Abstract

ορμόνες, συμπεριλαμβανομένης οιστρογόνων και της προγεστερόνης, και οι υποδοχείς τους παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκινώματος ωοθηκών. Ανδρογόνα, υποδοχέα και συνενεργοποιητές του έχουν επίσης εμπλακεί σε αυτές τις διαδικασίες. ρ44 /Mep50 /WDR77 αναγνωρίστηκε ως υπομονάδα του συμπλόκου methylosome και πρόσφατα χαρακτηρισθεί ως στεροειδούς συνενεργοποιητή υποδοχέα που ενισχύει υποδοχέα ανδρογόνων, καθώς και μεταγραφική δραστικότητα μεσολάβηση υποδοχέα οιστρογόνου σε έναν συνδέτη-εξαρτώμενο τρόπο. Περιγράψαμε προηγουμένως διακριτή έκφραση και η λειτουργία της ρ44 σε καρκίνους του προστάτη, όρχεις, και του μαστού. Στην έκθεση αυτή, εξετάσαμε την έκφραση και τη λειτουργία του p44 στον καρκίνο των ωοθηκών. Σε αντίθεση με τα ευρήματα του προστάτη και του καρκίνου των όρχεων και παρόμοια με τον καρκίνο του μαστού, p44 εμφανίζει έντονη κυτταροπλασματική εντόπιση σε μορφολογικά κανονική επιφάνεια των ωοθηκών και σάλπιγγα επιθήλια σωλήνα, ενώ η πυρηνική ρ44 έχει παρατηρηθεί σε διηθητικό καρκίνωμα των ωοθηκών. Παρατηρήσαμε ότι ρ44 μπορεί να χρησιμεύσει ως συνενεργοποιητή τόσο υποδοχέα ανδρογόνου (AR) και του υποδοχέα οιστρογόνου (ER) στα κύτταρα των ωοθηκών. Περαιτέρω, η υπερέκφραση του πυρηνικά εντοπισμένης ρ44 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με την παρουσία του οιστρογόνου ή ανδρογόνου. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι η ρ44 παίζει ένα ρόλο στη διαμεσολάβηση των επιπτώσεων των ορμονών κατά τη διάρκεια των ωοθηκών ογκογένεσης

Παράθεση:. Ligr Μ, patwa RR, Ντάνιελς G, Παν L, Γου Χ, Υ Li, et al. (2011) Έκφραση και λειτουργία των ανδρογόνων υποδοχέων συνενεργοποιητή ρ44 /Mep50 /WDR77 στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 6 (10): e26250. doi: 10.1371 /journal.pone.0026250

Επιμέλεια: Ilya Ulasov, University of Chicago, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Μάρ, 2011? Αποδεκτές: 23 Σεπτεμβρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 13η Οκτωβρίου του 2011

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε με την επιδότηση Northwestern Memorial Hospital Dixon Μεταγραφική Ταμείο Έρευνας για JJW. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πέμπτη συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες, και η δεύτερη πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Επιθηλιακά λογαριασμοί των ωοθηκών καρκίνο για περίπου 3% του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου στις γυναίκες. Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου εκτιμάται ότι το 2010, 21.880 γυναίκες θα διαγνωστεί και 13.850 γυναίκες θα πεθάνουν από καρκίνο των ωοθηκών [2].

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια ομάδα ετερογενών ασθενειών και αποτελείται από διαφορετικές ιστολογικών τύπων, η οποία μπορεί να να διαφοροποιούνται εύκολα από ιστολογική αξιολόγηση [3]. Τρέχουσες κλινικές κατευθυντήριες γραμμές που ορίζονται από την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας διακρίνει οκτώ ιστολογική υποτύπους όγκου: θηλώδες ορώδες καρκίνωμα (ΕΠΑ), ενδομητριοειδές καρκίνωμα (EMC), βλεννώδες καρκίνωμα (MUC), σαφές καρκίνωμα (CCC), καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο (TCC), πλακωδών κυττάρων , μικτή επιθηλιακά και αδιαφοροποίητα, με ορώδες καρκίνωμα που εμφανίζουν την πιο κακοήθη φαινότυπο [4], [5]. Γονιδίωμα-ευρύ σφαιρική ανάλυση γονιδιακής ορίζει περαιτέρω διακριτά προφίλ έκφρασης των διαφορετικών τύπων καρκίνου [6] ωοθηκών. Διαφορετικοί τύποι ιστολογικών του καρκίνου των ωοθηκών φαίνεται να ρυθμίζονται από διαφορετικούς παθογόνους οδών [7]. Οι περισσότεροι EMC και η ΕΠΑ παρούσα μέτρια έως υψηλά επίπεδα ER [8], [9], [10] και την έκφραση AR [11], [12].

Οι υποδοχείς στεροειδών ορμονών, όπως ER, υποδοχέα προγεστερόνης ( PR), και AR, εμπλέκονται στην ανάπτυξη καρκίνων ενδοκρινές όργανο, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών [12], [13], [14]. Τα οιστρογόνα είναι γνωστό ότι είναι ρυθμιστές της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης σε φυσιολογικές ωοθήκες, καθώς επίσης και στην ανάπτυξη των ωοθηκών καρκίνωμα, αλλά ο μηχανισμός αυτής της ορμονική ρύθμιση παραμένει ασαφής. Το οιστρογόνο δρα μέσω δύο πυρηνικών υποδοχέων, άλφα υποδοχέα οιστρογόνου (ΕΚα) και βήτα υποδοχέα οιστρογόνου (ΕΚβ) που συνδέονται προς ένα στοιχείο απόκρισης οιστρογόνου (ERE) στην περιοχή προαγωγού των γονιδίων στόχων, που ρυθμίζουν μεταγραφική δραστηριότητα τους [15]. Ομοίως, το AR είναι επίσης ένας συνδετήρας-ενεργοποιημένου μεταγραφικού παράγοντα. Η σύνδεση των ανδρογόνων με τα αποτελέσματα AR σε πυρηνικό εντοπισμό του συμπλόκου ορμόνης-υποδοχέα μαζί με συνενεργοποιητές και τα βασικά μηχανήματα μεταγραφική. Μόλις στο πυρήνα τότε συνδέεται με ένα στοιχείο απόκρισης ανδρογόνων (ARE), που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων [16].

