Abstract

Τα μέλη της οικογένειας πρώιμη απόκριση ανάπτυξης (EGR) των παραγόντων μεταγραφής παίξει διάφορες λειτουργίες σε απόκριση προς πολλές κυτταρικές ερεθίσματα, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης, το άγχος, και φλεγμονή. Egr3 έχει πάει σχετικά απλός, αλλά εδώ μέσω της χρήσης των SPECS (στρατηγικοί εταίροι για την αξιολόγηση της πρόβλεψης υπογραφές του καρκίνου του προστάτη) ολόκληρης της βάσης δεδομένων γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος Affymetrix αναφέρουμε ότι Egr3 mRNA είναι σημαντικά υπερεκφράζεται στον καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό του προστάτη (5 φορές). Η ανθρώπινη πρωτεΐνη Atlas (https://www.proteinatlas.org), μια βάση δεδομένων των μικροσυστοιχιών ιστού επισημανθεί με αντισώματα έναντι πάνω από 11.000 ανθρώπινες πρωτεΐνες, χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεϊνών Egr3 σε φυσιολογικούς ασθενείς προστάτη και του καρκίνου του προστάτη. Σε συμφωνία με τα δεδομένα SPECS, βρήκαμε ότι Egr3 πρωτεΐνη είναι σημαντικά αυξημένη σε καρκίνο προστάτη. Η βάση δεδομένων SPECS έχει το πλεονέκτημα της εκτεταμένης κλινικής παρακολούθησης για τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Ανάλυση της έκφρασης Egr3 mRNA σε σχέση με την κατάσταση της υποτροπής αποκαλύπτει ότι η έκφραση Egr3 mRNA αυξάνεται σε καρκινικά κύτταρα του μη-υποτροπιάζουσα δείγματα (n = 63) σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη, αλλά είναι σημαντικά χαμηλότερη σε υποτροπιάζον δείγματα (n = 38) σε σύγκριση σε μη υποτροπή. Οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων. Μια λίστα των γονιδίων που συσχετίζεται με αυτό το μοναδικό πρότυπο έκφρασης προσδιορίστηκε. Αυτά Egr3-συσχέτιση γονιδίων εμπλουτίστηκαν με Egr τοποθεσίες σε υποστηρικτές τους δεσμευτική. Ο κατάλογος γονίδιο περιέχει γονίδια φλεγμονής, όπως η IL-6, IL-8, IL-1β και COX-2, οι οποίες έχουν εκτεταμένες συνδέσεις με καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Pio R, Jia Ζ, Baron VT, Mercola D, UCI NCI SPECS κοινοπραξία από τους στρατηγικούς εταίρους για την αξιολόγηση του Καρκίνου υπογραφές, καρκίνο του προστάτη (2013) Early Growth απόκρισης 3 (Egr3) είναι εξαιρετικά υπερ-εκφράζεται σε μη-Υποτροπιάζουσα του καρκίνου του προστάτη, αλλά όχι σε Υποτροπιάζουσα καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (1): e54096. doi: 10.1371 /journal.pone.0054096

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13η Δεκεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 10, Δεκεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 14 Γενάρη του 2013

Copyright: © 2013 Pio et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την USPHS χορηγεί U01 CA1148102 (ΝΙΗ /NCI SPECS κοινοπραξία) και U01 CA152738 (ΝΙΗ /NCI EDRN), καθώς και από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια Βραβείο Irvine Σχολής Career Development (με τον Δρ Ζ Jia). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δ. Mercola είναι μέτοχος της Proveri Inc. του Σαν Ντιέγκο, μια έναρξη της βιοτεχνολογίας σχετικές δοκιμές -up εταιρείας ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη. Ο Δρ Baron είναι σύμβουλος για PellFiCure Pharmaceuticals, Inc., μια νεοσύστατη εταιρεία αναπτύσσει μια συνδυαστική θεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη. Δεν υπάρχουν στο εμπόριο προϊόντα να δηλώσει. Μια εκκρεμεί αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας είναι: Μιχάλης McClelland, Yipeng Wang, Daniel Mercola: Υλικά και μέθοδοι για τον προσδιορισμό διάγνωση και πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη. Σεπτέμβριος 2011: US 20110236903. Proveri αναπτύσσει ένα multiplex ανοσοϊστοχημεία προστάτη τεστ διάγνωσης του καρκίνου με βάση το υλικό του εκκρεμεί δίπλωμα ευρεσιτεχνίας. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Όλα τα δεδομένα πίνακα ανθρώπινο ιστό που παρατίθενται σε αυτό το χειρόγραφο είναι διαθέσιμη στο κοινό, όπως αναφέρεται στο κείμενο.

Εισαγωγή

Η απάντηση πρώιμης ανάπτυξης (EGR) μεταγραφικοί παράγοντες έχουν από καιρό έχουν εμπλακεί σε πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες σημαντικές για τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων της απόπτωσης, διαφοροποίησης, του πολλαπλασιασμού, αναστολή ανάπτυξης, και η φλεγμονή [1] – [5]. Οι παράγοντες μεταγραφής EGR επάγεται ταχέως και παροδικά σε απόκριση σε ποικίλες ερεθίσματα όπως παράγοντες ανάπτυξης, κυτοκίνες, εστέρες φορβόλης (ΤΡΑ) και ιονίζουσα ακτινοβολία, και να ρυθμίσει μία ποικιλία γονιδίων σε απόκριση σε αυτά τα ερεθίσματα [1], [6] – [ ,,,0],8]. Η οικογένεια EGR αποτελείται από Egr1, EGR2, Egr3, και Egr4 [9] και όλα τα μέλη της οικογένειας συνδέονται προς το στοιχείο DNA ίδια απόκριση EGR (ERE), GCGG /TGGGCG, μέσω τριών διατηρημένων πεδίων σύνδεσης δακτύλου ψευδαργύρου του DNA [10].

