Αφηρημένο

τάξεις του καρκίνου του ήπατος στην επικράτηση και θνησιμότητα μεταξύ των κορυφαίων πέντε καρκίνους παγκοσμίως. Οι Συσσωρευμένα συμφέροντα επικεντρωθεί στην ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι διϋδροαρτεμισινίνης (DHA) επέδειξε αντικαρκινική δράση έναντι του καρκίνου του ήπατος. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι οι αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDACi) αύξησε σημαντικά την αντινεοπλασματική δράση του DHA μέσω αύξησης της απόπτωσης

in vitro

και

in vivo

. Αναστολή της φωσφορυλίωσης ERK συνέβαλαν στην DHA επαγόμενη απόπτωση, λόγω του γεγονότος ότι ο αναστολέας της φωσφορυλίωσης της ERK (PD98059) αυξήθηκε DHA επαγόμενη απόπτωση. Σε σύγκριση με DHA και μόνο, η συνδυασμένη θεραπεία με DHA και HDACi μειωμένο δυναμικό της μεμβράνης μιτοχονδρίων, που κυκλοφόρησε το κυτόχρωμα

γ

σε κυτταρόπλασμα, αυξημένη ρ53 και Bak, μειωμένη Mcl-1 και p-ERK, ενεργοποιημένα κασπάσης 3 και PARP, και επαγόμενη από αποπτωτικά κύτταρα. Επιπλέον, δείξαμε ότι HDACi προεπεξεργασία διευκόλυνε DHA επαγόμενη απόπτωση. Σε Hep G2-ξενομοσχεύματος γυμνών ποντικών που φέρουν, η ενδοπεριτοναϊκή ένεση DHA και SAHA οδήγησε σε σημαντική αναστολή των όγκων ξενομοσχεύματος. Αποτελέσματα TUNEL και Η &? Χρώση Ε έδειξαν περισσότερο απόπτωση που επάγεται από συνδυασμένη θεραπεία. δεδομένα Ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε την ενεργοποίηση της PARP, και τη μείωση του Ki-67, ρ-ERK και Mcl-1. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ο συνδυασμός των HDACi και DHA προσφέρει μια αντικαρκινική επίδραση στον καρκίνο του ήπατος, και αυτή η θεραπεία συνδυασμού θα πρέπει να θεωρείται ως μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την χημειοθεραπεία

Παράθεση:. Zhang CZ, Παν Y, Cao Υ, Lai PBS, Liu L, Chen GG, et al. (2012) Αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης Διευκόλυνση διϋδροαρτεμισινίνης απόπτωση στον καρκίνο του ήπατος

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 7 (6): e39870. doi: 10.1371 /journal.pone.0039870

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Απριλίου 2012? Αποδεκτές: 28η Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 81172345 και Νο 30973506). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του ήπατος είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου παγκοσμίως και η τρίτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο [1]. Πάνω από το 75% των νέων περιπτώσεων που διαγιγνώσκονται στις αναπτυσσόμενες χώρες? Ωστόσο, η συχνότητα αυξάνεται σε οικονομικά ανεπτυγμένες περιοχές, συμπεριλαμβανομένης της Ιαπωνίας, τη Δυτική Ευρώπη και τις Ηνωμένες Πολιτείες [2], [3]. Αν και η χειρουργική εκτομή και μεταμόσχευση ήπατος αποτελούν τις δύο κύριες θεραπευτικές επιλογές με θεραπευτική δυναμικό, η χειρουργική επέμβαση είναι εφικτή μόνο για περίπου 20% των περιπτώσεων καρκίνου του ήπατος αφού οι ασθενείς είναι πιο συχνά διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο [4], [5]. Μέχρι σήμερα, η χημειοθεραπεία για τον καρκίνο του ήπατος δεν είναι ικανοποιητική και η μακροπρόθεσμη επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του ήπατος, είναι ακόμη ελλιπής [4], [6]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο του ήπατος είναι μεγάλη ανάγκη και τη σημασία.

ιστόνης δεακετυλάσης αναστολείς (HDACi) βρίσκονται σήμερα στο επίκεντρο του ενδιαφέροντος, όπως αντινεοπλασματικών παραγόντων [7], [8]. HDACi είναι μια κατηγορία παραγόντων που λειτουργούν μέσω αποκλεισμού απακετυλίωση ιστόνης, τροποποιώντας έτσι χρωματίνης δομή και τη μεταγραφή γονιδίων [9]. Ιδιαίτερα, HDACi αναστέλλουν την ακετυλίωση των καταλοίπων λυσίνης στην ιστόνη Ν-τερματική ουρά που έχει σαν αποτέλεσμα τη χαλάρωση της σύνδεσης των ιστονών με DNA, επιτρέποντας έτσι την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την καταστολή όγκου [10]. Η κατανόηση της συσχέτισης μεταξύ των δραστηριοτήτων HDAC και διαφόρων μορφών καρκίνου οδήγησε πολλούς ερευνητές να εξετάσουν αναστολείς HDAC ως ισχυροί παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν με τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και /ή την επιβίωση μέσω της ρύθμισης της προόδου του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποίηση, ή με την προώθηση κυτταρικό θάνατο. Για παράδειγμα, Kim et al. ανέφερε ότι η έκθεση CG0006 στον καρκίνο του μαστού κύτταρο σαν αποτέλεσμα κυτταρικό θάνατο μέσω ρύθμισης προς τα κάτω HDAC6 [11]. Bommi et al. απέδειξε ότι η προκαλούμενη από βουτυρικό νάτριο απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα με μεταγραφική ρύθμιση προς τα κάτω της BMI1 [12].

