Αφηρημένο

Επιλογή καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC), οι ασθενείς ενδέχεται να ανταποκριθούν στη θεραπεία παραμένει μια κλινική πρόκληση. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να διαπιστωθεί ποια γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε σχέση με την ευαισθησία της θεραπείας και αφορούν αυτή για να αντιγράψετε τον αριθμό σε ένα πάνελ των 15 κυτταρικών σειρών CRC. αριθμό αντιγράφων παραλλαγές των ταυτοποιημένων γονιδίων αξιολογήθηκαν σε μία ομάδα του ΚΕΣ. IC

50 μετρήθηκαν για 5-φθοριοουρακίλη, οξαλιπλατίνη, και BEZ-235, ένας αναστολέας ΡΙ3Κ /mTOR. Οι κυτταρικές σειρές προφίλ με τη χρήση συστοιχίας συγκριτική γονιδιωματική υβριδοποίηση, η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης Illumina, συστοιχίες αντίστροφη πρωτεΐνη φάσης, και στοχευμένη αλληλουχίας του

KRAS

μεταλλάξεις hotspot. Η συχνή κέρδη παρατηρήθηκαν σε 2p, 3q, 5ρ, 7ρ, 7q, 8q, 12p, 13q, 14q, 17q και και ζημίες κατά 2q, 3ρ, 5q, 8p, 9p, 9Q, 14q, 18q, και 20p. Συχνά αποκτήσει περιοχές που περιλαμβάνονται

EGFR

,

PIK3CA

,

MYC

,

ΠΕΑ

,

TRIB1

,

FZD1

και

BRCA2

, ενώ συχνά χάνεται περιοχές που περιλαμβάνονται

FHIT

και

MACROD2

.

TRIB1

επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη. ανάλυση εμπλουτισμός Gene έδειξε ότι διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε σχέση με ανταπόκριση στη θεραπεία συμμετείχαν σε σηματοδότηση Wnt, σηματοδότηση υποδοχέα EGF, απόπτωση, κυτταρικό κύκλο, και την αγγειογένεση. Σταδιακή ενσωμάτωση των δεδομένων αριθμού αντιγράφων και την έκφραση του γονιδίου απέδωσε 47 υποψήφια γονίδια που συσχετίζονταν σημαντικά.

PDCD6

ήταν διαφορικά εκφρασμένων σε όλες τις τρεις απαντήσεις θεραπείας. μικροσυστοιχίες ιστού κατασκευάστηκαν για μια ομάδα 118 ασθενών CRC και

TRIB1

και

MYC

ενισχύσεις μετρήθηκαν με τη χρήση φθορισμού

in situ υβριδισμού

.

TRIB1

και

MYC

ενισχύθηκαν σε 14,5% και 7,4% της ομάδας πληθυσμού, αντίστοιχα, και αυτές οι ενισχύσεις συσχετίζονταν σημαντικά (p≤0.0001).

TRIB1

έκφραση της πρωτεΐνης στην ομάδα των ασθενών συσχετίστηκε σημαντικά με pERK, Akt, και κασπάσης 3 έκφρασης. Εν κατακλείδι, ένα σύνολο υποψήφιων πρόβλεψης βιοδεικτών για 5-φθοριοουρακίλη, οξαλιπλατίνη και BEZ235 περιγράφονται που χρήζουν περαιτέρω μελέτης. Ενίσχυση του υποτιθέμενου ογκογονιδίου

TRIB1

έχει περιγραφεί για πρώτη φορά σε μια ομάδα ασθενών CRC

Παράθεση:. Briffa R, Um Ι, Faratian D, Zhou Υ, Turnbull AK, Langdon SP, et al. (2015) Multi-Scale Γονιδιωματική, Transcriptomic και πρωτεομική ανάλυση του καρκίνου του παχέος εντέρου Γραμμές κυττάρων για τον εντοπισμό νέων βιολογικών δεικτών. PLoS ONE 10 (12): e0144708. doi: 10.1371 /journal.pone.0144708

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 16 του Ιουνίου 2015? Αποδεκτές: 23 Νοεμβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 17 Δεκ, 2015

Copyright: © 2015 Briffa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Στρατηγικό εκπαιδευτικές οδοί Υποτροφιών (Μάλτα). Η υποτροφία είναι συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση – Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (ΕΚΤ) στο πλαίσιο Επιχειρησιακού Προγράμματος ΙΙ – Πολιτική Συνοχής 2007-2013, «ενδυνάμωση των ανθρώπων για περισσότερες θέσεις εργασίας και μια καλύτερη ποιότητα ζωής». Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από επιπλέον Ιατρικών Ερευνών της Σκωτίας

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) αντιπροσωπεύει το 8 % του συνόλου των θανάτων από καρκίνο [1], με μεταβλητό επιβίωση μεταξύ 39% και 65%, ανάλογα με το στάδιο κατά τη διάγνωση [2]. Ο κίνδυνος ανάπτυξης CRC εξαρτάται τόσο από γενετικούς όσο και τον τρόπο ζωής που σχετίζονται με παράγοντες και αυξάνει σημαντικά με την ηλικία [2]. Αν και η θεραπεία μπορεί να είναι θεραπευτική, ένα σημαντικό ποσοστό των ασθενών CRC έχουν υψηλό κίνδυνο υποτροπής της νόσου μετά από χειρουργική επέμβαση και χημειοθεραπεία [3].

