Abstract

Ο ρόλος της πρωτεΐνης δέσμευσης ασβεστίου, καλβιδίνη 2 (CALB2), στη ρύθμιση της απόκρισης των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) για την 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) ερευνήθηκε. Real-time RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western απεκάλυψε ότι CALB2 mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε άγριου τύπου ρ53 και ρ53 null ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές HCT116 CRC επόμενες 48 ώρες και 72 ώρες θεραπεία 5-FU. Επιπλέον, 5-FU-επαγόμενη απόπτωση ήταν σημαντικά μειωμένη σε HCT116 και LS174T κυτταρικές γραμμές CRC στα οποία είχε σιγήσει έκφραση CALB2. Περαιτέρω έρευνα αποκάλυψε ότι CALB2 μετατοπίζεται προς τα μιτοχόνδρια μετά την αγωγή με 5-FU και ότι η 5-FU-επαγόμενη απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (Δψ

m) καταργήθηκε σε κύτταρα CALB2-σιγήσει. Επιπλέον, CALB2 σίγηση μειώθηκαν 5-FU που προκαλείται κυτοχρώματος c και SMAC απελευθέρωση από τα μιτοχόνδρια και μειώθηκε επίσης 5-FU επαγόμενη ενεργοποίηση κασπασών 9 και 3/7. Της σημείωσης, συν-αποσιώπηση των ΧΙΑΡ ξεπέρασε 5-FU αντίσταση στα κύτταρα CALB2-σιγήσει. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι μετά την αγωγή με 5-FU σε κυτταρικές γραμμές CRC, CALB2 εμπλέκεται στην επαγωγή απόπτωσης μέσω της ενδογενούς μιτοχονδριακής οδού. Αυτό υποδεικνύει ότι CALB2 μπορεί να είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της 5-FU-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση των CALB2 σε απάντηση 5-FU μπορεί να αντιπροσωπεύει μια εγγενή μηχανισμό αντίστασης σε αυτό το αντικαρκινικό φάρμακο

Παράθεση:. Stevenson L, Allen WL, Proutski Ι, Stewart G, Johnston L, McCloskey Κ, et al. (2011) καλβιδίνη 2 (CALB2) Ρυθμίζει 5-φθοριοουρακίλη ευαισθησία στον καρκίνο του παχέος διαμορφώνοντας τις εγγενείς αποπτωτικό μονοπάτι. PLoS ONE 6 (5): e20276. doi: 10.1371 /journal.pone.0020276

Επιμέλεια: Αντρέι Λ Gartel, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 του Δεκέμβρη, 2010? Αποδεκτές: 28η Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: May 24, 2011

Copyright: © 2011 Stevenson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν έλαβε από Cancer Research UK (C212 /A7402)? και Έρευνας και Ανάπτυξης Γραφείο Βόρειας Ιρλανδίας, Υπουργείο Υγείας, Κοινωνικών Υπηρεσιών και Δημόσιας Ασφάλειας (RRG /3261/05, RRG 6,42). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Καθηγητής Patrick Johnston είναι ο ιδρυτής και διευθυντής του Almac Diagnostics, Craigavon, Ηνωμένο Βασίλειο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στην Ευρώπη και οι ΗΠΑ 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) -με βάση σχήματα χημειοθεραπείας παραμείνει η τυπική θεραπεία για CRC τόσο στην επικουρική και προηγμένες ρυθμίσεις της νόσου. Ωστόσο, τα ποσοστά ανταπόκρισης στη θεραπεία με 5-FU είναι μεταξύ 10-20% στο μεταστατικό πλαίσιο [1]. Ο συνδυασμός της 5-FU με τον αναστολέα τοποϊσομεράσης Ι, ιρινοτεκάνη (CPT-11), ή τον παράγοντα βλάβης του DNA, οξαλιπλατίνη, έχει βελτιωθεί σημαντικά ποσοστά ανταπόκρισης έως και 50% [2] – [3]. Novel παράγοντες, όπως τα μονοκλωνικά αντισώματα cetuximab, panitumumab (επιδερμικού αυξητικού παράγοντα αναστολείς του υποδοχέα), και bevacizumab (α αγγειακού αναστολέας ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα) έδειξαν επίσης ευεργετικά αποτελέσματα όταν συνδυάζονται με χημειοθεραπεία [4] – [6]. Παρά το γεγονός αυτό, η πρόγνωση για την πλειοψηφία των ασθενών με προχωρημένο CRC παραμένει φτωχή λόγω των εγγενών ή επίκτητη χημειοαντίσταση. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός των μορίων σηματοδότησης που εμπλέκονται στην μεσολάβηση της ανταπόκρισης του CRC σε 5-FU απαιτείται για τον προσδιορισμό των υποκείμενων μηχανισμών αντοχής 5-FU.

καλβιδίνη-2 (CALB2, επίσης γνωστή ως καλρετινίνη) είναι ένα 29 kDa ασβέστιο (Ca

2+) σύνδεση πρωτεΐνης της οικογένειας ΕΡ-χέρι [7], η οποία είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών που περιέχουν Ca

2 + που δεσμεύουν μοτίβα που αποτελούνται από δύο έλικες (Ε και F). Ca

2 + επαγόμενη διαμορφωτικές αλλαγές δείχνουν ότι CALB2 είναι πιθανό να ανήκουν σε μια ομάδα Ca

2 + πρωτεϊνών αισθητήρα της σειράς αυτής [8]. Στους ανθρώπους, CALB2 κυρίως εκφράζεται από ορισμένα κύτταρα του νευρικού συστήματος, αλλά μπορεί επίσης να βρεθεί σε κύτταρα των ωοθηκών [9]. Κανονικό κόλον επιθηλιακά κύτταρα δεν εκφράζουν CALB2, αλλά βρίσκεται σε καρκινώματα του παχέος εντέρου [10], οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από πρωτογενείς όγκους του παχέος εντέρου [11] και είναι ένα διαγνωστικό δείκτη για μεσοθηλιώματα [12] – [13]. Ο ρόλος του στη ρύθμιση CALB2 νευρωνική διεγερσιμότητα έχει καταδειχθεί με συνέπεια [14]. Ωστόσο, η φυσιολογική λειτουργία των CALB2 σε καρκινικά κύτταρα μένει να διευκρινιστεί.