Αν και HDACi μόνη της μπορεί να είναι κλινικά χρήσιμο, πιθανότατα θα είναι χρήσιμες σε συνδυασμό με άλλους αντικαρκινικούς παράγοντες. SAHA έχει εγκριθεί από τον Αμερικανικό Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) για τη θεραπεία του λεμφώματος δερματικών κυττάρων Τ και άλλων HDACi υποβάλλονται τώρα σε /II των κλινικών δοκιμών φάσης Ι ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες [13], [14 ]. Οι εκθέσεις έχουν Συσσωρευμένα έδειξε την συνεργική επίδραση στην θνησιμότητα του συνδυασμού της HDACi και άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Kretzner et al. έδειξε ότι ο συνδυασμός των HDACi και Aki ενισχυμένη θάνατο λέμφωμα κυττάρων μέσω της καταστολής του c-myc, hTERT, και τα επίπεδα microRNA [15]. Nguyen et al. ανέφεραν ότι η συγχορήγηση HDACi συνεργικά αυξημένη KW-2449 θνησιμότητα που προκύπτει από αδρανοποίηση της Bcr /Abl [16]. Τον τελευταίο καιρό, μια μελέτη φάσης II αποκάλυψε ότι η θεραπεία vorinostat σε συνδυασμό με ταμοξιφένη παρέτεινε σημαντικά την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του μαστού [17]. Ωστόσο, μια τέτοια συνεργιστική δράση σπάνια έχει αποδειχθεί σε καρκίνο του ήπατος.

Πρόσφατα, έχουν αναφέρει ότι διϋδροαρτεμισινίνης (DHA), το κύριο δραστικό μεταβολίτη της παράγωγα αρτεμισινίνης, επέδειξε αντικαρκινική δράση έναντι του καρκίνου του ήπατος [18]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι (α) το DHA απόπτωση που επάγεται μέσω προς τα κάτω ρύθμιση φωσφορυλίωσης ERK, η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τα δεδομένα ότι ο αναστολέας της φωσφορυλίωσης της ERK (PD98059) αυξήθηκε DHA-επαγόμενη απόπτωση, (β) HDACi

in vitro

αξιοσημείωτα ενισχυμένη DHA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, που συνοδεύουν με μείωση του δυναμικού της μεμβράνης μιτοχονδρίων, απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

σε κυτταρόπλασμα, αύξηση του ρ53 και Bak, και οι μειώσεις των Mcl-1 και p-ERK, ( γ) ο συνδυασμός του HDACi και DHA

in vivo

σταμάτησε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύματος καρκίνου του ήπατος. Τα δεδομένα μας μπορεί να υποδηλώνουν τον συνδυασμό HDACi και DHA ως μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη χημειοθεραπεία του καρκίνου του ήπατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου ήπατος (Hep G2 και PLC /PRF /5) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 mg /ml πενικιλίνη, και 100 mg /ml στρεπτομυκίνη σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 και 95% αέρα στους 37 ° C.

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Αντισώματα για Mcl- 1, PARP, Bak, και ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντισώματα για κασπάσης 3, ρ38, ρ-ρ38, ERK, ρ-ERK, JNK, και ρ-ΙΝΚ δόθηκαν από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ). Διϋδροαρτεμισινίνη (DHA, διαλυμένο σε DMSO), βουτυρικό νάτριο (ΝαΒ, διαλυμένο σε H

2O), σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA, διαλύθηκε σε DMSO) και ο αναστολέας ρ-ΕΚΚ (PD98059, διαλυμένο σε DMSO) αγοράστηκαν από την Sigma ( St. Louis, ΜΟ).

ΜΤΤ

η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-diphenyltetrazo-lium (ΜΤΤ) χημική δοκιμή. Εν συντομία, 8 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων για 24 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση με διάφορες δόσεις DHA για προκαθορισμένο χρόνο. Μετά την προσθήκη 100 μl /φρεάτιο διαλύματος ΜΤΤ, τα κύτταρα επωάστηκαν για άλλες 2 ώρες. Τα υπερκείμενα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν και οι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 100 μΙ /φρεάτιο DMSO. Η απορρόφηση στα 570/630 nm κάθε δείγματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη multilabel πλάκας (PerkinElmer). Τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Colony σχηματισμός

Εκατό από κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες. Και στη συνέχεια το μέσο αντικαταστάθηκε από φρέσκο ​​μία που περιέχει DHA. Αφού επωάστηκαν για άλλες 7 d, αποικία που σχηματίζεται από τα καρκινικά κύτταρα του ήπατος χρωματίστηκε με 0,05% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma, St. Louis, ΜΟ) για 8 λεπτά. Ο αριθμός των αποικιών στη συνέχεια ποσοτικά.

κηλίδος

λύματα Western κυττάρων έβρασαν με 6x δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) ρυθμιστικού φόρτωσης και έπειτα κλασματοποιήθηκαν με SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF που μετά επωάστηκε με πρωταρχικό ειδικό αντίσωμα σε 5% γάλα χωρίς λιπαρά, που ακολουθείται από μια υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) αντι-ποντικού ή δεύτερα αντισώματα αντι-κουνελιού. αντιδραστήριο ανίχνευσης ECL (Amersham Life Science, Piscataway, NJ) χρησιμοποιήθηκε για να αποδείξει τα αποτελέσματα.

