Αφηρημένο

Αντοχή στην σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση είναι μια σημαντική αιτία της αποτυχίας της θεραπείας με προχωρημένο καρκίνο της ουροδόχου κύστης (BC) ασθενείς. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι οι microRNAs εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την πρόοδο της BC. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη λειτουργία των microRNAs στην πρόβλεψη της επίδρασης των επικουρική χημειοθεραπεία στην επιβίωση BC και τη ρύθμιση ανταπόκριση στη σισπλατίνη. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, θα χρησιμοποιηθεί RT-qPCR να αξιολογηθεί η κλινική σημασία του miR-203 έκφρασης σε 108 ιστούς των ασθενών π.Χ. λήψη της σισπλατίνης επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη, και πραγματοποιείται in vitro μελέτες για τη διερεύνηση χημειοθεραπευτικών ευαισθησία έναντι σισπλατίνης σε miR-203 που υπερεκφράζουν π.Χ. κύτταρα. Βρήκαμε επίπεδα miR-203 ήταν σημαντικά χαμηλότερες στην ομάδα εξέλιξης π.Χ. από ομάδα μη-εξέλιξης (

P

& lt? 0.001). ROC ανάλυση καμπύλης που απεικονίζεται miR-203 θα μπορούσε να διακρίνει σημαντικά προοδευμένη ασθενείς από εκείνους χωρίς εξέλιξη (

P

& lt? 0.001), δίνοντας μια περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC των 0.839 (95% CI, 0,756 – 0,903). Επιπλέον, τα χαμηλά miR-203 έκφρασης συσχετίζεται με μικρότερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) των ασθενών π.Χ., και ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας. Η υπερέκφραση του miR-203 στο 5637 και τα κύτταρα Τ24 π.Χ. θα μπορούσε να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων, την ενίσχυση της σισπλατίνης κυτταροτοξικότητα, και να προωθήσει την απόπτωση. Western και δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης έδειξε Bcl-w και Survivin ήταν άμεση κατάντη στόχοι του miR-203. Υπήρξε επίσης μια σημαντική αντίστροφη σχέση μεταξύ miR-203 και Bcl-w ή Σουρβιβίνης έκφραση σε ιστούς π.Χ. (r = -0,781, -0,740, τόσο

P

& lt? 0.001). Εν κατακλείδι, μειώθηκε miR-203 προβλέπει την εξέλιξη και την κακή πρόγνωση για τους ασθενείς π.Χ. αγωγή με σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση ενώ miR-203 υπερέκφραση μπορεί να ενισχύσει σισπλατίνη ευαισθητοποίηση μέσω της προώθησης της απόπτωσης μέσω απευθείας στόχευση Bcl-w και Survivin

Αιτιολογική αναφορά.: Zhang Χ, Zhang Υ, Liu Χ, Fang Α, Li P, Li Ζ, et al. (2015) microRNA-203 είναι ένας προγνωστικός δείκτης σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης και ενισχύει χημειοευαισθησία να Cisplatin μέσω απόπτωσης από Στόχευση Bcl-w και Σουρβιβίνης. PLoS ONE 10 (11): e0143441. doi: 10.1371 /journal.pone.0143441

Επιμέλεια: Bernard Μαρί, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Γαλλία

Ελήφθη: 30 του Ιούλη του 2015? Αποδεκτές: 4 Νοέμβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 Νοέμβρη του 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (https://www.nsfc.gov.cn/) σε CW (Νο 81271916) ? Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (https://www.nsfc.gov.cn/) να XZ (Νο 81301506)? Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shandong (https://www.sdnsf.gov.cn/portal/) να XZ (ZR2013HQ063)? . Και Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης της Κίνας (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm) να XZ (Αρ 20130131120067)

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Παγκοσμίως, ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης (π.Χ.) είναι η δεύτερη πιο συχνή κακοήθεια του ουροποιητικού συστήματος, με περίπου 386.300 νέα κρούσματα και 150.200 θανάτους ετησίως [1 ]. Επειδή οι περισσότεροι ασθενείς τοπικά προχωρημένο BC βιώνουν υποτροπή μετά ριζική κυστεκτομή [2], επικουρική χημειοθεραπεία συνήθως προσχηματισμένα σε μια προσπάθεια να καθυστερήσει την επανάληψη και να παρατείνει την επιβίωση. Επί του παρόντος, η σισπλατίνη είναι ένα από τα πιο σημαντικά φάρμακα χημειοθεραπείας σε θεραπευτική αγωγή σε συνδυασμό π.Χ., όπως MVAC (μεθοτρεξάτη, βινβλαστίνη, δοξορουβικίνη, και σισπλατίνη) και GC (γεμσιταβίνη και σισπλατίνη). Ωστόσο, μόνο το 50% των μυών ασθενών επεμβατικές π.Χ. ανταποκρίθηκαν στην σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση [3]. Ακόμη χειρότερα, κάποιοι ασθενείς υποφέρουν μόνο τοξικότητα χωρίς την επίτευξη χημειοθεραπευτικών όφελος. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να προβλεφθεί η επίδραση της συμπληρωματικής χημειοθεραπείας στην επιβίωση π.Χ. και να κατανοήσουν τους μηχανισμούς που εμποδίζουν την ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία.