Ca

2+ έχει αναγνωριστεί ως αγγελιοφόρος που συντονίζει ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) -mitochondrial αλληλεπιδράσεις που ρυθμίζουν την απόπτωση [15]. Πολλά είδη κυτταρικού στρες είναι γνωστό ότι επάγουν Ca

2+ απελευθέρωσης από το ER και επακόλουθη Ca

εισροή 2+ στα μιτοχόνδρια με αποτέλεσμα την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης που ακολουθείται από απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και SMAC [16]. Η επαγωγή της ER στρες έχει επίσης αναφερθεί ότι ενισχύει τη χημειοθεραπεία ευαισθητοποίηση [17]. Μιτοχονδριακή Ca

2+ δυναμική εμπλέκονται επίσης στην ρύθμιση του μεταβολισμού κυτταρικής ενέργειας και σε διαδικασίες όπως η κυτταρική κινητικότητα και την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών. Ως εκ τούτου, ο κανονισμός του Ca

2+ απελευθέρωση είναι υπό αυστηρό έλεγχο, και πολλά Ca

2 + που δεσμεύουν τις πρωτεΐνες, όπως CALB2, μπορεί να λειτουργήσει κατάντη του ER Ca

2+ απελευθέρωση να διαμορφώνει απόπτωση ή άλλα κυττάρων λειτουργίες.

Μια μελέτη μικροσυστοιχιών DNA πραγματοποιείται με την ομάδα μας χρησιμοποιώντας τη HGU133 συν πίνακα 2.0 (Affymetrix, UK) εξέτασε τα προφίλ έκφρασης του p53

+ /+ κύτταρα HCT116 CRC που έλαβαν θεραπεία με 5-FU [ ,,,0],18]. Στη μελέτη αυτή, CALB2 αναγνωρίστηκε ως πιθανός νέος ρυθμιστής της απόκρισης 5-FU. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει το μηχανισμό με τον οποίο CALB2 ρυθμίζει την απάντηση 5-FU σε κύτταρα CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

5-FU αγοράστηκε από Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ). Αποθεματικά διαλύματα παρασκευάστηκαν σε στείρο PBS και αποθηκεύτηκαν στους 4 ° C πριν από τη χρήση. Το αντίσωμα CALB2 αγοράστηκε από την Chemicon International (Temecula, CA). Πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης αντίσωμα (PARP) αγοράστηκε από PharMingen (San Diego, CA, USA). γ αντισώματα smac /DIABLO και κυτόχρωμα αγοράστηκαν από την BD Biosciences (Oxford, UK). Οξειδάσης κυτοχρώματος ο υπο μονάδα IV (Cox IV) και Χ-συνδεδεμένη αναστολέα (ΧΙΑΡ) αντισωμάτων πρωτεΐνη απόπτωσης αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology, Inc (Danvers, ΜΑ, USA). αντίσωμα άλφα-τουμπουλίνης αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). GAPDH αγοράστηκε από Abd Serotec (Κίντλινγκτον, UK). ιωδιούχο προπίδιο αγοράστηκε από τη Sigma (Poole, UK) και ΡΙΤΟ-αννεξίνης V αγοράστηκε από την BD Biosciences (Oxford, UK). Ένας αναστολέας παν-κασπάσης, Z-VAD (OMe) -FMK, αγοράστηκε από Calbiochem (Darmstadt, Γερμανία)

Κυτταρική καλλιέργεια

Γονική HCT116 και ισογονικούς p53

-. /- και Bax

– /- κυτταρικές σειρές CRC ήταν ευγενική προσφορά από τον καθηγητή Bert Vogelstein (Πανεπιστήμιο Johns Hopkins, Βαλτιμόρη, MD). Το LS174T κυτταρική γραμμή αγοράστηκε από ATCC® (CL-188 ™). Οι κυτταρικές σειρές HCT116 διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Invitrogen, UK) και η κυτταρική σειρά LS174T διατηρήθηκε σε κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (Invitrogen, UK). Το μέσο συμπληρωμένο με 10% σε διαπίδυση ορό εμβρύου μόσχου, 50 μg /ml πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη, 2 mM Ε-γλουταμίνη και 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο και επωάστηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη χρήση ενός 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ, Sigma) δοκιμασία όπως περιγράφεται προηγουμένως [19].

σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR

το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNA Stat-60 αντιδραστήριο (Biogenesis, Poole, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με 8 μα του RNA χρησιμοποιώντας έναν ιό Moloney Ποντικού Λευχαιμίας (Μ-ΜΕν) Κιτ που βασίζονται αντίστροφη μεταγραφή (Invitrogen, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε πραγματικό χρόνο αντίστροφης μεταγραφής-ΡΟΚ (RT-PCR) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Primer αλληλουχίες ήταν ως εξής: CALB2 (προς τα εμπρός) 5′-GCAGAGCTGGCGCAGATC- 3 ‘, CALB2 (ανάστροφη) 5′-GCTCATCGTACGGCCGGTTCG- 3’? GAPDH (προς τα εμπρός) 5 ‘-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT- 3’ και GAPDH (πίσω) 5 ‘- GACAAGCTTCCCGTTCTCAG -3’. Η γονιδιακή έκφραση κανονικοποιήθηκε προς την έκφραση του γονιδίου αναφοράς GAPDH. Τελικές τιμές έκφραση παρουσιάστηκαν σε σχέση με το μη επεξεργασμένο ώρα αντιστοίχιση ελέγχου.