δοκιμασία

αννεξίνη V /PI

Η απόπτωση εκτιμήθηκε με διπλή χρώση αννεξίνης V-PI. Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, και χρωματίστηκαν με 0,5 mg /ml αννεξίνης V σε ρυθμιστικό (10 mM HEPES ελεύθερο οξύ, 0,14 Μ NaCl, και 2.5 mM ΟαΟ

2) σύνδεση για 30 λεπτά. Κατόπιν, ΡΙ (5 μg /mL τελική συγκέντρωση) προστέθηκαν και επωάστηκαν για άλλα 15 λεπτά. Τα κύτταρα εφαρμόζονται σε ένα κυτταρόμετρο ροής για τη συλλογή δεδομένων.

δοκιμασία TUNEL δοκιμασία

Η απόπτωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ Αρο-Direct TUNEL Δοκιμασία (Millipore). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 4% PFA για 60 λεπτά στους 4 ° C, ακολουθούμενη από μία δεύτερη στερέωση σε 70% (ν /ν) αιθανόλη για όλη τη νύχτα στους -20 ° C. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορα αντιδραστήρια για μία σχεδιασμένη περίοδο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τέλος, τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας FACS Vantage μηχάνημα (Becton Dickinson). Το λογισμικό Cell Quest (Verity Software House) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων.

In situ

ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου

Σήμανση του κατακερματισμένου DNA για την αξιολόγηση της απόπτωσης έγινε με TUNEL χρώση (πράσινο φθορισμό), χρησιμοποιώντας το

In Situ

κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου (Roche, LA), όπως περιγράφεται στην προηγούμενη μελέτη μας [19].

η μέτρηση της δραστηριότητας κασπάσης 3

Η δραστηριότητα της κασπάσης 3 που επάγεται με αγωγή DHA προσδιορίστηκε με την κασπάσης 3-Activity Assay Kit (Merck, Darmstadt).

Μέτρηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (Δψ

m) με κυτταρομετρία ροής

Σαράντα ηΜ DiOC6 (Sigma-Aldrich, ΜΟ) επωάστηκαν με κατεργασμένων κυττάρων σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τα συλλεχθέντα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας Becton Dickinson FACS Vantage μηχανή (Becton Dickinson, NJ). Κύτταρα με χαμηλή Δψ

m παρουσιάστηκαν ως ποσοστό του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων. Το λογισμικό CellQuest (Verity Software House) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων.

Μελέτες σε ζώα

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις σχετικές εθνικές και διεθνείς κατευθυντήριες γραμμές και έχουν εγκριθεί από το Ινστιτούτο Ιατρικών Ερευνών Επιτροπή ηθικής και Δεοντολογίας της Sun Yat-Sen University Center Καρκίνου. 1 × 10

7 κυττάρων Hep G2 εναιωρήθηκαν σε αποστειρωμένο PBS και ενέθηκαν υποδορίως στα δεξιά πλευρά των ποντικών. Οι ποντικοί ελέγχθηκαν καθημερινά για ανάπτυξη ξενομοσχεύματος /όγκου. Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε τρεις ομάδες των 6 ποντικών /ομάδα. DHA (5 mg /kg ποντικού σωματικού βάρους) χορηγήθηκε στην ομάδα του «DHA», SAHA (1,5 mg /kg σωματικού βάρους του ποντικού) δόθηκε στην ομάδα των «SAHA», συνδυασμός SAHA και DHA δόθηκε σε «ΟΗΑ + SAHA «ομάδα, μία φορά την ημέρα για πέντε διαδοχικές ημέρες την εβδομάδα επί 24 d. Η ομάδα DMSO έλαβε ισοδύναμο όγκο ελέγχου διαλύτη. Μετά την επεξεργασία σε διάφορα χρονικά διαστήματα, μετρήθηκαν ποντίκι το σωματικό βάρος και το μέγεθος του όγκου. Τέλος, οι όγκοι αποκόπηκαν, ζυγίστηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 4% PFA του. Εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς κατόπιν τεμαχίστηκαν σε 4 nm και είναι έτοιμο για Η &?. Ε χρώση και δοκιμασία TUNEL

Ανοσοϊστοχημεία

φορμαλίνη σταθερού ενσωματωθεί σε παραφφίνη και τομές καρκίνο του ήπατος με πάχος 4 μm αποκηρώθηκαν σε ξυλόλιο και βαθμονομημένων αλκοολών, ενυδατωμένο, και πλύθηκαν σε phosphatebuffered αλατούχο (PBS). Μετά από προκατεργασία σε ένα φούρνο μικροκυμάτων, ενδογενούς υπεροξειδάσης ανεστάλη με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε μεθανόλη για 20 λεπτά, ακολουθούμενο από αβιδίνη-βιοτίνη μπλοκάρισμα χρησιμοποιώντας ένα βιοτίνης-blocking kit (ϋΑΚΟ, Germany). Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν με αντισώματα για 4 ώρες σε ένα υγρό θάλαμο σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν σε PBS, και επωάστηκαν με αντισώματα βιοτινυλιωμένο κατσίκας αντι-κουνελιού /ποντικό. Τα σλάϊντς αναπτύχθηκαν με την Dako Liquid 3, «3-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (DAB) + υπόστρωμα χρωμογόνου συστήματος και με αιματοξυλίνη.