Egr1 είναι το καλύτερα μελετημένο μέλος της οικογένειας παράγοντα μεταγραφής. Πολυάριθμες μελέτες έχουν λεπτομερή ογκοκατασταλτικό λειτουργίες του και, κατά συνέπεια, προς τα κάτω ρύθμιση της στην μαστού, των πνευμόνων, και νευρογλοιακά καρκίνων [11] – [13]. Είναι ενδιαφέρον, Egr1 έχει αποδειχθεί ότι δρα ως ένα ογκογονίδιο στον καρκίνο του προστάτη. Πολλαπλές ερευνητές έχουν αναφέρει την υπερ-έκφραση του Egr1 mRNA και της πρωτεΐνης σε καρκίνο του προστάτη [14] – [15]. Τα μοντέλα ποντικού TRAMP και CR2-Τ-Ag του καρκίνου του προστάτη, χρησιμοποιήθηκαν για να εξετασθεί περαιτέρω ο λειτουργικός ρόλος του Egr1 στην έναρξη και εξέλιξη της νόσου. EGR1-null ποντίκια που διασταυρώθηκαν είτε με το μοντέλο του καρκίνου έδειξαν καθυστερημένη εξέλιξη από προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) σε διηθητικό καρκίνωμα [16].

Παρά τα καλά χαρακτηρισμένο λειτουργίες της EGR1, πολύ λιγότερα είναι γνωστά για την άλλη μεταγραφή παράγοντες στην οικογένεια EGR όπως Egr3. Αρκετές μελέτες λεπτομέρεια η λειτουργία των Egr3 στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος, ειδικά των μυών ανάπτυξη της ατράκτου, συμπονετικός διαφοροποίηση των νευρώνων, και η απόκριση σε περιβαλλοντικό στρες (ήχος, το χειρισμό, και νέες καταστάσεις) [17] – [20]. Egr3-ανεπαρκή ποντίκια εμφανίζουν συμπαθητικού δυσαυτονομία και σοβαρή αισθητική αταξία [17], [20], ενώ Egr1-ανεπαρκή ποντίκια παρουσιάζουν καμία εμφανή συμπτώματα συμπεριφοράς ή αναπτυξιακό πρόβλημα [21]. ποντίκια knockout Egr3 δεν έχουν ακόμη χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη του ρόλου του μεταγραφικού παράγοντα στον καρκίνο, ωστόσο πρόσφατες αναφορές έχουν χρησιμοποιηθεί τα μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας και τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης για τη μελέτη της λειτουργίας Egr3 σε διάφορους τομείς που έχουν σημασία για τον καρκίνο. Έτσι, Egr3 είναι up-ρυθμίζεται από αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (VEGF) σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC) [22], [23], και knockdown του Egr3 σε αυτά τα αποτελέσματα κύτταρα σε μία μείωση του VEGF που επάγεται πολλαπλασιασμός, μετανάστευση , και tubulogenesis [23]. Εκτός από το ρόλο του στην αγγειογένεση, αρκετές αναφορές έχουν διερευνηθεί ο ρόλος των Egr3 στον καρκίνο του μαστού, όπου βρέθηκε να είναι ένα γονίδιο οιστρογόνο αποκρίνεται οποίου η ανοσοαντιδραστικότητα συνδέεται θετικά με τον υποδοχέα οιστρογόνου α (ΕΚα) κατάσταση, την κατάσταση λεμφαδένων, και μακρινή μετάσταση [24], [25].

Πολλή δουλειά απομένει να γίνει, όμως, στη διαλεύκανση του ρόλου των Egr3 σε άλλους τύπους καρκίνου. Με βάση την γνώση μας για Egr1 και τα χαρακτηριστικά δεσμευτικά κοινά DNA όλων των παραγόντων μεταγραφής EGR, υποθέτουμε ότι Egr3 παίζει πράγματι έναν ρόλο είτε σχηματισμό ή την πρόοδο του καρκίνου του προστάτη. Εδώ αναφέρουμε την υπερ-έκφραση του Egr3 mRNA και της πρωτεΐνης σε καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό του προστάτη. Εκτός από την μελέτη της υπερ-έκφραση του Egr3, χρησιμοποιήσαμε επίσης τις εκτεταμένες σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης του προστάτη από το Πανεπιστήμιο του προγράμματος Καλιφόρνια-Irvine προδιαγραφές για να εξετάσει την μορφή έκφρασης του Egr3 σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη με γνωστή κατάσταση υποτροπή, και βρήκαν ότι η έκφραση Egr3 σε κύτταρα όγκου είναι χαμηλότερη σε όγκους που υποτροπή σε σύγκριση με τους όγκους που δεν υποτροπιάζουν. Αυτό το πρότυπο έκφρασης: χαμηλή Egr3 mRNA σε φυσιολογικό προστάτη έναντι υψηλής έκφρασης σε καρκίνο, και η διάκριση μεταξύ των υποτροπών και μη υποτροπή, επιβεβαιώθηκε με τον ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων γονιδιακής έκφρασης του καρκίνου του προστάτη από το Πανεπιστήμιο του Pittsburg [26] – [28]

Χρήση της ανθρώπινης πρωτεΐνης Atlas, μπορούμε επίσης να λεπτομέρεια μια μοναδική μέθοδο in-silico για τη διερεύνηση της υπερ-έκφραση της πρωτεΐνης σε Egr3 καρκίνο του προστάτη. Τα συνδυασμένα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι Egr3 είναι ένας βιοδείκτης της κακής έκβασης του καρκίνου του προστάτη. Επιπλέον, μια ομάδα από υψηλή συσχέτιση γονιδίων εμφανίζει ένα παρόμοιο μοτίβο έκφρασης, και τα μέλη αυτής της κλάσης είναι υποψήφιος Egr3-ρυθμιζόμενων γονιδίων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγματα του προστάτη ιστών