κηλίδες Western κηλίδωση Western

διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων ποντικού έναντι πρωτογενούς CALB2, PARP, Smac, κυτόχρωμα c, ΧΙΑΡ, α-τουμπουλίνης ή GAPDH σε συνδυασμό με χρένο peroxidise-συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού προβάτου (Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, England). Ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι Cox IV χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με ένα γαϊδούρι δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού (Amersham). Το φθορίζον σήμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα χημειοφωταύγειας ανίχνευσης Σούπερ Signal (Pierce, Rockford, IL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Western blot πρωτείνης ποσοτικοποίηση

αξίες πυκνομετρία ζώνες πρωτεΐνης αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα τεκμηρίωσης των συστημάτων ChemiDoc-XRS πλοίο (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Συγκροτήματα στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Ποσότητα One®1-D λογισμικό ανάλυσης (Bio-Rad Laboratories, Inc., έκδοση, 4.5.2).

Ανάλυση subG1 /G0

περιεχόμενο DNA του κύτταρα αξιολογήθηκε με χρώση ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Μετρήσεις και ανάλυση εκτελέστηκαν σε ροή FACS Calibur κυτταρόμετρο με το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, San Diego).

FITC Annexin V /ιωδιούχου προπιδίου ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν σύμφωνα με το κατασκευαστή οδηγίες (BD Biosciences, Oxford, UK). Εν συντομία, τα επίπεδα της απόπτωσης υπολογίστηκαν σαν το άθροισμα των ΡΙΤΟ-αννεξίνης V θετική /αρνητική ιωδιούχο προπίδιο (πρώιμη απόπτωση) και ΡΙΤΟ-αννεξίνης V θετική /ιωδιούχο προπίδιο θετικό (αργά απόπτωση) κυτταρικό πληθυσμό. Μετρήσεις και ανάλυση διεξήχθησαν σε ροή FACS Calibur κυτταρόμετρο με το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, San Diego).

μεμβράνης μιτοχονδριακού ενδεχόμενη ανάλυση

Για να προσδιοριστεί η απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (Δ

ψ

m), τα κύτταρα επωάστηκαν με 25 ηΜ tetramethylrhodamine, αιθυλεστέρας percholate (TMRE) στους 37 ° C για 15 λεπτά και συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στις 800

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C και επαναιωρηματοποιήθηκαν σε 0,5 ml PBS. Μέτρηση και ανάλυση διεξήχθησαν σε ροή FACS Calibur κυτταρόμετρο με το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, San Diego).

siRNA επιμόλυνση

Η CALB2 στόχευση (siCALB2) και μη-στόχευσης ελέγχου (SC) κατασκευάσματα siRNA αγοράστηκαν από Dharmacon Inc. (Chicago, IL). Οι κατασκευάσει ακολουθίες siCALB2 που χρησιμοποιήθηκαν ήταν GGCUCUGGCAUGAUGUCAAdTdT (λογική) και UUGACAUCAUGCCAGAGCCdTdT (αντιπληροφοριακό). Οι αλληλουχίες κατασκεύασμα SC χρησιμοποιήθηκαν ήταν UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT (λογική) και ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT (αντιπληροφοριακό). Ένα επιπλέον 4 CALB2-αλληλουχία στόχευσης siRNA αγοράστηκαν από την Qiagen: siCALB2_5 (SI02660980), siCALB2_6 (SI03190824), siCALB2_7 (SI04157790) και siCALB2_8 (SI04267697). Προ-σχεδιασμένα siRNA για ΧΙΑΡ αγοράστηκε από την Cell Technology σηματοδότηση (Danvers, ΜΑ, USA). επιμολύνσεις siRNA διεξήχθησαν με αντιδραστήριο Oligofectamine (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 5 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη γονική ~IC

60 (72 ώρες) δόσεις 5-FU (5 μΜ για HCT116 και 20 μΜ για LS174T). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες εξής 5-FU κατεργασία πριν από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής και στυπώματος Western.

Υπο-κυτταρική κλασμάτωση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, πλύθηκαν σε 1 ml παγωμένου μιτοχονδριακή ρυθμιστικό απομόνωσης (200 mM μαννιτόλη, 70 mM σακχαρόζη, 1 mM αιθυλενογλυκόλη δις (α-αμινοαιθερο) –

Ν

,

Ν

,

N

1

,

N

1

, τετραοξικού οξέος, 10 mM HEPES, 0,5 mg /ml αλβουμίνη ορού βοός? ρΗ 7,4) πριν από την Dounce ομογενοποίηση. Τα κυτταρικά υπολείμματα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στα 800

g

για 10 λεπτά. το μιτοχονδριακό κλάσμα σφαιροποιήθηκε με φυγοκέντρηση στις 10.000

g

για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο που περιέχει το κυτοσολικό κλάσμα μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα και η μιτοχονδριακή ίζημα επαναιωρήθηκε σε 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος RIPA (50 mM Tris ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton-Χ100, 0,1% SDS) που περιείχε πρωτεάση κοκτέιλ αναστολέα (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany).

Caspase δοκιμασίες ενεργοποίησης

η ενεργοποίηση της κασπάσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Caspase Glo 3/7, 8 και 9 δοκιμασίες (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική ανάλυση

τα αποτελέσματα συνοψίζονται ως μέσο ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM) από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα των δεδομένων ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα 2-way ANOVA (GraphPad PRISM® έκδοση 5.01).

