εν συντομία, οι πνεύμονες ολόκληρο φέρουν όγκο με το χέρι διογκωθεί με και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και εγκλείστηκαν. Εγκλεισμένα σε παραφίνη πνεύμονες τεμαχίσθηκαν σειριακά στα 350 μm και ιστολογικά εξετάζονται με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε).

Ανοσοϊστοχημική Αναλύσεις

Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Mouse αντί-Ki-67 (Abcam, Cambridge, UK) χρησιμοποιήθηκε ως πρωτογενές αντίσωμα. Δευτερεύουσα επώαση αντισώματος και χρώση έγιναν χρησιμοποιώντας το κιτ EnVision® + System-HRP (AEC) (Dako, Carpinteria, CA, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Για τη δοκιμασία TUNEL, ένα ™ Colorimetric TUNEL Σύστημα αδιέξοδο (Promega) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Ο αριθμός των Ki-67 ή TUNEL-θετικά κύτταρα όγκου και των συνολικών κυττάρων αριθμό όγκου μετρήθηκε σε έξι μικροσκοπικά πεδία τυχαία επιλεγμένων όγκων και, στη συνέχεια, η μέση τιμή υπολογίστηκε ως το ποσοστό των TUNEL θετικών κυττάρων όγκου Ki-67 ή.

Δυτική Blotting

πνεύμονα οζίδια όγκου μικροτομή προσεκτικά χρησιμοποιώντας μια βελόνα 18 G. από τους πνεύμονες κάτω από ένα μικροσκόπιο. Για πλήρη απομόνωση πρωτεΐνης, 10 mg οζιδίου όγκου ομογενοποιήθηκαν στον μΙ ρυθμιστικού διαλύματος κυτταρικής λύσεως 500 (Cell Σηματοδότηση Technology, Danvers, ΜΑ, USA) που περιέχει 5 mM PMSF και αναστολείς πρωτεάσης χρησιμοποιώντας ρότορα-στάτορα ομογενοποιητή. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Εν συντομία, το σύνολο των εκχυλισμάτων πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές, υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση, και κηλιδώθηκε επί Hybond-C έξτρα μεμβράνες (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο). Τα πρωτογενή αντισώματα περιελάμβαναν: αντι-ΒοΙ-Χι, ποντικού αντι-ΒοΙ-2 (και τα δύο από την Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)? ποντικού αντι-ΡΟΝΑ, αντι-cIAP1, κουνελιού αντι-Survivin (τα τρία από Abcam, Cambridge, UK)? ποντικού αντι-β-ακτίνης (Sigma Aldrich, Steinheim, Γερμανία). HRP-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology) ή αντι-ποντικού κουνελιού χρησιμοποιήθηκαν σαν δευτερεύον αντίσωμα (Dako, Glostrup, Δανία).

βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BALF) ο αριθμός των λευκοκυττάρων και κυψελιδικά μακροφάγα Απομόνωση

BALF προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Ποσοστά των υποπληθυσμών λευκοκυττάρων προσδιορίστηκαν μετρώντας 100 λευκοκυττάρων σε ένα τυχαία επιλεγμένο τμήμα του slide cytospin. Ο συνολικός αριθμός των λευκοκυττάρων στο BAL προσδιορίσθηκε με τη χρήση ενός αιμοκυτταρόμετρο (Beckman Coulter, Miami, FL, USA). Κυψελιδικά μακροφάγα απομονώθηκαν για EMSA όπως περιγράφεται προηγουμένως [15]. Εν συντομία, το BALF ήταν σπόρων σε ϋΜΕΜ και διατηρήθηκαν σε πιάτο καλλιέργειας κυττάρων. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο αέρα με 5% CO2 για 1 ώρα. Ο δίσκος στη συνέχεια πλύθηκε 3 φορές με PBS, και τα προσκολλημένα κύτταρα, κυρίως μακροφάγα, συλλέχθηκαν για εκχύλισμα πυρηνική πρωτεΐνη.

