Αφηρημένο

Η έγκαιρη χαρακτηρισμό της εξέλιξης ενός καρκίνου είναι απαραίτητη για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας και να ανιχνεύουν την αντίσταση νωρίς. Υψηλή ανάλυση περιεχομένου του ενιαίου κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ) επιτρέπει διαδοχική χαρακτηρισμό γενοτυπική, μορφομετρικών και η έκφραση πρωτεΐνης μεταβολές σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου. Αυτή η έννοια ερευνήθηκε σε έναν ασθενή με ευνουχισμού ανθεκτικά καρκίνο του προστάτη εξελίσσεται μέσω τόσο χημειοθεραπεία και στοχευμένη θεραπεία. Σε αυτή τη μελέτη περίπτωσης, έχουμε ενσωματώσει σε τέσσερις χρονικές στιγμές 41 γονιδίωμα-ευρεία διακύμανση αριθμό αντιγράφων (CNV) προφίλ συν παραμέτρους μορφομετρικών και τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR), τα επίπεδα της πρωτεΐνης. Αξιοσημείωτα, μικρή αλλαγή παρατηρήθηκε σε απάντηση συνήθη χημειοθεραπεία, αποδεικνύεται από το γεγονός ότι ένας μοναδικός κλώνος (Α), που εμφανίζει ιδιαίτερα αναδιατάσσεται προφίλ CNV και AR + φαινότυπο βρέθηκε κυκλοφορεί πριν και μετά τη θεραπεία. Ωστόσο, η κλινική απόκριση και η επακόλουθη πρόοδος μετά στοχευμένη θεραπεία συσχετίστηκε με τη δραστική μείωση του κλώνου Α, ακολουθούμενη από τη διαδοχική εμφάνιση των δύο διακριτές CTC υποπληθυσμούς που διέφεραν τόσο AR γονότυπος και φαινότυπος έκφρασης. Ενώ AR-κυττάρων με επίπεδες ή ψευδο-διπλοειδή προφίλ CNV (κλώνος Β) ταυτοποιήθηκαν κατά τη στιγμή της απόκρισης, μια νέα γενεαλογία όγκος του AR + κυττάρων (κλώνος C) με CNV μεταβληθεί προφίλ ανιχνεύθηκε κατά τη διάρκεια της υποτροπής. Δείξαμε ότι ο κλώνος C, παρά φυλογενετικά που σχετίζονται με την κλωνοποίηση Α, διέθετε ένα μοναδικό σύνολο των σωματικών αλλαγών CNV, συμπεριλαμβανομένου του

MYC

ενίσχυσης, ένα γεγονός που συνδέεται με τη διαφυγή των ορμονών. Ενδιαφέρουσες, δείξαμε ότι και οι δύο κλώνοι που αποκτήθηκαν

γονίδιο ενίσχυσης AR

αναπτύσσοντας διαφορετικές εξελικτικές πορείες. Συνολικά, τα στοιχεία αυτά καταδεικνύουν το χρονοδιάγραμμα της εξέλιξης του όγκου σε απόκριση στη θεραπεία και να παρέχει ένα πλαίσιο για την ανάλυση πολλαπλής κλίμακας του υγρού βιοψίες για την ποσοτικοποίηση και την παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου σε κάθε ασθενή

Παράθεση:. Dago AE, Stepansky Α , Carlsson Α, Luttgen Μ, Kendall J, Baslan Τ, et al. (2014) Η ταχεία φαινοτυπική και Γονιδιωματική αλλάζουν ανάλογα με θεραπευτική πίεση στον καρκίνο του προστάτη συναχθεί από το πλούσιο περιεχόμενο Ανάλυση της Ενιαίας Κυκλοφορούν Tumor Cells. PLoS ONE 9 (8): e101777. doi: 10.1371 /journal.pone.0101777

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13η Δεκεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 11 Ιουνίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 1 του Αυγ 2014

Copyright: © 2014 Dago et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο υποστηρίχθηκε από Award Number U54CA143906 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Α Ε Dago είναι αποδέκτης ενός PA-12-149- Έρευνας Συμπληρώματα για την Προώθηση της Διαφορετικότητας στην υγεία που σχετίζονται με την έρευνα που χορηγείται από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI). Α Carlsson χρηματοδοτείται από το Σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας, Dnr 2012 έως 235. JH, JK, η φυματίωση και MW υποστηρίχθηκαν από μια ειδική επιχορήγηση από τον Δρ Μέριλιν Simons για την έρευνα για τον καρκίνο σε CSHL, μια Μαστού επιχορήγηση του Καρκίνου Ίδρυμα Ερευνών, και την υποστήριξη της έρευνας από το Skyline Genomics. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Ο Δρ Asya Stepansky του Skyline Γονιδιωματική είχε ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του πρωτοκόλλου για την απομόνωση DNA από κύτταρα HD-CTC και πραγματοποίησε τις προετοιμασίες της βιβλιοθήκης Illumina. Γονιδιωματική ορίζοντα υποστήριξε οικονομικά την αλληλούχιση Illumina στην εγκατάσταση Cold Spring Harbor Γονιδιώματος ως επίδειξη των δυνατοτήτων τους ως μελλοντικό φορέα παροχής υπηρεσιών. Η εταιρεία δεν έχει ένα ρόλο στο σχεδιασμό των πειραμάτων ή την ερμηνεία των δεδομένων