μικροσυστοιχιών ανάλυση

Η 5-FU-ανθεκτικά HCT116 υπο-line δημιουργήθηκε σε μας εργαστήριο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. HCT116 γονικά κύτταρα και HCT116 5-FU ανθεκτικά θυγατρικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ 5-FU για 24 ώρες για την ταυτοποίηση γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά. Ολικό RNA απομονώθηκε από τα

in vitro

πειράματα χρησιμοποιώντας το Total αντιδραστήριο απομόνωσης RNA RNA Stat-60 (Tel-Test) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το συνολικό RNA (5 μg) εστάλη στην Almac Diagnostics για τη σύνθεση cDNA, σύνθεση οΡΝΑ, ο κατακερματισμός, και υβριδοποίηση πάνω στο ορθοκολικού συγκεκριμένες ασθένειες Array (DSA, Almac Diagnostics) microarrays. Όλα

in vitro

δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι MIAME συμβατό και όλα τα πρωτογενή δεδομένα έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME (αριθμός ένταξης ArrayExpress: E-Μπειραμ-1691)

Δημιουργία λιστών γονιδίου

Αρχικά κάθε σειρά ήταν. ομαλοποιούνται στη διάμεση ένταση σήματος όλων των συστοιχιών. Για τους πίνακες που πήραν φάρμακο, το 24 ώρες 5-FU κατεργασία δείγματα κατόπιν κανονικοποιούνται με τα δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής. Στην περίπτωση της βασικής πειράματος, οι 5-FU ανθεκτικά συστοιχίες κανονικοποιήθηκαν προς τις γονικές σειρές HCT116. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών (E-Μπειραμ-1691) στη συνέχεια φιλτράρεται χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα κριτήρια: Affymetrix σημαία κλήσεις (Ρ /Μ σε όλα τα δείγματα), Σταυρός Gene Μοντέλο Error (μέσος βάσης /αναλογική cut-off), φορές μεταβολής (1,5-φορές ) και t τεστ (ρ & lt? 0,05), μόνο τα γονίδια που διέρχεται τα 4 φίλτρα διατηρήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν ως τα τελικά genelists εργασίας. Τρεις

in vitro

genelists δημιουργήθηκαν: 5-FU-επαγώγιμη σε γονικά, 5-FU-επαγώγιμη σε 5-FU-ανθεκτικό και ιδιοσυστατικά απορρυθμισμένη σε 5-FU ανθεκτικά

Ταυτοποίηση. μονοπάτια που σχετίζονται με 5-FU-αντίσταση

KEGG λειτουργίας της οδού εντός Genespring GX (v7.3.1) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό απορυθμισμένη οδών πέρασμα ενός 1,5 φορές αλλαγή και t-test (ρ & lt? 0,05) από την microarray

in vitro

genelists.

Σύλλογος έκφρασης CALB2 με την κλινική ανταπόκριση

Έχουμε κατεβάσει δεδομένα έκφρασης CALB2 από σύνολα δεδομένων δημόσια μικροσυστοιχιών. λογισμικό GraphPad Prism 5 χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθούν καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier που βασίζεται σε διάμεση έκφραση CALB2 μήκος κάθε στάδιο του όγκου ή σε συνδυασμό στάσης. Αυτά τα σύνολα δεδομένων που περιλαμβάνονται σε ομάδα CRC (GSE12945? PMID: 19399471) από 62 ασθενείς (13 στάδιο 1, 23 το στάδιο 2, 21, στάδιο 3 και 5 σταδίου IV) υποβάλλονται σε εκλεκτική πρότυπο ογκολογική εκτομή [21] και μια ομάδα του καρκίνου του μαστού (GSE9893? PMID: 18347175) από 132 ασθενείς με ταμοξιφαίνη-θεραπεία) [22]

Αποτελέσματα

έκφραση CALB2 στα κύτταρα HCT116 ρυθμίζεται προς τα κάτω από το 5-FU θεραπεία

Ένα προηγούμενο. μελέτη μικροσυστοιχίας από την ομάδα μας ανέφερε την έκφραση του γονιδίου CALB2 στο HCT116 κυτταρική γραμμή να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα μετά από 24 ώρες 5-FU θεραπεία σε σχέση με ένα μη επεξεργασμένο μάρτυρα 0 h [18]. Ωστόσο, περαιτέρω αναλύσεις αποκάλυψαν ότι συστατική έκφραση CALB2 αυξάνει την πάροδο του χρόνου (Εικ. S1), ως εκ τούτου έχουμε εκ νέου αναλύθηκαν 5-FU μεταβολές που προκαλούνται mRNA σε επίπεδα γονιδιακής έκφρασης CALB2 σε σχέση με ένα μη επεξεργασμένο, χρονικά συμφωνημένα ελέγχου. Σε αντίθεση με προηγούμενη μελέτη μας, η μέθοδος αυτή έδειξε ότι η θεραπεία με έναν ~IC

60 (72 ώρες) δόση (5 μΜ) της 5-FU στην πραγματικότητα είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική, εξαρτώμενη από το χρόνο κάτω ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε CALB2 η p53

+ /+ HCT116 κυτταρική σειρά (Εικ. 1Α). Στην ρ53

– /- κυτταρική σειρά HCT116, η γονιδιακή έκφραση CALB2 ήταν δεν μεταβάλλονται σημαντικά μετά από 24 ώρες αγωγή με 5-FU, αλλά ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε 48 ώρες και 72 ώρες (Εικόνα 1Β).. Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε ότι αυτή η ρύθμιση προς τα κάτω αντανακλάται στην μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης CALB2 σε 5-FU κατεργασμένων κυττάρων (Εικ. 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση CALB2 σε κύτταρα HCT116 είναι έντονα κάτω-ρυθμίζονται σε απόκριση σε 5-FU θεραπεία και ότι αυτή η διαμόρφωση δεν εξαρτάται από το ρ53.