Οι κύριες οδοί που εμπλέκονται στην καρκινογένεση του παχέος περιλαμβάνουν, αλλά δεν περιορίζονται σε αυτά, την ΡΙ3Κ /mTOR μονοπάτι, το μονοπάτι που ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνικών κινασών (ΜΑΡΚ), και η οδός Wnt [4], με την οδό ϋΑΚ /δΤΑΤ, Hedgehog μονοπάτι, και ΝΡκΒ μονοπάτι που εμπλέκονται επίσης [5]. Αυτές οι οδοί ελέγχονται μέσω πολύπλοκων στιχομυθία, αρνητική ανάδραση, και άλλα αντισταθμιστικών μηχανισμών. Ενώ η ενεργοποίηση αυτών των οδών γίνεται μέσω μεταλλάξεων στα συμμετέχοντα ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια, αντίστοιχα, των 80 σωματικών μεταλλάξεων σε οποιοδήποτε μεμονωμένο CRC, μόνο 15 ή, ενδεχομένως, είναι λιγότερο πιθανό να είναι βασικές οδηγούς για την έναρξη του όγκου, της προόδου, ή /και συντήρηση [ ,,,0],6]. Οι πιο συχνά μεταλλαγμένα γονίδια στο CRC είναι

APC

(70-80%),

TP53

(50%),

KRAS

(35-45%),

PIK3CA

(25-32%),

BRAF

(10-17%) και

PTEN

(4-5%) [7-12].

θεραπεία πρώτης γραμμής για CRC είναι συνήθως fluoropyramidine μονοθεραπεία και οξαλιπλατίνη ή ιρινοτεκάνη χημειοθεραπεία με βάση [13]. Πιο πρόσφατα, μονοκλωνικά αντισώματα όπως cetuximab, panitumumab και bevacizumab έχουν αδειοδοτηθεί σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία για μεταστατικό CRC (mCRC) [14], όπως επιλεκτική και ειδική αντικαρκινικούς παράγοντες με υψηλό θεραπευτικό δείκτη και χαμηλότερη τοξικότητα από συμβατικές θεραπείες [15]. Ωστόσο, οι αντιδράσεις σε θεραπεία είναι ποικίλη, με λιγότερο από το ένα τρίτο των ασθενών που ανταποκρίθηκαν σε 5-φθοριοουρακίλη [16]. Παρά το γεγονός ότι

KRAS

και

BRAF

μεταλλάξεις δείχνουν αντοχή σε θεραπείες που στοχεύουν EGFR, περίπου 40-70% του άγριου τύπου

KRAS

ασθενείς mCRC αντλήσει λίγη ή καθόλου όφελος από EGFR- στοχευμένες θεραπείες [17]. Εξακολουθεί να υπάρχει έλλειψη πρόβλεψης δεικτών που επιτρέπουν στους γιατρούς να επιλέξετε ασθενείς είναι πιθανότερο να ωφεληθούν από μια ειδική θεραπεία.

Εδώ, επιδιώξαμε να χαρακτηρίζουν συστηματικά ένα πάνελ των κυτταρικών σειρών CRC, επιλέγονται για να αντικατοπτρίζει την ποικιλομορφία αυτής της ασθένειας , χρησιμοποιώντας υψηλής απόδοσης αναλύσεις, προκειμένου να εντοπίσει βιοδείκτες της αντίστασης σε δύο στοχευμένα και μη στοχευμένες θεραπείες.

Μέθοδοι

CRC κυτταρική σειρά πάνελ

Δεκαπέντε κυτταρικές σειρές CRC ήταν μελετήθηκαν: τα κοντά διπλοειδή κυτταρικές σειρές DLD-1, HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, και LoVo (όλα από ECACC εκτός HCT116p53 – /- το οποίο ήταν ένα δώρο από τον Dr G Smith, Πανεπιστήμιο του Dundee, UK [18]) και οι ανευπλοειδικών κυτταρικές σειρές SW480, SW837, ΗΤ29, Τ84, Colo 201, Colo 320DM, LS411N, SK-CO-1, NCI H508 και NCI Η716 (όλα από την ATCC) εκτός από την Κόλο 320DM, Τ84, και SW837 (όλα από ECACC) .

Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) (Gibco

®, Cat ηο 31885..) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? ΡΑΑ, Cat ηο.. A15-101) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Gibco

®, Cat. No.15140-122). Οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C που περιέχει 5% CO

2. Όλες οι κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν για μυκόπλασμα χρησιμοποιώντας το Venor

™ GEM Mycoplasma Detection Kit (Sigma-Aldrich, Cat. Ηο. MP0025). Όταν οι κυτταρικές σειρές έφθασαν 70-80% συρροή, αυτά θρυψινοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 0.05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (1Χ) με ερυθρό φαινόλης (Gibco

®, Cat. Ηο. 25300).

Κλινικά δείγματα

, παραφίνη-ενσωματωμένες δείγματα ιστού Αρχειακή φορμόλη-σταθερό (FFPE) ελήφθησαν από δείγματα εκτομής από ασθενείς που ζουν στη Σκωτία που είχαν διαγνωστεί με CRC μεταξύ του 1996 και του 2003 και ήταν κάτω των 55 ετών κατά τη στιγμή της διάγνωσης (ανατρέξτε έως S1 πίνακα). Ένα σύνολο 870 ασθενών που είχαν προσληφθεί, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Όλες οι περιπτώσεις εξετάστηκαν από μία γαστρεντερική ιστοπαθολόγο πριν από την κατασκευή TMA για να εξασφαλιστεί ότι ο ιστός που αποτελείται κυρίως όγκου. Όλοι οι καρκίνοι οργανώθηκαν Dukes ‘Α και πρόσβαση Β Cohort υλικό και κλινικά αρχεία χορηγήθηκε από την Επιτροπή των ιστών, του Εδιμβούργου Πειραματική Cancer Medicine (Ref: TR029), Lothian Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας (Κωδ: 08 /S1101 /41) και τη Νοτιοανατολική Σκωτία HSS (SAHSC) Bioresource. (Ref: SR117)