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και να έχουν συγκρούσεις να αποκαλύψει. Η τεχνολογία ανάλυσης HD-CTC περιγράφεται εδώ έχει την άδεια να Epic Επιστημών. ML, AK, ΚΒ και PK έχουν ιδιοκτησιακά συμφέροντα Epic Επιστημών. AS είναι ένας υπάλληλος του Skyline Genomics, και είχε ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του πρωτοκόλλου για την απομόνωση DNA από κύτταρα HD-CTC και πραγματοποίησε τις προετοιμασίες της βιβλιοθήκης Illumina. AS δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό των πειραμάτων ή ερμηνεία των δεδομένων. JH είναι συν-ιδρυτής και μέτοχος της γονιδιωματικής στον ορίζοντα. AED, AC, JK, η φυματίωση, MW και MEG και έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας ανδρογόνων-ανδρογόνων (AR), οδός σηματοδότησης είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και αποτελεί βασικό στόχο πολλών θεραπευτικών παραγόντων [1]. Στον μεταστατικό καρκίνο του προστάτη (PCA), θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT), αποτελεί την τυπική θεραπεία χρυσού να προκαλέσει υποχώρηση του όγκου καταστέλλοντας την ενεργοποίηση AR. Παρά την αρχική απάντηση στην ADT, οι ασθενείς συχνά αναπτύσσουν ανθεκτικότητα και την πρόοδο του καρκίνου ανθεκτική ευνουχισμό του προστάτη (CRPC), μια ανίατη ασθένεια με κακή πρόγνωση. Οι ασθενείς αυτοί συχνά αντιμετωπίζονται με διάσωσης ορμόνη κατευθυνόμενη θεραπείες, συμπεριλαμβανομένων παραγόντων όπως μη-στεροειδή αντι-ανδρογόνα και αναστολείς ανδρογόνου σύνθεση [1]. Στο πλαίσιο της διαχείρισης αυτές τις θεραπείες, την πρόβλεψη θεραπευτική ανταπόκριση και τον έγκαιρο εντοπισμό των δεικτών αντίστασης θεραπεία είναι σημαντικές προκλήσεις. Τα επίπεδα του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA), ενός ανδρογόνου ρυθμίζονται πρωτεΐνη μετρήθηκε στον ορό, χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της θεραπευτικής ανταπόκρισης κατά CRPC ασθενείς, ωστόσο προβλεπτική ικανότητα του για αυτή την ομάδα ασθενών είναι περιορισμένη [2]. Επιπλέον, ενώ πολλές μελέτες έχουν προσδιορίσει μοριακά γεγονότα που μπορεί να συμβάλλουν σε θεραπευτική αντίσταση σε παράγοντες ανδρογόνα στόχευσης, είναι δύσκολο να εφαρμοστούν αυτά τα ευρήματα, λόγω της περιορισμένης προσφοράς διαδοχικά αποκτηθεί ιστού και την αναμενόμενη ετερογένεια σε πολλαπλές μεταστατικές αποθέσεις υπάρχουν σε οποιοδήποτε επιμέρους ασθενής [3], [4]. Ως εκ τούτου, οι μέθοδοι που θα επιτρέπουν τη μη επεμβατική διαδοχική παρακολούθηση μέσω της κλινικής πορείας της θεραπείας θα είναι τεράστια αξία για τους κλινικούς ιατρούς.

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ) έχουν τη δυνατότητα να παρέχουν μια μη επεμβατική μέσα αξιολόγηση προοδευτική καρκίνων σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια της θεραπείας, και περαιτέρω, για να βοηθήσει την άμεση θεραπεία με παρακολούθηση φαινοτυπική φυσιολογικές και γενετικές αλλαγές που συμβαίνουν σε απόκριση στη θεραπεία. Στους περισσότερους ασθενείς CRPC, ο πρωτογενής όγκος έχει αφαιρεθεί, και ΚΜΑ αναμένεται να αποτελείται από κύτταρα που αποβάλλονται από μεταστάσεις, παρέχοντας μια «βιοψία ρευστό». Επί του παρόντος, η μόνη μέθοδος που έχουν εγκριθεί για CTC απαρίθμηση (CellSearch, Veridex) βασίζεται σε μια προσέγγιση του ανοσοποιητικού εμπλουτισμού ότι οι προ-επιλέγει για κύτταρα που εκφράζουν Επιθηλιακά μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM), ένα επιθηλιακό δείκτης κυτταρικής επιφάνειας [5]. Παρά το γεγονός ότι, αριθμητική ποσοτικοποίηση της ΚΜΑ χρησιμοποιώντας CellSearch απέφερε κάποια προγνωστικές πληροφορίες σε ορισμένους καρκίνους [6] – [8], η μεθοδολογία αυτή έχει περιορισμούς, όπως η χαμηλή ευαισθησία (κύτταρα με χαμηλή έκφραση ή απούσα EpCAM δεν θα συλληφθεί) και την τακτική παρουσία /μόλυνση των γονιδίωμά κανονική λευκοκυττάρων κατά την προετοιμασία του δείγματος που δυσχεραίνει περαιτέρω μοριακό χαρακτηρισμό και την ερμηνεία των δεδομένων. Πρόσφατα, γονιδιωματική αλλαγές βασίζονται σε array CGH και περιορισμένη αλληλουχίας έχει αναφερθεί στο ΚΜΑ απομονωθεί με την CellSearch συστήματος [9]. Λεπτομερής ανάλυση σε ζεύγη όγκους και μετάσταση (n = 2) και ΚΜΑ (n = 8) πρότεινε ότι οι περισσότερες μεταλλάξεις ανιχνεύονται σε ΚΜΑ ήταν παρόντα σε χαμηλό επίπεδο στον πρωτογενή όγκο [9]. Ωστόσο, επειδή ένα μόνο χρονικό σημείο κατά τη διάρκεια της κλινικής πορείας της νόσου διερευνήθηκε αυτή τη μελέτη δεν ασχολείται με το πώς ένας όγκος μπορεί να ανταποκριθεί και να εξελιχθεί σε θεραπευτική πίεση.

Εδώ, έχουμε αποδείξει τη δύναμη των δύο νεοαποκτηθέντα τεχνολογίες με σκοπό να παράσχει μια πιο ολοκληρωμένη πορτρέτο των μοριακών αλλαγών που συμβαίνουν, στο επίπεδο του ενός κυττάρου, σε ένα CRPC ασθενή υπό την πίεση θεραπείας σε τόσο ADT και τις ρυθμίσεις χημειοθεραπεία. Το High Definition-CTC (HD-CTC) μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τη διαχρονική αναγνώριση και καταμέτρηση των ΚΜΑ [10], καθώς και για την αξιολόγηση για την έκφραση του AR [11]. Η δοκιμασία χρησιμοποιεί μια αμερόληπτη πρωτόκολλο για να εξετάσει και να διακρίνουν ΚΜΑ μεταξύ των γύρω λευκοκυττάρων με βάση την κυτοκερατίνη θετικό (CK +) φαινότυπο τους, χρησιμοποιώντας μια απεικόνιση ανοσοφθορισμού υψηλή ανάλυση. Επιπλέον, η τεχνολογία HD-CTC διατηρεί τη μορφολογία των κυττάρων με τέτοιο τρόπο που επιτρέπει την μορφομετρικές και την έμμεση ποσοτικοποίηση των AR και πρωτεΐνης CK επίπεδα έκφρασης για όλα τα κέντρα θεραπείας χολέρας εντοπίστηκαν στο δείγμα αίματος. Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό κάθε CTC, ένα πρωτόκολλο αναπτύχθηκε για την εξαγωγή μεμονωμένων κυττάρων υπό συνθήκες κατάλληλες για επακόλουθη γονιδιωματική ανάλυση με μια τροποποίηση της μεθόδου προσδιορισμού αλληλουχίας ενιαίου πυρήνα που περιγράφεται από Navin,

et al.