Πρόσφατες μελέτες έχουν βρει αντίσταση στη θεραπεία με σισπλατίνη θα μπορούσε να διαμεσολαβείται από microRNAs (miRNAs) [ ,,,0],4, 5]. miRNAs είναι μια κατηγορία μη-κωδικοποίησης ρυθμιστικών RNAs που αποτελείται από περίπου 22 νουκλεοτίδια τα οποία λειτουργούν κυρίως για να ρυθμίζουν προς τα κάτω mRNAs στόχο με ειδική πρόσδεση στο 3′-αμετάφραστη περιοχή τους (3′-UTR) και ακολούθως την προώθηση αποικοδόμηση ή /και αναστολή της μετάφρασης [6, 7]. Πολλαπλές δημοσιεύσεις έχουν τεκμηριώσει miRNAs μπορούν να δράσουν ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια που εμπλέκονται στο σχηματισμό όγκου, τη συντήρηση και τη μετάσταση, και είναι πιθανοί βιοδείκτες για τη διάγνωση του καρκίνου, θεραπευτικού αποτελέσματος και την πρόγνωση [8-10]. Μεταξύ αυτών, miR-203 συνήθως δρα ως καταστολέας όγκου, και ρυθμίζεται προς τα κάτω σε πολλαπλούς τύπους ανθρώπινων κακοηθειών περιλαμβανομένων BC [11]. Πρόσφατα, miR-203 έκφρασης έχει συνδεθεί με την ανάπτυξη της αντίστασης κατά τη χημειοθεραπεία σε πολλούς καρκίνους. Για παράδειγμα, τα επίπεδα miR-203 μειώθηκαν σε αποκτήθηκαν χημειοθεραπεία του καρκίνου του μαστού κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο [12]. Η υπερέκφραση του miR-203 αύξησε την αντικαρκινική δράση της πακλιταξέλης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων μέσω αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την προώθηση της κυτταρικής απόπτωσης και θανάτου [13]. Σε αντίθεση, Zhou et al [14] διαπιστώθηκε εξωγενή έκφραση του miR-203 που επάγεται αντίσταση στη οξαλιπλατίνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Μέχρι τώρα, υπάρχει μικρή γνωστά για τον πιθανό ρόλο του miR-203 στην σισπλατίνη βασίζεται π.Χ. χημειοθεραπεία και απαιτείται περαιτέρω έρευνα.

Σε αυτή τη μελέτη, miR-203 εξετάστηκε σε κλινικά εκτομή ιστών π.Χ. αντιμετωπίζονται με ριζική κυστεκτομή και σισπλατίνη επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη, και η συσχέτιση μεταξύ miR-203 και πρόγνωση αναλύθηκε. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι μηχανισμοί που διέπουν το ρόλο του miR-203 στο χημειοαντίσταση της BC. Βρήκαμε χαμηλή έκφραση του miR-203 συσχετίστηκε με την εξέλιξη και την κακή επιβίωση των ασθενών π.Χ. λήψη της σισπλατίνης επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη. Περαιτέρω, αποκατάσταση της έκφρασης miR-203 θα μπορούσε να ενισχύσει την ευαισθησία του cisplatin σε κύτταρα BC μέσω της προώθησης κυτταρικής απόπτωσης με στοχοθέτηση Bcl-w (επίσης γνωστή ως BCL2L2) και Survivin (επίσης γνωστή ως BIRC5), η οποία έδειξε miR-203 θα μπορούσε να έχει κάποια πιθανή αξία στην πρόβλεψη πρόγνωση και θεραπευτική εφαρμογή.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα ιστών