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ποσοτικοποίηση των επιπέδων mRNA σε CALB2 ισογονιδιακά (Α) ρ53

+ /+ και (Β) ρ53

– /- HCT116 κύτταρα μετά από 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες θεραπεία 5-FU (γονική ~IC60

(72 ώρες) δόση 5 μΜ). Φορές αλλαγή στις τιμές έκφρασης είναι σε σχέση με το μη επεξεργασμένο χρόνο-συμφωνημένα ελέγχου. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM, NS: δεν υπάρχει σημαντική διαφορά, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των CALB2 σε κυτταρικές σειρές HCT116 ακόλουθες 72 ώρες 5-FU (5 μΜ) θεραπεία και την αντίστοιχη πυκνομετρία δεδομένα της έκφρασης CALB2 σχέση με τον έλεγχο GAPDH φόρτωσης.

Η

5-FU επαγόμενη κάτω ρύθμιση των CALB2 είναι κασπάσης-ανεξάρτητο

για να καθοριστεί αν η μείωση της πρωτεΐνης CALB2 σε απάντηση 5-FU ήταν κασπάσης-εξαρτώμενη, γονικών κυττάρων HCT116 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα ~IC

60 (72 ώρες ) δόση (5 μΜ) της 5-FU μόνη της ή σε συνδυασμό με μια δόση 10 μΜ αναστολέα παν-κασπάσης (Ζ VAD-) για 72 ώρες. Η αναστολή της δραστικότητας κασπάσης μετά την αγωγή Z-VAD ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα κασπάσης 3/7-ειδική δοκιμασία δραστικότητας (Σχ. 2Α). 5-FU κατεργασία σημαντικά (ρ & lt? 0,05) αυξημένη κασπάσης 3/7 δραστικότητα από ~ 4 φορές, σε σύγκριση με τους μη επεξεργασμένους μάρτυρες, και αυτό ήταν εντελώς καταργήθηκε με Z-VAD. Σημαντικά, Z-VAD συν-θεραπεία δεν ανέστειλε 5-FU επαγόμενη κάτω-ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης CALB2 (Σχ. 2Β) ή πρωτεϊνική έκφραση (Εικ. 2C), υποδεικνύοντας ότι CALB2 κάτω ρύθμιση δεν κασπάσης-εξαρτώμενη.

ρ53

+ /+ κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ένα ~IC60

(72 ώρες) δόση της 5-FU μόνη της ή σε συνδυασμό με μια δόση 10 μΜ του αναστολέα παν-κασπάσης Ζ-VAD (OMe ) -FMK (Ζ-VAD) για 72 ώρες δραστικότητα (Α) Caspase 3/7 ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης βασίζεται. Οι τιμές είναι RFU αναγνώσεις σε σχέση με τη βιωσιμότητα των κυττάρων, όπως προσδιορίζεται με ΜΤΤ. (Β) σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ποσοτικοποίηση των CALB2 mRNA (πολλαπλάσια μεταβολή σε σχέση με το μη επεξεργασμένο, χρονικά συμφωνημένα ελέγχου). (C) ανάλυση Western blot της έκφρασης CALB2 και τα αντίστοιχα δεδομένα πυκνότητας της έκφρασης CALB2 σε σχέση με τον έλεγχο GAPDH φόρτωσης.

Η

CALB2 αποσιώπηση προσδίδει αντίσταση 5-FU

Από CALB2 είναι μεταγενέστερος ρυθμίζονται μετά από θεραπεία 5-FU, διερευνήσαμε το ρόλο της στη μεσολάβηση 5-FU-απόκρισης. Μια προσέγγιση σίγηση γονίδιο χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η λειτουργία του CALB2 σε 5-FU-επαγόμενη απόπτωση. CALB2 γκρεμίζω από siRNA επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western (Εικ. 3Α). siRNA μεσολάβηση αποσιώπηση της έκφρασης CALB2 ενισχύθηκε περαιτέρω από την 5-FU συν-θεραπεία, πιθανότατα λόγω της καταστολής της CALB2 mRNA σε απόκριση σε 5-FU θεραπεία (Εικ. 1Α). διάσπαση PARP, ένας δείκτης του θανάτου των κυττάρων, παρατηρήθηκε στον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα ρ53

+ /+ HCT116 μετά από αγωγή με 5-FU. Αυτό ήταν εντελώς καταργήθηκε στις CALB2-σιγήσει κύτταρα, δεικνύοντας μειωμένη 5-FU που προκαλείται θάνατος. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίχθηκαν με κυτταρομετρία ροής δεδομένων η οποία έδειξε ότι το επίπεδο της 5-FU-επαγόμενη απόπτωση μειώθηκε σημαντικά (ρ & lt? 0,05) από -30% στα κύτταρα ελέγχου siRNA σε ~ 17% στην CALB2-σιγήσει ρ53

κύτταρα + /+ HCT116 (Σχ. 3Β). Στην ρ53

– /- κυτταρική σειρά HCT116, 5-FU-επαγόμενη απόπτωση μειώθηκε επίσης σημαντικά (ρ & lt? 0,05), από ~ 14% στα κύτταρα ελέγχου siRNA στο ~ 9% στα CALB2-σιγήσει κύτταρα (Σχ . 3C). Η μειωμένη ευαισθησία του p53