δοκιμασίες ευαισθησίας των ναρκωτικών

5-φθοριοουρακίλη (5-FU) 50mg /ml ενέσιμο διάλυμα αγοράστηκε από Medac GmbH. Οξαλιπλατίνη (L-OHP) 5 mg /ml πυκνό διάλυμα προς έγχυση (Fresenius Kabi Oncology plc, UK) ελήφθη από την Western General Hospital Pharmacy, Εδιμβούργο. Η στοχευμένη αναστολέας BEZ235 (Cat. Αρ. S1009) αγοράστηκε από Σέλεκ Chemicals. Κάθε πλάκα 96 φρεατίων αποτελούνταν από έξι φρεάτια που περιέχουν κύτταρα σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, η οποία χρησίμευσε ως μάρτυρας. Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί 48 ώρες πριν από την προσθήκη των φαρμάκων. Οκτώ διαφορετικές συγκεντρώσεις χρησιμοποιήθηκαν ανά φάρμακο που κυμαίνεται μεταξύ 5 μΜ έως 100 μΜ (5-FU, L-ΟΗΡ) και μεταξύ 2.5ηΜ και 80 ηΜ, (BEZ235) αντιστοίχως. Τα κύτταρα επωάστηκαν με τα φάρμακα για 96 ώρες. Για τον προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων, 20 μL του Alamar Μπλε προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για 6 ώρες πριν από την ανάγνωση των πλακών χρησιμοποιώντας Fluoroskan Ascent FL. Ολες οι δοκιμασίες ευαισθησίας φαρμάκου επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές και έξι κοιλότητες σπάρθηκαν σε κάθε συγκέντρωση φαρμάκου.

Μια μέση ανάγνωση RFU λήφθηκε για κάθε συγκέντρωση φαρμάκου και η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε ως ποσοστό του μη επεξεργασμένου ελέγχου. Οι ράβδοι σφάλματος υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το συσχετισμένης τυπική απόκλιση των μέσων. Τα IC

’50 για 5-FU, L-OHP και BEZ235 προσδιορίστηκαν με τη χρήση του πακέτου XLfit 5,0 λογισμικού (ID Business Solutions, UK). Δεν παρέκταση πραγματοποιήθηκε κατά τον καθορισμό του IC

50 αξίες και ακραίες τιμές υπολογίστηκαν ως έχουν ένα επίπεδο εμπιστοσύνης μεγαλύτερο από 0.05.

DNA, RNA και πρωτεϊνών εξόρυξη

Το γονιδιακό DNA εκχυλίζεται από κάθε κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας DNeasy αιμοποιητικού και Kit Tissue (Qiagen, Cat 69504) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις DNA επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο μικρο-όγκου NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Ικανοποιητική καθαρότητα DNA θεωρήθηκε ως μεγαλύτερη ή ίση με μία αναλογία 260/280 1,8, εξασφαλίζοντας ελάχιστη μόλυνση πρωτεΐνη του δείγματος. Η ποιότητα των δειγμάτων DNA περαιτέρω προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή απομακρύνθηκε προσεκτικά και οι ζώνες του DNA έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας το Σύστημα Gel Documentation.

Ολικό RNA εξήχθη από τις κυτταρικές γραμμές εις διπλούν χρησιμοποιώντας το RNeasy MinElute Kit καθαρισμού (Qiagen, Cat. Ηο. 74204 ) και miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Cat. Νο. 217004). Η συγκέντρωση του RNA επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο NanoDrop 2000. Ικανοποιητική καθαρότητα RNA θεωρήθηκε ως αναλογία 260/230 των περίπου 2.0.

προϊόντα λύσης πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν όταν οι κυτταρικές σειρές ήταν περίπου 80% συρρέοντα, όπως περιγράφεται λεπτομερώς αλλού [20]. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των κυτταρολυμάτων προσδιορίστηκε μέσω του δικιγχονινικού οξέος (BCA) δοκιμασία (Sigma-Aldrich, αρ. Κατ. C2284-25ML, Cat.No. B9643-1L).

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης με Sanger αλληλούχισης

μεταλλάξεις Hotspot στο κωδικόνιο 12 και 13 αναλύθηκαν. Το σετ εκκινητών σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας Primer Premier

® λογισμικού V6.0 (PREMIER Biosoft International). Οι αλληλουχίες των εκκινητών (5 ‘προς 3’) για

KRAS

01 είχαν ως εξής: GGT ACT GGT GGA GTA ΤΤΤ GAT AGT GT (προς τα εμπρός) και TGA ΑΤΤ AGC TGT ATC GTC AAG GCA CT (reverse).

KRAS

ενίσχυση εξόνιο 2 διεξήχθη με τη χρήση του HotStar Hi Fidelity Polymerase Kit (Qiagen Ποιότητας

®, αρ. Κατ. 202602). Η αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε στο DNA Engine Opticon 2 Real-Time Cycler (GMI, Inc). Η αναμενόμενη διάρκεια του PCR προϊόντος επιβεβαιώθηκε με την παρουσία μιας μόνο ζώνη στο κατάλληλο μοριακό βάρος. αλληλουχίας Sanger πραγματοποιήθηκε στο Ιατρικό Συμβούλιο Έρευνας Ανθρώπινης Γενετικής Μονάδας (MRC-HGU), Εδιμβούργο. Προϊόντα αλληλουχία χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ Prism

® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Μετάλλαξη Surveyor

® DNA Variant Ανάλυση V3.97.

μικροσυστοιχιών αναλύσεις

Array συγκριτικής γονιδιωματικής υβριδοποίησης.

συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμός (CGH) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του μικροσυστοιχιών NimbleGen (Roche). σήμανση δείγματος διεξήχθη με τη NimbleGen Dual-Color DNA Labeling Kit (Roche, αρ. κατ. 06 370 250 001). Ο υβριδισμός διεξήχθη στην MRC-HGU, Εδιμβούργο χρησιμοποιώντας ένα NimbleGen Hybridization Kit (Roche, αρ. Κατ. 05 583 683 001), NimbleGen Δείγμα Παρακολούθηση Kit ελέγχου (Roche, αρ. Κατ. 05 223 512 001) και δύο ανθρώπινα CGH 12 x 135Κ Οροφοδιαμέρισμα Γονιδιώματος Πλακάκια Πίνακες V3.0 (Roche, αρ. κατ. 05 520 878 001). λογισμικό NimbleScan χρησιμοποιήθηκε για να παράγει τα αρχεία έκθεση ζεύγος χρησιμοποιούνται για την ανάλυση αριθμού αντιγράφων των δεδομένων. Τα δεδομένα έχουν κατατεθεί στο Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI) έκφραση γονιδίων Omnibus με τον αριθμό προσχώρησης GSE72296.