[12] και Baslan,

et al.

[13]. Οι συνδυασμένες μέθοδοι επέτρεψε να εντοπίσει την πάροδο του χρόνου οι μοριακές αλλαγές στον πληθυσμό CTC συσχετίζοντας τα δεδομένα μορφομετρικών και η έκφραση της πρωτεΐνης με το γονιδίωμα μεγάλη αλλοιώσεις CNV για κάθε ένα από 41 μεμονωμένες ΚΜΑ απομονωθεί σε τέσσερα κλινικά σημαντική χρονικά σημεία. Είχαμε τη δυνατότητα να συνδέσει την εμφάνιση διακριτών υποπληθυσμών CTC προικισμένο με ειδικές μοριακές αλλαγές με την κλινική πορεία της νόσου, ιδίως κατά την περίοδο της στοχοθετημένης ADT, η οποία κλινικά αντιπροσωπεύεται από μια μικρή χρονική απόκριση ακολουθούμενη από την αντίσταση και την κλινική διαφυγής.

Υλικό και Μέθοδοι

Ασθενών Κλινική Ιστορία και Αίμα Ισοπαλίες Συνολικές τη διάρκεια της θεραπείας

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας (IRB) του Πανεπιστημίου της Νότιας Καλιφόρνιας Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου. Ο ασθενής παρέχεται έγγραφη συγκατάθεση.

Ο ασθενής παρουσίασε με προστάτη μεταστατικό σε οσφυϊκών σπονδύλων κατά τη διάγνωση του οποίου πρωταρχικός βιοψία αποτελεί το πρώτο δείγμα σε αυτή τη μελέτη. Η αρχική θεραπεία αποτελούνταν από θεραπείας στέρησης ανδρογόνων (οξικό λευπρολίδιο). Μετά από 5 μήνες, υπήρξε κλινική εξέλιξη της CRPC και ο ασθενής είχε εγγραφεί σε μια κλινική δοκιμή της docetaxel σε συνδυασμό με μπεβασιζουμάμπη και everolimus (αναγνωριστικό clinicaltrials.gov: NCT00574769). Πριν άρχισε χημειοθεραπεία, μια βασική γραμμή ισοπαλία ελήφθη αίμα (Draw 1) σύμφωνα με το πρωτόκολλο συλλογής δείγματος. Κλινική εξέλιξη σημειώθηκε μετά από 4 μήνες ορίζονται από το πρωτόκολλο χημειοθεραπείας. Κατά τη διάρκεια των επόμενων 3 μηνών, επιπλέον δόσεις docetaxel, καθώς και την ακτινοθεραπεία εξωτερικής δέσμης και το σαμάριο (

153Sm) lexidronam (ένα ραδιοφάρμακο στόχευσης οστών) έχουν χρησιμοποιηθεί με περιορισμένη παρηγορητική όφελος. Στους 12 μήνες μετά τη διάγνωση, τη θεραπεία με οξικό αμπιρατερόνη, μια ιδιαίτερα εκλεκτικό αναστολέα σύνθεσης ανδρογόνων, ξεκίνησε. Ελήφθη αίμα πριν από την έναρξη αμπιρατερόνη (ισοπαλία 2), σε 3 εβδομάδες συνεχούς θεραπείας συμπίπτει με την κλινική ανταπόκριση αντιπροσωπεύεται από μειωμένο επίπεδο του πόνου και της PSA (Draw 3), και στις 9 εβδομάδες που συμπίπτει με την κλινική εξέλιξη αντιπροσωπεύεται από την αύξηση των επιπέδων του πόνου και η PSA (Draw 4). Μετά abiraterone, η θεραπεία άλλαξε σε καμπαζιταξέλης χωρίς κλινική ανταπόκριση που ακολουθείται από ταχεία κλινική επιδείνωση. Ο ασθενής πέθανε από ευρέως μεταστατικό καρκίνο του προστάτη 4 μήνες μετά Draw 4 (17 μήνες μετά τη διάγνωση).

Συλλογή δείγματος αίματος και επεξεργασίας για τα CTC Ανίχνευση

Ο ασθενής δείγματα περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν σύμφωνα με μια IRB εγκεκριμένο πρωτόκολλο. Τα δείγματα αποστέλλονται στο εργαστήριο μας και να υποβάλλονται σε επεξεργασία εντός 24 ωρών μετά την ώρα της κλήρωσης. Η προετοιμασία των δειγμάτων προηγουμένως περιγράφεται στο [10]. Εν συντομία, αυτή συνίσταται σε λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων που ακολουθείται από επιμετάλλωση των εμπύρηνων κυττάρων ως μονοστοιβάδα επί παραγγελία γυάλινη πλάκα κυτταρικής προσκόλλησης που ακολουθείται από αποθήκευση σε biorepository. Κάθε δείγμα που παράγεται τουλάχιστον 14 ανεξάρτητων διαφάνειες για την ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό της CTC.