AR είναι ένα διαδεδομένο υποδοχέας στεροειδούς φύλου που εκφράζεται σε καρκίνους των ωοθηκών. Ογδόντα τέσσερα τοις εκατό των όγκων εκφράζουν AR, σε αντίθεση με μόνο το 74% των όγκων που εκφράζουν ER και 41% εκφράζουν PR [17]. Υπάρχει μεγαλύτερο κίνδυνο καρκίνου των ωοθηκών σε μετά την εμμηνόπαυση, στην οποία ανδρογόνα χρόνο είναι τα κύρια στεροειδή που εκκρίνονται από την ωοθήκη [18]. Υψηλή έκφραση του PR συνδέεται με καλή πρόγνωση σε multivariant ανάλυση για τον καρκίνο των ωοθηκών [19]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα είναι αμφιλεγόμενα για την συσχέτιση αυτών των τριών υποδοχέων με πρόγνωση και ποσοστό επιβίωσης σε ασθενείς [12], [20].

ρ44 είναι ένας 44 kDa AR-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης, η οποία έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει AR μεταγραφική δραστηριότητα. Περιέχει 342 υπολείμματα αμινοξέων και τέσσερις υποθετικές WD40 επαναλήψεις [21]. Επιπλέον, ρ44 υπάρχει σε ένα σύμπλοκο methylsome με αργινίνη μεθυλ τρανσφεράσης 5 (PMRT5), και είναι επίσης μια υπομονάδα της επιβίωσης κινητικού νευρώνα (SMN) σύμπλοκο [22]. Λόγω φωσφορυλίωση της υπομονάδας του, το συγκρότημα ΔΠΕ είναι ενεργή στο κυτταρόπλασμα, όπου αυτή προάγει U snRNP συναρμολόγησης [23]. Η έκφραση και η λειτουργία των πρωτεϊνών ρ44 έχουν αναφερθεί σε καρκίνους του προστάτη, των όρχεων, και του μαστού. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε διαφορετικά πρότυπα έκφρασης και λειτουργίας σε αυτούς αναπαραγωγικά όργανα [21], [24], [25]. Βρήκαμε διακριτές ενδοκυτταρική εντόπιση του ρ44 σε καλοήθη (όπως η πυρηνική πρωτεΐνη) και κακοήθεις (ως κυτταροπλασματική πρωτεΐνη) προστατικό ιστό. Πυρηνική έκφραση της ρ44 αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη υπό την επίδραση των ανδρογόνων [21]. Σε αντίθεση, ρ44 εκφράστηκε ως κυτταροπλασματική πρωτεΐνη σε καλοήθεις επιθήλια του στήθους και ως μία πυρηνική πρωτεΐνη στον καρκίνο του μαστού. Πυρηνική ρ44 προωθείται αύξηση καρκινικού κυττάρου μαστού με την παρουσία οιστρογόνων [21], [24]. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι λειτουργεί ρ44 ως συμπαράγοντας που επηρεάζουν την ογκογένεση συγκεκριμένων οργάνων στο σεξ στεροειδούς ορμόνης ρυθμίζεται όγκων.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την έκφραση του ρ44 σε καλοήθεις και κακοήθεις ωοθηκών ανθρώπινα κύτταρα. Βρήκαμε ότι ρ44 είχε εκφράζονται διαφορικά σε διάφορα είδη καρκίνων των ωοθηκών. Σε ενδομητριοειδές και ορώδες καρκίνους των ωοθηκών, ρ44 εκφράστηκε ως μία πυρηνική πρωτεΐνη. Ωστόσο, ρ44 εκφράστηκε ως κυτταροπλασματική πρωτεΐνη σε καλοήθεις ωοθηκών (ΟΣΕ), σάλπιγγα (FT), και του ενδομητρίου (ΕΜ) επιθήλια. Τα δεδομένα μας έδειξαν επίσης ότι AR και ER παίζουν ένα ρόλο στην ρύθμιση της πυρηνικής-κυτταροπλασματική μετατόπιση του ρ44 σε καρκίνο των ωοθηκών και στην συνέχεια την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και εισβολή.

Αποτελέσματα

Έκφραση και κυτταρικό εντοπισμό του AR συνενεργοποιητή ρ44 στον καρκίνο του ανθρώπου ωοθηκών: δυναμικό ρύθμιση εντοπισμού από ανδρογόνων και οιστρογόνων

Για να προσδιορίσετε αν ρ44 συνδέεται με καρκίνους των ωοθηκών, εξετάσαμε την έκφραση ρ44 σε καλοήθεις ωοθηκών, του ενδομητρίου, και σάλπιγγα ιστούς σωλήνα και διαφορετικό histotypes της καρκίνωμα ωοθήκης με ανοσοϊστοχημεία. Για να προσδιοριστεί η κυτταρική εντόπιση του ρ44, την έκφραση της ρ44 σε κυτταρόπλασμα και πυρήνες ήταν ημι-ποσοτικά βαθμολογούνται ξεχωριστά (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι).