μετατόπισης κινητικότητας ηλεκτροφορητικής Δοκιμασία (EMSA)

πυρηνικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν από πνεύμονες όγκους και κυψελιδικά μακροφάγα χρησιμοποιώντας Nuclear Kit Extract (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) και η δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA μετρήθηκε με EMSA όπως περιγράφεται [13]. Εν συντομία, πυρηνικές πρωτεΐνες επωάστηκαν με [

32Ρ] -επισημασμένο δίκλωνο ΝΡ-κΒ συναίνεση ανιχνευτή (Promega) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. συμπλέγματα ϋΝΑ-πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 4% εξισορροπημένη σε 0.5 × ΤΒΕ υπό 300V. Οι πηκτές ξηράνθηκαν και εκτέθηκαν σε Hyperfilm ECL (Amersham Bioscience) στους -80 ° C και αναπτύχθηκε με τη χρήση φιλμ Kodak (Eastman Kodak, Rochester, ΝΥ, USA).

Οι κυτοκίνες Δοκιμασία ELISA

δείγματα BALF παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. TNFa, IL-6, και KC μετρήθηκαν με εμπορικά διαθέσιμο τύπου σάντουιτς ELISA (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA), ακολουθώντας τις κατασκευές «οδηγίες

Ποντίκια μυελό οστών μακροφάγα (BMDMs. ) Απομόνωση και λουσιφεράσης Δοκιμασία Reporter

Τα κύτταρα από το μυελό των οστών των ποντικών C57BL6 καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEMs (10% FCS) συμπληρωμένο με 10 ng /ml ανασυνδυασμένου ποντικού M-CSF (eBioscience, San Diego, CA, USA ) για 7 ημέρες για να επιτραπεί η διαφοροποίηση σε μακροφάγα. Αδενοϊικών δομημάτων που κωδικοποιούν την πλήρους μήκους cDNA TLR2 δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα AdEasy όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16], [17]. Το ΝΡ-κΒ αδενοϊού λουσιφεράση πλασμίδιο PNF-κΒ-Leu (BD Clontech) που περιέχει πολλαπλά αντίγραφα του συναινετικής αλληλουχίας ΝΡ-κΒ για την παρακολούθηση της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ. BMDMs (1 × 10

5 ανά φρεάτιο πλακών 12 φρεατίων) μολύνθηκαν με τα αδενοϊικά πλασμίδια TLR2 και πλασμίδια ελέγχου, μετά από 5 ώρες, τα κύτταρα μολύνθηκαν πάλι με λουσιφεράση πλασμίδιο αδενοϊού PNF-κΒ-Leu. Ακολουθούμενη από 24 ώρες επώασης, τα μολυσμένα κύτταρα διεγέρθηκαν για 24 ώρες με LLC-CM ή /και CDA-2, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λύση και η δραστικότητα του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA) .

LLC ρυθμισμένο μέσο

Ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε από κύτταρα LLC επωάζονται σε DMEM ελεύθερο ορού (SFM) για 24 ώρες, και διηθείται μέσω ενός φίλτρου 0,2 μm. Κλιματιζόμενο δείγματα μέσου προστέθηκαν BMDMs για 24 ώρες, μετά την οποία προσδιορίστηκαν έκφραση γονιδίων TLRs.

Απομόνωση RNA και Real-time PCR

Σύνολο πνευμονικό ιστό και BMDMs RNA παρασκευάστηκαν με RNeasy συν μίνι kit (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Οι σε πραγματικό χρόνο μίγματα αντίδρασης PCR έχουν περιγραφεί προηγουμένως [18]. Εν συντομία, το cDNA συνετέθη με αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης πρώτου κλώνου οϋΝΑ (Invitrogen). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του QPCR SYBR Green Mix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) σε πραγματικό χρόνο μηχανή του συστήματος PCR ΑΒ 7300 (ΑΒ Applied Biosystems, Σιγκαπούρη). Οι ακόλουθες PCR εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: ποντίκι β-ακτίνης, 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 ‘και 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′? ποντίκι IL-1β, 5’-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3 ‘και 5′-GATCCACACTC TCCAGCTGCA-3′? ποντίκι IL6, 5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3 ‘και 5′-TCC ACGATTTCCCAGAGAAC-3′? ποντικός TNFa, 5’-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3 ‘και 5′-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3′? ποντίκι Kc, 5’-CTTGGGGACACCTTT TAGCA-3 ‘και 5′-GCTGGGATTCACCTCAAGAA-3′? ποντίκι Mip1, 5’-TGGAG CTGACACCCCGAC-3 ‘και 5′-ACGATGAATTGGCGTGGAA-3′? ποντίκι MCP1, 5’-GCAGGTCCCTGTCATGCTTC-3 ‘και 5′-TCCAGCCTACTCATTGGGATCA-3′? ποντίκι ΤΙγ2, 5’-TGGTGTCTGGAGTCTGCTGTG -3 ‘και 5′-CGCTCCGTACGAA GTTCTCAG -3′? TLR6, 5’-CAACTTAACGATAACTGAGAG -3 ‘και 5′-CCAGAG AGGACATATTCTTAG -3′? CD14, 5’-ACA TCT TGAACC TCC GCA AC-3 ‘και 5′-AGGGTTCCTATCCAGCCTGT -3’. Ιδιαιτερότητα της RT-PCR ελέγχθηκε με » χωρίς αντίστροφη μεταγραφή » ελέγχους και την ανάλυση καμπύλης τήξης. Ποσοτικά αποτελέσματα PCR ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο ΔΔCT (κατώφλι κύκλου). Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη επίπεδα σε κάθε δείγμα.