δείγματα προστάτη αποκτήθηκαν από ενημερωμένη συγκατάθεση σύμφωνα με το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Irvine Διοικητικό Institutional Review (IRB) -approved και HIPAA συμμορφώνεται πρωτόκολλα. απόκτηση ιστού ήταν μέρος του προγράμματος NCI-SPECS στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Irvine. Προστάτη καρκινικών ιστών συλλέχθηκαν κατά τη στιγμή της προστατεκτομής, επανεξετάζονται από έναν παθολόγο, και καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο. φύλλα παρακολούθησης ιστού διατηρήθηκαν για την καταγραφή του χρόνου που έχει παρέλθει από τη χειρουργική επέμβαση στην κατάψυξη (κατά μέσο όρο 2,8 ώρες). Φυσιολογικά δείγματα προστάτη ήταν είτε καταψύχονται σε υγρό άζωτο από φρέσκο ​​πυρήνες βιοψία ή snap-παγώσει μετά τη συλλογή από την ταχεία αυτοψία πρόγραμμα στο Sun Health Research Institute (Sun City, AZ), μέλος SPECS κοινοπραξίας. Τα δεδομένα αποτελείται από 19 φυσιολογικά δείγματα προστάτη από 13 άτομα (12 από την κανονική βιοψία και 7 από την ταχεία αυτοψία) και 108 δειγμάτων καρκίνου του προστάτη από 84 άτομα (Πίνακας 1). Οι παράμετροι που αξιολογήθηκαν και σχετικών κλινικών δεδομένων από μια εκτενή ιστορία είχαν συσσωρευτεί κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 11 χρόνια και συντηρούνται τα specs βάση σχεσιακών δεδομένων με ένα λεξικό δεδομένων πάνω από 250 είδη. Η παράμετρος αποτέλεσμα «υποτροπή» αναφέρεται σε βιοχημική υποτροπή, η αύξηση των επιπέδων του PSA πάνω από 0,2 ng /ml μετά από μια προηγούμενη μετα-op PSA που ήταν κάτω από το όριο για τη δοκιμή. Μη υποτροπή σημαίνει ότι δεν βιοχημική υποτροπή παρατηρήθηκε στον ασθενή κατά τη διάρκεια της κλινικής πλαίσιο παρακολούθησης του χρόνου. Σημειώστε ότι όλα τα δείγματα όγκων συλλέχθηκαν κατά τη στιγμή της προστατεκτομής, έτσι υποτροπή κατάσταση προσδιορίστηκε μετά τα δείγματα που έχουν ήδη συγκεντρωθεί. Οι σχετικές κλινικές και δημογραφικές τιμές συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

Affymetrix Gene Expression Συστοιχίες και Στατιστική Ανάλυση

RNA από τα δείγματα ιστού του προστάτη αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης Affymetrix. Το RNA παρασκευάστηκε από το φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστό με το διαχωρισμό μπλοκ ιστού με ένα κρυοστάτη και καθαρισμό ολικό RNA άμεσα από τα συσσωρευμένα κατεψυγμένες τομές. Το καθαρισμένο RNA υβριδοποιήθηκε είτε Affymetrix U133 Plus2.0 ή συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης U133A, και οι σειρές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με το πρωτόκολλο Affymetrix. Τα δεδομένα έντασης που χρησιμοποιούνται εδώ είναι διαθέσιμα από δημόσιες πηγές (GEO GSE17951 και Geo GSE8218, αντίστοιχα).

τιμών έντασης Κανονικοποιημένη Affymetrix χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν Egr3 (Affymetrix ID καθετήρα 206115_at) έκφραση σε ολόκληρη δείγματα φυσιολογικού προστάτη και του προστάτη καρκινικό ιστό. Κανονικοποιημένες τιμές των δύο δειγμάτων τύπους συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ί-τεστ ενός σπουδαστή. Ανάλυση LIMMA (Γραμμικά Μοντέλα για μικροσυστοιχιών δεδομένων) από Bioconductor υλοποιήθηκε στο περιβάλλον R για την ανίχνευση διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων [29].

Για να αναλυθεί η εξειδίκευση τύπου κυττάρου έκφρασης του Egr3 και συσχετίζοντας τα γονίδια, χρησιμοποιήσαμε μια πολλαπλή γραμμική παλινδρόμηση (MLR) μοντέλο για να περιγράψει τη σχέση μεταξύ του παρατηρούμενου επιπέδου έκφρασης του γονιδίου και τον κυτταρικό τύπο σύνθεση Affymetrix για τέσσερις τύπους κυττάρων σε υποτροπιάζον και μη-υποτροπιάζουσα περιπτώσεις: (1) όπου είναι το σημείο τομής, είναι το ποσοστό των κυτταρικού τύπου j όπως προσδιορίζεται από μια ομάδα παθολόγους, είναι ο συντελεστής για τη συμβολή από κυτταρικό τύπο, είναι η απόκλιση ή μεταβολή του για τον τύπο κυττάρου όταν τα υποτροπές της νόσου. είναι η μεταβλητή δείκτης υποτροπής κατάστασης. εάν υπόκειται υφίσταται υποτροπή και αλλιώς. είναι το τυχαίο σφάλμα με υποτιθέμενη κατανομή. Αυτό το μοντέλο MLR χρησιμοποιήθηκε για να ταιριάξουν τα δεδομένα για την εκτίμηση των συντελεστών έκφρασης, και, όπου είναι ο συντελεστής έκφραση ειδικού τύπου κυττάρου και γ είναι η διαφορά σε τύπου-ειδική έκφραση των κυττάρων μεταξύ των υποτροπών και μη υποτροπή περιπτώσεις. Έτσι,

β

ι μετρά την έκφραση ενός γονιδίου από τον κυτταρικό τύπο ι μη υποτροπή περιπτώσεις και

γ

j είναι η αλλαγή στο

β

ι σε υποτροπή περιπτώσεις. Για MLR, β

0 είναι η μέση έκφραση όλων των γονιδίων για όλους τους τύπους κυττάρων και την κατάσταση έκβαση (RS). Ως εκ τούτου, β