ανοσοφθορισμού χρώσης και CTC Καταμέτρηση

Για τη μελέτη αυτή, χρησιμοποιήσαμε ένα πρωτόκολλο με βάση τη δημοσιευμένη ανάλυση HD-CTC σε συνδυασμό με την αξιολόγηση του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) την κατάσταση στο εσωτερικό της κυτοκερατίνη (CK) θετική πληθυσμού CTC [11]. Εν συντομία, τα κύτταρα επισημάνθηκαν χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά ποντικού κυτοκερατίνη 19 (1:100? Dako) και panCK (1:100? Sigma) πρωτογενή αντισώματα για τον εντοπισμό κυτοκερατίνης (CK) θετικά κύτταρα. AR θετική HD-ΚΜΑ ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντι-AR μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1:250, Cell Signaling Technology). Τόσο τα αντιγόνα CK και AR οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας AlexaFluor δευτερεύοντα αντισώματα? τα πρωτογενή αντισώματα CK αναγνωρίστηκαν με Alexa Fluor 555 IgG1 δευτερεύον αντίσωμα (1:500, Invitrogen) και το αντίσωμα AR κουνέλι αναγνωρίστηκε με Alexa Fluor 488 IgG (H + L) δευτερογενές αντίσωμα (1:1000, Invitrogen). Alexa Fluor 647 συζευγμένο αντι-CD45 (1:125? ΝΑΒ Serotec) πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για να ταυτοποιηθούν λευκοκύτταρα ως δείκτης αποκλεισμού. Για να επιβεβαιωθεί ότι τα κύτταρα είναι εμπύρηνα και να καταστεί δυνατή η ανάλυση της πυρηνικής μορφολογίας όλα τα κύτταρα βάφτηκαν με ένα 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ).

Οι πλάκες απεικονίστηκαν και υποθετικές ΚΜΑ καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας μια ηλεκτρονική υψηλής απόδοσης μικροσκόπιο φθορισμού σε μεγέθυνση 10x. ΚΜΑ εντοπίστηκαν από έναν τεχνικό αιματολογία, χρησιμοποιώντας τα προηγουμένως δημοσιευμένα κριτήρια της ύπαρξης ενός DAPI + πυρήνα συν κυτοκερατίνη θετικότητα και CD45 αρνητικότητα [10]. έκφραση της πρωτεΐνης του υποδοχέα ανδρογόνων και εντοπισμού αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δύο κριτήρια (1) παρουσία (AR

+) ή απουσία (AR

-) της χρώσης AR, και (2) AR υποκυτταρικού εντοπισμού (πυρηνική AR έναντι κυτταροπλασματική χρώση ή και τα δύο ). Το όριο για AR θετικότητα ορίστηκε ως ένα σήμα πάνω από 6 τυπικές αποκλίσεις πάνω από τη μέση τιμή της έντασης σήματος (sDom) που παρατηρείται στα λευκοκύτταρα περιβάλλοντα (υπόβαθρο). Υποκυτταρικός εντοπισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη σχετική πυκνότητα εικονοστοιχείων χρώση AR πάνω από τον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα.

Επαναληψιμότητα Δοκιμασία HD-CTC

Η δοκιμασία HD-CTC είχε επικυρωθεί από τεχνική άποψη με κυτταρική γραμμή αιχμηρό πειράματα για να φθάσουν ένα R

2 = 0,9997 για τις δοκιμές γραμμικότητα όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SK-BR-3 κυτταρικές γραμμές και 0 έως 3 × 10

2 κύτταρα ανά ml φυσιολογικό αίμα ελέγχου δότη. Ο συντελεστής μεταβολής είναι 16% και η συσχέτιση μεταξύ του επεξεργαστή είναι R

2 = 0.979. Δείγμα διαδικασία προετοιμασίας τηρούνται τυποποιημένες διαδικασίες λειτουργίας για τα δείγματα των ασθενών μέσω ενός κωδικοποιημένου συστήματος bar για όλα τα αναλώσιμα και τα όργανα. Όλα τα off-the-shelf οργάνων κλιμακώνεται ανάλογα με τα τεχνικά πρωτόκολλα επικύρωσης που καθορίστηκαν κατά την ανάθεση [14].

Εξόρυξη μεμονωμένα κύτταρα

Ως τυπική διαδικασία που ακολουθείται, με στόχο την ελαχιστοποίηση των κυττάρων του κατακερματισμού του DNA συλλέχθηκαν εντός 5 ημερών από την αρχική διαδικασία χρώσης. Το πειραματικό πρωτόκολλο για το HD-CTC σύλληψη ρευστή φάση χωρίστηκε σε τρία διακριτά διαδοχικά στάδια: (1). CTC μετεγκατάσταση, (2) η εκχύλιση των κυττάρων και (3) την απομόνωση και τις πράξεις χειραγώγησης της ενιαίας ΚΜΑ για τους μεταγενέστερους μοριακές αναλύσεις

HD-ΚΜΑ μετεγκαταστάθηκε (βήμα 1) χρησιμοποιώντας μια μήτρα μετασχηματισμού από την αρχική απόκτηση δεδομένων για την αναγνώριση HD-CTC. Μετά τη βαθμονόμηση και τη μετεγκατάσταση, κάθε υποψήφιος κυττάρων επανεξελέγη απεικονίστηκαν σε 40 × ψηφίσματος για τη λεπτομερή ανάλυση μορφομετρικών. Για την εκχύλιση των κυττάρων (στάδιο 2) μία Eppendorf μεταγραφών Man ΝΚ2 μικροχειριστή χρησιμοποιήθηκε για να συλλάβει το κύτταρο που μας ενδιαφέρει μέσα σε ένα οδοντωτό μικροπιπέτα των 25 ° (Piezo Δράπανο Tip ES, Eppendorf) εφαρμόζοντας αναρρόφηση υγρού. Μόλις το κύτταρο που μας ενδιαφέρει συνελήφθη στο εσωτερικό του μικροσιφωνίου (στάδιο 3), το κύτταρο ξεπλύθηκε με PBS και εναποτίθενται μέσα σε ένα σωλήνα 0.2 mL PCR που περιέχει 2 μι ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (200 mM ΚΟΗ? 50 mM DTT). Το δείγμα στη συνέχεια και αμέσως καταψύχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία. Όλα τα όργανα και τα αναλώσιμα έχουν απολυμανθεί χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα ϋΝΑάση και την έκθεση σε υπεριώδες φως για 30 λεπτά πριν από το πείραμα.