προφίλ

Η γονιδιακή έκφραση.

Τρεις σειρές δειγμάτων RNA ετοιμάστηκαν για Illumina

® ολόκληρο το γονιδίωμα Gene Expression Profiling, όπου δημιουργήθηκαν 48.804 μεταγραφές ανά δείγμα. Τα τρία σετ αποτελούνταν από δύο σύνολα βιολογικών επαναλήψεων και μία σειρά τεχνικών επαναλήψεις. Όλα τα RNA δείγματα αραιώθηκαν σε μια συγκέντρωση 500 ng /11 μΙ. Η Illumina

® TotalPrep

™ RNA Amplification Kit (Ambion

®, αρ. Κατ. AMIL1791) χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει βιοτινυλιωμένο, ενισχυμένο RNA για υβριδισμό με την Illumina

® Ανθρωπίνων HT-12 v4. 0 BeadChip. Πριν από την πρόοδο με την προετοιμασία των δειγμάτων RNA για ανάλυση μικροσυστοιχιών, η ακεραιότητα του RNA αξιολογήθηκε περαιτέρω με την Agilent

® 2100 Bioanalyzer χρησιμοποιώντας την Agilent

® RNA 6000 Nano Kit (Agilent, αρ. Κατ. 5067-1511) . Δείγματα με RNA Ακεραιότητα Αριθμός (RIN) 7 ή καλύτερα κρίθηκαν αποδεκτές για υβριδισμό.

Τα δείγματα αναλύθηκαν στο Wellcome Trust Clinical Research Facility, Εδιμβούργο (Gene Expression Έργο-CRF E11960), όπου ήταν αραιωμένο σε συγκέντρωση 150ng /μl και υβριδοποιήθηκε επί τρία ΗΤ-12 συστοιχίες BeadChip V4 Έκφραση Ανθρώπινου. Δύο τεχνικές επαναλήψεις υβριδοποιήθηκαν πάνω σε κάθε συστοιχία για να χρησιμεύσει ως εσωτερικός έλεγχος ποιότητας. Τα δείγματα τυχαία σε υβριδισμό κατά μήκος των τριών Illumina

® συστοιχίες Έκφραση BeadChip HumanHT-12v4.

Μετά την υβριδοποίηση, οι συστοιχίες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας την Illumina HiScan

® Platform (Illumina

®, αρ. κατ. SY-103 – 1001). Τα αρχεία δεδομένων BeadArray εξήχθησαν από το λογισμικό σάρωσης της Illumina και εισάγονται στην μονάδα γονιδιακής έκφρασης του λογισμικού GenomeStudio (Illumina

®), όπου στη συνέχεια τα αρχεία δεδομένων μετατράπηκαν σε καρτέλα οριοθετημένο αρχεία. Τα δεδομένα έχουν κατατεθεί στο Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI) έκφραση γονιδίων Omnibus με αριθμό ένταξης GSE72544 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE72544).

συστοιχίες πρωτεΐνη αντίστροφης φάσης

ανάστροφης φάσης συστοιχίες πρωτεΐνη (RPPA) είναι μια τεχνική μέσον απόδοσης που επιτρέπει την διαλογή των δειγμάτων με μια μεγάλη ομάδα πρωτεϊνών ενδιαφέροντος σε ένα σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα , ενώ χρησιμοποιώντας ελάχιστες ποσότητες τόσο δείγματος και αντισωμάτων [21]. Οι μετουσιώνεται και ανάγεται δείγματα πρωτεΐνης από τα δείγματα 15 CRC κηλιδώθηκαν εις τριπλούν πάνω σε κάθε επίθεμα ενός 2-Pad FAST

® νιτροκυτταρίνης επικαλυμμένο γυάλινο πλακίδιο (Whatman Ltd., αρ. Κατ. 10485317) χρησιμοποιώντας ένα BioRobotics MicroGrid MG II Βιοτράπεζας (Isogen Life Science). Στη συνέχεια, είχαν επιτυχώς ανιχνεύθηκαν με ένα πάνελ 31 βελτιστοποιημένες, in-house επικυρωθούν, συνολική και φωσφο- αντισωμάτων όπως περιγράφεται προηγουμένως (S2 Πίνακας) [20]. επιλέχθηκαν Αυτά τα αντισώματα για τη στόχευση κλειδί πρωτεΐνες που εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση, εισβολή, μετάσταση, αγγειογένεση, βλάβη του DNA, και η απόπτωση βελτιστοποιήθηκαν και επικυρώθηκαν μέσω Western Blotting. Οι κηλίδες RPPA μετρήθηκαν με MicroVigene

™ λογισμικό μονάδας ανάλυσης RPPA (VigeneTech Inc.). Τα δεδομένα αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22].

Οι κηλίδες RPPA μετρήθηκαν με MicroVigene

™ λογισμικό μονάδας ανάλυσης RPPA (VigeneTech Inc.).

Ανάλυση

Δεδομένα

Γονιδιωματική ανάλυση των δεδομένων.

δεδομένα αλληλουχίας Sanger αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Μετάλλαξη Surveyor

® DNA παραλλαγή ανάλυση λογισμικού V3.97 (Soft Γενετικής

®, USA). Τα αρχεία ανεπεξέργαστα δεδομένα .ab1 που παράγεται από την ΑΒΙ Prism

® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) εισήχθησαν στο λογισμικό και εφαρμόστηκαν οι προεπιλεγμένες ρυθμίσεις ανάλυσης. Τα αρχεία σχολιασμών GenBank έγιναν αυτόματα λήψη και τα αρχεία αναφοράς που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση μεταλλάξεων ήταν αυτόματα συντίθεται.