Στατιστική ανάλυση

διαφορά μεταξύ των ομάδων προσδιορίσθηκε για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας μία κατευθύνσεων ANOVA ή του Student

t-test

. Όλα

P

-τιμές είναι δύο όψεων και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικοί υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL). Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Αποτελέσματα

ενεργοποιήσεις των ΜΑΡ κινασών συμμετείχαν σε DHA-επαγόμενη απόπτωση

DHA έχει αποδειχθεί επάγουν κυτταρικό θάνατο σε ανθρώπινους καρκίνους [20], [21]. Αρχικά αξιολογήθηκε DHA επαγόμενη απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του ήπατος, με χρήση του προσδιορισμού αννεξίνης V. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ποσοστό αννεξίνης V-θετικά κύτταρα αυξήθηκαν δραματικά κατά την αγωγή DHA (Εικ. 1Α), γεγονός που υποδηλώνει DHA είναι ένας ισχυρός επαγωγέας απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος. Σε σύγκριση με τον μάρτυρα, μετά από έκθεση 10 μΜ DHA για 24 ώρες, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ήταν σημαντικά αυξήθηκε από 5.3% και 4.9% έως 16.6% και 13.5%, αντίστοιχα σε Hep G2 και PLC /PRF /5 κύτταρα (Σχ. 1Β).

Α. DHA επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος. Κύτταρα κατεργασμένα με είτε DMSO ή 10 μΜ DHA για 24 και 48 ώρες βάφτηκαν τόσο με Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για 45 λεπτά. Απόπτωση που επάγεται από το DHA στη συνέχεια αξιολογήθηκε με κυτταρόμετρο ροής ανάλυση. B. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων δείχθηκαν, μετά ποσοτική ανάλυση της δοκιμασίας ΡΙ /αννεξίνης V. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. *

P

& lt? 0,05, έναντι της ομάδας DMSO. Γ ΜΑΡ κινάσες ενεργοποιούνται με DHA. Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ DHA για προκαθορισμένο χρόνο. Η φωσφορυλίωση της p38, ERK και JNK προσδιορίστηκε. δεδομένα D. Ποσοτική από τρία ανεξάρτητα πειράματα φαίνεται να υποδεικνύουν τη σχετική έκφραση ρ-ρ38, ρ-JNK και π-ERK.

Η επαγωγή

Η απόπτωση συνήθως συσχετίζει με την ενεργοποίηση των ΜΑΡ κινασών. Μια ανάλυση χρονικής πορείας πραγματοποιήθηκε για τα επίπεδα φωσφορυλίωσης από τρία μέλη ΜΑΡ κινάσης, συμπεριλαμβανομένων των εξωκυτταρικών κινάση σήματος ρυθμιζόμενη (ΕΚΚ), η c-Jun ΝΗ2-τερματικής κινάσης (JNK) και ρ38 (Εικ. 1 C). Τα επίπεδα της πρωτεΐνης και των 3 ΜΑΡ κινασών παρέμεινε αμετάβλητη. Ωστόσο, φωσφορυλίωση ρ38 αυξήθηκε μετά τη θεραπεία DHA στα δύο δοκιμάστηκαν κύτταρα. Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης JNK παρέμεινε το ίδιο όπως ο έλεγχος σε κύτταρα Hep G2, αλλά ήταν σημαντικά αυξημένη σε PLC /PRF /5 κύτταρα (Σχ. 1D). Τα επίπεδα του p-ERK εμφανίστηκε μειώνονται σε δύο καρκινικά κύτταρα του ήπατος σε επεξεργασία με DHA. Αυτά τα δεδομένα μπορεί να υποδηλώνουν ότι η αδρανοποίηση του ERK συμβάλλει DHA επαγόμενη απόπτωση.

Αναστολή της φωσφορυλίωσης ERK αποδόθηκε σε DHA επαγόμενη απόπτωση σε ηπατικά καρκινικά κύτταρα

Για να δοκιμαστεί η υπόθεση μας ότι η αδρανοποίηση του ERK είχε εμπλακεί σε DHA επαγόμενη απόπτωση, εμείς προεπεξεργασία κυττάρων με PD98059, έναν αναστολέα της φωσφορυλίωσης ERK. Πρώτον, η κυτταροτοξικότητα των PD98059 ελέγχθηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι PD98059 μόνο του δεν προκαλεί σημαντική απόπτωση σε δύο κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στην συνέχεια προσδιορίσαμε την επίδραση της PD98059 επί DHA επαγόμενη εξασθένηση της κυτταρικής ανάπτυξης. Όπως υποδεικνύεται από ΜΤΤ αποτέλεσμα, PD98059 μείωσε σημαντικά ήπατος βιωσιμότητες των καρκινικών κυττάρων, σε σύγκριση με τις ομάδες DHA (Εικ. 2Α).

PD98059, ένας αναστολέας της φωσφορυλίωσης της ERK, ενισχυμένη DHA προκληθείσα μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 μΜ PD98059 για 2 ώρες, και στη συνέχεια επωάστηκαν με 10 μΜ DHA για άλλες 24 ώρες. Το υπολειμματικό κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, *

P

& lt? 0.05. θεραπεία Β PD98059 αύξησε την παραγωγή των αποπτωτικών σώματος. Κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 μΜ PD98059 για 2 ώρες, και στη συνέχεια επωάστηκαν με 10 μΜ DHA για άλλες 24 ώρες βάφτηκαν με χρωστική Hoechst 33342. κατάτμησης DNA (που υποδεικνύεται με αστερίσκους) και πυρηνική συμπύκνωση (συμβολίζεται με τα βέλη) παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. θεραπεία C. PD98059 ενισχυμένη DHA επαγόμενη απόπτωση. δοκιμασία TUNEL πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί απόπτωση. Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε και το ποσοστό που προσδιορίστηκε από ιστόγραμμα. *