– /- κύτταρα HCT116 με 5-FU έχει προηγουμένως επισημανθεί από την ομάδα μας και τους άλλους [23], [24]. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε μια άλλη γραμμή κυττάρων CRC, LS174T, όπου η απόπτωση αυξήθηκε σημαντικά μετά από ~IC

60 (72 ώρες) δόση των 20 μΜ 5-FU και CALB2 σίγασης μειωθεί σημαντικά αυτό (Σχήμα 3D, σ & lt?. 0.01 ). CALB2 γκρεμίζω επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western (Εικ. 3D ένθετο) και όπως στις κυτταρικές γραμμές HCT116, τα επίπεδα πρωτεΐνης CALB2 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω μετά από θεραπεία 5-FU. Για να αποκλειστεί εκτός στόχου επιπτώσεις της CALB2-στόχευσης siRNA, χρησιμοποιήσαμε αννεξίνη /ΡΙ κυτταρομετρία ροής για να προσδιοριστεί η επίδραση ενός επιπλέον 4 CALB2-ακολουθίες στόχευσης siRNA στις 5-FU-επαγόμενη απόπτωση σε ρ53

+ /+ κύτταρα HCT116 (Σχ. 3Ε). Μια σημαντική μείωση της 5-FU-επαγόμενη απόπτωση παρατηρήθηκε με όλες 4 επιπλέον CALB2 siRNA αλληλουχίες και CALB2 σίγηση επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western blot (ένθετο).

(Α) ανάλυση

Western blot του CALB2 και PARP στην ρ53 κυτταρική γραμμή

+ /+ HCT116 μετά από επιμόλυνση με έλεγχο siRNA (-) ή CALB2 στόχευση siRNA (+) και 72 ώρες συν-κατεργασία με ~IC60

(72 ώρες) δόση της 5-FU. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Ιωδιούχου προπιδίου ανάλυση κυτταρομετρίας ροής που δείχνει το ποσοστό του πληθυσμού κυττάρων σε υπο-G1 /G0 για το (Β) p53

+ /+ και (C) p53

– /- HCT116 κυττάρων μετά από επιμόλυνση με έλεγχο siRNA (SC) ή CALB2 στόχευση siRNA (siCALB2) και 72 ώρες συν-θεραπεία με 5 μΜ 5-FU. (D) Annexin V /προπιδίου ροής ιωδιούχου ανάλυση κυτταρομετρίας του LS174T κυτταρική σειρά CRC μετά από επιμόλυνση με έλεγχο siRNA (SC) ή CALB2 στόχευση siRNA (siCALB2) και 72 ώρες συν-θεραπεία με ~IC60

(72 ώρες) δόση 5-FU (20 μΜ). ** P & lt? 0,01, μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. (Ένθετο) ανάλυση Western blot της έκφρασης CALB2 σε LS174T. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε) p53

+ /+ HCT116 κυττάρων μετά από επιμόλυνση με έλεγχο siRNA (SC), CALB2 στόχευση siRNA (siCALB2) ή πρόσθετες CALB2-ακολουθίες στόχευσης siRNA (siCALB2_5, siCALB2_6, siCALB2_7 και siCALB2_8) και 72 ώρες συν-θεραπεία με 5 μΜ 5-FU. (Ένθετο) ανάλυση Western blot της έκφρασης CALB2 ακόλουθες 72 ώρες επιμόλυνση με έλεγχο siRNA (SC) ή CALB2 στόχευσης siRNAs σε ρ53 κυττάρων

+ /+ HCT116. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

αντίσταση 5-FU σχετίζεται με απορρύθμιση του Ca

2 + σηματοδότησης

Ο προσδιορισμός του ρόλου CALB2 στη διαμεσολάβηση 5-FU-επαγόμενη απόπτωση μαζί με Ca του

2+ ιδιότητα δέσμευσης μας οδήγησε να διερευνήσει την επίδραση της 5-FU επί Ca

2+ σηματοδότησης γενικά. Μεταγραφική πειράματα προφίλ διεξήχθησαν σε HCT116 γονικών και 5-FU ανθεκτικά θυγατρικά κύτταρα γραμμών πριν και μετά τη θεραπεία με 5 μΜ 5-FU για 24 ώρες. ανάλυση μικροσυστοιχιών προσδιορίζονται 1.389 γονιδίων στα γονικά κύτταρα HCT116 και 922 γονιδίων στα 5-FU ανθεκτικά θυγατρικά κύτταρα που είχαν μεταβληθεί (≥1.5 φορές, ρ & lt? 0,05) μετά από θεραπεία 5-FU. Επίσης, 1.329 γονίδια ταυτοποιήθηκαν ως ιδιοσυστατικά μεταβληθεί (≥1.5 φορές, ρ & lt? 0,05) μεταξύ των γονικών κυττάρων HCT116 και τα 5-FU ανθεκτικά θυγατρικά κύτταρα. Οι προκύπτουσες genelists στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της οδού χρησιμοποιώντας τη λειτουργία οδού KEGG μέσα Genespring GX (v7.3.1). ανάλυση Pathway προσδιορίζονται 60 μονοπάτια στα γονικά κύτταρα HCT116 και 24 πορείες στην 5-FU ανθεκτικά θυγατρικά κύτταρα που είχαν μεταβληθεί (≥1.5 φορές, ρ & lt? 0,05) μετά από 24 ώρες 5 αγωγή μΜ 5-FU. Επίσης, 49 οδοί αναγνωρίσθηκαν ως ιδιοσυστατικά μεταβληθεί (≥1.5 φορές, ρ & lt? 0,05) μεταξύ των γονικών κυττάρων HCT116 και τα 5-FU ανθεκτικά θυγατρικά κύτταρα (Πίνακας S1). Τα αποτελέσματα από την ανάλυση μονοπάτι έδειξε ότι 11 οδοί συνήθως μεταβάλλεται σε κάθε μία από τις τρεις genelists (Πίνακας 1). Ιδιαίτερη σημασία για την παρούσα μελέτη ήταν οι Ca

2+ μονοπάτια σηματοδότησης και την απόπτωση, τα οποία μεταβάλλονται σε τόσο γονικών και 5-FU-ανθεκτικά κύτταρα μετά από θεραπεία με 5-FU και επίσης basally απορρυθμισμένη σε 5-FU-ανθεκτικά κύτταρα σε σύγκριση με τις προγονικά. Αυτό υποδηλώνει ότι το Ca

2+ σηματοδότησης και της απόπτωσης μπορεί να είναι μεσολαβητές της 5-FU ευαισθησία /αντοχή σε αυτή τη ρύθμιση.