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Shandong, και γραπτές ενημέρωσε συγκατάθεση από κάθε ασθενή ελήφθη επίσης. Η αρχική μελέτη συμμετείχαν συνολικά 149 ασθενείς π.Χ. αντιμετωπίζονται με ριζική κυστεκτομή και σισπλατίνη επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη στην Qilu Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Shandong μεταξύ Απριλίου 2007 και Μαρτίου 2010. Όλοι οι ασθενείς είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένη εντοπισμένο καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο, που ανέβηκε ως pT3a-4α /N + και M0 σύμφωνα με 2010 κατάταξη AJCC /ΤΝΜ. Το πρότυπο χημειοθεραπευτικό σχήμα (MVAC ή GC) δόθηκε μεταξύ 3 έως 10 εβδομάδες μετά την πλήρη εκτομή, με μέγιστο αριθμό 6 κύκλων εκτός εξέλιξης ή μη αποδεκτή τοξικότητα εμφανίστηκε. Από αυτούς, οι 25 έλαβαν ακτινοθεραπεία, θεραπεία με BCG ή εισαγωγική χημειοθεραπεία, και 16 αποκλείστηκαν λόγω της ατελούς εκτομής. Οι προφυλάκισής 108 ασθενείς παρακολουθήθηκαν με κυστεοσκόπηση τριμηνιαία για τα πρώτα 2 χρόνια, στη συνέχεια, ανά εξάμηνο έως 5 χρόνια, και στη συνέχεια ετησίως μέχρι τον Ιανουάριο του 2015. Η εξέλιξη ορίστηκε ως τοποπεριοχική υποτροπή, απομακρυσμένη μετάσταση, ή ο θάνατος οφείλεται σε BC. Επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) υπολογίστηκε από το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης για την ημερομηνία της πρώτης εξέλιξης, και τη συνολική επιβίωση (OS) υπολογίστηκε από το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης για την ημερομηνία θανάτου. Ασθενείς χωρίς παραπάνω εκδήλωση περικόπηκαν την ολοκλήρωση της μελέτης. Όλοι οι ιστοί καταψύχθηκαν και επιβεβαιώθηκε από παθολογική ανάλυση, και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του RNA.

Κυτταρικές γραμμές και καλλιέργεια

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές BC (5637 και Τ24) και ΗΕΚ 293Τ κυτταρική γραμμή αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C με ένα υγροποιημένο περιβάλλον 5% CO

2 σε αέρα.

η επιμόλυνση

Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για ΜΙΚ 203 μιμείται /miRNA μιμείται αρνητικές επιμολύνσεις ελέγχου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. miR-203 μιμείται (Dharmacon, Lafayette, CO, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) ήταν διπλής έλικας RNA ολιγονουκλεοτίδια σχεδιασμένα να μιμούνται ενδογενείς, ώριμη miR-203. μιμείται miRNA αρνητικό μάρτυρα (Dharmacon) βασίστηκε σε cel-miR-67, ώριμο σειρά: UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA, και είχαν τον ίδιο σχεδιασμό και τροποποιήσεις ως miR-203 μιμείται

εξαγωγή RNA και RT-qPCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ιστούς χρησιμοποιώντας πρότυπη μέθοδο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και μετράται με φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA). RT-qPCR διεξήχθη σε ΑΒΙ PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Ανίχνευση miR-203 διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Για Bcl-w και Σουρβιβίνη mRNAs ποσοτικοποίηση, το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), τότε η 10-πλάσια αραιωμένο cDNA ενισχύθηκε με υδραυλικό SYBR Green PCR Master Mix ( Applied Biosystems). Το σχετικό επίπεδο έκφρασης του miR-203 και Bcl-w και Survivin mRNAs υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας 2

-ΔΔCT μέθοδος μέσω της ανηγμένης σε γονίδια U6 snRNA και GAPDH mRNA αναφοράς, αντίστοιχα.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

η βιωσιμότητα των κυττάρων ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας τη μέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8? Diojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κύτταρα (5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων εις τριπλούν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, και επωάστηκαν με 0, 5, 10, 15, 20, 25 και 30 μΜ cisplatin σε 100 μΐ μέσο καλλιέργειας για ένα άλλο 24h. Στη συνέχεια, WST-8 προστέθηκε υπόστρωμα στους 37 ° C για 2 ώρες, και η απορρόφηση διαβάστηκε από φασματοφωτόμετρο στα 450nm.

Η κυτταρομετρία ροής για ανίχνευση απόπτωσης

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης αναλύθηκε με τη χρήση ενός αννεξίνη V-FITC κιτ χρώσης /ΡΙ (BestBio, Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) διεγέρθηκαν με 5 μΜ σισπλατίνη για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέγονται. Μετά από πλύση 3 φορές με με ψυχρό PBS, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που ακολουθείται από χρώση με Annexin V-FITC για 15 λεπτά και ΡΙ για 5 λεπτά στο σκοτάδι δεσμευτική. 1 × 10

4 κύτταρα αξιολογήθηκαν σε μια ροή FACS Calibur κυτταρομετρητή (BD, Bedford, MA, USA). Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν.

TUNEL δοκιμασία

Κύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων εις τριπλούν μετά την επιμόλυνση, και επωάστηκαν με 5 μΜ σισπλατίνης σε 100 μΐ μέσο καλλιέργειας για 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά, στη συνέχεια εξουδετερώθηκε με 2 mg /ml γλυκίνη για 5 λεπτά, διαπερατά σε 0.1% Triton Χ-100 για 10 λεπτά, και τελικά επισημασμένου με φλουορεσκεΐνη-12-dUTP χρησιμοποιώντας τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης. Η εντοπισμένη πράσινος φθορισμός των αποπτωτικών κυττάρων (φλουορεσκεΐνη-12-dUTP) ανιχνεύθηκε με μικροσκοπία φθορισμού.