P

& lt? 0,05. D. PD98059 συν θεραπεία DHA οδήγησε σε διασπάσεις του PARP και κασπάσης 3. Πρωτεΐνες που συλλέγονται από κύτταρα επεξεργασμένα με PD98059 και DHA για 24 ώρες υποβλήθηκαν σε Western Blot για την ανίχνευση των διασπάσεις της PARP και κασπάσης 3. ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε εάν η θεραπεία PD98059 ενισχυμένη DHA που προκαλείται αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης μέσω της επαγωγής της απόπτωσης. Εκτιμήσαμε DHA επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος προκατεργάστηκαν με 10 μΜ PD98059 για 2 ώρες από την Hoechst χρώση 33.342. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν περισσότερα κύτταρα με χαρακτηριστικά που περιλαμβάνουν συμπύκνωση χρωματίνης και αποπτωτικά σώμα παρουσιάζονται στην PD98059 προεπεξεργασμένων κύτταρα (Σχ. 2Β). Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με δοκιμασίες TUNEL δείχνουν ότι τα ποσοστά των TUNEL-θετικών κυττάρων ήταν αυξημένα στα καρκινικά κύτταρα του ήπατος σε επεξεργασία με αμφότερα PD98059 και DHA (Σχ. 2C). Επιπλέον, τα επίπεδα της διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση 3 ήταν αισθητά αυξημένη από τον αναστολέα ΕΚΚ στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του ήπατος 2 (Σχ. 2D). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το DHA-επαγόμενη απόπτωση μπορεί να σχετίζονται με τη φωσφορυλίωση ERK.

HDACi διευκολύνεται DHA επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος

Υπό το πρίσμα αυτής HDACi είναι ικανό για την ενίσχυση της θανατηφόρου επίδρασης της χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [22], [23], σκοπεύαμε να εξεταστεί αν DHA σε συνδυασμό με HDACi οδήγησε σε περισσότερο κυτταρικό θάνατο σε καρκίνο του ήπατος. ΝΑΒ και SAHA χρησιμοποιήθηκαν σε ανάλυση ΜΤΤ. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, ο συνδυασμός του DHA και HDACi μείωσε σημαντικά βιωσιμότητες κυττάρου σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος, σε σύγκριση με τη θεραπεία με απλού παράγοντα (Εικ. 3Α). Η αυξημένη κυτταροτοξικότητα του συνδυασμού του DHA και HDACi προσδιορίστηκε επίσης με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Κύτταρα σε ομάδες DMSO σχημάτισε αριθμός των ορατών αποικιών σε 15 d. Ο αριθμός των αποικιών που σχηματίζονται από κύτταρα που καλλιεργούνται τόσο με DHA και HDACi ήταν σημαντικά μικρότερη από ότι με DHA μόνο (Σχ. 3Β).

Συνδυαστική θεραπεία με HDACi και DHA αυξημένο κυτταρικό θάνατο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4 mM NaB, 1,25 μΜ SAHA, 10 μΜ DHA ή συνδυασμός NaB /SAHA και DHA για 24 ώρες. βιωσιμότητες κυττάρου μετρήθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ. B. Η ανασταλτική δράση του HDACi και DHA σε συνδυασμό επί της ανάπτυξης του καρκίνου του ήπατος των κυττάρων επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Εκατό από κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων για 7 d, και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν είτε με HDACi ή DHA για άλλες 7 d. Οι αποικίες βάφτηκαν με 0.05% κρυσταλλικό ιώδες. Ο αριθμός των αποικιών σε κάθε φρεάτιο μετρήθηκε και στατιστική ανάλυση εκτελέσθηκε. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. C. Η επίδραση του HDACi επί DHA επαγόμενη απόπτωση μετρήθηκε με δοκιμασία TUNEL, χρησιμοποιώντας το

in situ

κιτ ανίχνευσης θανάτου κυττάρου. κύτταρα Hep G2 σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Α υποβλήθηκαν σε δοκιμασία TUNEL. Τα αποπτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. D. Η επίδραση της HDACi και DHA σε συνδυασμό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με δοκιμασία TUNEL, χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκε. Ε κασπάσης 3 ενεργοποίηση είχε εμπλακεί σε HDACi μεσολάβηση απόπτωση σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DHA. Η δραστικότητα της κασπάσης 3 σε κύτταρα σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Α προσδιορίστηκε και η σχετική μεταβολή δείχθηκε. Για τα Α, Β, D και Ε, *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01, έναντι της ομάδας DHA

Η

Στη συνέχεια, καθόρισαν την προ-αποπτωτική δραστικότητα συνδυασμένης θεραπείας με DHA και HDACi. θεραπεία DHA επάγεται ισχυρά απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος, αλλά περισσότερο απόπτωση που επάγεται από την συνδυασμένη θεραπεία με δύο παράγοντες, όπως φαίνεται από ανιχνεύσεις TUNEL υποδεικνύοντας μία αξιοσημείωτη αύξηση στο TUNEL-θετικά κύτταρα (Εικ. 3C). Στατιστικά, DHA σε συνδυασμό με NaB ή SAHA αυξήθηκε αποπτωτικά κύτταρα με 1,9 ή 2,8 φορές, αντίστοιχα σε κύτταρα Hep G2, και κατά 3,0 ή 3,5 φορές αντιστοίχως σε PLC /PRF /5 κύτταρα (Σχ. 3D). Σύμφωνα με την αυξημένη απόπτωση, δράση της κασπάσης 3 ήταν υψηλότερη στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τόσο DHA και HDACi (Εικ. 3Ε).

απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

στο κυτταρόπλασμα και προς τα κάτω ρύθμιση των Mcl-1 και ρ-ΕΚΚ συνέβαλαν στην απόπτωση που προκαλείται από τη συνδυασμένη θεραπεία με HDACi και DHA

Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι το DHA-επαγόμενη απόπτωση συνδέεται με Mcl-1 αποικοδόμηση και την ενεργοποίηση Bak [18]. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν Mcl-1 και Bak συμμετείχαν σε HDACi διαμεσολαβείται εμπλουτισμό απόπτωσης σε DHA-επεξεργασμένα κύτταρα. Όπως αναφέρεται στα αποτελέσματα της δυτικής κηλίδος, Mcl-1 ήταν δραματικά μειωθεί, ενώ Bak ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα Hep G2 αγωγή τόσο με DHA και NaB /SAHA. Οι μεταβολές των Mcl-1 και Bak στο PLC /PRF /5 κύτταρα μοιράζονται μια παρόμοια τάση με εκείνες στα κύτταρα Hep G2 (Σχ. 4Α). Επιπλέον, άγριου τύπου ρ53 σε κύτταρα Hep G2 ήταν ρυθμίζεται προς τα πάνω, ενώ τα κύτταρα μεταλλαγμένο ρ53 σε PLC /PRF /5 ήταν επηρεάστηκε ελάχιστα, μετά τη θεραπεία (Εικ. 4Α).

Συνδυαστική θεραπεία με HDACi και DHA προέκυψαν σε προς τα κάτω ρύθμιση των Mcl-1 και προς τα πάνω ρύθμιση του Bak. ηπατικά καρκινικά κύτταρα εκτέθηκαν σε 4 mM NaB, 1,25 μΜ SAHA, 10 μΜ DHA ή συνδυασμός NaB /SAHA και DHA για 24 ώρες. Έκφραση των Mcl-1, Bak και διασπασμένη PARP εξετάστηκε από κηλίδα western. Άνω του πίνακα: ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα φαίνεται στην εικόνα. Κάτω πίνακας: η σχετική έκφραση του Mcl-1 και Bak κανονικοποιημένη προς ακτίνη υποδείχθηκε από ιστόγραμμα. B. Η έκφραση του ρ-ERK μειώθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με HDACi και DHA. Πρωτεΐνες που συλλέγονται από καρκίνο του ήπατος κύτταρα επεξεργασμένα με SAHA, DHA ή τα συνδυασμένα φάρμακα υποβλήθηκαν σε στύπωμα western για να εξετάσει την έκφραση ρ-ΕΚΚ. Άνω του πίνακα: ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα παρουσιάστηκε. Κάτω πίνακας: η σχετική έκφραση του ρ-ΕΚΚ /ERK δείχθηκε. C. Μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) προκλήθηκε σε HDACi /DHA-κατεργασμένα κύτταρα. Hep G2 και PLC /PRF /5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Α Η κατάρρευση ΜΜΡ (Δψ

mL) μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση των κυττάρων με DiOC6 και ποσοτική ανάλυση των Δψ

m δείχθηκε. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Δ κυτοχρώματος

γ

κυκλοφόρησε στο κυτταρόπλασμα στα επεξεργασμένα κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Α Κλάσματα από κυτοσόλιο απομονώθηκαν να εξεταστεί η διανομή του κυτοχρώματος

γ

. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης για κυτοσόλιο. Ε HDACi προεπεξεργασία ευαισθητοποιημένα κύτταρα σε DHA επαγόμενη απόπτωση. καρκίνο του ήπατος κύτταρα προκατεργάστηκαν με 4 mM NaB ή 1,25 μΜ SAHA για 2 ώρες περαιτέρω εκτέθηκαν σε 10 μΜ DHA για άλλες 24 ώρες. δοκιμασίες TUNEL διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί απόπτωση. Το ποσοστό των TUNEL θετικών κυττάρων δείχθηκε. Για Β, C και Ε, *

P

& lt?. 0,05, έναντι της ομάδας DHA

Η

Υπό το φως των αναδυόμενων δεδομένων που φωσφορυλίωση ERK ανεστάλη σε DHA-θεραπεία και HDACi- επεξεργασμένα κύτταρα. Στη συνέχεια εξετάσαμε το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ERK. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια γρήγορη μείωση του ρ-ERK σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος σε επεξεργασία τόσο με DHA και SAHA, ειδικά σε PLC /PRF /5 κύτταρα (Σχ. 4Β).

Από DHA επαγόμενη απόπτωση αποδόθηκε στην εκπόλωση μιτοχονδριακών εξωτερικής μεμβράνης [18], εξετάσαμε έπειτα τη μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συνδυασμένη θεραπεία μείωσε εντυπωσιακά την μιτοχονδριακή διαμεμβρανικό δυναμικό (Σχ. 4C), που ακολουθείται από μια προφανή απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

από μιτοχόνδρια προς κυτόπλασμα (Εικ. 4D).