Στατιστική Ανάλυση

Οι τιμές εμφανίζονται ως μέση τιμή συν ή μείον SEM. Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με τη δοκιμασία t (διπλής όψης) ή ANOVA για τα πειράματα με περισσότερες από δύο υποομάδες ή ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές για τις τιμές P λιγότερο από 0.05.

Αποτελέσματα

CDA-2 Μειώσεις πνεύμονα ανάπτυξη όγκων σε μοντέλα ποντικών όγκων

Για να διερευνηθεί η επίδραση της CDA-2 και κύριο συστατικό PG της για την ανάπτυξη του όγκου πνεύμονα, όγκοι παρήχθησαν με ενδοφλέβια ένεση 2 × 10

5 κύτταρα LLC σε ποντίκια C57BL6. After14 ημέρες, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (ΙΡ) με 500 mg /kg, 1000 mg /kg, και 2000 mg /kg CDA-2 ή 200 mg /kg, 400 mg /kg, και 800 mg /kg ΡΟ σε PBS ή PBS μόνη φορά καθημερινά για 10 ημέρες. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν, και τον αριθμό των όγκων τους και μέγιστη μεγέθη όγκων των όγκων του πνεύμονα αξιολογήθηκαν. Σε αντίθεση με τον έλεγχο, η χορήγηση του CDA-2 στους ποντικούς μειώνεται σημαντικά τον αριθμό των όγκων του πνεύμονα και η μέγιστη μεγέθη των όγκων (Σχ. 1Α, Β). Η &? Χρώση Ε επιβεβαίωσε τη μαζική μείωση του φορτίου του όγκου στα ποντίκια CDA-2-θεραπεία. (Εικ. 1Α). Υπάρχουν επίσης σημαντικές διαφορές στα βάρη των όγκων του πνεύμονα μετά από διαφορετικές δόσεις της χορήγησης CDA-2 που δείχνει CDA-2 ανέστειλε την μεταστατική ανάπτυξη όγκου σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1Α, Β). Ομοίως, PG είχε επίσης ένα σημαντικό ανασταλτικό αποτέλεσμα επί μεταστατική ανάπτυξη του όγκου πνεύμονα, όπως αποκαλύπτεται από μακρο-παρατή- και μικροσκοπία εξέταση (Σχ. 2Α, Β). Αξιολογήσαμε επίσης τους χρόνους επιβίωσης των ποντικών εγχύθηκε όγκου που υποβλήθηκαν σε αγωγή με CDA-2 με ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier. χρόνοι επιβίωσης Ποντικοί αξιολογήθηκαν και έδειξαν ότι η διάρκεια ζωής των ποντικών που φέρουν όγκο παρατάθηκαν όταν δίνεται διαφορετική συγκέντρωση του CDA-2 θεραπεία (Εικ. 1 C). Εκεί είχε επίσης σημαντική διαφορά στο ποσοστό επιβίωσης των διαφορετικών συγκέντρωση CDA-2-ποντίκια με αγωγή που φέρουν όγκο (Σχ. 1 C). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν αυτά που λαμβάνονται από την εξέταση πολλαπλότητα του όγκου, η μέγιστη μεγέθη όγκων, η H & amp? Ε χρώση από πνεύμονα μεταστατικά καρκινώματα μοντέλα