Η

CALB2 σίγηση καταργεί 5-FU-επαγόμενη απόπτωση μέσω της ενδογενούς οδού

Λόγω του Ca

2+ ιδιότητες CALB2 και τον πρωταγωνιστικό ρόλο του Ca δεσμευτική

2 + σηματοδότησης στην ενδογενή αποπτωτικό μονοπάτι, ο ρόλος των CALB2 στη μεσολάβηση 5-FU που προκαλείται, μιτοχονδριακό ρυθμιζόμενη απόπτωση ερευνήθηκε περαιτέρω. Εξέταση των HCT116 υποκυτταρικών κλασμάτων κατέδειξε ότι σε ακατέργαστα κύτταρα, CALB2 βρισκόταν στο κυτοσόλιο και δεν συνδέθηκε με μιτοχόνδρια (Σχ. 4Α). Ωστόσο, μετά από 72 ώρες αγωγή με 5-FU, τα επίπεδα CALB2 στο κυτταρόπλασμα μειώθηκε ενώ μιτοχονδριακή επίπεδα CALB2 αυξήθηκε, υποδηλώνοντας 5-FU επαγόμενη μετατόπιση CALB2 στα μιτοχόνδρια. Η ανάλυση στυπώματος Western των α-τουμπουλίνης και CoxIV κατέδειξε την καθαρότητα αυτών των υπο-κυτταρικά κλάσματα (Σχ. S2). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν έναν επαγώγιμο σύνδεσης μεταξύ CALB2 και μιτοχόνδρια σε απόκριση σε θεραπεία 5-FU.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των CALB2 στη μιτοχονδριακή και κυτοσολικά κλάσματα της ρ53

+ /+ HCT116 κύτταρα μετά επιμόλυνση με έλεγχο siRNA (-) ή CALB2 στόχευση siRNA (+) και 72 ώρες συν-θεραπεία με 5-FU. Cox IV χρησιμοποιήθηκε ως μιτοχονδριακό ελέγχου φόρτωσης και α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως κυτοσολικό έλεγχος φόρτωσης. (Β) TMRE ανάλυση κυτταρομετρίας ροής δείχνει το ποσοστό των ισογονικών ρ53

+ /+ και p53

– /- HCT116 κυττάρων με απώλεια του Δψ

m (% αποπολώνεται) μετά την επιμόλυνση με τον έλεγχο siRNA (sc) ή CALB2 στόχευση siRNA (siCALB2) και 72 ώρες συν-θεραπεία με 5 μΜ 5-FU. ** P & lt? 0,01, μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. (C) TMRE κυτταρομετρία ροής πείραμα επαναλήφθηκε με μία δεύτερη ακολουθία siCALB2. (D) ανάλυση κηλίδας Western των SMAC και κυτοχρώματος Ο στη μιτοχονδριακή και κυτοσολικά κλάσματα της 5-FU κατεργασία ρ53 κυττάρων

+ /+ HCT116. Cox IV και α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. (Ε) δοκιμασίες δραστηριότητα κασπάσης σε p53 κύτταρα

+ /+ HCT116. τιμές RFU κανονικοποιήθηκαν προς τη βιωσιμότητα των κυττάρων (ΜΤΤ δοκιμασία) και εκφράζεται ως πολλαπλή μεταβολή RFU στα CALB2 σιγήσει κυττάρων σε σχέση με τον έλεγχο siRNA (SC) κύτταρα. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την μέση ± SEM. (F) αννεξίνης V /προπιδίου ροής ιωδιούχο κυτταρομετρική ανάλυση των αποπτωτικών κυττάρων ρ53

+ /+ HCT116 εξής CALB2 ή ΧΙΑΡ φίμωση μόνα τους ή σε συνδυασμό. Τα κύτταρα συν-θεραπεία με 5 μΜ 5-FU για 72 ώρες όπως υποδεικνύεται. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. (Ένθετο) ανάλυση Western blot της έκφρασης ΧΙΑΡ μετά την επιμόλυνση με 10 ηΜ siRNA ελέγχου (-) ή 10 ηΜ ΧΙΑΡ στοχευμένη siRNA (+). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Η συσχέτιση μεταξύ CALB2 και μιτοχόνδρια μετά την αγωγή με 5-FU μας ώθησε να διερευνήσει περαιτέρω το ρόλο της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι σε αντίσταση 5-FU. Η προ-αποπτωτικά Bcl-2 μέλος της οικογένειας, Bax είναι ένα σημαντικό εκκινητή του μιτοχονδριακού μεσολάβηση απόπτωση. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε HCT116 γονικών και ισογενετικών ηυΙΙ κύτταρα Bax μετά από θεραπεία με το πατρικό ~IC

60 (72 ώρες) δόση της 5-FU για 72 ώρες. Η γονική ~IC

60 (72 ώρες) δόση της 5-FU προκάλεσε ~ 3-πλάσια αύξηση στην απόπτωση στην γονική κυτταρική σειρά HCT116 (ρ & lt? 0,01), αλλά δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στα επίπεδα της απόπτωσης στο Βαχ null κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τα προηγούμενα ευρήματα [25], [26] ότι Βαχ και η ενδογενής οδός αποπτωτική αποτελούν μείζονες τελεστές της 5-FU-επαγόμενη απόπτωση.