δεδομένα aCGH αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Partek

® Γονιδιωματική Σουίτα

™ Έκδοση 6.6 (Partek Inc.). Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αρχικά Loess Κανονικοποίηση και η γονιδιωματική Τμηματοποίηση αλγόριθμος χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα αριθμό αντιγράφων επιμηκύνσεις και διαγραφές. Το έθιμο παραμέτρους κατάτμησης είχαν ως εξής: οι ελάχιστες γονιδιωματικής δείκτες ήταν 10, η p-τιμή ήταν 0.001, και ο λόγος σήματος προς θόρυβο ήταν 0,03. Μια περιοχή έχει αναφερθεί ως χαμένο, αν η αναλογία του αριθμού αντιγράφων log2 ήταν κάτω από -0,3 και κέρδισε, αν η αναλογία του αριθμού αντιγράφων log 2 ήταν πάνω από 0,15. Τρεις διαφορετικές λίστες περιοχή δημιουργήθηκαν: (1) τις περιοχές που είχαν αποκτηθεί σε επτά ή περισσότερες κυτταρικές σειρές? (2) περιοχές διαγραφεί σε επτά ή περισσότερες κυτταρικές σειρές? (3), αυτά που περιέχουν τις υψηλότερες επιμηκύνσεις, δηλαδή, αναλογία log2 ίση ή μεγαλύτερη προς 1,0 (ισοδύναμο με ένα αριθμό αντιγράφων του 2). Επιπλέον, γονιδιωματική ομαδοποίηση τμηματοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Ευκλείδειας απόστασης και μέσο σύνδεσης. Η ανάλυση αριθμός αντιγράφων διεξήχθη στο χρωμόσωμα 1 στο χρωμόσωμα 22 και εξαιρούνται τα δύο φυλετικά χρωμοσώματα.

Transcriptomic ανάλυση των δεδομένων.

Το αρχείο προφίλ γονίδιο δείγμα που παράγεται από την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης ήταν quantile ομαλοποιημένη και διηθείται για εκείνες ανιχνευτές όπου το ≤0.05 p-value ανίχνευσης. Τα δεδομένα στη συνέχεια log2 μετασχηματίζονται και σημαίνουν κεντραρισμένη για να ληφθούν τιμές σχετικής μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Το αρχείο προφίλ γονίδιο δείγμα στη συνέχεια εμπλουτίζονται με τη χρήση Hg18 πριν από την εκτέλεση ανάλυσης διαφορική γονιδιακή έκφραση (DGEA).

Η DGEA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ArrayMining, ένα online λογισμικό εξόρυξης δεδομένων μικροσυστοιχιών [23]. διαφορική γονιδιακή έκφραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανάλυση SAM στη λίστα των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε σχέση με την ανταπόκριση στη θεραπεία. Τρεις διαφορετικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν: (1) 5-FU εξαιρετικά ευαίσθητες κυτταρικές σειρές

vs

. 5-FU λιγότερο ευαίσθητες κυτταρικές σειρές, όπου εξαιρετικά ευαίσθητο κυτταρικές γραμμές ορίζεται ως έχον ένα IC

50 ≤ 30μΜ? (2) L-OHP εξαιρετικά ευαίσθητες κυτταρικές σειρές

vs

. L-ΟΗΡ λιγότερο ευαίσθητες κυτταρικές σειρές, όπου εξαιρετικά ευαίσθητο κυτταρικές γραμμές ορίζεται ως έχον ένα IC

50 ≤ 10 μΜ? (3) ευαίσθητες κυτταρικές σειρές BEZ235

vs

. αναίσθητη κυτταρικές σειρές BEZ235, όπου ευαίσθητες κυτταρικές σειρές ορίστηκαν ως έχουν IC

50 & lt? 80 ηΜ.

Ερμηνεία των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Λειτουργική Clustering Σχολιασμός στο DAVID πόρων βιοπληροφορικής [24].

Ενσωμάτωση συχνά ενισχυμένες περιοχές με δεδομένα γονιδιακής έκφρασης.

Η έκφραση του γονιδίου δεδομένα για τα γονίδια που βρίσκονται στις περιοχές συχνά αποκτήθηκε διηθήθηκε. Χρησιμοποιώντας συντελεστές συσχέτισης Pearson με Bonferroni διόρθωση, μια λίστα με τα γονίδια που είχαν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της αξίας αριθμό αντιγράφων log2 και γονιδιακής έκφρασης δημιουργήθηκε. Τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης για κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν σε σχέση με την ανταπόκριση στη θεραπεία με τη χρήση Mann-Whitney U test χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 6.

πρωτεομική ανάλυση των δεδομένων.

Τα δεδομένα που παράγονται από RPPA ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Cluster 3.0 , ένα εργαλείο ομαδοποίησης ανοικτού κώδικα [25]. Τα δεδομένα log-μετασχηματιστεί, σημαίνει στο κέντρο Cluster 3,0, και ομαδοποιούνται ανά συσχέτιση κεντράρισμα και το μέσο σύνδεσης χρησιμοποιώντας MeV 4.8 [26]. αποτελέσματα RPPA για τον πίνακα 15 CRC αναλύθηκαν σε σχέση με την ανταπόκριση στη θεραπεία με τη χρήση Mann Whitney U test χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 6.