(Α) του πνεύμονα εμφάνιση (επάνω) και ιστολογία. (H & amp? E λεκέ? Προς τα κάτω) στην LLC εμβολιασμένες C57 /BL6 ποντίκια 10 ημέρες μετά την επεξεργασία CDA-2 με υποδεικνυόμενες δόσεις. 2 × 10

5 κύτταρα LLC ενέθηκαν ενδοφλεβίως σε φύλου αντιστοίχιση C57 /BL6 ποντίκια με φλέβα της ουράς, 14 ημέρες αργότερα, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS ή CDA-2 για 10 ημέρες, κατά την ημέρα 25, οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν. (Β) πολλαπλότητα του πνεύμονα όγκου και μέγιστη όγκου μεγέθη προσδιορίστηκαν με σειριακές τομές ανά διαστήματα 350 μm. Τα αποτελέσματα είναι μέση τιμή ± SEM, η = 5, σημαντική διαφορά, * ρ & lt? 0.05. (C) Επιβίωση καμπύλες των ποντικών (ρ & lt? 0,001? Log-rank test για στατιστική ανάλυση? N = 10).

Η

(Α) του πνεύμονα εμφάνιση (επάνω) και ιστολογία (H & amp? E λεκέ? κάτω) σε LLC εμβολιάστηκαν C57 /BL6 ποντίκια 10 ημέρες μετά την αγωγή PG με ενδεικνυόμενες δόσεις. 2 × 10

5 LLC κύτταρα ενέθηκαν ενδοφλεβίως σε φύλου αντιστοίχιση C57 /BL6 ποντίκια με φλέβα της ουράς, 14 ημέρες αργότερα, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS ή PG για 10 ημέρες, κατά την ημέρα 25, οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν. πολλαπλότητα όγκου (Β) του πνεύμονα και μέγιστη μεγέθη του όγκου προσδιορίσθηκαν όπως στο σχήμα 1Β. Τα αποτελέσματα είναι μέση τιμή ± SEM, n = 5, σημαντική διαφορά, * ρ & lt?. 0.05

Η

CDA-2 Μειωμένη διάδοση των πυρηνικών όπλων και την απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα του πνεύμονα Καρκίνος

Στη συνέχεια, για να διερευνήσει κατά πόσον CDA-2 που προκαλείται από την αλλαγή στο φορτίο όγκου πνεύμονα οφειλόταν στην αλλαγμένη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή απόπτωση, εξετάσαμε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από ανοσο-ιστοχημική ανάλυση του Ki-67 και την κυτταρική απόπτωση με in situ dUTP μεσολάβηση τέλος επισήμανση nick τερματικό-τρανσφεράσης (TUNEL) χημική δοκιμή. 2 × 10

5 κύτταρα LLC εγχύθηκαν σε ποντικούς και 14 ημέρες καθυστέρηση 2000 mg /kg CDA-2, 800 mg /kg PG ή PBS χορηγήθηκε ως ανωτέρω για 5 ημέρες. Συνεπής με τις αλλαγές στο φορτίο όγκου πνεύμονα, Ki-67-θετικά κύτταρα ήταν χαμηλότερες σε CDA-2 ή PG-αγωγή όγκους συγκριτικά με όγκους PBS-αγωγή ζώα (Σχ. 3Α). Αντιστρόφως, η απόπτωση ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω μετά CDA-2 ή PG θεραπεία, ενώ πολύ λίγο απόπτωση παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία PBS (Σχ. 3Β).

(Α) ποντικών που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με 2000 mg /kg CDA- 2 ή 800 mg /kg PG για 5 ημέρες, και οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και ενσωματωμένα σε παραφίνη. τομές όγκου πνεύμονα που φέρει εγκλεισμένα σε παραφίνη εξετάστηκαν με ανοσοχρώση με αντι-Ki-67-αντισωμάτων για την ανίχνευση πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Bar = 100 μm. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SEM, η = 5, σημαντική διαφορά, * ρ & lt? 0.05. κύτταρα (Β) Τα αποπτωτικά ταυτοποιήθηκαν με χρώση TUNEL. Bar = 200 μm. όγκοι (C) που έχουν αποκοπεί πνεύμονα αναλύθηκαν για την έκφραση του υποδεικνύεται πολλαπλασιαστικών και αποπτωτικών πρωτεϊνών με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Η έκφραση της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για το ποσό των πρωτεϊνών.