ρ44 ήταν ανοσοδραστική τόσο κυτταρόπλασμα και πυρήνες. Σε φυσιολογικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των FT, ΕΜ, και ΟΣΕ, υπήρχε υψηλότερο επίπεδο ρ44 ανοσοαντιδραστικών στο κυτόπλασμά ό, τι σε πυρήνες (λόγος κυτοπλάσματος προς πυρήνα ήταν περίπου 2:01, Εικόνα 1Β). Σε όλες τις 5 είδη των ωοθηκών καρκινώματα, συμπεριλαμβανομένων των MUC, CCC, EMC, ορώδες οριακά (SBT), και PSC, υπήρξε μία αύξηση της πυρηνικής ανοσοαντιδραστικότητα για ρ44 σε σύγκριση με κυτόπλασμα (Σχήμα 1Α, Πίνακας 1), αν και τα επίπεδα της πυρηνικής ρ44 ποικίλη μεταξύ των διαφορετικών ιστολογικών τύπων καρκίνου των ωοθηκών. SBT είχε την υψηλότερη ανοσοαντιδραστικότητα για ρ44 σε πυρήνες και MUC είχε το χαμηλότερο (Σχήμα 1Β, S1). Πολλαπλή ανάλυση ANOVA έδειξε ότι υπήρχαν σημαντικές διαφορές του p44 ανοσολογική αντίδραση σε πυρήνες μεταξύ καλοήθους (FT: 0,89 ± 0,17? EM: 0,55 ± 0,15? ΟΣΕ: 0.54 ± 0.14) και κακοήθεις (CCC: 1,64 ± 0,13? EMC: 1,71 ± 0,16? ΕΠΑ: 2,06 ± 0,14? και SBT: 2,67 ± 0,17) επιθήλια (p & lt? 0,01). Paired t-test έδειξε ότι υπήρχε σημαντική διαφορά της p44 ανοσολογική αντίδραση σε πυρήνες ζεύγη μεταξύ FT και ΕΠΑ, ΟΣΕ και ΕΠΑ, EM και η EMC, αντίστοιχα (p & lt? 0,05). ΕΠΑ, EMC, και της CCC καρκινώματα έδειξε παρόμοια immunointensity της p44 στον πυρήνα με ανάλυση ANOVA (p & gt? 0.05, Σχήμα 1Β, S1). Σε αντίθεση, υπήρξε ελάχιστη διαφορά των κυτταροπλασματικών ανοσοαντιδραστικότητα για ρ44 μεταξύ καθενός από καλοήθων και κακοήθων επιθήλια (ρ & gt? 0,05, Σχήμα 1Β). Σε γενικές γραμμές, EMC, PSC, και SBT είχαν σχετικά άφθονη έκφραση ER και αυτοί οι όγκοι έδειξαν σχετικά υψηλότερα επίπεδα ρ44 ανοσοαντιδραστικότητας σε πυρήνες (Σχήμα 1Α, 1Β, Σχήμα S1). Τα ευρήματα της διαφοράς στην κυτταρική εντόπιση του ρ44 μεταξύ φυσιολογικών ιστών και του καρκίνου των ωοθηκών μπορεί να προτείνει έναν ρόλο των ρ44 ως μεσολαβητής υποδοχέα οιστρογόνου σε ογκογένεση του καρκίνου των ωοθηκών.

A. Παραδείγματα έκφραση ρ44 με ανοσοϊστοχημεία σε 4 διαφορετικά ιστολογικών τύπων καρκίνου των ωοθηκών και της κανονικής σάλπιγγας και του ενδομητρίου (μεγέθυνση 200x). B. ημι-ποσοτική ανάλυση του ρ44 immunointensity και κυτταρικό εντοπισμό της σε τέσσερις διαφορετικούς τύπους καρκίνου των ωοθηκών και της κανονικής σάλπιγγα και του ενδομητρίου. Σκούρο γκρι μπάρες είναι πυρηνικές ρ44 και ανοιχτό γκρι ράβδοι είναι κυτταροπλασματικό p44. Μικρές t-μπάρες αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα. Η ανάλυση στυπώματος Western Γ του AR, Ετα και Ετβ έκφραση σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων T29, SKOV-3, OVCAR-3. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η αραίωση πρωτογενούς αντισώματος που χρησιμοποιείται για ρ44 ήταν 1:5000, για AR 1:1000, για Ετα και Ετβ 1:2000 και για την β-ακτίνη 1:5000.

Η

Για την αξιολόγηση της σχέσης του ρ44 με AR και ER στον καρκίνο των ωοθηκών, εξετάσαμε πρώτα τα επίπεδα έκφρασης αυτών των υποδοχέων στις επιλεγμένες κυτταρικές γραμμές των ωοθηκών. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η έκφραση ρ44 ήταν υψηλότερη στις κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών OVCAR-3 και SKOV-3 από την καλοήθη επιθηλιακά επιφάνεια των ωοθηκών (OSE) κυτταρική γραμμή T29. Τα επίπεδα έκφρασης ρ44 συσχετίζεται θετικά με Ετα /β και έκφραση AR (Σχήμα 1 C). Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι η έκφραση ΕΡα ήταν υψηλότερη σε SKOV-3 και αντίστροφα, ΕΚβ ισομορφή έδειξε τα υψηλότερα επίπεδα σε OVCAR-3 cells.To καθορίσει ρ44 κυτταρικού εντοπισμού και ρύθμισης με οιστρογόνων και ανδρογόνων σε καλοήθη και κακοήθη κύτταρα του ΟΣΕ, εξετάσαμε το εντοπισμός της ρ44 κάτω από τρεις διαφορετικές συνθήκες μέσα: μέσου άνευ ορμόνης και μέσο με τα καθορισμένα επίπεδα είτε ανδρογόνων ή οιστρογόνων με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, καλοήθη κύτταρα T29 είχαν υψηλότερα επίπεδα κυτταροπλασματικής ρ44 και, σε κάποιο βαθμό, την πυρηνική ρ44 και στις τρεις συνθήκες μέσων. Σε SKOV-3, ρ44 εντοπίστηκε κυρίως στο πυρήνα σε άνευ ορμόνης, ανδρογόνων (10 ηΜ συνθετικό ανδρογόνο R1881) και τα οιστρογόνα (10 ηΜ 17β-οιστραδιόλη) μέσα (Σχήμα 2). Σε OVCAR-3 κύτταρα, ρ44 εντοπίστηκε τόσο στο πυρήνα και κυτταρόπλασμα μέσα στο μέσα χωρίς ορμόνες, και βρίσκεται στον πυρήνα με την παρουσία είτε ανδρογόνων ή οιστρογόνων (Σχήμα 2).