Ενιαίου τηλέφωνα Next Generation Sequencing και βιοπληροφορική ανάλυση

Το κύτταρο που περιέχει φιαλίδια μεταφέρθηκαν σε ξηρό πάγο στο εργαστήριο προσδιορισμού αλληλουχίας. Εν συντομία, το μίγμα λύθηκαν κυττάρων αποψύχθηκε και υποβλήθηκε σε WGA και κατασκευή βιβλιοθήκης αλληλούχιση όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [13]. WGA διεξήχθη με το χέρι σε μορφή πλάκας 96-φρεατίων χρησιμοποιώντας τον WGA4 Genomeplex μόνο κύτταρο ολόκληρο το γονιδίωμα Amplification Kit (Sigma-Aldrich), που ακολουθείται από καθαρισμό χρησιμοποιώντας QIAquick 96 PCR Kit καθαρισμού (Qiagen). Συγκέντρωση του εκλουσμένου DNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Nanodrop 8000 (Thermo Scientific). Για κάθε φρεάτιο, η ενίσχυση θεωρήθηκε επιτυχής εάν η προκύπτουσα συγκέντρωση DNA ήταν ≥70 ng /μl (όγκος έκλουσης 50 μΐ), ακολουθούμενη από περαιτέρω Ελέγχου Ποιότητας (QC) για να επιβεβαιώσει την κατάλληλη κατανομή μεγέθους του δείγματος χρησιμοποιώντας τον Agilent 2100 Bioanalyzer (Υψηλού Δοκιμασία ευαισθησίας DNA και κιτ, Agilent Technologies).

Επιπλέον, αναλυτικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση των δεδομένων αλληλουχίας δημοσιεύθηκαν πρόσφατα από την ομάδα μας [13]. Εν συντομία, οι μέθοδοι της πληροφορικής περιλαμβάνει τρία στάδια: πρώτον, deconvoluting την ακολουθία διαβάζει βασίζονται σε barcodes? δεύτερο, χαρτογραφώντας το διαβάζει στο ανθρώπινο γονιδίωμα (hg19, Genome Αναφορά Κοινοπραξία GRCh37, UCSC Genome Database Browser) [15], και την αφαίρεση διπλότυπα PCR? και το τρίτο, την εξομάλυνση για το περιεχόμενο γουανίνη-κυτοσίνη (GC) και την εκτίμηση αριθμού αντιγράφων χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο κατάτμησης CBS. Τα προφίλ αριθμού αντιγράφων στην παρούσα έκθεση βασίζονται σε 20.000 κάδους μεταβλητού μήκους γονιδιώματος, κατά μέσο όρο μήκος -150 ζευγών κιλό βάσης κάθε μία, και υπολογίστηκαν ως αναλογία σε σύγκριση με φυσιολογικούς (Hg 19). Τα δεδομένα που αναφέρονται εδώ είχαν ένα μεσαίο καταμέτρηση των 1.780.000 μοναδικά χαρτογράφηση διαβάζει, με μια σειρά από 244190 (ελάχιστο αποκοπής 200.000) σε 5.330.000.

Cluster Analysis

Η ιεραρχική ομαδοποίηση έγινε σε R [16] χρησιμοποιώντας τη λειτουργία heatmap.2 στο πακέτο gplots. μέθοδος του Ward με Ευκλείδεια μετρική απόστασης χρησιμοποιήθηκε για την ομαδοποίηση. Η θερμικός χάρτης χρωματίζεται σύμφωνα με τις αποκοπές που περιγράφεται παραπάνω και η ομαδοποίηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας διάμεσος κεντραρισμένη δεδομένων.

Ανάλυση συχνότητας να Ορίστε Genomic Αλλοιώσεις

Χρησιμοποιώντας διάμεσος κεντραρισμένη προφίλ CNV, αναλογίες αποκοπής έναντι του διάμεσου του 0,8 και 1,25 χρησιμοποιήθηκαν για να καθορίσουν διαγραφές και ενισχύσεις, αντίστοιχα. Αυτές οι αποκοπές χρησιμοποιήθηκαν τόσο για το χρωματισμό του heatmap και να κάνει την ανάλυση συχνότητας.

Στατιστικά και Κυτταρικής Μορφολογίας Ανάλυση

Το σχήμα των κυττάρων (

κυττάρων στρογγυλάδα

) αναλύθηκε με τον εντοπισμό το περίγραμμα κυτταρόπλασμα στη σύνθετη εικόνα κάθε CTC. Η εντοπιστεί κύτταρο εικόνα εισήχθη στην R, και ένα ελλειπτικό προσαρμόστηκε στο σχήμα χρησιμοποιώντας μία ελαχίστων τετραγώνων προσαρμογή αλγορίθμου που περιγράφεται από Halir και Flusser [17]. Ο αλγόριθμος εξάγει μεγάλο άξονα του κυττάρου, η οποία είναι η μεγαλύτερη ακτίνα της εντοιχισμένες αποσιωπητικά (Ανατρέξτε στις πληροφορίες υποστήριξης). Η κυκλικότητα των κυττάρων (

γ

) υπολογίζεται ως το κλάσμα του

de facto

περιοχή των κυττάρων (

Α

) και το εμβαδόν ενός κύκλου με την ακτίνα (

r

) ρυθμιστεί σε μεγάλο άξονα του κυττάρου.

Η p-τιμή που χρησιμοποιείται κατά τη σύγκριση της στρογγυλάδα μεταξύ των CTCs στο Draw 3 και 4 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

θεραπεία Response παρακολουθείται από διαμήκεις CTC Μοριακή ανάλυση

Για την εκτίμηση της ανταπόκρισης του ασθενούς στη θεραπεία ανάλυση υψηλή περιεκτικότητα μόνο κύτταρο περιλαμβάνει: (1) φαινότυπο έκφραση της πρωτεΐνης AR , (2) AR υποκυτταρικό εντοπισμό και (3) CNV γονιδιακό προφίλ πραγματοποιήθηκαν στην ΚΜΑ εντοπίστηκαν στα δείγματα αίματος που συλλέχθηκαν σε τέσσερις διαφορετικές χρονικά διαστήματα που αντιπροσωπεύουν σημεία απόφαση στη συνήθη φροντίδα του CRPC συμπεριλαμβανομένων: (Draw 1) αμέσως πριν από την έναρξη της docetaxel χημειοθεραπεία με βάση, (ισοπαλία 2) αμέσως πριν από την οξική αμπιρατερόνη (ένα εξαιρετικά εκλεκτικός αναστολέας της σύνθεσης των ανδρογόνων), (Draw 3) μετά από τρεις εβδομάδες, και (Draw 4) μετά από εννέα εβδομάδες συνεχούς θεραπείας αμπιρατερόνης. Τα συγκεκριμένα δεδομένα για όλες προφίλ κύτταρα παρουσιάζεται στο στοιχείο. Επιπλέον, μια μέθοδος παρόμοια αλληλούχισης βάση χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί το προφίλ CNV ενός μεταστατικού site από τον ασθενή χρησιμοποιώντας μια βιοψία οστού ελήφθησαν κατά την στιγμή της διάγνωσης (5 μήνες πριν να συντάξει 1) πριν από τη λήψη οποιασδήποτε ειδική για τον καρκίνο θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, και κατά την περίοδο 7 μηνών μεταξύ εφιστά 1 και 2, ο ασθενής εμφάνισε αρχική ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία docetaxel με βάση ακολουθούμενη από την αντίσταση. Παράλληλα, η βιοψία υγρό του ασθενούς έδειξε ένα σταθερό ποσοστό του AR