Ιστός μικροσυστοιχίες (ΤΜΑ), αυτοματοποιημένη ποσοτική ανάλυση (AQUA), και FISH

Πέντε-micron αιματοξυλίνη και ηωσίνη διαφάνειες χρώση παρασκευάστηκαν από τα μπλοκ FFPE, και οι περιοχές του όγκου χαρακτηρίστηκαν από έναν παθολόγο και έναν εκπαιδευμένο τεχνικό έρευνα. Μετά την ιστοπαθολογική εξέταση, 118 περιπτώσεις επιλέχθηκαν από την αρχική ομάδα και μια μικροσυστοιχία ιστού (ΤΜΑ) κατασκευάστηκε από εξειδικευμένο τεχνικό. Τέσσερις βιολογικές επαναλήψεις (TMA000034A-D) κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται λεπτομερώς αλλού [27] και τα κόβουμε σε τομές 5μm χρησιμοποιώντας μικροτόμο και τοποθετείται επάνω γυάλινες πλάκες. Τα κλινικά και παθολογικά παράμετροι αυτής της κοόρτης συνοψίζονται στον Πίνακα S1.

Protein έκφραση του TRIB1 εκτιμήθηκε με αντι-TRIB1 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού στο CRC TMA χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένη ανάλυση ποσοτικές (AQUA), που περιγράφεται λεπτομερώς αλλού [28 , 29]. έκφραση TRIB1 τόσο η κυτταροπλασματική και πυρηνικά διαμερίσματα στη συνέχεια συσχετίζεται με άλλες πρωτεΐνες μετρήθηκαν προηγουμένως στην παρούσα κοόρτη. έκφραση TRIB1 ερευνήθηκε επίσης σε σχέση με την επιβίωση του ασθενούς, όπως περιγράφεται παρακάτω.

TRIB1

και

MYC

ενίσχυση στην ομάδα των ασθενών CRC διερευνήθηκαν με τη χρήση φθορισμού

στο situ υβριδισμού

(FISH). Μια MYC /CEN8p ανιχνευτή αγοράστηκε από Abnova (αρ. Κατ. FG0065) και η TRIB1 /CEN8p ανιχνευτή έθιμο σχεδιαστεί από Abnova. Ο χρόνος επεξεργασίας πρωτεάσης μεταβάλλεται για να βελτιστοποιήσει την πέψη και την εξασφάλιση καλής ποιότητας υβριδισμού. Η οπτικοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ϋΑΡΙ (4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη-2-υδροχλωρική (Abnova) για τη χρώση των πυρήνων.

Έτοιμα προς χρήση διπλής-σήμανσης ανιχνευτών για

MYC

και

TRIB1

αγοράστηκαν από Abnova. Ο ανιχνευτής FISH MYC /CEN8p αποτελούνταν από ένα ~ 160kb

MYC

αισθητήρα που βρίσκεται στο 8q24.12-q24.13 με Texas Red φθοροφόρου μαζί με ένα ~ 520kb CEN8p ανιχνευτής βρίσκεται σε 8p11.21 με ένα φθοροφόρο FITC. Η TRIB1 /CEN8p καθετήρα FISH αποτελείται από ένα ~ 260KB

TRIB1

ανιχνευτής βρίσκεται σε 8q24.13 με Texas Red φθοροφόρου μαζί με ένα ~ 520kb καθετήρα CEN8p βρίσκεται στο 8p11.21 με ένα φθοροφόρο FITC.

η βαθμολόγηση έγινε από έναν εκπαιδευμένο τεχνικό και έναν παθολόγο σύμβουλος. Τα πλακίδια βαθμολογήθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού Leica DMLB χρησιμοποιώντας φακό βύθισης 100X πετρελαίου. χρησιμοποιήθηκαν τα κριτήρια Κολοράντο βαθμολόγησης [ ,,,0],30], για να σημειώσει τα διαφάνειες TMA. ένα μέγιστο των είκοσι πυρήνων ανά πυρήνα βαθμολογήθηκαν στις περισσότερες περιπτώσεις, αν και σε ορισμένες περιπτώσεις βαθμολογήθηκαν τουλάχιστον δέκα πυρήνες οφείλεται στο ότι δεν έχουν είκοσι μετρήσιμου πυρήνες. Το άθροισμα από τα κόκκινα και πράσινα φθοροφόρα σημειώθηκε για κάθε πυρήνα, και το τελικό σκορ αποτελούνταν από το λόγο του κόκκινου φθοροφόρου στο πράσινο φθοροφόρο. βαθμολογίες FISH λιγότερο από 1,8 ερμηνεύτηκαν ως αρνητικά [31].

Στατιστικές αναλύσεις

δεδομένα έκφραση της πρωτεΐνης TRIB1 που παράγεται από την ανάλυση AQUA συσχετίστηκαν με ΑΚΤ, κασπάσης 3, κυκλίνη Β1, ERK, Ki67, MYC, S6, PTEN, ρΑΚΤ, pERK, pHistone Η3, pMEK και PS6 έκφραση της πρωτεΐνης. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας συσχετισμούς Pearson, καθώς και τιμές ρ ρυθμίστηκαν για πολλαπλές δοκιμές με τη διόρθωση Bonferroni. Ένα πρόγραμμα ανοιχτού κώδικα TMA Navigator (https://www.tmanavigator.org/) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Η ανάλυση επιβίωσης για

TRIB1

και

MYC

ενίσχυση στην ομάδα CRC διεξήχθη χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 6.

Αποτελέσματα

ανάλυση μόνο γονίδιο μεταλλάξεων είναι ανεπαρκής για διαστρωμάτωση των όγκων σε σχέση με τη θεραπεία

Μετά την αγωγή με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) επί 96 ώρες, δεκατρείς κυτταρικές σειρές CRC έδειξαν διαφορετικούς βαθμούς ευαισθησίας όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με συγκεντρώσεις του φαρμάκου που κυμαίνονται από 2,5 μΜ έως 100 μΜ ( Σχήμα 1Α). Δύο κυτταρικές σειρές CRC (ΟοΙο320ϋΜ, Τ84) ήταν ευαίσθητα στην 5-FU σε συγκέντρωση 100 μΜ. Τα IC