κηλίδωση Western ανάλυση

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν σε παγωμένο δοκιμασία ράδιο ανοσοκαταβύθιση (RIPA) ρυθμιστικό διάλυμα για 30 λεπτά, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad, CA, USA). Τριάντα δείγματα πρωτεΐνης μg φορτώθηκαν και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε πολυβινυλιδένιο φθορίδιο μεμβράνες (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA). Οι μεμβράνες πρώτα αποκλείστηκαν με 5% άπαχο αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες, στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-ΒοΙ-νν (1: 1000? Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA), αντι-Survivin (1: 1000? Abcam, Cambridge, Massachusetts, USA) ή μονοκλωνικού αντισώματος κουνελιού αντι-β-ακτίνης (1: 1000? Cell Signaling Technology) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με HRP-σημασμένο δευτερεύον αντίσωμα (1: 5000? Cell Signaling Technology) για 1 σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) επί FluorChem E χημιφωταύγειας Western Blot Σύστημα Απεικόνισης (Cell Biosciences, Santa Clara, CA, USA).

δοκιμασίας λουσιφεράσης ανταποκριτή

Η pmiR-ΕΚΘΕΣΗ

TM φορείς (RiboBio, Guangzhou, Κίνα) κατασκευάστηκαν με άγριου τύπου (WT) ή μεταλλαγμένο (MUT) 3′-UTR της Bcl-w και Survivin, και όλες οι αλληλουχίες ήταν παρεμβάλλεται μεταξύ του hRluc και το γονίδιο hLuc. κύτταρα ΗΕΚ293Τ (1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και συν-επιμολύνθηκαν με miR-203 /αρνητικό έλεγχο φορέα miRNA και WT-Survivin 3′-UTR /MUT- Survivin 3′-UTR διάνυσμα ή WT-Bcl-w 3′-UTR φορέα /MUT- Bcl-w 3′-UTR φορέα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν.

Στατιστική Ανάλυση

Η έκφραση miR-203 σε δείγματα ιστού προσδιορίστηκε ως μη κανονική κατανομή με τη χρήση της δοκιμής Kolmogorov-Smirnov. Έτσι, Mann-Whitney U test ή δοκιμή Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σημασία του miR-203 διαφορές μεταξύ των ομάδων. λειτουργούν χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη δέκτη διεξήχθη για να αξιολογήσει την ισχύ των διακρίσεων του miR-203 για διακρίσεις προχώρησε ασθενείς από εκείνους που δεν έχουν εξέλιξη, και η βέλτιστη τιμή αποκοπής ορίστηκε με βάση δείκτη Youden (ευαισθησία + ειδικότητα-1) [16]. Οι καμπύλες επιβίωσης κατασκευάσθηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier, και σε σύγκριση με την δοκιμασία log-rank. Cox μοντέλο που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των ανεξάρτητων παραγόντων της PFS και OS. t-test του Student πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία των δεδομένων σε δοκιμασία βιωσιμότητας, δοκιμασία απόπτωσης και δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή. Η σχέση μεταξύ του miR-203 και η έκφραση του γονιδίου-στόχου εξερευνήθηκε από Spearman συσχέτιση. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS Statistics 17.0 για Windows (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Αποτελέσματα

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών

Η μέση ηλικία του 108 π.Χ. ασθενείς που έλαβαν σισπλατίνη επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη ήταν 62 (εύρος 42-81) έτη και η μέση περίοδος παρακολούθησης ήταν 51,5 (εύρος 6-65) μήνες. Κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης, 45 ασθενείς παρουσίασαν εξέλιξη, εκ των οποίων 32 περιπτώσεις είχε τοποπεριοχική υποτροπής, 11 περιπτώσεις έδειξε μακρινή μετάσταση, και 39 τελικά πέθανε με BC. Τα χαρακτηριστικά βασικής γραμμής λεπτομέρεια των ασθενών φαίνονται στον πίνακα 1.

Η

Μειωμένη έκφραση miR-203 συνδέθηκε με την εξέλιξη της νόσου

Τα επίπεδα miR-203 μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα εξέλιξη σε σύγκριση με το ομάδα μη-εξέλιξης (

P

& lt? 0.001? Σχήμα 1Α και S1 αρχείου). καμπύλες ROC αναλύει εικονογραφημένα miR-203 απέδωσε μια περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC αξίας (AUC) των 0.839 (95% CI, 0,756 – 0,903) για τη διάκριση των ασθενών με εξέλιξη από εκείνους χωρίς εξέλιξη, η οποία ήταν πιο ακριβή από ό, τι μαντέψουν (

P

& lt? 0.001? Σχήμα 1Β). Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές συσχετίσεις βρέθηκαν μεταξύ miR-203 επίπεδα και την ηλικία, το φύλο, τάξη, το στάδιο Τ, κομβική θέση, και χημειοθεραπευτικά σχήματα (όλα σε

P

& gt? 0,05? Πίνακας 2).