+ και AR

-. Υποπληθυσμών, ενώ ο συνολικός αριθμός των CTCs μειώθηκε (Σχήμα 1Α, 1Δ, το σχήμα S1 και τον πίνακα S1)

( Α) Οι συνολικές μετρήσεις HD-ΚΜΑ, συμπεριλαμβανομένου του αριθμού των φαινοτυπικά διακριτών AR

+ και AR

– κύτταρα, προσδιορίστηκε για κάθε αίματος Ισοπαλία που συλλέγονται κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής παρέμβασης. ΚΜΑ ορίστηκαν ως AR θετική εάν η ένταση σήματος AR ήταν υψηλότερη από έξι τυπικές αποκλίσεις πάνω από τη μέση τιμή (sDom) των γύρω λευκοκυττάρων (φόντο). Το μπαρ-γράφημα δείχνει την αλλαγή στην κατανομή του AR

+ και AR

– υποπληθυσμών CTC κατά μήκος της πορείας της θεραπείας, αναφέρεται σε κόκκινο και μπλε αντίστοιχα, και οι αριθμοί που παρουσιάζονται πάνω από κάθε γραμμή. συγκέντρωση (Β) PSA μετρήθηκαν σε κάθε χρονικό σημείο της θεραπείας. (Γ) Boxplot κυτταρικών κυκλικότητα για κάθε επιμέρους CTC προσδιορίζονται στις διάφορες χρονικές στιγμές θεραπεία. (Δ) Εκπρόσωπος 40 × εικόνες ανοσοφθορισμού του AR

+ και AR

– HD-ΚΜΑ από τους υποπληθυσμούς που προσδιορίζονται σε κάθε χρονικό σημείο της θεραπείας. Τα κανάλια ανοσοφθορισμού χρωματιστά ως εξής: πυρήνας: μπλε? κυτοκερατίνη: κόκκινο? AR: λευκό? και CD45: πράσινο. AR φαινότυπο υποδεικνύεται στην κάτω αριστερή γωνία της κάθε εικόνας. Όλα τα γραφήματα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τα πακέτα ggplot2 και RGL στο R.

Η

Οι γονιδιωματικής προφίλ CNV της CK

+ κύτταρα από Ισοπαλίες 1 και 2 ήταν δύο τύπων (Σχήματα 2 και S2). Τρία από αυτά τα κύτταρα ήταν αρνητικά για την έκφραση AR (CK

+ AR

-), ενώ η πλειοψηφία (16/19) έδειξαν υψηλά επίπεδα AR πρωτεΐνης (CK

+ AR

+). Ένα AR

– και ένα AR

+ κυττάρων είχε σχεδόν φυσιολογική CNV προφίλ συγκρίσιμα με εκείνα που λαμβάνονται από την ενιαία CK

-CD45

+ λευκοκύτταρα (Σχήμα 2). Όλα τα άλλα CK

+ AR

+ κύτταρα παρουσίασαν ένα πολύπλοκο πρότυπο του γενωμικού αναδιατάξεων που ήταν παρόμοια με την γενωμική προφίλ που λαμβάνεται αναδρομικά από μετάσταση στα οστά του ασθενούς (ορμόνη αφελή δείγμα ιστού) που λαμβάνεται κατά τη διάγνωση (Σχήμα 2 και Σχήμα 3Α) . Τα + AR + κύτταρα CK και το δείγμα μετάσταση στα οστά μοιράζονται πολλαπλά κέρδη και οι ζημίες των όπλων χρωμοσώματος συν ένα χαρακτηριστικό εστιακό ενίσχυσης για 3p13 με επίκεντρο την φωσφατάση ρυθμιστική υπομονάδα PPP4R2 και περιέχει τουλάχιστον δύο γονίδια που εμπλέκονται στον καρκίνο, FoxP1 [18], [19] και MITF [20] (Σχήμα 2). Στο επίπεδο της διαθέσιμης ανάλυσης, κάθε μία από τις κοινές εκδηλώσεις έδειξαν πανομοιότυπες γονιδιωματικής σημεία διακοπής, και στην ανάλυση ιεραρχικής ομαδοποίησης το AR

+ κύτταρα από ισοπαλίες 1 και 2 συγκεντρωμένα μαζί με την μετάσταση στα οστά (Cluster Α στο Σχήμα 3Α). Από αυτά τα στοιχεία, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι αυτά τα κύτταρα είναι

καλόπιστους

ΚΜΑ που προέρχονται από μεταστατικό καταγωγή του ασθενούς. Παρά τη σαφή σχέση καταγωγή, το AR

+ κυκλοφορούντα κύτταρα διέφερε από την μετάσταση στον τόπο AR, δείχνοντας πολλαπλών ενίσχυση των διαφόρων τμημάτων σε Xq12 που περιέχει το ίδιο το γονίδιο AR. ενίσχυση AR είναι συχνή σε CRPC, και έχει συνδεθεί με την πρόοδο από ευνουχισμό ευαίσθητο καρκίνο του προστάτη να CRPC [21]. Είναι αξιοσημείωτο ότι κάθε μία από τις ενισχύσεις AR (Σχήμα 3C) είναι μοναδικά, που προκύπτουν από πολλαπλές διαφορετικές σημεία διακοπής σε κάθε πλευρά του γονιδίου AR, υποδεικνύοντας ότι η ενίσχυση AR προέκυψαν πολλαπλά ανεξάρτητα φορές (Εξέλιξη συγκλίνουσα) πιθανόν ως αποτέλεσμα της επιλεκτικής πίεσης που επιβάλλεται από η θεραπεία στέρησης ανδρογόνων

Αντιγραφή προφίλ παραλλαγή αριθμό από μετάσταση στα οστά του ασθενούς.? Ένας έλεγχος μόνο WBC? και ενιαία CTCs από καθένα από τα τέσσερα χρονικά σημεία θεραπείας απεικονίζεται. Η αντίστοιχη φθορίζουσα εικόνα του κυττάρου που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία του προφίλ CNV εμφανίζεται προς τα δεξιά. Οι σχετικές γονιδιωματικής αλλαγές και τοπικές προσαρμογές χρωμόσωμα τους που συμβαίνουν σε κάθε συγκεκριμένη κλήρωση υποδεικνύεται με ανοιχτό μπλε μπάρες.