Η

Εξετάσαμε ορισμένες πρωτεΐνες και γονίδια που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση. Οι όγκοι μικροτομή προσεκτικά χρησιμοποιώντας βελόνες από τους πνεύμονες, λύθηκαν, και εξετάστηκαν με ανοσοκηλίδωση. Σε αντίθεση με την ομάδα θεραπείας PBS, η έκφραση των πρωτεϊνών αντιαποπτωτικών Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, και Survivin έντονα μειωμένη σε απόκριση CDA-2 θεραπεία (Εικ. 3C). θεραπεία CDA-2 μείωσε επίσης την έκφραση πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA), ένας άλλος δείκτης S φάση του κυτταρικού κύκλου (σχ. 3C). ανάλυση ανοσοκηλίδος των προϊόντων λύσης όγκου των ποντικών αποκάλυψε επίσης ρύθμιση προς τα κάτω της Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, και Survivin καθώς και PCNA σε όγκους του πνεύμονα μετά από αγωγή PG (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα συσχετίζονται με αυτά που παρατηρήθηκαν με την ανάλυση του Ki-67 και TUNEL.

CDA-2 Αναστέλλει ΝΡ-κΒ ενεργοποίησης και πνευμονική φλεγμονή στο πνεύμονα ποντικών

Έχει αποδειχθεί ότι NF -κB ενεργοποίηση παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην ρύθμιση των φλεγμονωδών και ανοσοαπόκριση, απόπτωση, και ογκογένεση η οποία σχετίζεται με τη φλεγμονή που προάγουν την ανάπτυξη του όγκου [19], [20]. Για τον προσδιορισμό των μηχανισμών του όγκου στην ανασταλτική επίδραση της CDA-2, συγκρίναμε πρώτα την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ από αποκόπηκαν καρκίνο από ποντικούς με CDA-2, PG ή θεραπεία PBS. Αξίζει να σημειωθεί, εκτομή ιστού περιείχε ιστό όγκου, συμπεριλαμβανομένων όγκου και φλεγμονώδη κύτταρα. Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και η ενεργοποίηση του NF-κΒ εξετάστηκε με EMSA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, θεραπεία CDA-2 μειώθηκε σημαντικά δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA σε σύγκριση με τον έλεγχο μετά από 5 ημέρες 2000 mg kg θεραπεία /CDA-2. Σημαντικά, η δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA επίσης αναστέλλονται ισχυρά σε απόκριση προς θεραπεία CDA-2 στα κυψελιδικά μακροφάγα βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) (Εικ. 4Β). Στη συνέχεια, η θεραπεία με 800 mg /kg PG για 5 ημέρες σε ποντικούς που φέρουν όγκο, επίσης ανέστειλε αποτελεσματικά το ΝΡ-κΒ DNA δραστικότητα δέσμευσης τόσο σε καρκινικά κύτταρα και κυψελιδικά μακροφάγα (Εικ. 4C). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η PG έχει παρόμοια επίδραση στην αναστολή της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ.

EMSA των πυρηνικών εκχυλισμάτων που απομονώθηκε από τα καρκινικά κύτταρα και κυψελιδικά μακροφάγα που δείχνει πυρηνική δέσμευση του ΝΡ-κΒ μετά από 5 ημέρες 2000 mg /kg CDA-2 (Α και Β) ή /kg ΡΟ (C) κατεργασία 800 mg. Συνολικός αριθμός κυττάρων και ο πληθυσμός των λευκοκυττάρων σε BALF συλλέγονται από ποντικούς C57BL6 3 ή 5 ημέρες 2000 mg /kg CDA-2 (D) και 800 mg /kg PG (Ε) ή θεραπεία PBS. Cellular σύνθεση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας cytospin παρασκευάσματα. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SEM, η = 5, σημαντική διαφορά, * ρ & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια, το ερώτημα εάν το CDA-2 επαγόμενη από απενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε μυελοειδή κύτταρα αλλάζει την φλεγμονώδη κατάσταση στους πνεύμονες. Εμείς χαρακτηριζόμενη φλεγμονωδών κυττάρων και μεσολαβητών σε πνεύμονες ποντικών υποβάλλεται σε μοντέλο καρκίνου ποντίκια. Συνολικός αριθμός κυττάρων και απόλυτους αριθμούς των μακροφάγα, ουδετερόφιλα, και λεμφοκύτταρα σε BALF μειώθηκαν σημαντικά 3 και 5 ημέρες μετά από 2000 mg /kg CDA-2 θεραπεία (Εικ. 4D) ή 5 ημέρες μετά από 800 mg kg θεραπεία /PG (Σχ. 4Ε ). CDA-2 ή PG θεραπεία μείωσε αποτελεσματικά την έκφραση διαφόρων φλεγμονωδών κυτοκινών και των χημειοκινών mRNAs, όπως Il1b, IL6, Kc, TNFa, Mip1α, και MCP1 στον πνεύμονα (Εικ. 5Α, Β). CDA-2 ή PG αγωγή μείωσε επίσης την έκκριση του TNF-α, IL-6, και KC από τα κύτταρα των πνευμόνων (Εικ. 5C, D). Εργασίες αποτελέσματα υπέδειξαν ότι η μείωση του φλεγμονώδους αντίδρασης με αναστολή της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ, είναι πιθανό να είναι μια σημαντική ανασταλτική του όγκου μηχανισμός του CDA-2 και PG.