(α) επίπεδα miR-203 ανιχνεύθηκαν με τη μέθοδο RT-qPCR και κανονικοποιημένο έναντι U6 RNA σε 108 περιπτώσεις ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Επίπεδα miR-203 στην ομάδα εξέλιξης ήταν σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες στην ομάδα μη-εξέλιξης (

P

& lt? 0,001, Mann-Whitney τεστ U). διακρίνονται ασθενείς (Β) της καμπύλης ROC με την εξέλιξη από εκείνους χωρίς εξέλιξη χρησιμοποιώντας miR-203, με μια περιοχή κάτω από την τιμή της καμπύλης ROC των 0.839 (95% CI, 0,756 – 0,903). (C, D) Kaplan-Meier καμπύλες PFS και OS βασίζεται σε miR-203 έκφραση των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Η βέλτιστη τιμή αποκοπής (0.345) που υπολογίζεται με ανάλυση ROC χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση των ασθενών ως υψηλής και χαμηλής miR-203 ομάδες έκφρασης. Χαμηλή έκφραση του miR-203 συσχετίστηκε σημαντικά με κοντή PFS ή OS. (Τόσο

P

& lt? 0,001, δοκιμασία log-rank)

Η

miR-203 προβλέψει πρόγνωση σε ασθενείς π.Χ., μετά τη χημειοθεραπεία

με βάση την βέλτιστη τιμή αποκοπής (0.345) υπολογίζονται με ανάλυση ROC για την εξέλιξη π.Χ., μετά τη χημειοθεραπεία, 79 ασθενείς των οποίων miR-203 επίπεδα ήταν πάνω από 0.345 ταξινομήθηκαν ως ομάδα υψηλού έκφραση του miR-203 , οι υπόλοιπες 29 περιπτώσεις είχαν ταξινομηθεί ως ομάδα χαμηλής έκφρασης του miR-203. Καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε χαμηλή έκφραση του miR-203 συσχετίστηκε σημαντικά με κοντή PFS και OS (Τόσο σε

P

& lt? 0.001? σχήμα 1Γ και 1Δ).

αναλύσεις παλινδρόμησης μονοπαραγοντική Cox αποκάλυψε σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των miR-203, το στάδιο Τ, κομβική θέση και PFS (όλα σε

P

& lt? 0,05? πίνακας 3), καθώς και miR-203, το στάδιο και το λειτουργικό σύστημα T (όλα σε

P

& lt? 0,05? Πίνακας 3). Όταν βάζοντας πάνω από τους σημαντικούς παράγοντες στην πολυμεταβλητή μοντέλο Cox, miR-203, το στάδιο Τ, και κομβικά κατάσταση αποδειχθεί ανεξάρτητη προγνωστική αξία για PFS (όλα σε

P

& lt? 0,05? Πίνακα 3), και miR-203, Τ στάδιο αποδειχθεί ανεξάρτητη προγνωστική αξία για το OS (όλα σε

P

& lt? 0,05? Πίνακας 3).

Η

Η υπερέκφραση του miR-203 ενισχύεται ευαισθητοποίηση σισπλατίνη σε κύτταρα π.Χ.

για να διερευνήσει την επίδραση της miR-203 στην σισπλατίνη χημειοευαισθησία στα κύτταρα π.Χ., καμπύλες συγκέντρωσης-εξαρτώμενη για 5637 και κυτταρικών σειρών Τ24 π.Χ. επιμολυσμένα με miR-203 μιμείται και αρνητικού ελέγχου χαράχθηκαν. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα επίπεδα έκφρασης miR-203 σε 5637 και τα κύτταρα Τ24 επιμολυσμένα με miR-203 μιμείται ήταν 5297 και 8089 φορές υψηλότερα από εκείνα που επιμολύνθηκαν με αρνητικό έλεγχο (

P

& lt? 0.001). βιωσιμότητες κυττάρου του miR-203 που υπερεκφράζουν 5637 και τα κύτταρα Τ24 ήταν δραματικά μειωμένος σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο σε μία βαθμίδωση συγκέντρωσης των 5, 10, 15, 20, 25 και 30 μΜ για 24 ώρες (όλο σε

P

& lt? 0,05? Σχήμα 2Β και 2C). Οι μέγιστες ανασταλτική συγκέντρωση (IC50) τιμές μισό της σισπλατίνης για 5637 και Τ24 κύτταρα ήταν 11.1 (95% IC 09/07 έως 12/05) μm και 14,3 (95% IC 12,7 έως 16,1) μm, αντίστοιχα. Η υπερέκφραση του miR-203 μείωσε σημαντικά τις τιμές IC50 σε 8,3 (95% IC 06/09 με 09/06) μm και 9,0 (95% IC 07/06 έως 10/04) μΜ, αντίστοιχα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της miR-203 σε συνδυασμό γεμκιταβίνης και σισπλατίνη είχαν φαίνεται στο S2 File.