ρ44 πρωτογενές αντίσωμα και ροδαμίνη συζευγμένο κουνελιού πολυκλωνικό δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε. DAPI χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων. (Μεγέθυνση: 400x)

Η

λειτουργίες AR συνενεργοποιητή p44 και ως AR και ER συνενεργοποιητή στα κύτταρα των ωοθηκών

ρ44 είναι ένα συνενεργοποιητή του AR και ER και έχει ξεχωριστή έκφραση σε προστάτη και του μαστού κυττάρων γραμμές [21], [24]. Για να καθοριστεί εάν ρ44 λειτουργεί σαν ένας ενεργοποιητής της μεταγραφής σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών, πραγματοποιήσαμε μία in vivo μεταγραφική δοκιμασία με τη χρήση του διπλού συστήματος λουσιφεράσης. Εμείς παροδικά επιμολυσμένα T29 κυττάρων με φορέα που εκφράζει ρ44 και είτε ένα ζεύγος φορέων που εκφράζουν AR και αναφοράς λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο των τεσσάρων στοιχείων ανδρογόνων απόκριση (Σχήμα 3Α), ή ΕΚα και ρεπόρτερ λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο των στοιχείων απόκρισης οιστρογόνου (Εικόνα 3Β). Με την παρουσία ανδρογόνων, ρ44 ενεργοποιείται μεταγραφή υποδοχέα ανδρογόνων οδηγείται σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, οδηγώντας σε όσο 2.6-πλάσια αύξηση της δραστικότητας ανταποκριτή σε σύγκριση με τον έλεγχο. Ομοίως, με την παρουσία των οιστρογόνων, ρ44 μεταγραφής εξαρτώμενη από τον υποδοχέα ενεργοποιημένου οιστρογόνου σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο: το σήμα αναφοράς αυξήθηκε όσο 4,5 φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο. Όταν ρ44 εκφράστηκε μόνη της, με την απουσία του, είτε AR ή ER, καμία επίδραση στην δραστικότητα ανταποκριτή παρατηρήθηκε τόσο με την παρουσία και απουσία των ορμονών στο μέσο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), επιβεβαιώνοντας την ενεργοποίηση ρ44 μέσω των υποδοχέων ορμόνης. Τα ευρήματα έδειξαν ότι το p44 όντως λειτουργεί ως συνενεργοποιητή των δύο υποδοχείς ανδρογόνων και οιστρογόνων στα κύτταρα των ωοθηκών.

Α. Φορείς που περιέχουν ρ44 και AR διαμολύνθηκαν σε κύτταρα T29 μαζί με έναν φορέα ανταποκριτή που περιέχει γονίδιο λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο προαγωγέα που περιέχει 4 στοιχεία απόκρισης ανδρογόνων. B. Φορείς που περιέχουν ρ44 και ΕΚα διαμολύνθηκαν σε κύτταρα T29 μαζί με τον φορέα ρεπόρτερ ER-Luc. δραστηριότητα δημοσιογράφος εκφράστηκε ως σχετικές μονάδες.

Η

AR συνενεργοποιητή ρ44 προωθεί την ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων και εισβολή

Για να αναλύσουμε την επίδραση της p44 στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, πρέπει πρώτα επιμολυσμένα φορείς ρετροϊών εκφράζει NLS-ρ44 σε SKOV-3 κύτταρα. NLS-ρ44 είναι κατασκευασμένο με σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) συντηγμένο σε πλαίσιο προς Ν-άκρο της ρ44. SKOV-3 κύτταρα είναι σε θέση να ανταποκριθεί στην ενεργοποίηση των οιστρογόνων [26], [27]. Μετά την επιβεβαίωση ότι η επιμολυσμένα ρ44 εκφράστηκε, προχωρήσαμε για να αναλυθεί η πολλαπλασιαστική κατάσταση των κυττάρων (Σχήμα 4Α). Σε αμφότερες χωρίς ορμόνες και οιστρογόνα συμπληρωμένο μέσο, ​​η υπερέκφραση του NLS-ρ44 δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων SKOV-3 (ρ & gt? 0,05). Ωστόσο, με την παρουσία ανδρογόνου, η υπερέκφραση του NLS-ρ44 οδήγησε σε μείωση περίπου 33% στην ανάπτυξη των κυττάρων (ρ & lt? 0,01). Μειώνοντας τα επίπεδα της ρ44 δια κατεργασίας των κυττάρων SKOV-3 με την αντίστοιχο siRNA οδήγησε σε παρόμοια αποτελέσματα. Ενώ σε μέσα που περιέχουν ανδρογόνο ο knockdown του ρ44 οδήγησε σε -25% μείωση του ρυθμού ανάπτυξης (ρ & lt? 0,05), και -15% μείωση της ανάπτυξης των κυττάρων σε μέσα χωρίς ορμόνες (ρ & lt? 0,05), δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική επίδραση της θεραπείας siRNA για την ανάπτυξη των κυττάρων σε μέσο που περιέχει οιστρογόνα (Σχήμα 4C). Δεδομένου ότι ο υποδοχέας οιστρογόνου σε SKOV-3 κύτταρα είναι μη ανταποκρίνονται στα οιστρογόνα, τα αποτελέσματα επικυρωμένες μεθόδους μας της μελέτης

Α, Β:. SKOV-3 κύτταρα (Α) και OVCAR-3 κύτταρα (Β) διαμολύνθηκαν είτε με φορέα pBabe-NLSp44 υπερέκφραση ή έναν φορέα ελέγχου, και καλλιεργήθηκαν είτε σε άνευ ορμόνης μέσο ή με την παρουσία ανδρογόνων ή οιστρογόνων. Η υπερέκφραση του ρ44 επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western (δείγματα που ελήφθησαν κάθε δεύτερη μέρα) και τα κύτταρα μετρήθηκαν κάθε μέρα. C, D: SKOV-3 κύτταρα (C) και τα κύτταρα OVCAR-3 (D) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρ44 siRNA χρησιμοποιώντας Hiperfect και καλλιεργήθηκαν είτε σε άνευ ορμόνης μέσο ή με την παρουσία ανδρογόνων ή οιστρογόνων. Η θεραπεία siRNA επαναλήφθηκε κάθε δεύτερη μέρα. Η υπερέκφραση και knockdown του ρ44 επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western (δείγματα που ελήφθησαν κάθε δεύτερη μέρα) και τα κύτταρα μετρήθηκαν κάθε μέρα.