ι συντελεστές & lt? 0 δείχνουν ότι η έκφραση του γονιδίου j σε ένα δεδομένο κυτταρικό τύπο είναι μικρότερο από το μέσο β

0, ενώ β

ι συντελεστές & gt? 0 δείχνουν αυξημένη έκφραση σε σύγκριση με την β

0. Ομοίως, γ

j & lt? 0 υποδεικνύει ότι η έκφραση του γονιδίου j είναι μειωμένη σε υποτροπιάζοντα καρκίνο προστάτη σε σύγκριση με μη-υποτροπιάζοντα καρκίνο του προστάτη, ενώ γ

j & gt? 0 υποδεικνύει ότι η έκφραση του γονιδίου j αυξάνεται σε υποτροπιάζοντα καρκίνο προστάτη σε σύγκριση με μη-υποτροπή της νόσου. Η σημασία της γ

j προσδιορίστηκε με t-test, με βάση το σ σφάλμα

j του γ

j. Η ακρίβεια των συντελεστών εισφοράς έκφρασης ειδικού τύπου κυττάρου, β, έχει επικυρωθεί [30].

Ανθρώπινη Πρωτεΐνη Atlas

εικόνες Ανοσοϊστοχημεία είχαν κατεβάσει από το διαθέσιμο στο κοινό Ανθρώπινη Πρωτεΐνη Atlas (HPA) ( https://www.proteinatlas.org). ΗΡΑ έκδοση 8.0 είναι μια βάση δεδομένων των μικροσυστοιχιών ιστού (TMA) εικόνες που επισημαίνονται με αντισώματα έναντι 11.250 ανθρώπινες πρωτεΐνες [31]. Οι μικροσυστοιχίες ιστού αποτελούνται από τμήματα από 46 φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς και 20 διαφορετικούς τύπους καρκίνου στον άνθρωπο. Υπάρχουν το πολύ 24 εικόνες του καρκίνου του προστάτη (από 12 ασθενείς) και 3 κανονικές εικόνες προστάτη (από 3 δότες) ανά αντίσωμα, αν και ο αριθμός της εικόνας μπορεί να ποικίλει ανάλογα με το αντίσωμα που αναλύθηκαν. Οι εικόνες HPA αναλύθηκαν ήταν τμήματα του προστάτη επισημαίνονται είτε με Egr3 (HPA006206), PSMA (CAB001451, Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία), ή PRLH (HPA014768) αντισώματα.

Οι εικόνες HPA αναλύθηκαν και η ένταση σήμανσης ποσοτικά με το λογισμικό Aperio ImageScope (Vista, CA) (Σχήματα S1 και S2). Η Θετική Pixel Count Αλγόριθμος έκδοση 9.1 χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί το ποσό της δέσμευσης του αντισώματος και να αποκτήσουν pseudocolored εικόνες TMA. Για να ποσοτικοποιηθεί η επισήμανση συγκεκριμένων δομών, όπως το στρώμα ή acini όγκου, χρησιμοποιήθηκαν οι τιμές κατωφλίου της έντασης που καθορίζονται από το λογισμικό Aperio, σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή.

ένταση Pixel ορίζεται ως μέτρο της φωτεινότητας της το pixel, ή η ποσότητα του φωτός που μεταδίδεται μέσω του slide. Όσο χαμηλότερη είναι η τιμή της έντασης είναι η πιο σκοτεινή η χρώση λόγω της αυξημένης απορρόφησης Α = -log I

obs /I

διαιτητή, όπου

obs δείχνει μεταδίδεται ένταση του φωτός και Ι

ref είναι η περιστατικό ένταση του φωτός. κατώφλια Ένταση τέθηκαν στα 220, 175, 100, και -1 για τους αδύναμους, μεσαία, ισχυρή, και «αρνητικά» pixels, αντίστοιχα. Pseudocolors του μπλε, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο και εφαρμόστηκαν στην αρνητική, αδύναμη, μέσης και ισχυρής pixels, αντίστοιχα.

Κανονικό προστάτη και του καρκίνου του προστάτη ιστών αναλύθηκαν με τη θετική αλγόριθμο αριθμό pixel. Για να συγκριθεί η πυκνότητα της χρώσης σε φυσιολογικά και προστάτη καρκινικούς ιστούς, ο NSR (αριθμός ισχυρό δείκτη θετικής pixels) χρησιμοποιήθηκε. Ο αριθμός των ισχυρώς θετικών επισημασμένου pixels διαιρείται με το συνολικό αριθμό των θετικών pixels να εξομαλύνει κάθε δείγμα στην περιοχή υπό εξέταση, παρέχοντας έτσι την ένταση επισήμανση ενός επιλεγμένου τύπου κυττάρου ανά μονάδα επιφανείας του ιστού.

Η θετική pixel αλγόριθμος καταμέτρηση χρησιμοποιήθηκε επίσης για σύγκριση της έκφρασης πρωτεΐνης στα στρωματικά και επιθηλιακά συστατικά του ιστού του προστάτη. Ένα εργαλείο πένας ποντίκι-οδηγείται χρησιμοποιήθηκε για να περιγράψει 10 στρωματικών και 10 αδένα περιοχές ανά τμήμα TMA. Οι 10 περιοχές δειγματοληψίας επιλέχθηκαν τυχαία όποτε αυτό είναι δυνατό, στο πλαίσιο των περιορισμών μεγέθους των ιστών και τη σύνθεση

Περιορισμοί στο μέγεθος του ιστού:. Ήταν αποφεύχθηκαν η συνολική έκταση του ιστού μόνο το 1 mm σε διάμετρο, και τα άκρα του κάθε τμήματος ιστού γιατί χρώση σε αυτές τις περιοχές τείνουν να επηρεάζονται από την επεξεργασία του TMAs. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε περιοχές δειγματοληψίας που δεν αγγίζουν το ένα το άλλο

Περιορισμοί ως προς τη σύνθεση των ιστών:. Ορισμένα τμήματα του ιστού που περιέχονται πολλές αδένες, και όταν αυτή ήταν η περίπτωση που οι περιοχές δειγματοληψίας επιλέχθηκαν τυχαία. Άλλα τμήματα που περιέχονται πολύ λιγότερες περιοχές αδένα, μειώνοντας επιλογή μας από τους αδένες που ήταν παρόντες. Τα τμήματα στρωματικά, από την άλλη πλευρά, ήταν όλα επιλεγεί τυχαία, δεδομένου ότι οι τομές ιστού είχε πολλές στρωματικά περιοχές.