Η

(Α) Τρεις διαφορετικές κλωνική καταγωγές, εκπροσωπήθηκαν ως Cluster Α, Β και Γ, ταυτοποιήθηκαν με βάση το σύγκριση των 41 και μόνο προφίλ κυττάρων CNV σε μια ανεξέλεγκτη ιεραρχική ομαδοποίηση. Η κλήρωση αίμα από το οποίο απομονώθηκε το κάθε κύτταρο υποδεικνύεται ως Draw 1: κίτρινο? Ισοπαλία 2: πορτοκαλί? Ισοπαλία 3: μωβ? και Draw 4: μαύρο. Για αναφορά, η FFPE ιστού μετάσταση στα οστά είχε συμπεριληφθεί στο δέντρο, χρωματισμένο με πράσινο. Κάτω από το δέντρο, ένα θερμικός χάρτης δείχνει τα επιμηκύνσεις (κόκκινο) και διαγραφές (μπλε) σε ολόκληρο το γονιδίωμα κάθε ξεχωριστού κυττάρου. (Β) Συχνότητα γενωμικών ενισχύσεων και διαγραφές στις τρεις συστάδες προσδιορίζονται. Περιοχές μοναδικά ενισχυμένο (κόκκινο) ή να διαγραφεί (μπλε) στο σύμπλεγμα Α και C τονίζονται. (Γ) Ένα οικόπεδο λεπτομέρεια της εκδήλωσης ενίσχυσης AR χρωματιστά ανά κλήρωση για κάθε cluster εμφανίζεται.

Η

Στο Draw 3, μετά από τρεις εβδομάδες θεραπείας οξική αμπιρατερόνη, ο ασθενής εμφανίζεται μια σαφή κλινική ανταπόκριση ως ορίζεται από μείωση στην PSA και του πόνου (Σχήμα 1Β). Αυτή η απάντηση συνέπεσε με μια απότομη αλλαγή στην φαινοτύπους CTC και γονότυπους. Παρά το γεγονός ότι ο απόλυτος αριθμός των CTCs στο Draw 3 ήταν συγκρίσιμη με εκείνη της ισοπαλία 2, υπήρξε μια σχεδόν πλήρη εξάντληση του AR

+ CTC πληθυσμού (Εικόνα 1Α). Το CK

+ κυττάρων που προσδιορίζονται στο Draw 3 εξέφρασαν λίγη ή καθόλου πρωτεΐνη AR και επίσης διέφερε μορφολογικά, φαίνεται να είναι πολύ πιο επίμηκες από το AR

+ κύτταρα από Ισοπαλίες 1 και 2 (Σχήμα S1 και τον πίνακα S1). Αυτή η μορφολογική αλλαγή αντανακλάται σε μια μείωση στο μέσο των κυττάρων στρογγυλάδα (Σχήμα S3) από 0,87 (SD = 0.14) στο Draw 1 και 2 – 0,62 (SD = 0.15) στο Draw 3, σ & lt? 10

-11 Wilcoxon rank -sum δοκιμής (Σχήμα 1C).

Η προφανής επίδραση της θεραπείας ήταν επίσης εμφανής στην γονιδιωματική ανάλυση Ισοπαλία 3, όπου οι αλλαγμένες φαινοτυπική καταστάσεις συσχετίζονται με διακριτή γονιδιωματική προφίλ. Η πλειοψηφία (10/12) των φαινοτυπικά AR

– κύτταρα από Draw 3 δεν ενισχύθηκαν για AR και παρουσίασαν φαινομενικά φυσιολογική ή σχεδόν φυσιολογική προφίλ (ψευδοδιπλοειδής) (Εικόνα S2) τοποθετώντας τα σε συμπλέγματος Β στα σχήματα 3Α. Μία από τις δύο AR

– κύτταρα από αυτό το χρονικό σημείο είχε την υπογραφή CNV τυπικό Cluster Μια συμπεριλαμβανομένων ενίσχυση του AR, ενώ το άλλο συνδέεται με ένα τρίτο σύμπλεγμα (Cluster C στο Σχήμα 3Α), που κυριαρχείται από τα κύτταρα από τη μεταγενέστερη χρονική στιγμή ( Ισοπαλία 4). εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις που επηρεάζουν την σταθερότητα της πρωτεΐνης AR ή /και μεταλλάξεις χωρίς νόημα στο γονίδιο AR θα μπορούσε να εξηγήσει την AR-φαινότυπο γονότυπο ανισότητα των δύο τελευταίων κυττάρων. Να ερμηνεύσουμε ότι η αρχική απάντηση σε οξικό αμπιρατερόνη εξαντληθεί σημαντικά την εξαρτώμενη από ανδρογόνο AR

+ πληθυσμού, και ότι άλλο AR

– πληθυσμού που κυριαρχείται από ψευδοδιπλοειδής κύτταρα ήταν παρούσα στην κυκλοφορία. Με βάση το συνολικό αριθμό των κυττάρων, μένοντας σταθερή μεταξύ ισοπαλίες 2 και 3, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η κλήρωση 3 του πληθυσμού είναι συνέπεια του καρκίνου, αλλά από μια πηγή έξω από την κύρια γενεαλογίας του όγκου (Σχήμα 3Α).