Η

Σε αντίθεση με SKOV-3 κυτταρική γραμμή, τα OVCAR-3 κύτταρα αποκρίνεται σε οιστρογόνο διέγερση [28]. Πράγματι, όταν OVCAR-3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσα συμπληρωμένα με οιστρογόνο ή ανδρογόνο (Σχήμα 4Β και D, ανοικτά τρίγωνα και τετράγωνα), και οι δύο παρουσίασαν αυξημένο πολλαπλασιασμό σε σύγκριση με κύτταρα που αναπτύσσονται σε μέσα χωρίς ορμόνες (55% και 40%, αντίστοιχα ). Σε αντίθεση με την κατάσταση στην SKOV-3 κύτταρα, παρατηρήσαμε μια ισχυρή θετική επίδραση της υπερέκφρασης πυρηνικών ρ44 επί της ανάπτυξης OVCAR-3 κύτταρα σε μέσο συμπληρωμένο μαραίνονται είτε ανδρογόνων ή οιστρογόνων. Με την παρουσία ανδρογόνων, η υπερέκφραση του NLS-ρ44 είχε σαν αποτέλεσμα 1,5 φορές αύξηση στο ρυθμό ανάπτυξης, και παρουσία των οιστρογόνων η επαγωγή παρατηρούμενη αύξηση ήταν 1,6 φορές. Δεν υπήρχε σημαντική επίδραση της κυτταρικής ανάπτυξης με ρ44 υπερέκφραση σε μέσα χωρίς ορμόνες (Σχήμα 4Β).

Παρατηρήσαμε επίσης μια ισχυρή, αλλά αρνητικό, αποτέλεσμα της εξάντλησης των ρ44 σε OVCAR-3 κύτταρα χρησιμοποιώντας siRNA επιβεβαιώθηκε στο το επίπεδο πρωτείνης με ανάλυση κηλίδος Western. Ενώ η υπερέκφραση του p44 δεν είχε σημαντική επίδραση στην αύξηση της ορμόνης ελεύθερο μέσο, ​​knock-down των επιπέδων της πρωτεΐνης p44 οδήγησε σε μείωση κατά 25% του ρυθμού ανάπτυξης στην άνευ ορμόνης μέσο. Σε ορμόνη συμπληρώνεται μέσα ενημέρωσης η μείωση ανάπτυξης που σχετίζονται με την εξάντληση p44 εμφανίστηκε ακόμη πιο ισχυρή. Σε media οιστρογόνων, η εξάντληση ρ44 προκαλείται μείωση κατά 40% του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων του όγκου, ενώ με την παρουσία ανδρογόνων αυτή η διαφορά αντιπροσώπευε το 33% (Σχήμα 4D).

δοκιμάστηκε περαιτέρω επιδράσεις ρ44 στην ικανότητα κυτταρικής εισβολής χρησιμοποιώντας ένα

in vitro

δοκιμασία εισβολής Matrigel. Παρατηρήσαμε αυξημένη ικανότητα εισβολής των κυττάρων σε μέσα συμπληρωμένα με ανδρογόνων σε σύγκριση με μέσου άνευ ορμόνης. Η επεξεργασία των κυττάρων με τα οιστρογόνα δεν άλλαξε τον αριθμό των κυττάρων που διέρχονται από τη μεμβράνη (Εικόνα 5Α). Όταν υπερεκφράζεται NLS-ρ44 σε SKOV-3 κύτταρα, δεν υπήρξε μεταβολή στην ικανότητα των κυττάρων να εισβάλλουν μέσω της μεμβράνης Matrigel, είτε σε άνευ ορμόνης μέσο ή μέσα συμπληρωμένα με ανδρογόνων ή οιστρογόνων. Για να αποκλείσετε την ενδογενή έκφραση ρ44, εισάγαμε siRNA ρ44 σε SKOV-3 κύτταρα. Σε μέσα χωρίς ορμόνες, η εξάντληση των ρ44 δεν επηρέασε εισβολής καρκινικών κυττάρων μέσω Matrigel, δεδομένου ότι δεν επηρέασε εισβολή όγκου στα μέσα που περιέχουν οιστρογόνα. Σε μέσα συμπληρωμένα με ανδρογόνων, έλλειψη έκφρασης ρ44 μειώθηκε σημαντικά κύτταρο εισβολή έως 3-φορές (Σχήμα 5C)

Α, Β:. SKOV-3 κύτταρα (Α) και OVCAR-3 κύτταρα (Β) ήταν επιμολυσμένα είτε με φορέα υπερέκφραση pBabe-NLSp44 ή φορέα ελέγχου? C, D: SKOV-3 κύτταρα (C) και τα κύτταρα OVCAR-3 (D) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA ρ44 χρησιμοποιώντας Hiperfect και καλλιεργήθηκαν είτε στην άνευ ορμόνης μέσο ή με την παρουσία ανδρογόνων ή οιστρογόνων. Η υπερέκφραση και knockdown του ρ44 επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western (βλέπε σχήμα 4). Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί Matrigel μεμβρανών σε μέσα χωρίς ορμόνες. Ανδρογόνων ή οιστρογόνων χρησιμοποιήθηκαν ως chemoatractants στον κάτω θάλαμο.

Η

Δοκιμάσαμε επίσης την επίδραση της p44 για την εισβολή στο OVCAR-3 κύτταρα. Παρόμοια με SKOV-3 κύτταρα, αύξηση ή μείωση της έκφρασης ρ44 δεν επηρέασε την εισβολή των κυττάρων σε μέσα χωρίς ορμόνες (Σχήμα 5Β, D). Σε ανδρογόνο ή οιστρογόνο-συμπληρωμένο μέσο, ​​περισσότερο από δύο φορές αύξηση του Matrigel εισβολής σημειώθηκε (Σχήμα 5Β). Σταθερά, knockdown του ρ44 σε OVCAR-3 κύτταρα οδήγησε σε δραματική μείωση της ικανότητας εισβολής στην ορμόνη-συμπληρωμένο μέσο.