Ένα στιγμιότυπο πάρθηκε κάθε δείγματος επιλέγονται τυχαία και χρησιμοποιείται για να επαληθεύει ότι τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση ήταν αντιπροσωπευτικό του συνόλου τμήματος.

Τα αποτελέσματα κατά μέσο όρο και να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των σημαντικών διαφορών σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό του προστάτη.

Egr3-συσχετιζόμενων γονίδια

Συντελεστής συσχέτισης του Pearson (R ) και η σχετική πιθανότητα και κλίση υπολογίστηκαν στο περιβάλλον R για το συσχετισμό της έκφρασης του κάθε γονιδίου στην πλατφόρμα συστοιχία Affymetrix με την έκφραση του Egr3. Τα γονίδια με

σ

τιμές ≤0.001 με βάση την ανάλυση συσχέτισης Pearson και συντελεστή συσχέτισης Pearson ≥0.45 επιλέχθηκαν ως ορισμό Egr3-συσχέτιση γονιδίων. γονίδια Egr3-συσχετίζονται για τον κύριο σύνολο δεδομένων SPECS Affymetrix U133 Plus2.0 (127 δείγματα προστάτη) που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, και Egr3-συσχετίζονται γονίδια για ένα σύνολο δεδομένων εκφράσεως γονιδίων επιπλέον προδιαγραφές (136 δείγματα προστάτη) με βάση την πλατφόρμα U133A Affymetrix, υπολογίστηκαν . Η επικάλυψη των γονιδίων μεταξύ συνόλων δεδομένων που τηρούνται οι τιμές αποκοπής σημασία ελήφθησαν ως τον τελικό κατάλογο των Egr3-συσχέτιση γονιδίων. Η κλίση της γραμμής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε επίσης για να χαρακτηρίσει την προσκόλληση του κάθε συσχέτιση για έκφραση Egr3 και αναφέρεται στον Πίνακα S1.

Στατιστική Προσομοίωση

Αρκετές προσομοιώσεις διεξήχθησαν προκειμένου να αξιολογηθεί τυχαία περιστατικό. Σε γενικές γραμμές, η συχνότητα εμφάνισης των συνόλων υποψήφιος ανιχνευτή σε μια τάξη συγκρίθηκε με τη συχνότητα εμφάνισης με τυχαία επιλογή από ίσο αριθμό των σετ καθετήρα από το υπόλοιπο της συστοιχίας, δηλαδή από όλα τα σύνολα ανιχνευτή εκτός από τα σύνολα ανιχνευτή υποψήφιος με τη χρήση του R πρόγραμμα. Τυχαία επιλογή επαναλήφθηκε 10.000 φορές και ο μέσος τυχαία συχνότητα εμφάνισης σε σύγκριση με την παρατηρούμενη συχνότητα των συνόλων ανιχνευτή υποψήφιος χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η πιθανότητα του τυχαίου γεγονότος.

Μεταγραφή Factor θέση σύνδεσης και ανάλυση του δικτύου Gene

Genomatix (Μόναχο, Γερμανία), το λογισμικό MatInspector χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του παράγοντα μεταγραφής τοποθεσίες για περιοχές υποκινητή 1500 βάσεις ανοδικά έως 1000 βάσεις καθοδικά της θέσης έναρξης μεταγραφής (TSS) σύνδεση. Ο παράγοντας μεταγραφής θέσεις σύνδεσης (μήτρες βάρος) βιβλιοθήκη και σπονδυλωτά στοιχεία προαγωγού γενικό πυρήνα (0.75 /Optimized) ομάδα μήτρα χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό θέσεις σύνδεσης για κάθε υποκινητή. Με βάση το μοντέλο φόντο MatInspector για εμφανίσεις του V $ EGRF (TRANSFAC σχολιασμός για τα σπονδυλωτά μέλη Egr Οικογένεια Egr1, EGR2, Egr3, CKROX, και WT) θέσεις πρόσδεσης, ένα 10000 × προσομοίωση διεξήχθη στο περιβάλλον R να συγκρίνει το ποσοστό φόντο (62,7%) του V $ EGRF θέσεις πρόσδεσης όπως προσδιορίζεται με MatInspector στο παρατηρούμενο ποσοστό (99%).

σ

-τιμή = ο αριθμός των φορές την αναμενόμενη ήταν μεγαλύτερη από την παρατηρούμενη /10000 χρησιμοποιώντας Genomatix. Η προσομοίωση

σ

-τιμή παρέχει μια εκτίμηση της ψευδούς ανακάλυψης.

MetaCore (Thomson Reuters, New York, NY), το λογισμικό ανάλυσης μονοπατιού χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση συνδέσεων μεταξύ Egr3-συσχέτιση γονιδίων. ανάλυση εμπλουτισμό μεταγραφικού παράγοντα και την ανάλυση του εμπλουτισμού της λειτουργίας των πρωτεϊνών υπολογίστηκαν με MetaCore χρησιμοποιώντας μια ψεύτικη ρυθμό ανακάλυψης (FDR) 0,05 και ένα πρότυπο υπόβαθρο των αναφερθέντων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης ή πρωτεΐνης-DNA αλληλεπίδραση. Όλες τις φωτογραφίες

σελ

-τιμές που αναφέρονται για την ανάλυση MetaCore προέρχονται απευθείας από τους υπολογισμούς MetaCore που βασίζεται σε μια εκθετική κατανομή. Το web-based πρόγραμμα γονίδιο οντολογία DAVID [32], [33] (https://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) χρησιμοποιήθηκε επίσης για να αναλύσει λειτουργικές συνδέσεις μεταξύ Egr3-συσχέτιση γονιδίων.