Επαγωγή φλεγμονώδους κυτοκίνης και χημειοκίνης mRNA σε ομογενοποιήματα του 3 ή 5 ημέρες 2000 mg /kg CDA-2 (Α) ή 800 mg /kg ΡΟ (Β) κατεργάζεται πνεύμονες μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SEM, η = 5, σημαντική διαφορά, * ρ & lt? 0.05. Συγκέντρωση των φλεγμονωδών κυτοκινών σε BALF των 3 ή 5 ημέρες 2000 mg /kg CDA-2 (C) ή /kg ΡΟ (D) αγωγή ποντικούς 800 mg αξιολογήθηκε με ELISA. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SEM, n = 5, σημαντική διαφορά, * ρ & lt?. 0.05

Η

CDA-2 Αναστέλλει TLR2 Σηματοδοσίας στη μυελού των οστών που προέρχονται από μακροφάγα

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ΤοΙΙ υποδοχέων (TLRs) μεσολάβηση σηματοδότησης ευνοούν την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ, που οδηγεί σε μια προ-φλεγμονώδη απόκριση [21]. Για την αντιμετώπιση είτε CDA-2 ανέστειλε NF-κΒ μέσω TLR οδό σηματοδότησης, εξετάσαμε την έκφραση των μελών της οικογένειας TLR σε μακροφάγα μυελού των οστών που προέρχεται από (BMDM) που διεγείρονται από ρυθμισμένο μέσο άνευ ορού από κύτταρα LLC (LLC-CM) . LLC-CM επαγόμενη σημαντικά την έκφραση του TLR2 και συν-υποδοχέα του TLR6 και CD14 (Σχ. 6Α, Β), αλλά όχι TLR1, TLR3, TLR4, και TLR9 σε BMDM (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι σημαντικό ότι, η προσθήκη CDA-2 ή PG καταστέλλεται σημαντικά την έκφραση του TLR2, TLR6, και CD14 σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ. 6Α, Β). Η επώαση των BMDM με CDA-2 ή PG μόνη δεν είχε καμία επίδραση επί TLR2, TLR6 και έκφραση CD14 (Σχ. 6Α, Β). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι TLR2 signiling θα μπορούσαν να δράσουν ως μεσολαβητής και συμβάλλει στην ΝΡ-κΒ απενεργοποίηση από CDA-2 και PG.

BMDMs υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με ϋΜΕΜ ελεύθερο ορού (SFM) ή LLC-CM ή συνδυασμός με CDA-2 (Α) ή PG (Β). Ολικά RNAs απομονώθηκαν από BMDMs, και γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου. Τα αποτελέσματα είναι μέσες φορές αλλαγή ± SEM, η = 3, σημαντική διαφορά, * ρ & lt?. 0.05

Η

Αναστολή της CDA-2 για ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ καταργήθηκε από την υπερβολική έκφραση των TLR2