(Α) miR-203 επίπεδα έκφρασης σε 5637 και τα κύτταρα Τ24 επιμολυσμένα με miR-203 μιμείται /αρνητικό έλεγχο. επίπεδα miR-203 ήταν σημαντικά αυξημένα σε κύτταρα επιμολυσμένα με miR-203 μιμείται σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα (*

P

& lt? 0.001, δοκιμασία t, n = 6). (B, C) εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση καμπύλες για 5637 και Τ24 κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με miR-203 μιμείται και αρνητικού μάρτυρα στις 24 ώρες. βιωσιμότητες κυττάρου του miR-203 που υπερεκφράζουν κύτταρα μειώνεται δραματικά σε σύγκριση με κύτταρα αρνητικού ελέγχου στα 5, 10, 15, 20, 25 και 30 μΜ σισπλατίνη (όλα σε

P

& lt? 0,05, t τεστ). (Δ) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την απόπτωση μέσω διπλή χρώση των κυττάρων με Annexin V FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). (Ε) ποσοτική ανάλυση της απόπτωσης που φαίνεται στο σχήμα 2Β. Η υπερέκφραση του miR-203 αύξησε σημαντικά την απόπτωση σε 5.637 και κυτταρικές σειρές T24 (*

P

& lt? 0,01, t test, η = 6). προσδιορισμού (F) ΤΟΥΝΕΛ υποδεικνύεται 5637 και Τ24 κυτταρικές σειρές επιμολύνονται με miR-203 μιμείται έδειξαν αυξημένα επίπεδα της διάσπασης του DNA σε σύγκριση με την κανονική ελέγχου (40 ×). Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και υποβλήθηκε σε δοκιμασία TUNEL για την ανίχνευση DNA και αποπτωτικά κύτταρα.

Η

Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την ποσοτικοποίηση της απόπτωσης μέσω διπλή χρώση των κυττάρων με Annexin V FITC και ιωδιούχο προπίδιο ( ΠΙ). Τα αποτελέσματα έδειξαν υπερέκφραση του miR-203 αύξησε σημαντικά την απόπτωση και στους δύο π.Χ. κυτταρικές γραμμές (τόσο σε

P

& lt? 0,05? Σχ 2D και 2Ε). Για να επαληθευθεί ότι η αύξηση στην απόπτωση οφείλεται στην ενεργοποίηση του προαναφερόμενου μονοπάτι απόπτωσης, μετρήσαμε κατακερματισμού του DNA με δοκιμασία TUNEL και επιβεβαίωσε ότι τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με miR-203 έδειξαν αυξημένα επίπεδα διάσπασης DNA (Σχήμα 2F).

Bcl-w και Survivin ήταν άμεση κατάντη στόχοι του miR-203

Bcl-w και Survivin είχαν προβλεφθεί ως πιθανοί άμεσοι στόχοι του miR-203 από δύο μεγάλα προγράμματα πρόβλεψης στόχου, TargetScan 5.1 (http: //www.targetscan.org/) και η Μιράντα (https://www.microrna.org/). Επιπλέον, Bcl-w και Survivin έπαιξαν σημαντικούς ρόλους στην ανάπτυξη π.Χ., και προς τα κάτω ρύθμιση τους συνδέθηκαν με αυξημένη ευαισθησία σε σισπλατίνη απόπτωση [17-20]. Οι προβλεπόμενες miR-203 στόχευση τόπων σε περιοχές 3’UTR της Bcl-w (επίσης γνωστή ως BCL2L2) και Survivin (επίσης γνωστή ως BIRC5) έχουν δειχθεί στο Σχήμα 3Α. Μια δοκιμασία λουσιφεράσης dual-δημοσιογράφος είχε χρησιμοποιηθεί για να επιβεβαιώσει εάν η 3’UTR της Bcl-w και Survivin mRNA που είχαν θέσεις στόχους για το miR-203. Κατασκευάσαμε ένα λουσιφεράσης φορέα αναφοράς που κωδικοποιεί το φυσικού τύπου 3′-UTR αλληλουχία του Bcl-w mRNA ή Survivin mRNA, συμπεριλαμβανομένων των προβλεπόμενων miR-203 θέσεις στόχους, και ένα αντίστοιχο μεταλλαγμένο φορέα αναφοράς. Όπως φαίνεται στο Σχ 3Β, miR-203 ανέστειλε σημαντικά την ένταση της φωταύγειας του WT-Bcl-w φορέα 3′-UTR και WT-Survivin φορέα 3′-UTR (αμφότερα

P

& lt? 0,01), ενώ η μετάλλαξη του η θέση σύνδεσης μπλοκάρει τη μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης, υποδεικνύοντας υπήρχε άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ miR-203 και του 3’UTR της Bcl-w mRNA ή Survivin mRNA.