εξωτερικές επικύρωση συνόλου δεδομένων

Η δημόσια διαθέσιμες GEO σύνολο δεδομένων GDS2545 χρησιμοποιήθηκε ως εξωτερική επικύρωση της Egr3 και Egr3-συσχέτιση γονιδίων που προσδιορίζονται στο σύνολο δεδομένων SPECS. GDS2545 αποτελείται από 18 δείγματα φυσιολογικού προστάτη από τους δότες, 63 δείγματα φυσιολογικού προστάτη που γειτνιάζουν με όγκο, 65 δείγματα του πρωτογενούς καρκίνου του προστάτη, και 25 δείγματα από μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υβριδισμό σε συστοιχίες U95A Affymetrix. Chandran et al. [27] και Yu et al. τιμές έκφραση Affymetrix Egr3 [26] έκθεση συμπληρωματικές πληροφορίες και στους πίνακες των τιμών γονιδιακής έκφρασης. γονιδιακή ανάλυση Egr3-συσχετιζόμενων διεξήχθη χρησιμοποιώντας αυτό το σύνολο δεδομένων. Το top 150 Egr3-συσχετιζόμενων σύνολα ανιχνευτών, όπως κρίνεται από συσχέτισης του Pearson

σ

-τιμή αποτελείται από 121 μοναδικά γονίδια, τα οποία συγκρίθηκαν με τις 80 μοναδικές Egr3-συσχέτιση γονιδίων που προσδιορίζονται στις SPECS σύνολο δεδομένων δίδοντας επικάλυψη των 43 μοναδικό γονίδια. Μια προσομοίωση 10.000 × πραγματοποιήθηκε σε περιβάλλον R για τον προσδιορισμό της πιθανότητας αυτής της επικάλυψης που συμβαίνουν κατά τύχη (

σ

= 0,0001).

Cell Culture

Μ12 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI ελεύθερο ορού συμπληρωμένο με L-γλουταμίνη, 10 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, 0.1 μΜ δεξαμεθαζόνη, 5 μg /ml ινσουλίνη, 5 μg /ml τρανσφερίνη, 5 ng /ml σελήνιο, 0,05 mg /ml γενταμικίνη και 2.5 μg /ml αμφοτερικίνη Β, όπως περιγράφεται στο [34].

Σταθερό εξόντωση Egr3 Έκφραση σε Μ12 κύτταρα

κύτταρα Μ12 καλλιεργήθηκαν την ημέρα πριν από την επιμόλυνση σε μια πυκνότητα 750.000 κυττάρων /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων, σε μέσο ανάπτυξης ελεύθερο από αντιβιοτικά που περιέχει 2% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 3 μg shRNA σκαρφάλωμα πλασμίδιο (shSCR) ή shEgr3 πλασμίδιο (SA Biosciences, Valencia CA) με 6 μΙ Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πουρομυκίνη (1 μg /ml) προστέθηκε τρεις ημέρες αργότερα για την επιλογή των επιμολυσμένων κυττάρων. κλώνοι απλών κυττάρων απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους. Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα (shSCR-M12 και shEgr3-M12) στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης Μ12 συμπληρωμένο με πουρομυκίνη.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό σε παρουσία αναστολέων πρωτεάσης. Το προϊόν λύσης υποβλήθηκε σε κατεργασία υπερήχων συνοπτικά και εκκαθαρίζονται με φυγοκέντρηση στις 13.200 rpm στους 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας BioRad Protein Assay. Οι πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE ακολουθούμενη από μεταφορά σε μεμβράνη PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% γάλα (w /v) σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα που περιέχει Tween-20 0,5% (TBST) επί 2 ώρες. Egr3 αντίσωμα (sc-191 Σάντα-Cruz Technology, Santa Cruz CA) επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C, ακολουθούμενη από 3 πλύσεις σε TBST. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ΗΚΡ-συζευγμένο αντισωμάτων για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Μετά από 3 πλύσεις σε TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με HyGlo-HRP χημιφωταύγειας κιτ (Denville Scientific, Metuchen NJ). Μεμβράνες απογυμνώθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται με αντι-ακτίνη αντισώματα (Santa-Cruz).

Ποσοτική RT-PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη από κύτταρα shSCR-M12 (έλεγχος αγωνίζομαι) ή shEgr3-M12 χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Plus (Qiagen, Valencia CA) σύμφωνα με τις οδηγίες, και επαναιωρήθηκε σε νερό. ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης φορμαλδεΰδης. Ενα μα RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας την Quanta qScript cDNA Super-mix (5 λεπτά στους 25 ° C? 30 λεπτά στους 42 ° C? 5 λεπτά στους 85 ° C) σε ένα θερμοκυκλοποιητή. Σε πραγματικό χρόνο qPCR διεξήχθη επί ΑΒΙ Prism 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, CA) χρησιμοποιώντας πρότυπες παραμέτρους. Κάθε δείγμα τρέχει σε τέσσερα αντίγραφα με ανάλυση καμπύλης διαστάσεως. Οι διαφορές στα επίπεδα mRNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το -ΔΔCT μέθοδο 2

. GAPDH χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των δειγμάτων. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρέχονται στο Σχήμα S4.