Συζήτηση

Οι στεροειδείς ορμόνες είναι σημαντικοί παράγοντες για την ανάπτυξη και την πρόοδο της ωοθήκης Καρκίνος. Οι υποδοχείς ορμονών και συμπαράγοντες τους είναι απαραίτητα για τη δράση της ορμόνης. Οι περισσότεροι των ωοθηκών καρκινώματα, συμπεριλαμβανομένων και ορώδες ενδομητριοειδές τύπων, εμφανίζουν ποικίλα επίπεδα ER, PR, και AR έκφραση [12], [27]. Έκφραση των υποδοχέων ορμόνης στεροειδούς του φύλου και συμπαράγοντες τους στον καρκίνο των ωοθηκών παρέχουν τους στόχους για θεραπείες αντι-ορμόνης. Έτσι, είναι ζωτικής σημασίας για τον χαρακτηρισμό του ρόλου των ορμονών του φύλου και συμπαράγοντα διαμεσολαβούμενη ογκογένεση τους στον καρκίνο των ωοθηκών. Έχει αναφερθεί ότι το AR είναι ένας σημαντικός δείκτης στον καρκίνο των ωοθηκών [29], ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί για τον AR που σχετίζονται επιθετική συμπεριφορά καρκίνο των ωοθηκών [30], [31], [32] δεν είναι επαρκώς κατανοητές.

σε προηγούμενες μελέτες μας, βρήκαμε ότι ρ44 AR συνενεργοποιητή παίζει σημαντικό ρόλο και στις δύο καρκίνους του προστάτη και του μαστού, που υποδεικνύουν την εμπλοκή του μονοπατιού AR στην ογκογένεση αυτών ενδοκρινών αδένων. Σε αυτή τη μελέτη, εφαρμόσαμε παρόμοιες αρχές για τον προσδιορισμό της συμβολής της ρ44 σε ογκογόνους λειτουργίες στην ογκογένεση του καρκίνου των ωοθηκών σε σχέση με ανδρογόνων ή οιστρογόνων. Βρήκαμε ότι κυτταροπλασματική ρ44 εκφράζεται έντονα σε καλοήθεις ωοθηκών, ενδομητρίου, και φαλλοπιανού επιθηλιακά κύτταρα επιφάνεια του σωλήνα. Ωστόσο, σε διαφορετικούς τύπους όγκων, ρ44 έχει διαφορική μοτίβα κυτταρική έκφραση, που αντικατοπτρίζεται από τα διαφορετικά επίπεδα των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών τοπικές προσαρμογές. ρ44 υπερεκφράζεται σημαντικά σε υψηλής ποιότητας ορώδες καρκίνωμα, ενδομητριοειδές καρκινώματα, καρκίνωμα διαυγούς κυττάρου, και ορώδες οριακά όγκων (Σχήμα 1Α). Ειδικότερα, η έκφραση της πυρηνικής ρ44 είναι σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών σε σχέση με συμφωνημένα καλοήθη ομολόγους τους, υποστηρίζοντας το λειτουργικό ρόλο της πυρηνικής ρ44 στην ογκογένεση του καρκίνου των ωοθηκών. Παρομοίως, ανάλυση στυπώματος western έδειξε συγκρίσιμα επίπεδα ρ44 μεταξύ OVCAR-3 και SKOV-3 (Εικόνα 1C), όταν τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο (με ερυθρό της φαινόλης και μη απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα ορό), ωστόσο, σε ανδρογόνα συμπληρωμένο μέσο, χρώση ανοσοφθορισμού αποκάλυψε ότι ρ44 εκφράζεται σε υψηλότερο επίπεδο στον πυρήνα (Σχήμα 2). Θα είναι μεγάλο ενδιαφέρον για τον προσδιορισμό σε μελλοντικές μελέτες κατά πόσον τα επίπεδα του ER, AR και η έκφραση ρ44 συνδέονται με συγκεκριμένους τύπους καρκίνου των ωοθηκών, του βαθμού του όγκου, τα στάδια, και την επιβίωση.

Για να καθορίσει περαιτέρω τη λειτουργική ρόλους των ρ44, ρ44 ερευνήσαμε σε καλοήθεις και κακοήθεις ΟΣΕ κυτταρικές γραμμές με την παρουσία και απουσία ανδρογόνων ή οιστρογόνων. Χρησιμοποιήσαμε καλοήθης αθανατοποιημένη επιφάνεια επιθηλιακή κυτταρική γραμμή ωοθηκών T29 και δύο κακοήθεις καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών SKOV-3 και OVCAR-3 σε αυτή τη μελέτη. Έχει αναφερθεί ότι SKOV3 δεν ανταποκρίνεται στο οιστρογόνο ενώ OVCAR-3 κύτταρα αποκρίνονται σε διέγερση με οιστρογόνα. Σε συμφωνία, βρήκαμε ότι τα οιστρογόνα δεν επηρέασε ρ44 εντοπισμού, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ή εισβολή του SKOV-3 κύτταρα, ενώ τα οιστρογόνα ενισχύεται ρ44 πυρηνικό εντοπισμό, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και εισβολή του OVCAR-3 κύτταρα. Ενώ και οι δύο ΕΚα και ΕΚβ εκφράζονται σε SKOV-3 κύτταρα (Σχήμα 1C), SKOV-3 απάθεια σε οιστρογόνα μπορεί να οφείλεται σε μετάλλαξη στο ΕΚα [27], υποδεικνύοντας την λειτουργία του ρ44 μπορεί να διαμεσολαβείται από ΕΚα, αντί του ΕΡβ.