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω TLR2 σηματοδότηση με τη μεσολάβηση της ενεργοποίησης του NF-κΒ ρυθμίζεται από CDA-2, πραγματοποιήσαμε δοκιμασία γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης NFκB-οδηγείται. Ανασυνδυασμένοι φορείς αδενοϊών παράχθηκαν κωδικοποιούν TLR2 εκφράζονται σε BMDM. TLR2 ή φορέα ελέγχου μολυσμένα BMDM μολύνθηκαν με ΝΡ-κΒ ανταποκριτή λουσιφεράσης πλασμίδιο αδενοϊού. Και οι δύο έχουν μολυνθεί θεραπεία BMDMs με LLC-CM είχε σαν αποτέλεσμα σημαντικές αυξήσεις στη σύνδεση του ΝΡ-κΒ σε συναινετική αλληλουχία DNA του, όπως εμφανίζεται από την αύξηση της ενεργοποίησης της λουσιφεράσης (Σχ. 7Α). TLR2 μολυνθεί BMDM έδειξαν σημαντική αρχική ενεργοποιήσεις αυτού του παράγοντα μεταγραφής και υψηλότερες τιμές από LLC-CM σε σύγκριση με τις τιμές ελέγχου (Σχ. 7Α). Θεραπεία της CDA-2 ή PG προκάλεσαν σημαντική μείωση των LLC-CM προκαλείται από NF-κΒ μετενεργοποίηση στον έλεγχο μολυνθεί BMDM, ενώ δεν υπάρχει καμία αλλαγή στη δραστηριότητα δημοσιογράφος από CDA-2 ή PG σε μολυσμένα κύτταρα TLR2 (Εικ. 7Α). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα μετενεργοποίηση ΝΡ-κΒ, αυτά τα κατασκευάσματα παράγονται επίσης παρόμοιες επιδράσεις στην έκφραση της TNFαand IL-6 (Σχ. 7Β). Έτσι, TLR2 αναστολή έκφρασης με CDA-2 και το συστατικό του PG απαιτείται για την απενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε μυελοειδή κύτταρα.

(Α) BMDMs συν-μολύνθηκαν με TLR2 και NF-κΒ γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης αδενοϊικά κατασκευάσματα . 24 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SFM ή LLC-CM και /ή CDA-2 ή PG όπως υποδεικνύεται. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης προσδιορίζονται 24 ώρες μετά την θεραπεία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM φορές σε σχέση με τον έλεγχο. n = 3, σημαντική διαφορά, * ρ & lt? 0,05? ns, δεν είναι σημαντική. (Β) Επαγωγή του mRNA φλεγμονώδους κυτοκίνης σε μολυσμένα BMDMs όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα αποτελέσματα είναι μέσες φορές αλλαγή ± SEM, η = 3, σημαντική διαφορά, * ρ & lt? 0,05? ns, δεν είναι σημαντική.

Η

Συζήτηση

Το κύριο εύρημα της παρούσας μελέτης είναι ότι η CDA-2, ένα ουροποιητικού προετοιμασία, αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων του πνεύμονα μέσω ενός μυελοειδούς κυττάρου ενδιάμεσο. CDA-2 μειώνει τη φλεγμονή στον πνεύμονα μέσω της καταστολής της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ σε μυελοειδή κύτταρα συνδέει με διαμόρφωση του TLR2 σηματοδότησης. Το κύριο συστατικό του CDA-2, PG, είναι πιθανό να διαδραματίσει καίριο ρόλο στην αντικαρκινική επίδραση του CDA-2.

Αυτή η μελέτη εξέτασε άμεσα το σημαντικό όγκο ανασταλτική επίδραση του CDA-2 με τη χρήση πειραματικών πνεύμονα μοντέλα όγκου. Προηγούμενες μελέτες είχαν δείξει ότι η CDA-2 είναι από δυνητική αξία ως αντικαρκινικό παράγοντα [3], [7]. CDA-2 έχει μελετηθεί και έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου μαστού, κύτταρα γλοιώματος, και ανθρώπινα κύτταρα λευχαιμίας