(α) Απεικόνιση της προβλεπόμενης miR-203 στόχευση τοποθεσίες στην 3’UTR περιοχές της Bcl-w και Σουρβιβίνης. (Β) δοκιμασία δραστικότητας Dual-λουσιφεράσης εκτελέστηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ συν-επιμολυσμένα με τον έλεγχο /miR-203 και φορείς pmiR-REPORT με άγριου τύπου /μεταλλαγμένο 3′-UTR του Bcl-w (παραπάνω) και Survivin (παρακάτω). *

P

& lt? 0,01, t test, η = 6. (C) κηλίδες Western που δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση των πρωτεϊνών Bcl-w και Survivin μετά την επιμόλυνση του miR-203 μιμείται σε 5.637 και κυτταρικές σειρές Τ24. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (D) RT-qPCR δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση της Bcl-w και Survivin mRNAs μετά την επιμόλυνση του miR-203 μιμείται σε 5.637 και κυτταρικές σειρές Τ24. *

P

& lt? 0,01, t test, η = 6. Ανάλυση συσχέτισης (Ε) Spearman που δείχνει μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-203 και Bcl-w mRNA ή έκφραση Σουρβιβίνης mRNA στην κύστη καρκινικούς ιστούς (r = -0,781, -0,740, τόσο σε

P

& lt?. 0.001)

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τις σχέσεις τους στην π.Χ., έχουμε επιμολυσμένα 5637 και Τ24 κυτταρικές σειρές με miR-203 μιμείται ή αρνητικού ελέγχου, και ανέλυσε την έκφραση mRNA και πρωτεΐνης Bcl-w ή Survivin με RT-qPCR και προσδιορισμούς δυτική-κηλίδωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενδογενής έκφραση του Bcl-w και Survivin μειώθηκαν σημαντικά και στις δύο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης για miR-203 επιμολυσμένα κύτταρα BC (Σχ 3C και 3D). Σύμφωνα με αυτό, υπήρξε επίσης μια σημαντική αντίστροφη σχέση μεταξύ miR-203 και Bcl-w ή Survivin mRNA έκφρασης σε ιστούς π.Χ. (r = -0,781, -0,740, τόσο σε

P

& lt? 0.001? Σχήμα 3Ε ). Στο σύνολό τους, miR-203 μπορεί να ασκήσει τη λειτουργία του με την άμεση στόχευση Bcl-w και το γονίδιο Σουρβιβίνης στην π.Χ.

Συζήτηση

Μετεγχειρητική σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τους μυς επεμβατικές ή μεταστατικό π.Χ. , με αποτέλεσμα μια απόκριση σε ποσοστό έως 70% των ασθενών [21]. Δυστυχώς, λόγω χημειοαντίσταση των καρκινικών κυττάρων, η απόκριση δεν επέρχεται σε περισσότερες από 50% των περιπτώσεων, με αποτέλεσμα ένα ποσοστό επιβίωσης 5 ετών το 15% [22, 23]. Έτσι, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε καλύτερα τους παράγοντες που καθορίζουν την αντίδραση χημειοθεραπεία και πρόγνωση. Nordentoft et al [24] βρήκαν 15 miRNAs στην ανταπόκριση στη θεραπεία με σισπλατίνη και 5 miRNAs που σχετίζονται με το χρόνο επιβίωσης, εκ των οποίων 3 miRNAs (miR-886-3p, miR-923, miR-944) θεωρήθηκαν ως προγνωστικοί παράγοντες τόσο της σισπλατίνης ανταπόκριση και την πρόγνωση. Προηγούμενες μελέτες έχουν τεκμηριώσει μειωμένη έκφραση του miR-203 συνδέθηκε με την εξέλιξη του όγκου και κακή πρόγνωση σε ορισμένους καρκίνους, όπως τα ανθρώπινα κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο [25], τα γλοιώματα [26], και αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου [27]. Συνεπής με τα πορίσματα που περιγράφηκαν παραπάνω, η μελέτη αυτή ποσοτικά miR-203 επίπεδα σε μια σειρά ασθενών π.Χ. αντιμετωπίζονται με ριζική κυστεκτομή και σισπλατίνη επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη, και βρήκε miR-203 ήταν σημαντικά μειωμένη σε ασθενείς με προοδευτική νόσο, ενώ δεν συνδέονται με άλλες κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Επιπλέον, η ανάλυση ROC έδειξε miR-203 είχε κάποια διαγνωστική δύναμη σε διακρίσεις ασθενείς με ή χωρίς εξέλιξη. Με βάση την βέλτιστη τιμή αποκοπής του miR-203, που ταξινομούνται σε όλους τους ασθενείς σε υψηλές και χαμηλές ομάδες έκφραση του miR-203. Kaplan-Meier ανάλυση έδειξε χαμηλή ομάδα έκφραση του miR-203 είχε κακή PFS και OS. αναλύσεις πολυμεταβλητή Cox παλινδρόμησης έδειξε ότι το miR-203 ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τους ασθενείς. π.Χ. Έτσι, mi-203 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη της πρόγνωσης των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με BC σισπλατίνη επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη.