Reporter Assay

Το ανθρώπινο υποκινητή IL8 (βάσεις -262 να -55) κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pGL3 λουσιφεράσης και τον έλεγχο πλασμιδίου λουσιφεράσης pRL-SV40 Renilla ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Carlotta Glackin (City of Hope, Los Angeles, CA) και έχουν περιγραφεί στο Li et al. [35]. Το πλασμίδιο IL6-pGL3 λουσιφεράσης περιέχει τον υποκινητή IL6 ήταν ένα δώρο από τον Dr. Steve Cole (UCLA, CA) και έχει περιγραφεί στο Eickelberg et al. [36]. Τα κύτταρα shSCR-M12 και τα κύτταρα shEgr3-M12 απλώθηκαν σε πυκνότητα 20.000 κύτταρα /φρεάτιο σε μια λευκή πλάκα 96-φρεατίων την ημέρα πριν από την επιμόλυνση, και αναπτύχθηκαν σε ελεύθερο από αντιβιοτικά, άνευ ερυθρού φαινόλης μέσο ανάπτυξης. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με IL6-pGL3 ή IL8-pGL3 πλασμίδια και το πλασμίδιο λουσιφεράσης Renilla (για την εξομάλυνση για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης και αριθμών κυττάρων). FuGene αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Promega, Madison, WI) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με 160 ng πλασμιδίου pGL3, 40 ng πλασμιδίου pRL και 0,6 μl FuGene. Δύο ημέρες αργότερα, αντιδραστηρίου Dual-Glo λουσιφεράσης (Promega) προστέθηκε στο μέσο ανάπτυξης (1:01 ο /ο) και επωάστηκαν για 10 λεπτά RT. Οι πλάκες διαβάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο Dynatech ML-3000. Η αντίδραση σβήστηκε με την προσθήκη του Dual-Glo Stop & amp? αντιδραστήριο Glo, η οποία εκκινεί επίσης την αντίδραση λουσιφεράσης Renilla, για 10 λεπτά σε RT πριν από την ανάγνωση. Η αναλογία της Firefly για να ΚβηϊΙΙθ φωταύγεια υπολογίστηκε για κάθε φρεάτιο.

Αποτελέσματα

Τύπος ειδικών κυττάρων RNA έκφραση της Egr3 αυξάνεται σε καρκίνο του προστάτη

Αναλύσαμε Affymetrix ολόκληρο το γονιδίωμα δεδομένα έκφρασης από φυσιολογικό και καρκινικό ιστό προστάτη για να προσδιοριστεί εάν Egr3 εκφράζεται διαφορικά. Τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης Affymetrix U133 Plus2.0 αποτελείται από 19 φυσιολογικά δείγματα προστάτη (που λαμβάνεται από 13 δότες) και 108 δείγματα όγκου προστάτη (που λαμβάνεται από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη 84? Διάφορα δείγματα από τους ίδιους ασθενείς ήταν παρόντες στο σύνολο δεδομένων εκφράσεως γονιδίων). Ασθενής δημογραφικά πληροφορίες για τους 84 ασθενείς με καρκίνο και τους 13 φυσιολογικούς δότες ιστού συνοψίζεται στον Πίνακα 1. Η ανάλυση των κανονικοποιημένα δεδομένα έκφρασης από τα δείγματα 127 προστάτη αποκάλυψε ότι Egr3 (ανιχνευτής σετ 206115_at) είναι σημαντικά υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικά προστατικού ιστού. Σημαίνει η έκφραση στον καρκίνο του προστάτη είναι 5,35 φορές υψηλότερο από ό, τι στο φυσιολογικό ιστό του προστάτη και t-test του μαθητή (

σ

= 2 × 10

-15) επιβεβαίωσε ότι η διαφορά αυτή είναι πολύ σημαντική. Ανάλυση των μέσων τιμών έκφρασης αποκαλύπτει επίσης μια σημαντική διαφορά στην έκφραση Egr3 μεταξύ κανονικών δειγμάτων προστάτη και του καρκίνου του προστάτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ένα ιστόγραμμα της έκφρασης Egr3 σε όλες τις ασθενείς φαίνεται στο Σχήμα 1. Οι τιμές έκφρασης Egr3 εμφανίζονται ως Affymetrix τιμές έντασης και όχι σε μια κλίμακα log2 για να εμφανιστεί καλύτερη σειρά τους. Δεδομένου ότι οι μέσες ηλικίες των περιπτώσεων που φέρουν όγκο διαφέρει από εκείνη των κανονικών περιπτώσεων (Πίνακας 1), η διαφορά έκφραση Affymetrix για Egr3 συγκρίθηκε με τη λίστα των προηγουμένως προσδιορισθείσα αλλαγές σχετίζονται με την ηλικία του Jia et al. [37] βασίζεται στη σύγκριση των δεδομένων έκφρασης για 15 φυσιολογικά δείγματα βιοψίας προστάτη με μέσο όρο ηλικίας 54 ετών για εκείνους για τους 13 ταχείας αυτοψίας δειγμάτων με μέσο όρο ηλικίας τα 84 έτη. Από τις 3400 σειρές ανιχνευτών δώσουν σημαντικές διαφορές εντοπίστηκαν σε αυτή τη σύγκριση, δεν περιελήφθησαν σετ καθετήρα για Egr3. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αυξημένη έκφραση του Egr3 δεν συνδέεται με τη διαφορά ηλικίας μεταξύ φυσιολογικούς δότες και ασθενείς με καρκίνο του προστάτη και σχετίζεται με μία ή περισσότερες ιδιότητες ειδικά για ιστό που φέρει όγκο του προστάτη.

Affymetrix έκφραση αποτυπώνεται στον μια γραμμική κλίμακα όπου το αντι-log

2 της αξίας έκφρασης Egr3 κάθε ασθενούς αποτυπώνεται στον άξονα γ. Η διακεκομμένη γραμμή στο 1292 υποδηλώνει τη μέση τιμή της έντασης Egr3 για όλα τα δείγματα.