50 τιμές για 5-FU κυμαίνονταν από 3,1 έως & gt? 100μΜ με διάμεση τιμή της 19.6μM. Οι πιο ευαίσθητες κυτταρικές γραμμές ήταν ΗΤ29, LS411N, και HCT116. DLD-1, HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, και LoVo αναφέρεται ότι είναι αναντιστοιχία επισκευή ανεπάρκεια [32]. Αυτό το προφίλ της αναντιστοιχίας κατάστασης επισκευής δεν συσχετίζονται με 5-FU ευαισθησίας (p = 0,713? Mann-Whitney U test). Αντίθετα με μια μελέτη από Bracht και οι συνεργάτες του [33]

Α. οικόπεδο καταρράκτη για τα IC

50 τιμές 5-φθοριοουρακίλη (μΜ). οικόπεδο Β Καταρράκτης για IC

50 τιμές οξαλιπλατίνη (μΜ). οικόπεδο Γ Καταρράκτης για BEZ235 IC

50 τιμές (nM). Δ Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ομαδοποίηση των IC

50 τιμές για 5-FU, L-OHP και BEZ235 χρησιμοποιώντας Συσχέτιση Pearson με πλήρη σύνδεση.

Η

Παρά το γεγονός ότι μια σειρά από

in vitro

μελέτες έχουν δείξει ότι

TP53

ανεπάρκεια συμβάλλει στην ανθεκτικότητα στα φάρμακα [34], δεν καταφέραμε να δούμε μια ένωση (p = 0,238? Mann-Whitney U test). ΗΤ29, LS411N, HCT116 p53 – /-, SW837, NCI H508, NCI Η716 όλα

TP53

ανεπάρκεια (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/), αλλά ήταν ακόμη ευαίσθητα σε 5-FU σε αυτή τη μελέτη. Mariadason et al., Ωστόσο, ανέφεραν καμία διαφορά σε 5-FU-επαγόμενη απόπτωση σε μεταλλάξεως και αγρίου τύπου ρ53 κυτταρικές γραμμές [35].

Μετά την θεραπεία με οξαλιπλατίνη (L-ΟΗΡ) για 96 ώρες, το CRC κυτταρικές γραμμές έδειξαν διαφορετικούς βαθμούς ευαισθησίας όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του L-ΟΗΡ που κυμαίνονται από 2,5 μΜ έως 100 μΜ (Σχήμα 1Β). Τα IC

50 τιμές για το L-OHP κυμαίνονταν από 3,0 έως 31.1μM, με ένα μέσο όρο 8,0 μΜ, καταδεικνύοντας μια δεκαπλάσια εύρος ευαισθησίας. Οι πιο ευαίσθητες κυτταρικές σειρές ήταν ΗΤ29, LS411N, και SW837, ενώ η λιγότερο ευαίσθητη ήταν ΟοΙο320ϋΜ, NCI Η716, και Colo201. Δεν στατιστική σημαντικότητα (p = 0,462? Mann Whitney U Test) παρατηρήθηκε κατά τη σύγκριση των L-OHP IC

50 τιμές μεταξύ των κυτταρικών σειρών dMMR και κυτταρικές σειρές pMMR, η οποία είναι σε συμφωνία με μια παρόμοια μελέτη από Fink et al. . [36]

Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης p53 και L-OHP IC

50 τιμές (p = 0,187? Mann Whitney U Test), σε αντίθεση με μια προηγούμενη αναφορά [37]. Ωστόσο, μια πρόσφατη μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε 51 προηγμένες CRC ασθενείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι

TP53

κατάστασης μεταλλάξεων δεν συσχετίστηκε με όφελος από τη θεραπεία με οξαλιπλατίνη που βασίζεται πρώτης γραμμής [38].

Επτά κυτταρικές σειρές CRC ήταν ευαίσθητα και οκτώ κυτταρικές σειρές CRC ήταν ευαίσθητα στην αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις (2,5 ηΜ και 80 ηΜ) του BEZ235 για 96 h (Σχήμα 1 C). Τα IC

50 τιμές για BEZ235 κυμαίνονταν από 13,4 έως & gt? 80 ηΜ, με τα ευαίσθητα κυτταρικές σειρές που έχουν ένα μεσαίο ευαίσθητο συγκέντρωση 23.6nM. Οι πιο ευαίσθητες κυτταρικές γραμμές ήταν ΗΤ29, Colo201, και NCI Η716, ενώ NCI H508, Τ84, SW48, SW480, ΟοΙο320ϋΜ, HCT116, HCT116 ρ53 – /-, και LoVo ήταν αναίσθητη σε συγκέντρωση 80 ηΜ. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά (p = 0,346? Το Mann-Whitney U) μεταξύ του IC

50 τιμές για την επεξεργασία BEZ235 και

PIK3CA

μεταλλαγμένων και άγριου ομάδες τύπου. Όλες οι

PI3KCA

μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές είχε είτε ένα

BRAF

ή

KRAS

συν-μετάλλαξη. Δεν COSMIC υπήρχαν διαθέσιμα στοιχεία για

mTOR

μεταλλάξεις σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Serra et al. Διαπιστώθηκε ότι BEZ235 συνελήφθη τον πολλαπλασιασμό σε όλες τις 21 καρκινικές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη τους, ανεξάρτητα από PI3K κατάστασης μετάλλαξης μονοπατιού [39], και ότι οι κυτταρικές σειρές με

BRAF

ή

KRAS

μετάλλαξη ή

EGFR

ενίσχυση ήταν ελαφρώς λιγότερο ευαίσθητες σε BEZ235 σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές γραμμές [39].