Όπως φαίνεται σε προηγούμενη μελέτη μας, HDACi προεπεξεργασίας ευαισθητοποιημένα κύτταρα καρκίνου του ήπατος σε ετοποσίδη [22]. Εμείς προεπεξεργασία των κυττάρων με ΝαΒ ή SAHA, και στη συνέχεια να αξιολογηθεί η προκύπτουσα απόπτωσης από αναλύσεις TUNEL. Σε σύγκριση με εκείνες των unpretreated κυττάρων, τα ποσοστά των TUNEL θετικών κυττάρων σε HDACi-προκατεργασμένο κύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά (Εικ. 4Ε).

SAHA ενισχυμένη αντικαρκινική επίδραση του DHA στην Hep G2 ξενομοσχεύματος όγκου σε ποντικούς

Αφού αποδείξει την ικανότητά της να ενισχύσει SAHA DHA μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο

in vitro

, προσδιορίσαμε περαιτέρω την συνεργική δράση του SAHA και DHA

in vivo

. κύτταρα Hep G2 εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς για τη δημιουργία ξενομοσχεύματος όγκου. Γυμνοί ποντικοί που φέρουν ξενομοσχεύματα όγκου δοσολογήθηκαν με DHA (5 mg /kg /Bid) και /ή SAHA (1,5 mg /kg /Bid) ημερησίως για 24 ημέρες. Η αγωγή δεν φάνηκε να έχει σημαντική επίδραση στο σωματικό βάρος σε ποντικούς. Κατά μέσο όρο, η θεραπεία συνδυασμού ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου του καρκίνου του ήπατος κατά περισσότερο από 44,7%, ενώ η θεραπεία απλού παράγοντα είτε με DHA ή SAHA ανέστειλε μόνο την ανάπτυξη του όγκου κατά 17,6% και 4,6%, αντίστοιχα (Σχ. 5Α). Στις 24 Day, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και μετρήθηκαν τα βάρη των όγκων. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο συνδυασμός HDACi και DHA μείωσε σημαντικά τα βάρη του ξενομοσχεύματος όγκου, σε σύγκριση με DHA-μόνο τις ομάδες (Εικ. 5Β). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η θεραπεία συνδυασμού δημιουργείται ένα μεγαλύτερο αντι-πολλαπλασιαστική δράση και η κυτταροτοξικότητα από είτε απλός παράγων μόνος στο ήπαρ ξενομοσχεύματα καρκίνου

in vivo

.

Συνδυασμός SAHA και DHA σταμάτησε αισθητά την ανάπτυξη των Hep G2 ξενομόσχευμα όγκου. Γυμνά ποντίκια εμβολιάστηκαν με 1 × 10

7 των κυττάρων Hep G2. Μετά το σχηματισμένο όγκος ήταν ψηλαφητός, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες. DHA (5 mg /kg ποντίκι σωματικού βάρους) δόθηκε στην ομάδα των «DHA», SAHA (1 mg /kg ποντίκι σωματικού βάρους) δόθηκε στην ομάδα «SAHA», ο συνδυασμός των SAHA και DHA δόθηκε στην «DHA + SAHA «ομάδα, μία φορά την ημέρα για πέντε διαδοχικές ημέρες την εβδομάδα επί 24 d. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν κάθε δύο ημέρες. Έξι ξενομοσχεύματα διεξήχθησαν σε κάθε ομάδα. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD, *

P

& lt? 0,05, έναντι της ομάδας DMSO. B. Συνδυασμός SAHA και DHA θεραπείες οδήγησε σε δραματική μείωση του βάρους του όγκου. Την ημέρα 24, τα ποντίκια θυσιάστηκαν, και μετρήθηκαν τα βάρη των όγκων. Γ απόπτωση που προκαλείται

in vivo

. Οι όγκοι κόπηκαν και απόπτωση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας

in situ

κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου. Τα αποπτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. Δ SAHA αυξήθηκε σημαντικά απόπτωση σε ποντίκια DHA-θεραπεία. Τα ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων μετρήθηκαν με απαρίθμηση του αριθμού των πράσινων κυττάρων κάτω από πέντε τυχαία πεδία.

Η

Για να δοκιμαστεί εάν HDACi ενίσχυσε την θανατηφόρο επίδραση του DHA μέσω αύξησης της απόπτωσης, οι ιστοί του όγκου κόπηκαν και υποβλήθηκαν σε

in situ

ανίχνευση κυτταρικού θανάτου (Εικ. 5C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά από 8,6 ± 2,4% στην ομάδα DHA σε 17,7 ± 3,3% στην ομάδα συνδυασμένη θεραπεία (Εικ. 5D). Επιπλέον, εξετάσαμε την ιστολογία όγκων μετά τη θεραπεία με χρήση Η &? Χρώση Ε. Οι όγκοι από την ομάδα ελέγχου έδειξε χαρακτηριστική ιστολογική εμφάνιση του καρκίνου του ήπατος (Εικ. 6). Τα τμήματα των όγκων DHA αγωγή έδειξε ότι τα καρκινικά κύτταρα σημαντικά μειωμένη, με τα σημάδια της απόπτωσης, διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων και ίνωση. Στην ομάδα συνδυασμένης αγωγή, αποπτωτικά περιοχές και εκτεταμένη νέκρωση με διήθηση των φαγοκυττάρων θα μπορούσε να παρατηρηθεί αρκετά συχνά.