in vitro

και

in vivo

[3], [7]. Κλινικά, CDA-2 έδειξαν σημαντικές επιπτώσεις όσον αφορά τη βελτίωση των απαντήσεων χημειοθεραπείας σε γλοίωμα, ηπάτωμα, καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου, και οι ασθενείς με καρκίνο του μαστού [7]. PG είναι μια σημαντική βιοενεργό συστατικό στην CDA-2. Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι το PG έχει δυνατότητα όγκο ανασταλτική δράση, και αυτό επίσης είναι ένα σημαντικό συστατικό του antineoplaston AS2-1, ένα μίγμα αλάτων νατρίου του φαινυλοξικού οξέος και PG, η οποία είναι ένα φάρμακο κατά του όγκου [3], [22] . Τα παρόντα δεδομένα επιβεβαιώνουν ότι πρώτα θεραπεία CDA-2 οδηγεί κατευθείαν σε μία αύξηση σύλληψη του όγκου πνεύμονα και εκτεταμένη διάρκεια ζωής στα ποντίκια δείχνει την ισχυρή δραστικότητα κατά του όγκου του CDA-2 στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Τόσο ο πολλαπλασιασμός αναστολής και επιδράσεις που επάγει την απόπτωση παρατηρήθηκαν σε όγκους πνεύμονα, όπως καταδεικνύεται με ανοσοϊστοχημεία και στύπωμα Western ανάλυση. PG εμφανίζει επίσης μια άμεση επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου των πνευμόνων, και έχει παρόμοια αποτελέσματα της αναστολής του όγκου ως CDA-2. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι CDA-2 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα, και PG πιστεύεται ότι συμβάλλει το μεγαλύτερο βιοδραστικότητα του CDA-2 λόγω της υψηλής τοις εκατό (41%) και σαφή επίδραση καταστολής του όγκου.

Το μικροπεριβάλλον του όγκου διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην έναρξη του όγκου και την προώθηση και περιέχει τα κύτταρα του ανοσοποιητικού και του συνδετικού ιστού, όπως είναι οι ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, περικύτταρα, και μεσεγχυματικά κύτταρα [23]. Οι πιο συχνά βρέθηκαν κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος στο μικροπεριβάλλον του όγκου είναι τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ). ΤΑΜ προωθούν κυρίως την ανάπτυξη του όγκου και μπορεί να είναι υποχρεωτική για την αγγειογένεση, εισβολή, και μετάσταση από την απελευθέρωση φλεγμονωδών κυτοκινών και χημειοκινών, και η παρουσία τους στον καρκίνο του πνεύμονα έχει συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα [24], [25] και άλλα αποτελέσματα όπως αυξημένος αριθμός μικροαγγείων [26]. Ως τμήματα του θετικού βρόχων εμπρός τροφοδοσίας, χημειοκίνες που παράγονται με TMAs προσελκύσει επιπλέον ανοσοποιητικού /φλεγμονώδη κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων μακροφάγων να μικροπεριβάλλον του όγκου [27]. Τα δεδομένα μας δείχνουν θεραπεία του CDA-2 ή PG αποτέλεσμα μείωση των συνολικών κυττάρων σε BALF, οι οποίες ως επί το πλείστον προσβεβλημένο μακροφάγα, μειωμένη φλεγμονή. Έτσι, είναι πιθανό ότι CDA-2 αναστέλλει την ανάπτυξη όγκου πνεύμονα μέσω της καταστολής του πληθυσμού του ανοσοποιητικού /φλεγμονωδών κυττάρων και φλεγμονή στον πνεύμονα.

Η ενεργοποίηση του NF-κΒ είναι υπεύθυνος για την επαγωγή μιας ποικιλίας γονιδίων στόχων που είναι σημαντικά για την ογκογένεση [28], [29]. ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε φλεγμονώδη κύτταρα ελέγχει την παραγωγή των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, συμπεριλαμβανομένων των TNFa, IL-1, IL-6, και IL-23, που διαμεσολαβούν την προώθηση και την εξέλιξη του όγκου, καθώς και την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα όγκου [ ,,,0],8], [11]. ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ επίσης βρίσκεται σε καρκινικά κύτταρα όπου ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, επιβίωση, αγγειογένεση, εισβολή και μετάσταση [30] – [32]. Η δράση προαγωγής της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ επί του πνεύμονα καρκινογένεση έχει ήδη δείξει με διαφορετικές προσεγγίσεις και αναφέρθηκαν από διάφορες ομάδες, και η εξάντληση των μυελοειδών κυτταρικών ή επιθηλιακά ΝΡ-κΒ φαίνεται να έχει επίδραση στη μείωση του πνεύμονα ογκογένεσης [9], [ ,,,0],33] – [36].