Από τις 15 κυτταρικές σειρές CRC, οκτώ κυτταρικές σειρές κατείχε

KRAS

εξόνιο 2 μεταλλάξεις . Η DLD-1, HCT116, HCT116 ρ53 – /-, και κυτταρικές σειρές LoVo είχε ένα 5574 G & gt? Α υποκατάσταση συνεπής με μια μετάλλαξη G13D παρερμηνεύσιμη? Οι κυτταρικές σειρές SW480 SK-CO-1 και είχε ένα 5571 G & gt? Τ υποκατάσταση συνεπής με μια μετάλλαξη G12V παρερμηνεύσιμη? SW837 είχε 5570 G & gt? Υποκατάστασης Τ συνεπής με μια μετάλλαξη G12C? και Τ84 είχε ένα 5574 G & gt? υποκατάσταση συνεπής με μια μετάλλαξη G13D. Αυτό είναι σε συμφωνία με τα δημοσιευμένα δεδομένα αλληλουχίας και τα δεδομένα στην κοσμική βάση δεδομένων (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε απόκριση σε 5-FU, L-ΟΗΡ και BEZ235 σε σχέση με

KRAS

κατάστασης μεταλλάξεων (ρ = 0,98, ρ = 0,60 και ρ = 0,17, αντίστοιχα).

Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ομαδοποίηση για το IC

50 τιμές για 5-FU, L-OHP, και BEZ235 χρησιμοποιώντας συσχετίσεις κατά Pearson με πλήρη διασύνδεση έδειξαν ότι οι κυτταρικές σειρές δεν ομαδοποιούνται σύμφωνα με οποιαδήποτε συγκεκριμένη μετάλλαξη. Υπήρχε μεταβλητότητα σε απόκριση προς τις τρεις διαφορετικές αγωγές (Σχήμα 1 D).

περιοχές Χρωμοσωμικό συχνά αποκτήθηκε και χάνεται στο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές

Το πάνελ των κυτταρικών γραμμών επόμενη αξιολογήθηκε με aCGH να εντοπισμό των κοινών χρωμοσωμικές περιοχές του κέρδους και της απώλειας. Είκοσι-τέσσερις περιφέρειες συχνά αποκτήθηκε κατά τουλάχιστον 7/15 κυτταρικές σειρές CRC. Συχνές κέρδη παρατηρήθηκαν σε 2ρ, 3q, 5p, 7ρ, 7q, 8q, 12Ρ, 13q, 14q, 17q και (Σχήμα 2) (Πίνακας 1). Από την άλλη πλευρά, ένα σύνολο 14 περιοχών χάθηκαν σε τουλάχιστον 7/15 CRC κυτταρικές σειρές (Πίνακας 2). Συχνές απώλειες παρατηρήθηκαν στα 2q, 3ρ, 5q, 8p, 9p, 14q, 18q, και 20p (Σχήμα 2). Αυτές οι περιοχές του κέρδους και της απώλειας ήταν παρόμοιες με αυτές που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [32, 40-44].

Η

Η

Ιεραρχική ομαδοποίηση των κατακερματισμένων δεδομένων αριθμό αντιγράφων χρησιμοποιώντας Ευκλείδεια απόσταση μέση σύνδεση οδήγησε σε δύο μεγάλα συμπλέγματα: μία συστάδα περιείχε NCI Η716, ενώ η άλλη συστάδα περιείχε τις άλλες 14 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3). Ένα από τα υπο-clusters που περιέχονται ΗΤ29, SW48, LS411N, LoVo, HCT116, και HCT116p53 – /-. HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, και LoVo είναι σχεδόν διπλοειδή και είναι γνωστό ότι έχουν μεταλλάξεις στα MMR γονίδια

MLH1

και

MSH2

[45, 46]. Η άλλη σχεδόν διπλοειδή κυτταρική γραμμή, DLD-1, επίσης συγκεντρωμένα ξεχωριστά. Αυτή η κυτταρική γραμμή είναι ανεπαρκής σε MMR MSH6 [47].

Η

γονίδιο Διαφορική έκφραση όσον αφορά την ευαισθησία του φαρμάκου

Τα γονίδια εκφράζονται διαφορικά σε σχέση με το 5-FU ευαισθησίας παρατίθενται στον Πίνακα S3 και απεικονίζονται σε έναν χάρτη θερμότητας στο σχήμα 4Α. Λειτουργική σχολιασμού χρησιμοποιώντας DAVID [24] έδειξε ότι αυτά τα γονίδια ήταν ασχολείται κυρίως με τον κυτταρικό κύκλο (

TAF2

,

CHFR

,

CCND2

,

OSGIN2

,

TERF1

,

TBRG4

), εστιακό πρόσφυσης (

ABCB1

,

SH3KBP1

,

EBAG9

), απόπτωση (

SHRKBP1

,

EBAG9

,

TERF1

,

TBRG4

), και ρύθμιση της μεταγραφής (

LASS2

,

LMCD1

,

MAF1

,

TAF2

,

THAP11

,

CHURC1

,

MED14

,

PIAS3

,

purB

,

TERF1

,

ZNF239

,

ZNF7

). Σημαντικές οδοί KEGG που σχετίζονται με τη λειτουργία 5-FU δράσης και στη συνέχεια εμπλουτίζεται στη λίστα που προέρχονται από τη μελέτη αυτή περιλαμβάνονται μεταβολισμό των πουρινών (

NT5C2

,

POLR2J2

), το μεταβολισμό πυριμιδίνης (

NT5C2

,

POLR2J2

), ο μεταβολισμός του φαρμάκου (

GSTO2

), ABC μεταφορέων (

ABCB1

), και οξειδωτική φωσφορυλίωση (

NDUFA9

).

Α. Ένας θερμικός χάρτης που απεικονίζει την ανάλυση SAM για τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ 5-FU ευαίσθητη και λιγότερο ευαίσθητων κυτταρικών γραμμών CRC? B. Ένας θερμικός χάρτης που απεικονίζει την ανάλυση SAM για τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των ευαίσθητων και λιγότερο ευαίσθητων κυτταρικών σειρών CRC L-OHP? Γ θερμικός χάρτης που απεικονίζει την ανάλυση SAM για τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των ευαίσθητων και λιγότερο ευαίσθητων κυτταρικών σειρών CRC BEZ235.

Η

Τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε σχέση με το L-OHP ευαισθησία ενεπλάκησαν με δέσμευσης του DNA (