SAHA διευρυμένη την αποπτωτική περιοχή που προκαλείται από κατεργασία DHA στο Hep G2 ξενομοσχεύματος όγκου. Οι όγκοι αποκόπηκαν και υποβλήθηκαν σε Η &? Χρώση Ε για τον προσδιορισμό της παθολογικής αξιολόγησης. Από την άλλη πλευρά, ιστοί ξενομοσχευμάτων υποβλήθηκαν σε ανοσοχημεία για την ανίχνευση της έκφρασης του Ki-67, ρ53, Mcl-1, π-ΕΚΚ, και ενεργός PARP. Πρωτότυπη μεγέθυνση × 400.

Η

Επιπλέον, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημεία για την ανίχνευση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην HDACi /DHA-επαγόμενη απόπτωση (Εικ. 6). Μειωμένη έκφραση του Ki-67 έδειξε την μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και πιθανόν αυξημένη κυτταρικό θάνατο. Παρατηρήθηκε ανιχνεύσιμη διαφορά στην έκφραση p53. Εντυπωσιακή αύξηση της ενεργού PARP, καθώς και ένα κυρίαρχο πτώση του Mcl-1 και p-ERK, ήταν παρόν σε HDACi /DHA επεξεργασμένο ξενομόσχευμα. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι HDACi ήταν σε θέση να αυξήσουν σημαντικά την DHA-προκαλούμενα αποτελέσματα κατά των όγκων.

Συζήτηση

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι HDACi συμπεριλαμβανομένων ΝΑΒ και SAHA αλληλεπιδρούν συνεργικά με κυτταροτοξικούς παράγοντες, όπως φλουδαραβίνη και ετοποσίδη, να αυξήσουν δραματικά μιτοχονδριακή τραυματισμό και την απόπτωση σε λευχαιμικά και επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα [24], [25]. Οι ιδιότητες των αντιογκογένεσης HDACi είναι ιδιαίτερα αξιοσημείωτες πιθανόν να οφείλεται στο γεγονός ότι οι κυτταροτοξικές επιδράσεις τους είναι συνήθως ειδικές για καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα. Ωστόσο, όταν χρησιμοποιείται ως ένας και μόνο παράγοντας, θα μπορούσε να HDACi εμφανίζουν περιορισμένη φονική δραστηριότητα προς τον καρκίνο του ήπατος, η οποία είναι εμφανής στην παρούσα μελέτη δείχνει ότι τόσο η ΝΑΒ και SAHA σε χαμηλές δόσεις δεν είναι σε θέση να επάγουν σημαντική αναστολή της ανάπτυξης

in vitro

και

in vivo

. Ωστόσο, όταν HDACi χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με DHA, ένα παράγωγο της αρτεμισινίνης που κλινικώς χρησιμοποιείται στη θεραπεία της ελονοσίας με καλό προφίλ τοξικότητας [26], μπορούν να επάγουν απόπτωση πολύ περισσότερο, με αποτέλεσμα αξιοσημείωτη σταμάτημα του ξενομοσχεύματος όγκου σε γυμνούς ποντικούς. Υπάρχουν πολύ περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με HDACi σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες κατά του όγκου έναντι του καρκίνου του ήπατος. Τα δεδομένα μας για πρώτη φορά έχουν καταδείξει ένα συνεργικό αποτέλεσμα του DHA και HDACi σε αναστολή του καρκίνου του ήπατος.

Πολλές αναφορές έχουν δείξει ότι το κατώτατο όριο της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να ελεγχθεί από τις δραστηριότητες των οδών μεταγωγής σήματος πολλαπλών , ένα από τα οποία είναι Raf-ΜΕΚ1 /2-ERK1 /2 μονοπατιού [27], [28]. Αυτή η οδός συχνά απορυθμίζεται σε νεοπλασματικό μετασχηματισμό, μαζί με το c-Jun ΝΗ2-τελική κινάση (JNK1 /2) και οδοί ρ38 ΜΑΡΚ [29]. Έχει επίσης ενοχοποιηθεί ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού ERK1 /2 συνδέεται συνήθως με την επιβίωση αλλά JNK1 /2 και p38 μονοπάτι ΜΑΡΚ με την απόπτωση [30]. Στη μελέτη μας, η φωσφορυλίωση ERK1 /2 ήταν ελαφρώς αναστέλλεται με κατεργασία DHA αλλά αναστέλλεται έντονα από την συνδυασμένη θεραπεία με DHA και HDACi. Επιπλέον, με τη χρήση της ERK-ειδικό αναστολέα PD98059, αποδείξαμε ότι η ενεργοποίηση της ERK είναι αντιαποπτωτική αφού αναστολέα ERK ενισχυμένη DHA επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος.

Ένας αριθμός αντιαποπτωτικών πρωτεΐνες τελεστές έχουν ταυτοποιηθεί κατάντη του ERK1 2 σηματοδότησης /, συμπεριλαμβανομένων Bcl-xL και Mcl-1 [31], [32]. Μεταβολές των δύο φωσφορυλιωμένων ERK και Mcl-1 εμφανίζεται συχνά στην ίδια κατεύθυνση. Yuen et al. ανέφεραν ότι φίμωση Ran μπορεί να οδηγήσει σε απενεργοποίηση των ERK και προς τα κάτω ρύθμιση του Mcl-1 σε καρκινικά κύτταρα [33]. Reeves et al. έδειξαν ότι η ενεργοποίηση της ERK και επαγωγή Mcl-1 παρατηρήθηκαν σε μυελοειδή κύτταρα που έχουν μολυνθεί με ανθρώπινο κυτταρομεγαλοϊό [34]. Καλβίνο et al. αναφερθεί treatement με λονιδαμίνη συν τριοξείδιο του αρσενικού είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση των Mcl-1 και p-ERK [35].