Cellular αντοχή στη σισπλατίνη παρουσιάζει συχνά ένα πολυπαραγοντική φύση, συμπεριλαμβανομένης της πρόσληψης αποδυναμωθεί ενδοκυτταρικό φάρμακο, αυξημένη αποκατάσταση βλάβης του DNA, και μειωμένη εκτέλεση του αποπτωτικού προγράμματος [28]. Drayton et al [29] βρέθηκε miR-27a συνέβαλαν στην σισπλατίνη αντίσταση μέσω της ρύθμισης της ενδοκυτταρικής γλουταθειόνης. Vinall et al [30] έδειξε συν-θεραπεία με miR-34a και cisplatin είχε ως αποτέλεσμα μια δραματική αναστολή στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων σε σύγκριση με τη θεραπεία μόνο με σισπλατίνη. Αντίθετα, σισπλατίνη προκαλεί απομεθυλίωση του υποκινητή του miR-34a και αυξάνει την έκφραση του miR-34a, περαιτέρω ευαισθητοποίηση των κυττάρων π.Χ. σισπλατίνη [31]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η επιμόλυνση των κυττάρων BC με miR-203 μιμείται ευαισθητοποιημένα κύτταρα στην κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης. Εν τω μεταξύ, τα δεδομένα από προσδιορισμούς απόπτωσης έδειξαν κατά την προσθήκη 5μΜ σισπλατίνη, περισσότερο απόπτωση βρέθηκε σε miR-203 που υπερεκφράζουν τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της BC κυττάρων βιωσιμότητας μπορεί να σχετίζεται, τουλάχιστον εν μέρει, στην αυξημένη ευαισθησία σε σισπλατίνη που προκαλείται απόπτωση. Έτσι, ο συνδυασμός σχήμα του miR-203 μιμείται και σισπλατίνη θα μπορούσε να βελτιώσει π.Χ. αποτελέσματα της θεραπείας του ασθενούς.

Για να αποκτήσετε μια περαιτέρω κατανόηση του ρόλου του miR-203 στην ανάπτυξη π.Χ., οι δυνατότητες των κατάντη στόχους αναλύθηκαν. Ως μέλος της οικογένειας Bcl-2, Bcl-w μπορεί να προάγουν επιβίωση κυττάρου με αναστολή της ενδογενούς οδού της απόπτωσης [32]. Chen et al [33] διαπιστώθηκε Bcl-w ήταν υπερ-εκφράζεται σε δείγματα π.Χ. σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι έπαιξε σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του BC. Survivin, το οποίο ήταν βασικό μέλος του αναστολέα της πρωτεΐνης απόπτωσης (ΙΑΡ) της οικογένειας [34], εκτελούνται αντιαποπτωτικού λειτουργία του αναστέλλοντας δραστηριότητα των κασπασών σε ένα σύμπλοκο με αναστολέα φυλοσύνδετη πρωτεϊνών απόπτωσης (ΧΙΑΡ) [35]. Μια πολυκεντρική μελέτη διαπίστωσε Survivin έκφραση συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο π.Χ. υποτροπής και ειδική θνησιμότητα λόγω καρκίνου [36]. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι miR-203 θα μπορούσε να δεσμεύσει άμεσα την 3′-UTR τόσο Bcl-w και Survivin, με αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρυθμισμένη έκφραση του Bcl-w και Survivin στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Αυτά υποστηρίζονται από κλινικά δεδομένα, όπου βρήκαμε miR-203 έκφρασης ήταν και αρνητική συσχέτιση με Bcl-w και την έκφραση Σουρβιβίνης mRNAs σε δείγματα ιστών. Π.Χ. Έτσι, miR-203 θα μπορούσε να θεωρηθεί ως πιθανός θεραπευτικός παράγοντας με ταυτόχρονη αναστολή της αντιαποπτωτικών παραγόντων Bcl-w και Σουρβιβίνης.

Συμπερασματικά, η μελέτη μας δείχνει ότι μειώθηκε miR-203 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός για εξέλιξη και την πρόγνωση των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με BC σισπλατίνη βασίζεται χημειοθεραπεία. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-203 μπορεί να ενισχύσει σισπλατίνη ευαισθητοποίηση μέσω της προώθησης της απόπτωσης μέσω απευθείας στόχευση Bcl-w και Σουρβιβίνης. Πρόσθετες πολυκεντρικές μελέτες απαιτούνται για να επιβεβαιώσουν εάν miR-203 θα μπορούσε να είναι χρήσιμη ως δείκτης χημειοευαισθησία με σισπλατίνη βασίζεται σε σχήματα χημειοθεραπείας, καθώς και ένα θεραπευτικό στόχο για την BC στην κλινική.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 αρχείου . Οι miR-203 επίπεδα έκφρασης των ασθενών NMIBC, ομάδα Progression με 45 περιπτώσεις και ομάδα μη-εξέλιξης με 67 περιπτώσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0143441.s001

(XLSX)

S2 αρχείου. Τα αποτελέσματα του miR-203 σε συνδυασμό γεμσιταβίνη και σισπλατίνη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0143441.s002

(DOCX)