Η

Επικύρωση σε επίπεδο πρωτεΐνης με ένα σύνολο εξωτερικών δεδομένων

Αν και Egr3 είναι up-ρυθμίζονται σε επίπεδο mRNA , μπορεί να είναι το επίπεδο της πρωτεΐνης Egr3 που είναι σημαντικό για τη λειτουργία του Egr3 στον καρκίνο του προστάτη. Για να συμπληρώσει τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιήσαμε ένα

in silico

προσέγγιση για την ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης Egr3 στον προστατικό ιστό. Η ανθρώπινη πρωτεΐνη Atlas (ΗΡΑ) είναι μια συλλογή δεδομένων μικροσυστοιχιών ιστού για 20 διαφορετικούς τύπους καρκίνου και 46 φυσιολογικούς ιστούς (https://www.proteinatlas.org). πρότυπα μορφολογίας του ιστού και την έκφραση της πρωτεΐνης για τα δείγματα ασθενών ΗΡΑ επαληθεύθηκαν από έναν παθολόγο πίνακας-επικυρωμένο. ΗΡΑ παρέχει μία ένδειξη της έκφρασης πρωτεΐνης σε καρκίνο σε σύγκριση με την κανονική τους ομολόγους ιστό. Οι εικόνες HPA είχαν κατεβάσει για περαιτέρω ποσοτική ανάλυση. Οι διαθέσιμες εικόνες ανοσοϊστοχημεία προστατικού ιστού για χρώση Egr3 αποτελούνται από δείγματα καρκίνου του προστάτη 20 από 11 ασθενείς και 3 φυσιολογικά δείγματα προστάτη από 3 δότες.

Χρησιμοποιήσαμε τον αλγόριθμο καταμέτρηση θετική pixel Aperio ImageScope να ποσοτικοποιηθεί η ένταση της χρώσης Egr3 ( HPA006206). Pseudocolors εφαρμόστηκαν όπως περιγράφεται στις Μεθόδους και φαίνονται στο Σχήμα 2. Αν και χρησιμοποιήθηκαν μόνο τέσσερα επίπεδα κατωφλίου, οι pseudocolored εικόνες απεικονίζουν σαφώς ότι η ένταση χρώσης Egr3 χώριζε το επιθηλιακό περιέχει αδενικές δομές από άλλα χαρακτηριστικά, όπως το στρώμα (Σχήμα 2), υποδεικνύοντας ότι η απλή μέθοδος κατωφλίου διαχωρίζονται επαρκώς αδενικό στοιχεία από όλα τα άλλα. Το στρώμα ήταν ως επί το πλείστον άνευ χρώσης Egr3. Και για τα δύο φυσιολογικά και καρκινικά δείγματα, η κυρίαρχη αντι-Egr3 πρότυπο χρώσης ήταν ομοιόμορφα επιθηλιακά. Εντός επιθηλιακά κύτταρα, η χρώση Egr3 παρατηρήθηκε στα cytosol- διαμερίσματα μεμβράνης και ασθενώς στον πυρήνα

Α-Β:. ΗΡΑ κανονικό προστάτη, οι ασθενείς 2098 και 2472, αντίστοιχα. C-D: δείγματα ΗΡΑ καρκίνο του προστάτη, οι ασθενείς 3303 και 3744, αντίστοιχα. Όλες οι επιπλέον διαθέσιμες περιπτώσεις HPA εμφανίζεται στις πληροφορίες συμπλήρωμα. Ε:. Ιστόγραμμα ισχυρό δείκτη θετικών pixel (NSR) για κανονικά και προστάτη ασθενών με καρκίνο

Η

Αν και μεταγραφικούς παράγοντες μπορεί να αναμένεται να εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα, αυτό το μοτίβο χρώσης δεν είναι μοναδική για Egr3 στην ανθρώπινη πρωτεΐνη Atlas. Ως παράδειγμα, εξετάσαμε την χρώση ενός καλά μελετηθεί παράγοντας μεταγραφής, c-fos. Η χρώση για c-fos (HPA018531) είναι ως επί το πλείστον την πυρηνική, αλλά εμφανίζεται επίσης σε μια κυτταροπλασματική μεμβράνη-εντόπιση σε τέσσερα από τα δέκα ιστούς καρκίνου του προστάτη που χρωματίζονται θετικά για c-fos.

Είναι επίσης πιθανό ότι Egr3 εντοπισμός μεταβάλλεται σε παθολογικές καταστάσεις, όπως είναι η περίπτωση για τον παράγοντα μεταγραφής και ογκοκατασταλτικών ρ53, για παράδειγμα. Πράγματι, άγριου-τύπου ρ53 συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων σε φλεγμονώδεις καρκίνο του μαστού ή νευροβλάστωμα, που οδηγεί σε λειτουργική απενεργοποίηση της [38] – [40]. Θα μπορούσε να είναι ενδιαφέρουσα, στο μέλλον, να επιβεβαιώσει την κυτταροπλασματική εντόπιση /μεμβράνη Egr3 και τη σημασία της.

Για την ποσοτικοποίηση χρώση Egr3 επιλέξαμε ένα μέσο όρο των περιφερειών 10 αδένα και 10 στρώμα σε κάθε δείγμα ασθενούς. Κάθε ένα από τα 10 περιφερειών οριοθετείται χρησιμοποιώντας το δείκτη του ποντικιού-καθοδηγείται έτσι ώστε συμπεριλήφθηκαν μόνο περιοχές των καθαρών ιστολογικών χαρακτηριστικό, όπως αδένες και σχηματισμοί όγκων αδένα-όπως. Ο αυλός και pseudolumen αδένα λογισμικού αναγνωρίζονται αποκλείεται πιστά και pixels των περιοχών αυτών, εφόσον είχε ληφθεί μέριμνα για τον αποκλεισμό του αυλού με τα συντρίμμια. Οι προκύπτουσες Egr3 τιμές έντασης χρώσης και από τις 10 περιοχές για όγκο και στρώμα ομαλοποιήθηκαν ξεχωριστά. Γι ‘αυτό το βήμα, ο αριθμός των αδύναμων, μεσαίων και έντονα χρωματισμένο pixels ήταν σταθμισμένο (ασθενής = 1, medium = 2, ισχυρή = 3).