ρ44 ενισχυθεί σημαντικά κακοήθη πολλαπλασιασμό κυττάρου ΟΣΕ και εισβολή παρουσία ανδρογόνων ή οιστρογόνων, υποδηλώνοντας ότι η έκφραση του AR ή ER απαιτούνται για να διεγείρουν ρ44 μιτογένεση και εισβολή (Σχήμα 1 C). ρ44-διαμεσολαβούμενη ογκογόνο λειτουργία φαίνεται να είναι διαφορετική μεταξύ του προστάτη και των ωοθηκών. Στον καρκίνο του προστάτη, η πυρηνική ρ44 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ένα ανδρογόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Στην κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών OVCAR-3, πυρηνική ρ44 προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων. Ειδικότερα, σημειώνεται ότι η πυρηνική ρ44 προωθεί την εισβολή τόσο ανδρογόνων και οιστρογόνων μέσα ενημέρωσης. Τα αποτελέσματα από τον καρκίνο των ωοθηκών είναι παρόμοια με αυτά που παρατηρήθηκαν σε μαστού. Στον καρκίνο του μαστού, η πυρηνική ρ44 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όγκου σε ένα οιστρογόνο τρόπο που εξαρτάται [24]. Αν και siRNA μεσολάβηση πειράματα knockdown μας έδειξαν ότι ρ44 αντίσωμα μας αναγνωρίζονται ειδικά ένα μόνο είδος πρωτεΐνης σε προστάτη, του μαστού και των ωοθηκών, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε εντελώς την πιθανότητα πολύ σχετικές, αλλά λειτουργικά διακριτές πρωτεΐνες (π.χ. παραλλαγές ματίσματος του ρ44) δρουν ως διακριτές συμπαράγοντες υποδοχέα ορμόνης σε κάθε ένα από αυτούς τους ιστούς. Με αυτή την προειδοποίηση, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η ρ44 μπορεί επίσης να ενεργούν μέσω ER-μεσολάβηση λειτουργική μονοπάτι στο ωοθηκικό ιστό.

Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας έδειξε η πυρηνική p44 εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των ωοθηκών καρκίνο και την εισβολή. Αυτές οι διαδικασίες ρυθμίζονται από ανδρογόνων και οιστρογόνων. p44 μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

επιλογή υπόθεση, TMA και IHC

Οι περιπτώσεις συλλέχθηκαν μετά από χειρουργική επέμβαση στο Memorial Hospital Northwestern και ελήφθησαν Πανεπιστήμιο της Νέας Υόρκης από το 1996 έως το 2009. οι εγκρίσεις των Θεσμικών Διοικητικού συμβουλίου Έρευνας (IRB) και από τα δύο θεσμικά όργανα (εξαιρούνται). Ένα σύνολο 105 περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών συλλέχθηκαν για αυτή τη μελέτη (Πίνακας 1). Όλες οι περιπτώσεις ΕΠΑ και η EMC ανακτήθηκαν από την τράπεζα NYU ιστών και όλους τους άλλους τύπους καρκίνου των ωοθηκών, καθώς και φυσιολογικούς ιστούς ελέγχου, ανασύρθηκαν από την τράπεζα ιστών NWU. Αυτό περιλαμβάνεται ιστολογική διάγνωση της υψηλής ποιότητας θηλώδες ορώδες καρκίνωμα (ΕΠΑ, Ν = 32), ορώδες οριακά όγκου (SBT, Ν = 9), ενδομητριοειδές καρκίνωμα των ωοθηκών (EMC, Ν = 34), βλεννώδες καρκίνωμα ωοθηκών (MUC, Ν = 15 ) και το καρκίνωμα σαφή κυττάρων των ωοθηκών (CCC, Ν = 15). Φυσιολογικούς ιστούς ελέγχου που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη περιλαμβάνονται: 30 κανονικό σάλπιγγες (FT, οι πιο κοντινό φυσιολογικούς μάρτυρες για υψηλής ποιότητας ορώδες καρκίνωμα), 20 κανονική endometria (EM, τους στενότερους φυσιολογικούς μάρτυρες για ενδομητριοειδές καρκίνωμα), και 28 φυσιολογικές ωοθήκες (ΟΣΕ, των ωοθηκών επιθήλια επιφάνεια, όπως γενικά ιστού ελέγχου).

Όλα τα καρκινώματα ήταν ωοθηκών πρωτοβάθμια. Tissue μικροσυστοιχία (TMA) παρασκευή έχει περιγραφεί σε προηγούμενη μελέτη μας [33]. Εν συντομία, 0,6 και 1 πυρήνες ιστού mm συλλέχθηκαν από κάθε περίπτωση καλά διατηρημένα τομές όγκων και της υψηλής πυκνότητας ΤΜΑ παρασκευάστηκαν σε δύο μπλοκ απόδειξης.

Η παραγωγή, καθαρισμός συγγένειας, και η εξειδίκευση του κουνελιού πολυκλωνικό ρ44 αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε έχει περιγραφεί προηγουμένως [34]. Προ-άνοσος ορός χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η ειδικότητα του αντισώματος ρ44 επιβεβαιώθηκε από μια δοκιμασία siRNA που έδειξε μειωμένη έκφραση ρ44 με ρ44 RNA παρεμβολής [21]. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης ρ44 βαθμολογήθηκαν ημι-ποσοτικά με συνδυασμό immunointensity [0 (αρνητική), 1+ (εξασθενημένο), 2+ (ασθενής), 3+ (μέτρια), και 4+ (ισχυρή) έκφραση] και immunopercentage ( 1 ως 0-10%, 2 ως 10-50%, 3 όπως 50-75% και 4 ως 75-100%)]. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το t-test.

Κυτταρική καλλιέργεια και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

δοκιμασία

Οι κυτταρικές σειρές SKOV-3 [35] και OVCAR-3 [28] ελήφθησαν από την American Type Culture Συλλογή. Η καλοήθης αθανατοποιημένη επιφάνεια επιθηλιακή κυτταρική γραμμή ωοθηκών T29 [36], όπως περιγράφηκε προηγουμένως με λεπτομέρεια, διατηρήθηκε σε μέσο 199 και MCDB105 (Sigma). Οι δύο ωοθηκών καρκινικές κυτταρικές σειρές SKOV-3 και OVCAR-3 καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Invitrogen) και RPMI 1640 (Gibco), αντίστοιχα, συμπληρωμένο με 10% FBS και 1 U /ml πενικιλλίνης και 1 μg /ml στρεπτομυκίνη. Για τη μέτρηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού, 2 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Στα κατάλληλα χρονικά σημεία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,25% θρυψίνη και 0,38 mg /ml EDTA (Gibco) και απαριθμήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο (Reichert).