Ισοπαλία 4 συλλέχθηκε στο σημείο της κλινικής εξέλιξης, όταν τα επίπεδα PSA αυξήθηκαν μετά από 9 εβδομάδες σε αμπιρατερόνη (Σχήμα 1Β). Σε αυτό το σημείο, ο αριθμός CTC είχε μειωθεί στο 47% του προηγούμενου χρονική στιγμή, αλλά είχε υποβληθεί και πάλι μια σημαντική φαινοτυπική μεταστροφή, καθώς η πλειοψηφία των CTCs ήταν για άλλη μια φορά AR

+ με τιμή κελιού στρογγυλάδα των 0,81 τυπικών κυττάρων από τις δύο πρώτες κληρώσεις (Εικόνα 1C και Εικόνα S1). Το εύρημα αυτό, που υποδηλώνουν κάποια σχέση μεταξύ της απόκρισης θεραπείας και ένα φαινότυπο CTC παρά με συνολικό αριθμό CTC, είναι συνεπής με μια μελέτη που δημοσιεύθηκε πρόσφατα, όπου η έκφραση των δύο δεικτών για την οδό σηματοδότησης AR σε κέντρα θεραπείας χολέρας καταγράφηκε στην ανταπόκριση στη θεραπεία με ανδρογόνα-σκηνοθεσία [ ,,,0],22].

Μεταβολές σε απόκριση σε θεραπεία ήταν και πάλι εμφανής στο επίπεδο του γονιδιώματος, όπως (6/10) κύτταρα αποτελούσαν την πλειοψηφία ενός νέου, προφανώς κλωνική, υποπληθυσμό (Cluster C στα Σχήματα 3Α και S2). Οι υπογραφές CNV στο Cluster C είναι σαφώς στην αρχική καταγωγή, πηγαίνοντας πίσω στην μετάσταση στα οστά του δείγματος πριν από οποιαδήποτε συστηματική θεραπεία, αλλά τώρα χαρακτηρίζεται από λειτουργικά σχετικές εκδηλώσεις, όπως ένα στενό αμπλικονίου που περιέχει MYC, και την εξαφάνιση του FOXP1 /MITF αμπλικόνιο μαζί με άλλες διαφορές που παρατηρούνται στα σχήματα 2, 3Α και 3Β. MYC ενίσχυση είναι μία από τις πιο κοινές αλλοιώσεις παρατηρήθηκαν σε μεταστατικούς όγκους, και έχει προταθεί να είναι ένας μηχανισμός παράκαμψης για AR ανεξάρτητη αντίσταση [23]. Είναι ενδιαφέρον ότι η στενότερη εξέταση της γονιδιωματικής ενίσχυσης AR (σκιαγραφείται στο Σχήμα 3C) δείχνει ότι, σε αντίθεση με τα όρια ετερογενή ενίσχυση που παρατηρείται σε προηγούμενες κύτταρα (σύμπλεγμα Α), τα κύτταρα σε σύμπλεγμα C παρουσιάζουν ένα μόνο προφίλ σχήμα με σχεδόν ομοιόμορφη σημεία διακοπής και σημαντικά υψηλότερα επίπεδα ενίσχυσης AR. Όλα μαζί τα γονιδιωματικά στοιχεία υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα Cluster C αντιπροσωπεύουν μία νέα γενεαλογία, προφανώς ανθεκτικά σε οξικό αμπιρατερόνη, και δημιουργείται ίσως από ένα μόνο κύτταρο ανθεκτικό.

Επιπλέον, μορφομετρική ανάλυση του AR υποκυτταρικού εντοπισμού έδειξε ότι ήταν AR γενικά εντοπισμένη στον πυρήνα των κυττάρων από εφιστά 1 και 2, αλλά αναγνωρίστηκε ως σημαντικά μικρότερη εντοπισμένη στον πυρήνα των ΚΜΑ απομονώθηκαν σε Draw 4 συλλέγονται σε εξέλιξη (ρ = 0,00017 Wilcoxon τεστ rank-sum) (Σχήμα 4). Αυτό το εύρημα είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον υπό το φως πρόσφατων μελετών δείχνουν ότι οι παραλλαγές συνδέτη ανεξάρτητος AR ματίσματος μπορεί να μεσολαβήσει αντίσταση αμπιρατερόνη σε έναν άνθρωπο CRPC μοντέλο ξενομοσχεύματος [24], και ότι αυτά τα κολοβωμένη και συστατικώς δραστικές μορφές του AR βρέθηκε να εντοπίζεται στον πυρήνα καθώς και κυτταρόπλασμα σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη [25].

(Α) Σύγκριση του υποκυτταρικού εντοπισμού AR στους CTCs προσδιορίζονται στο αίμα πριν και μετά από εννέα εβδομάδες θεραπείας αμπιρατερόνη. Συσχέτιση μεταξύ των σημάτων AR και DAPI εντός του κυττάρου είναι ενδεικτικός του AR είναι colocalized με ϋΑΡΙ,

δηλ.

Εντοπισμένη στον πυρήνα του κυττάρου. Υψηλή συσχέτιση θεωρήθηκε γενικά πριν από τη θεραπεία abiraterone, αλλά μια στροφή προς λιγότερο πυρηνική χρώση παρατηρήθηκε μετά από εννέα εβδομάδες θεραπείας (p = 0,00017, Wilcoxon τεστ ποσό-rank). (Β) και (Δ) Ύψος χάρτες κατασκευάστηκαν από τις εντάσεις pixel της CK (κόκκινο), AR (πράσινο) και DAPI (μπλε) σε αντιπροσωπευτικές ΚΜΑ για να απεικονίσει τη υποκυτταρική εντόπιση της AR. Το κύτταρο στο (Β) απομονώθηκε πριν την έναρξη αμπιρατερόνη και εμφανίζει AR χρώση περιορίζεται στον πυρήνα, ενώ κυτταροπλασματική χρώση AR παρατηρείται στην CTC προσδιορίζονται κατά τον χρόνο της θεραπευτικής υποτροπής (D). (C) και (Ε) Οικόπεδα του AR έναντι εντάσεις σήματος DAPI για κάθε εικονοστοιχείο στο εσωτερικό του κυττάρου στα 40 × εικόνες των CTCs στο (Β) και (Δ), αντίστοιχα. Κάθε σημείο οικόπεδο χρωματίζεται από την αντίστοιχη ένταση του σήματος CK. Πυρηνική εντοπισμός παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ των δύο εντάσεων (C), και η πυρηνική αποκλεισμός ως αρνητική συσχέτιση (Ε). phenotype-genotype.

doi:10.1371/journal.pone.0101777.s004

(DOCX)

Acknowledgments

We