απώλεια μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (Δ

ψ

m) με ταυτόχρονη απελευθέρωση του SMAC και κυτοχρώματος C που ακολουθείται από κασπάσης 9 και 3/7 ενεργοποίηση παρατηρείται κατά τη διάρκεια της απόπτωσης μέσω της ενδογενούς οδού. Ως εκ τούτου, TMRE, μία φθορίζουσα χρωστική για τη μέτρηση του δυναμικού της μεμβράνης των μιτοχονδρίων χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί Δ

ψ

m με κυτταρομετρία ροής (Σχ. 4Β). 5-FU-επαγόμενη απώλεια της Δ

ψ

m, όπως υποδεικνύεται από μη-φθοριζόντων κυττάρων, ήταν σημαντικά μειωμένη (ρ & lt? 0.001) στην CALB2-σιγήσει ρ53

+ /+ HCT116 κύτταρα . 5-FU που προκαλείται από την απώλεια της Δ

ψ

m μειώθηκε επίσης σημαντικά (p & lt? 0,05) στην CALB2-σιγήσει p53

– /- κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε με μια δεύτερη ακολουθία CALB2 siRNA (Σχ. 4C), αποκλείοντας εκτός στόχου επιπτώσεις της CALB2 siRNA. Επιπλέον, η ανάλυση στυπώματος Western των υποκυτταρικών κλασμάτων απεκάλυψε ότι η 5-FU-επαγόμενη απώλεια της SMAC και κυτοχρώματος ο από το μιτοχονδριακό κλάσμα καταργήθηκε σε κύτταρα CALB2-σιγήσει (Εικ. 4D). Αυτό ήταν ταυτόχρονη με μειωμένα επίπεδα SMAC και κυτοχρώματος c απελευθερώνεται στο κυτοσόλιο σε απόκριση σε 5-FU στην CALB2-σιγήσει κύτταρα. Επιπλέον, 5-FU-επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης 9 και 3/7, όπως μετράται με λουσιφεράσης προσδιορισμούς δραστικότητας ανταποκριτή που βασίζονται, ήταν σημαντικά μειωμένη στα κύτταρα CALB2-σιγήσει (Εικ. 4Ε). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην κασπάσης 8 ενεργοποίηση μεταξύ των CALB2-σιγήσει κύτταρα και τους ελέγχους siRNA ακόλουθες 72 ώρες 5 αγωγή μΜ 5-FU (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν περαιτέρω έναν ρόλο για CALB2 στη ρύθμιση της 5-FU που προκαλείται από, την εγγενή αποπτωτική παθολογική οδό.

ευαισθησία 5-FU σε κύτταρα CALB2-σιγήσει αποκαθίσταται με ΧΙΑΡ συν-φίμωση

Η πειράματα που περιγράφονται ανωτέρω καταδεικνύουν ότι η διατήρηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, η διατήρηση του SMAC και κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια με συνακόλουθη μείωση της δραστηριότητας κασπάσης όλα σχετίζονται με αυξημένη αντίσταση 5-FU σε κύτταρα CALB2-σιγήσει, υποδηλώνοντας δυσλειτουργική σηματοδότηση μέσω του ενδογενούς αποπτωτική παθολογική οδό. Μια προηγούμενη μελέτη από την ομάδα μας έδειξε ότι η αντίσταση απόπτωσης που παρέχεται από ένα κίνδυνο εγγενή αποπτωτικό μονοπάτι μπορεί να παρακαμφθεί παρακάτω ΧΙΑΡ αποσιώπηση. ΧΙΑΡ αναστέλλει κασπάσης 9 ενεργοποίηση μέσω του τομέα του BIR3 και την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 μέσω του τομέα του BIR2. απελευθέρωσης Smac διαταράσσει την αλληλεπίδραση του ΧΙΑΡ με κασπάσης 9 και της κασπάσης 3 [27], που οδηγεί σε ενεργοποίηση αυτών των κασπασών και την επακόλουθη απόπτωση. Υποθέσαμε ότι η φίμωση ΧΙΑΡ μπορεί να ξεπεράσει την αντίσταση σε 5-FU που προκαλείται από CALB2 σίγηση παρακάμπτοντας το μπλοκ στην ενδογενή αποπτωτικό μονοπάτι. Ως εκ τούτου, η επίδραση της συν-φίμωση ΧΙΑΡ και CALB2 στις 5-FU απόκριση ερευνήθηκε. ΧΙΑΡ φίμωση στα κύτταρα HCT116 χρησιμοποιώντας ένα ΧΙΑΡ στόχευση siRNA επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western (Σχ. 4F ένθετο). Η αποπτωτική κλάσμα των κυττάρων ταυτοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής με Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο. Αυτό πάλι έδειξε ότι 5-FU-επαγόμενη απόπτωση μειώθηκε σημαντικά (ρ & lt? 0,05) σε CALB2-σιγήσει κύτταρα (Σχ 4F.) Ενώ, 5-FU απόπτωση που επάγεται ήταν σημαντικά αυξημένη σε ΧΙΑΡ-σιγήσει κυττάρων (ρ & lt? 0,05). Είναι σημαντικό ότι, η αντίσταση σε 5-FU-επαγόμενη απόπτωση που παρέχει CALB2 σίγηση είχε ξεπεραστεί με συν-φίμωση ΧΙΑΡ (ρ & lt? 0,01). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.