Western ανάλυση κηλίδος

ανάλυση Western blot ήταν χρησιμοποιηθεί για να ελέγξει ρ44, έκφραση AR, Ετα και Ετβ σε πλήρες θρεπτικό μέσο, ​​νοκ ντάουν της ρ44, και η υπερέκφραση των πλασμιδίων p44 (φορέας pBabe και pBabeNLSp44) σε κυτταρικές σειρές των ωοθηκών. Τα κύτταρα είτε αναπτύχθηκαν σε 10 cm δίσκους, 6 φρεατίων ή 24 φρεατίων. ρυθμιστικού λύσης που περιέχει αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Sigma) σε αναλογία 1:100 προστέθηκε στα σφαιρίδια για επαναιώρηση. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμό πρωτεΐνης Bio-Rad και η κατάλληλη ποσότητα πρωτεΐνης φορτώθηκε για ηλεκτροφόρηση στην ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Η πρωτεΐνη στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης για ανάλυση κηλίδος western. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα και Tween 20 (20 mM Tris- HCI, ρΗ 7.6, 150 mM NaCl, και 0.1% Tween 20). Τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντισώματα που εγείρονται έναντι AR, ΕΚα, ΕΡβ (Santa Cruz Biotechnology), ρ44 και β-ακτίνης για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν με ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα Tween 20 τρεις φορές. Μετά τις πλύσεις, τα στυπώματα επωάστηκαν για 2 ώρες με τις κατάλληλες κρένου δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (GE Healthcare). Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με τη χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγεια κιτ (GE Healthcare).

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

T29, SKOV-3, και OVCAR-3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε δύο densities- 3 × 10

4 και 1 × 10

4 ανά καλά για τρεις διαφορετικές συνθήκες μέσα μαζικής ενημέρωσης (χωρίς ορμόνες, ανδρογόνων και οιστρογόνων) σε θαλάμους διαφάνειες. Τα κύτταρα πρώτα ξεπλένονται τρεις φορές σε PBS, και στερεώνονται επί 20 λεπτά με 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα διαπερατά με μεθανόλη και ακετόνη (1:01) και επωάστηκε στους -20 ° C για 20 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές σε PBS και αποκλείστηκαν για 1 ώρα με ένα διάλυμα 5% BSA σε ΤΒδ-Τ. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα ρ44 (1:250) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση με πρωτογενές αντίσωμα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ροδαμίνη-συζευγμένο αντίσωμα πολυκλωνικό κουνελιού (1:500) (Abcam) για 1 ώρα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Για μετρητής εφαρμόστηκε χρώση ϋΑΡΙ (1:1000) και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά στο σκοτάδι. Η ενδοκυτταρική εντόπιση του ρ44 στη συνέχεια εξετάστηκε χρησιμοποιώντας Nikon ψηφιακές DXM1200 F μικροσκόπιο με πρόγραμμα Nikon-ACT.

παρεμβολή RNA

δοκιμασία

Τρεις siRNAs πιο αποτελεσματικό στη μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης ρ44 στα κύτταρα των ωοθηκών συνενώθηκαν σε ισομοριακές ποσότητες και χρησιμοποιούνται στα επόμενα πειράματα, γενικά σε συγκέντρωση 100 ηΜ (Πίνακας 2). Κωδικοποιημένα siRNA (Ambion) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων σε επιθυμητά συρροή σε 2 ml κατάλληλου μέσου που περιέχει ορό χωρίς αντιβιοτικά. 100 ηΜ siRNA αραιώθηκε σε 423 μΙ Ορίί-ΜΕΜ (Gibco) χωρίς ορό που ακολουθείται από 75 μΙ αντιδραστηρίου HiPerfect (Qiagen) και επωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να επιτραπεί ο σχηματισμός συμπλοκών διαμόλυνσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με τα συμπλέγματα διαμόλυνσης υπό κανονικές συνθήκες τους για 48 ώρες

Η

Electroporation

τρία πλασμίδια. – Φορέα pBabe, pBabeNLSp44 [21], και GFP (έλεγχος) – επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας ηλεκτροδιάτρηση. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρεις συνθήκες – χωρίς ορμόνες, ανδρογόνων (10 ηΜ), και τα οιστρογόνα (10 ηΜ). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή. Τα κατακρημνισθέντα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ διαλύματος Nucleofactor (82 μΐ διαλύματος 18 μΙ διαλύματος συμπλήρωμα) (Lonza) για κάθε αντίδραση. Τέσσερις ng του πλασμιδίου στη συνέχεια συνδυάστηκαν και εναιώρημα κυττάρων /DNA μεταφέρθηκε σε κυψελίδα ηλεκτροδιάτρησης. πρόγραμμα Nucleofactor συνιστάται για κάθε κυτταρική γραμμή από τον κατασκευαστή επιλέχθηκε και εφαρμόστηκε. Μετά την ηλεκτροδιάτρηση η κυψελίδα απομακρύνθηκε και τα κύτταρα μεταφέρθηκαν αμέσως σε 10 ml αντίστοιχο μέσο με FCS και επωάζονται επί 48 ώρες υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης.

Λουσιφεράσης

δοκιμασία

vivo δοκιμασία μεταγραφής ανταποκριτή διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Dual-ρεπόρτερ σύστημα προσδιορισμού λουσιφεράσης (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το φως εξόδου μετρήθηκε με Lumat LB9507 φωτόμετρο (Berthold). Οι φορείς pcDNA-FAR, pcDNA-ΕΚα, και ο ανταποκριτής φορείς ER-Luc και pGL3-ARE4 αποκτήθηκαν από Addgene.

Matrigel δοκιμασία εισβολής

Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό στο